包含胆碱结合蛋白an－末端截取物的氨基酸的多肽、由该多肽衍生的疫苗及其应用的制作方法

专利名称：包含胆碱结合蛋白an－末端截取物的氨基酸的多肽、由该多肽衍生的疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明普遍涉及胆碱结合蛋白AN-末端截取物的多肽。本发明也涉及对细菌感染，特别是肺炎球菌感染提供保护作用或激发产生保护性抗体的疫苗和用于诊断和被动免疫治疗的对抗这种多肽的抗体和拮抗剂。该多肽和/或编码该多肽的核酸也可以用作肺炎球菌细菌附着的竞争性抑制剂。最后，本发明涉及利用该多肽进行治疗的治疗方法。
背景技术：
肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，它是引起侵袭性感染如败血症、脑膜炎、中耳炎、和大叶性肺炎的主要原因(Tuomanen等人，NEJM 3321280-1284，1995)。肺炎球菌强烈地与上下呼吸道细胞结合。象大多数细菌一样，通过与真核生物的碳水化合物结合的细菌表面蛋白质的呈递以类似凝集素的方式来完成肺炎球菌与人类细胞的粘着(Cundell，D.&Tuomanen，E.(1994)Microb Pathog 17361-374)。肺炎球菌与非炎性上皮结合可看作是无症状运输过程。已经有人提出，转变为侵袭性疾病与局部产生炎性因子有关，所述因子通过激活人类细胞改变可在人类细胞上获得的受体的数目和类型(Cundell，D.等人(1995)Nature377435-438)。在这种新的环境中肺炎球菌便有机会取得优势并且利用了这些未调整受体之一，血小板激活因子(PAF)受体(Cundell，D.等人(1995)Nature 377435-438)。在PAF受体出现的几分钟内，肺炎球菌经历粘着性和侵袭性增强的波动。例如通过可溶性受体类似物来抑制细菌与激活细胞的结合可在动物模型中阻断疾病的进展(Idanpaan-Heikkila，I.等人(1997)J.Infect.Dis.，176704-712)。在这点上特别有效的是包含有或没有附加唾液酸的乳糖-N-新四糖的可溶性碳水化合物，它在体外预防肺炎球菌附着在人类细胞上并且在体内预防移生于肺中。胆碱结合蛋白候选结构附着基因肺炎球菌产生一类能够与细菌表面结合的表面蛋白，这种结合是通过与细胞壁磷壁酸或脂磷壁质非共价结合的。肺炎链球菌表面覆盖着一类CBPs(胆碱结合蛋白)，这类蛋白与磷脂酰胆碱非共价结合。CbpA是一种75kD表面暴露的胆碱结合蛋白，显示嵌合结构。具有独特的N-末端区域，即富含脯氨酸的区域，其后是由10个负责结合胆碱的重复区组成的C-端区域。
CbpA是一种复合糖的粘附素(配体)，复合糖上包含存在于真核细胞表面上的受体。具有CbpA缺陷的突变在鼻咽移生的未成年大鼠模型中显示降低的毒力。这种结合涉及修饰磷壁酸的胆碱决定簇并且通过该类蛋白质各个成员中的特征胆碱结合区域来介导。Lopez等人在他们的自溶酶研究中发现了这种胆碱结合区域并且对其特性进行了充分地确定(Ronda等人(1987)Eur.J.Biochem，164621-624)。含有该区域的其它蛋白包括肺炎球菌噬菌体的自溶素和保护性抗原，即肺炎球菌表面蛋白A(PspA)(Ronda，C.等人(1987)Eur.J.Biochem，164621-624和McDaniel，L.S.，等人(1992)Microb Pathog，13261-269)。CbpA不能移生于鼻咽区域，该区域是与CbpA的共同具有的其它类型成员(C端)并且其与人细胞结合的活性是由其特有的N-末端区域产生的。由于移生的过程和疾病的发展取决于作为第一步骤的肺炎球菌附着于人细胞上，通过交叉反应性抗体或者通过与模拟该区的肽的竞争性抑制作用阻断N-末端区域的功能对于阻断疾病来说可能是关键性的。在PCT国际申请PCT/US97/07198中讨论了抗肺炎球菌疫苗的胆碱结合蛋白并且将该PCT申请的全部内容引入本文供参考。目前抗肺炎链球菌的疫苗使用该细菌23个最普通血清型的荚膜的纯化碳水化合物，但该疫苗仅仅有50％的保护作用(Shapiro等人，NJEM 3251453，1991)并且在2岁以下不具有免疫原性。而且，治疗性多肽在被多抗性生物体感染的病例中会提供治疗的选择性。所以，本发明通过提供保护性疫苗满足了这一长期的需要。
发明概述本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。所述多肽包含SEQ ID NOS 1，3-7或9-11中所述的氨基酸序列，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。而且，本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含具有SEQ ID NO 24氨基酸的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中该多肽显示其三级结构并且也提供制备该多肽的方法。分离的多肽适用于使动物和人对细菌感染，优选对肺炎球菌感染产生免疫作用。
本发明也涉及具有凝集素活性但没有胆碱结合活性的胆碱结合蛋白A的N-末端截取物。而且，本发明提供一种免疫原性胆碱结合蛋白A的N-末端截取物或其片段。
本发明也涉及分离的核酸，如重组DNA分子或克隆的基因或其简并变体、突变体、类似物或其片段，其编码分离的多肽或者其竞争性抑制多肽的活性。优选地，分离的核酸(包括简并物、变体、突变体、类似物或其片段)具有SEQ ID NOS12，14-17，19-22或23所述的序列。在本发明进一步的实施方案中，可以将如此确定的重组DNA分子或克隆基因的完整DNA序列有效地连接到表达控制序列上，该表达控制序列可以被引入到合适的宿主中。因此，本发明还涉及用克隆的基因或重组DNA分子转化的单细胞宿主，所述克隆基因或重组DNA分子包含编码本发明多肽的DNA序列，特别是由上文所述序列确定的DNA序列或其片段。
对抗分离多肽的抗体包括天然产生的和重组方法制备的抗体。这些抗体可包括通过已知的遗传技术制备的多克隆和单克隆抗体，以及双特异性的(嵌合的)抗体，和包括适于诊断使用及能够调节细菌粘附包括但不限于起竞争剂作用的其它功能的抗体。
本发明的再一目的是提供一种治疗哺乳动物来控制细菌或其亚单位的量或活性以便处理或预防侵入、自生或特发病态所产生的不利后果的方法。本发明提供在治疗方法中使用的药物组合物，其中包含或基于分离的多肽、其亚单位或其结合配对物。
最后，本发明提供药物组合物、疫苗及使用它们的诊断和治疗方法。
附图简述

图1.胆碱结合蛋白A(CbpA)和重组截取物R1(如图2所示从CbpA的N-末端开始约氨基酸16到氨基酸321)和R2(如图2所示从CbpA的N-末端开始约氨基酸16到氨基酸444)的图解。区域A是如图2所示从CbpA氨基酸序列的N-末端开始约氨基酸153到氨基酸321；区域B是如图2所示从CbpA氨基酸序列的N-末端开始约氨基酸270到氨基酸326；并且区域C是如图2所示从CbpA氨基酸序列的N-末端开始约氨基酸327到氨基酸433。
图2A-B.比较CbpA N-末端区域的核酸和氨基酸序列各种血清型的同源性。
图3.重组R1和R2的表达和纯化。
图4.在小鼠中被动保护的结果。对抗重组R2的免疫血清保护小鼠免受致死性肺炎链球菌的激发。
图5.抗-R2抗体对粘附到LNnT-HSA包被平板上的R6x的滴定。
图6.具有阻断肺炎球菌与LNnT-HSA包被平板粘附活性的抗-Cbp-A和吸附的抗-CbpA抗体的滴定。
图7.在小鼠中的主动保护结果。对抗重组R1的免疫血清保护小鼠免受致死性肺炎链球菌的激发(激发物560cfu血清型6B)。
发明详述本发明涉及一种分离的多肽，该多肽包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。该多肽适用于使动物对肺炎球菌感染产生免疫作用。这些多肽或其肽片段，当用合适的佐剂配制时，用于对抗肺炎球菌和对抗具有交叉反应性蛋白的其它细菌的疫苗中。
本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。在一个实施方案中，该多肽具有SEQ ID NO 1，3-5，7或9-11所述的任一氨基酸序列，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。在另一实施方案中，该多肽具有氨基酸KXXE(SEQ ID NO6)。
本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含图2所述的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。在一个实施方案中，该多肽具有图2所述保守区的氨基酸序列。例如，保守区包括但不限于氨基酸序列158-210；158-172；300-321；331-339；355-365；367-374；379-389；409-427和430-447。图2描述本发明CbpA N-末端区域的核酸和氨基酸序列各种血清型的同源性。
另外，本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含具有SEQ ID NO 24所述氨基酸的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中所述多肽显示其三级结构。在一个实施方案中，所述多肽是其类似物、片段、突变体或变体。所述变体如图2所示。本发明也提供一种分离的多肽，该多肽包含具有图2所述血清型4的约16位到约474位氨基酸或如图2所述血清型4相应氨基酸的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中所述多肽显示其三级结构。在一个实施方案中，三级结构与存在于天然蛋白质中的三级结构相对应。
制备所述多肽的方法的例子如下用羟胺裂解全长的胆碱结合蛋白A，其中所述羟胺裂解胆碱结合蛋白A血清型R6x和血清型4的475位处的氨基酸天冬酰胺(N)或者图2所示不同血清型中血清型R6x或血清型4的相应氨基酸，由此产生胆碱结合蛋白A的N-末端截取物。产生截断的胆碱结合蛋白A或其片段并且保持天然三级结构(即，全长胆碱结合蛋白A的三级结构)的其它方法是有所描述的并且对本领域技术人员来说是已知的。由于所述多肽保持其三级结构，分离的多肽适用于作为免疫原使动物和人对细菌感染，优选肺炎球菌产生免疫作用。
含有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型氨基酸序列的多肽如下ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAEKPAPAPKPEN(SEQ ID NO 24).
“多肽R2”意指含有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型(见图1)的N-末端截取物的氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(SEQ ID NO 1)编码胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的多肽R2的DNA序列GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTGAGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTAGTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGAATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAAAAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAAGTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAACAAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG(SEQ ID NO 12).CbpA血清型4的氨基酸序列ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPAPKAEKPAPAPKPENPAEQPKAEKPADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNSNGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQYNGSWYYLNANGSMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGDTWYYLEASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN.(SEQ IDNO 2)编码CbpA血清型4的氨基酸序列的DNA序列GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTGAGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTAGTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGAATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAAAAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTICGTCAAGTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAACAAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCCCATCCCTGAAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGgCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTGAACAACCACAACCAGCGCCGGCTCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCAAAACCAGAGAATCCAGCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAACCAGCTGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACAGCAACCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACAGGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAAtGGCTCAtGGTAcTACcTCAACAGCAATGGCGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACCTGGTACTATCTTGAAGCATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAAAGTATCAGATAAATGGTACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCAACACAACTGTAGATGGCTATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAACTAA(SEQ ID NO 13).
“多肽R1”意指含有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的16位到321位氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGATQVPTSSNRANESQAEQGEQPKKLDSERDKARKEVEEYVKKIVGESYAKSTKKRHTITVALVNELNNIKNEYLNKIVESTSESQLQILMMESRSKVDEAVSKFEKDSSSSSSSDSSTKPEASDTAKPNKPTEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADAKEQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETL(SEQ ID NO 3).
编码多肽R1的DNA序列为GAGAACGAGGGAGCTACCCAAGTACCCACTTCTTCTAATAGGGCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAGAACAACCTAAAAAACTCGATTCAGAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTCGAGGAATATGTAAAAAAAATAGTGGGTGAGAGCTATGCAAAATCAACTAAAAAGCGACATACAATTACTGTAGCTCTAGTTAACGAGTTGAACAACATTAAGAACGAGTATTTGAATAAAATAGTTGAATCAACCTCAGAAAGCCAACTACAGATACTGATGATGGAGAGTCGATCAAAAGTAGATGAAGCTGTGTCTAAGTTTGAAAAGGACTCATCTTCTTCGTCAAGTTCAGACTCTTCCACTAAACCGGAAGCTTCAGATACAGCGAAGCCAAACAAGCCGACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTC(SEQ ID NO 14).
“多肽C/R2”意指在R2内包含重复区C的多肽，其中重复区C具有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的327位到433位氨基酸序列，其具有下列序列KPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKA(SEQ ID NO 4).多肽C/R2的DNA序列AAACCAGAAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAAACGAGGAAAAAGTTAAGCAAGCAAAAGCGGAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAAAATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA(SEQ ID NO 15)“多肽A/R2”意指在R2内包含重复区A的多肽，其中重复区A具有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的153位到269位氨基酸序列，其具有下列序列TEPGEKVAEAKKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTITYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKVKANEPRDEQKIKQAEAEVESKQAEATRLKKIKTDREEAEEEAKRRADA(SEQ ID NO 5).如图1所示，多肽R2的A区与R1中的A区是相同的。
编码多肽A/R2的DNA序列为ACAGAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCATTACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGGAAGTTAAAAAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGTGAAAGCTAACGAACCTCGAGACGAGCAAAAAATTAAGCAAGCAGAAGCGGAAGTTGAGAGTAAACAAGCTGAGGCTACAAGGTTAAAAAAAATCAAGACAGATCGTGAAGAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAGAGCAGATGCT(SEQ ID NO 16).
可以改变或修饰一个或多个氨基酸残基的同一性或位置以包括变体，例如缺失物，包含比蛋白质全部特定残基少的残基，取代物，其中一个或多个特定残基被其它残基取代和加成物，其中一个或多个氨基酸残基被加入到所述多肽的末端或中间部分(见图2)。这些分子包括掺入对于由所选非哺乳动物宿主表达来说“优选的”密码子；提供限制性核酸内切酶的切割位点；并且提供促进易于表达载体构建的其它起始、末端或中间的DNA序列。具体来说，下列是血清型4中氨基酸取代的例子，其包括但不限于154位的E被K取代；155位的P被L取代；156位的G被E取代；157位的E被K取代；181位的K被E取代；182位的D被A取代；187位的R被Y、H或L取代；194位的I被N取代；200位的E被D取代；202位的E被D取代；209位的E被K取代；212位的K被E取代；218位的V被L取代；220位的V被K或E取代；221位的K被E取代；223位的N被D或K取代；225位的P被S、T或R取代；227位的D被N取代；228位的E被K取代；229位的Q被E、G或D取代；230位的K被T取代；232位的K被N取代；235位的E被K取代；236位的A被E取代；237位的E被K取代；240位的S被N取代；241位的K被E取代；242位的Q被K取代；249位的K被E取代；250位的K被N取代；257位的E被Q或K取代；263位的A被L取代；264位的K被E取代；265位的R被N取代；266位的R被I取代；267位的A被K或V取代；258位的D被T取代；269位的A被D取代；291位的A被T、V、P、G或X取代；294位的G被G、A或E取代；295位的V被D或A取代；295位的P被L或F取代；299位的L被P或Q取代；328位的P被S取代；329位的E被G取代；340位的E被A取代；343位的K被E或D取代；347位的E被K取代；349位的D被A取代；354位的R被H取代；366位的E被D取代；375位的E被K取代；378位的K被E取代；390位的E被G取代；391位的P被S取代；393位的N被D取代；397位的V被I取代；和408位的K被Q取代。
“多肽R2血清型-R6x”是指包含胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的16位到444位氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(SEQ ID NO 7)编码多肽R2血清型R6x的DNA序列GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGACAGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAAATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGCCTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAAATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCAAAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCAGAtCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGCTG(SEQ ID NO 17)CbpA血清型R6x的氨基酸序列ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETLPSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPAEQPQPAPATQPEKPAPKPEKPAEQPKAEKTDDQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKTEKPAQPSTPKTGWKQENGMWYFYNTDGSMATGWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQNNGSWYYLNANGSMATGWLQNNGSWYYLNANGAMATGWLQYNGSWYYLNSNGAMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWLQNNGSWYYLNANGDMATGWLQYNGSWYYLNANGDMATGWVKDGDTWYYLEASGAMKASQWFKVSDKWYYVNGSGALAVNTTVDGYGVNANGEWVN(SEQ ID NO 8).编码CbpA血清型R6x氨基酸序列的DNA序列GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGACAGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAAATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGCCTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAAATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCAAAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGAtCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTtCAGAtCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTCCAAGCTCATCCCTGAAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGCAGAAGAAGATAAAGTTAAAGAAAAACCAGAAGAACAACCACAACCAGCGCCGGCTACTCAACCAGAAAAACCAGCTCCAAAACCAGAGAAGCCAGCTGAACAACCAAAAGCAGAAAAAACAGATGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGCTCGTAGATCAGAAGAAGAATATAATCGCTTGACTCAACAGCAACCGCCAAAAACTGAAAAACCAGCACAACCATCTACTCCAAAAACAGGCTGGAAACAAGAAAACGGTATGTGGTACTTCTACAATACTGATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTATCTAAACGCTAATGGTTCAATGGCAACAGGATGGCTCCAAAACAATGGTTCATGGTACTACCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGTTCATGGTACTACCTAAACAGCAATGGCGCTATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAATGGCTCATGGTACTACCTCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGATGGCTCCAAAACAACGGTTCATGGTACTACCTCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGATGGCTCCAATACAACGGTTCATGGTATTACCTCAACGCTAATGGTGATATGGCGACAGGTTGGGTGAAAGATGGAGATACCTGGTACTATCTTGAAGCATCAGGTGCTATGAAAGCAAGCCAATGGTTCAAAGTATCAGATAAATGGTACTATGTCAATGGCTCAGGTGCCCTTGCAGTCAACACAACTGTAGATGGCTATGGAGTCAATGCCAATGGTGAATGGGTAAACTAA(SEQ ID NO 18).
“多肽R1血清型R6x”是指包含胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的16位到321位氨基酸序列的多肽，其具有下列序列ENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDEYIEKMLREIQLDRRKHTQNVALNIKLSAIKTKYLRELNVLEEKSKDELPSEIKAKLDAAFEKFKKDTLKPGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADAKLKEANVATSDQGKPKGRAKRGVPGELATPDKKENDAKSSDSSVGEETL(SEQ IDNO 9).编码多肽R1的DNA序列为GAAAACGAAGGAAGTACCCAAGCAGCCACTTCTTCTAATATGGCAAAGACAGAACATAGGAAAGCTGCTAAACAAGTCGTCGATGAATATATAGAAAAAATGTTGAGGGAGATTCAACTAGATAGAAGAAAACATACCCAAAATGTCGCCTTAAACATAAAGTTGAGCGCAATTAAAACGAAGTATTTGCGTGAATTAAATGTTTTAGAAGAGAAGTCGAAAGATGAGTTGCCGTCAGAAATAAAAGCAAAGTTAGACGCAGCTTTTGAGAAGTTTAAAAAAGATACATTGAAACCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAATCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCTAAGTTGAAGGAAGCTAATGTAGCGACTTCAGATCAAGGTAAACCAAAGGGGCGGGCAAAACGAGGAGTTCCTGGAGAGCTAGCAACACCTGATAAAAAAGAAAATGATGCGAAGTCTTCAGATTCTAGCGTAGGTGAAGAAACTCTTC(SEQ ID NO 19).
“多肽C/R2血清型R6x”是指在R2内包含重复区C的多肽(参见图2)，其中所述重复区C具有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的327位到433位的氨基酸序列，其具有下列序列KSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKA(SEQ ID NO 10)多肽C/R2血清型R6x的DNA序列AAATCAGGAAAAAAGGTAGCAGAAGCTGAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCCAAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGCCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGACCTTGAAATTGCTGAGTCCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAGGAACCTCGAGACGAGGAAAAAATTAAGCAAGCAAAAGCGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACATCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCA(SEQ ID NO 20).
“多肽A/R2血清型R6x”是指在R2内包含重复区A的多肽(参见图2)，其中所述重复区A具有胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的155位到265位的氨基酸序列，其具有下列序列PGEKVAEAKKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAEFDVKVKEAELELVKEEAKESRNEGTIKQAKEKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKADA(SEQ ID NO 11)编码多肽A/R2血清型R6x的DNA序列CCAGGAGAAAAGGTAGCAGAAGCTAAGAAGAAGGTTGAAGAAGCTAAGAAAAAAGCCGAGGATCAAAAAGAAGAAGATCGTCGTAACTACCCAACCAATACTTACAAAACGCTTGAACTTGAAATTGCTGAGTTCGATGTGAAAGTTAAAGAAGCGGAGCTTGAACTAGTAAAAGAGGAAGCTAAAGAAtCTCGAAACGAGGGCACAATTAAGCAAGCAAAAGAGAAAGTTGAGAGTAAAAAAGCTGAGGCTACAAGGTTAGAAAACAtCAAGACAGATCGTAAAAAAGCAGAAGAAGAAGCTAAACGAAAAGCAGATGCT(SEQ ID NO 21).
本发明涉及一种分离的多肽，其中该分离的多肽由如SEQ ID NOS22或23所述的氨基酸序列所组成，包括其片段、突变体、变体、或类似物，或衍生物。SPSLKPEKKVAEAEKKVEEAKKKAEDQKEEDRRNYPTNTYKTLELEIAESDVEVKKAELELVKEEAKEPRNEEKVKQAKAEVESKKAEATRLEKIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKPA(SEQ ID NO 22；血清型 4；323-434位)或PSSSLKSGKKVAEAEKKVEEAEKKAKDQKEEDRRNYPTNTYKTLDLEIAESDVKVKEAELELVKEEAKEPRDEEKIKQAKAKVESKKAEATRLENIKTDRKKAEEEAKRKAAEEDKVKEKRA(SEQ ID NO 23；血清型 R6x；322-434位).
“多肽B/R2”是指包含图2所述的胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型4型的N-末端截取物的270位到326位氨基酸序列的多肽。“多肽B/R2血清型-R6x”是指包含图2所述的胆碱结合蛋白A(CbpA)血清型R6x的N-末端截取物的264位到326位氨基酸序列的多肽。本发明研究具有图1所述的A、B、C、A+B、B+C、A+C区氨基酸序列的多肽。
此外，本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含胆碱结合蛋白A的N-末端截取物的氨基酸序列，其中所述多肽具有氨基酸KXXE(SEQ IDNO 6)。
本发明涉及包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列阐述于图2中。在一个实施方案中，所述多肽具有一个氨基酸序列，该序列是图2所述的保守区。例如，保守区包括但不限制于氨基酸序列158-172；300-321；331-339；355-365；367-374；379-389；409-427；和430-447。图2阐述了本发明所研究的各种血清型CbpA的N末端区的核酸和氨基酸序列的同源性。
本发明提供一种分离的多肽，该多肽包含从胆碱结合蛋白A的N-末端截取的氨基酸序列，其中所述多肽具有凝集素活性并且不与胆碱结合。在一个实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO 1、3-5、7或9-11中所述的任一氨基酸序列，包括其片段、突变体、变体、类似物，或衍生物。
本文所使用的“具有凝集素活性的多肽”是指一种以非共价键与碳水化合物结合的多肽、肽或蛋白质。本文所定义的“粘附素”是指细菌与人类细胞的非共价键结合或足够稳定以经得起洗涤的分泌。本文所定义的“结合LNnT”是指结合乳糖-N-新四糖包裹的底物多于结合白蛋白-对照。
本发明提供一种分离的免疫原性多肽，该多肽包含从胆碱结合蛋白A的N末端截取的氨基酸序列。本发明预测所述免疫原性多肽具有SEO ID NOS 1、3-7或9-11中所述的任一氨基酸序列，包括其片段、突变体、变体、类似物，或衍生物。本发明提供了一种分离的多肽，该多肽包含图2所述从胆碱结合蛋白A的N末端截取的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽具有图2所述保守区的氨基酸序列。
本发明涉及包含上述氨基酸序列的多肽的类似物。所述类似物多肽可能具有不连接或连接到包含所述氨基酸序列的多肽的N或COOH末端的N-末端蛋氨酸或N-末端聚组氨酸。
在另一实施方案中，本发明研究了由所述多肽的蛋白水解消化产物产生的多肽的肽片段。在另一实施方案中，所述多肽衍生物上连有一个或多个化学部分。在另一实施方案中，所述化学部分是水溶性聚合物。在另一实施方案中，所述化学部分是聚乙二醇。在另一实施方案中，所述化学部分是单、二、三或tetrapegylated。在另一实施方案中，所述化学部分是N-末端monopegylated。
聚乙二醇(PEG)连接到化合物上是特别有用的，因为PEG对哺乳动物具有很低的毒性(Carpenter等人，1971)。例如，美国批准利用腺苷脱氨基酶的PEG加合物来治疗人类严重的合并免疫缺陷综合症。与PEG结合获得的第二点好处是有效地降低异种化合物的免疫原性和抗原性。例如，人类蛋白质的PEG加合物可用于治疗其它哺乳动物物种的疾病并且没有诱发严重免疫反应的危险。本发明化合物可以以微囊包封装置递送以便于减少或预防对抗所述化合物或对抗可产生所述化合物的细胞的宿主免疫反应。本发明化合物也可以以包裹在膜中的微囊化形式如脂质体递送。
已经描述了许多适用于与蛋白质直接反应的PEG活性形式。用于与蛋白质氨基反应的PEG试剂包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，特别是其中离去基团为N-羟基琥珀酰亚胺、对-硝基苯酚、咪唑或1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸酯的化合物。包含马来酰亚氨基或卤代乙酰基的PEG衍生物是适用于蛋白质游离巯基改性的试剂。同样地，包含氨基肼或酰基肼的PEG试剂可用于与醛反应，所述醛是由蛋白质中碳水化合物基团的高碘酸盐氧化产生的。
在一个实施方案中，本文所描述的多肽的氨基酸残基优选以“L”同分异构形式存在。在另一实施方案中，以“D”同分异构形式存在的残基可替代任何L-氨基酸残基，只要所述多肽能够保留所需要的凝集素活性的功能特性即可。NH2是指在多肽的氨基端存在的游离氨基。COOH是指在多肽的羧基端存在的游离羧基。本文所使用的缩写与标准的多肽命名一致，J.Biol.Chem.，2433552-59(1969)。
应该注意，本文所有氨基酸残基序列都是由式子表示的，其中所述式子的左和右取向都是在氨基端到羧基端的常规方向上。此外，应该注意，在氨基酸残基序列开始或结尾的破折号表示与另外的一个或多个氨基酸残基序列连接的肽键。
利用公知的固相、液相或多肽缩合技术或其组合制备的合成多肽可包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是标准的Boc(Nα-氨基保护的Nα-叔丁氧基羰基)氨基酸树脂，通过Merrifield的最初固相方法中标准的脱保护、中和、偶联和洗涤方法(1963，J.Am.Chem.Soc.852149-2154)合成，或者是由Carpino和Han(1972，J.Org.Chem.373403-3406)首先描述的碱不稳定的Nα-氨基保护的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。因此，本发明多肽可包含D-氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸的组合和各种用于传达特殊性质的“设计者”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸等)。合成氨基酸包括用于合成赖氨酸的鸟氨酸，用于合成苯丙氨酸的氟苯丙氨酸和用于合成亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。另外，通过在特定偶联步骤指定特定氨基酸，可产生α-螺旋、β-转角、β折叠、γ-转角和环状肽。
一方面，本发明所述肽在C-末端可包含特殊的氨基酸，它结合CO2H或CONH2侧链以模拟游离的甘氨酸或甘氨酸-酰胺基团。考虑该特殊残基的另一方法是具有由接头组成的或与珠粒键合的侧链的D或L氨基酸类似物。在一个实施方案中，假游离的C-末端残基可为D或L光学构型；在另一实施方案中，可以使用D和L异构体的外消旋混合物。
在另外的实施方案中，焦谷氨酸可作为肽的N-末端残基包含在内。尽管焦谷氨酸经不起通过Edman降解所得序列的检验，但是通过将取代仅限制到所给出的具有N-末端焦谷氨酸的珠粒上的50％的肽，珠粒上仍将保留足够的非焦谷氨酸肽用于测序。普通技术人员会容易地意识到该技术可用于任何在N-末端掺入耐受Edman降解的残基的肽的测序。下文详细描述了表征表现出所需活性的各个肽的其它方法。在50％的肽中存在特定的N-末端基团时，含有被保护的N-末端基团如焦谷氨酸的肽的比活性通过比较完全(100％)被保护的肽与未被保护的(0％)肽的活性将会容易地得到证明。
另外，预计本发明制备的肽具有更好定义的结构特性，并且使用肽模拟物和肽模拟键如酯键来制备具有新特性的肽。在另一实施方案中，可以产生有还原肽键(即，R1-CH2-NH-R2，其中R1和R2是氨基酸残基或序列)的肽。可以作为二肽亚单位引入还原肽键。这样的分子将会耐受肽键水解，如，蛋白酶活性。这类肽将会提供具有独特功能和活性的配体，如，由于对代谢分解或蛋白酶活性具有耐受性而延长了体内的半衰期。而且，在某些系统中受约束的肽显示增强的功能活性是公知的(Hruby，1982，Life Sciences 31189-199；Hruby等人，1990，Biochem J.268249-262)；本发明提供一种生产受约束肽的方法，该肽在所有其它位置掺入随机序列。
可以合成受约束的、环状的或刚性化的肽，条件是在肽序列的至少两个位置插入氨基酸或氨基酸类似物以提供能够交联以在处理后约束、环化或刚性化该肽形成交联物的化学官能团。当掺入回转诱导氨基酸时将有利于环化。能够使肽交联的氨基酸的例子是形成二硫化物的半胱氨酸、形成内酯或乳糖酶的天冬氨酸和螯合剂如γ-羧基-谷氨酸(Gla)(Bachem)以螯合过渡金属并形成交联物。通过改良Zee-Cheng和Olson(1980，Biophys，Biochem.Res.Commun.941128-1132)所述的合成方法可以制备保护的γ-羧基-谷氨酸。可通过如氧化半胱氨酸残基以形成二硫化物或加入金属离子以形成螯合物来处理肽序列中含有至少两个能够交联的氨基酸的肽，使肽交联并形成受约束的、环状的或刚性化的肽。本发明提供系统制备交联物的策略。例如，如果将4个半胱氨酸残基掺入肽序列中，可使用不同的保护基(Hiskey，1981，in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Vol.3，Gross and Meienhofer，eds.，Academic PressNew York，137-167页；Ponsanti等人，1990，Tetrahedron 468255-8266)。第一对半胱氨酸可被脱保护并氧化，然后可将第二组脱保护并氧化。在该方法中，可形成特定组的二硫化的交联物。另外，可掺入一对半胱氨酸和一对核对的氨基酸类似物以便使交联物具有不同的化学特性。
可以将下列非经典氨基酸结合到肽中以便引入特定构象的基序1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，1991，J.Am.Chem.Soc.1132275-2283)；(2S，3S)-甲基-苯丙氨酸、(2S，3R)-甲基-苯丙氨酸、(2R，3S)-甲基-苯丙氨酸和(2R，3R)-甲基-苯丙氨酸(Kazmierski和Hruby，1991，Tetrahedron Lett)；2-氨基四氢萘-2-羧酸(Landis，1989，Ph.D.Thesis，University of Arizona)；羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，1989，J.Takeda Res.Labs.4353-76)；β-咔啉(D和L)(Kazmierski，1988，Ph.D.Thesis，University of Arizona)；HIC(组胺酸异喹啉羧酸)(Zechel等人，1991，Int.J.Pep.Protein Res.43)；和HIC(组胺酸环脲)(Dharanipragada)。
下列氨基酸类似物和肽模拟物可被引入肽中以诱导或有利于形成特异的二级结构LL-Acp(LL-3-氨基-2-丙烯酮-6-羧酸)，一种诱导β-转角的二肽类似物(Kemp等人，1985，J.Org.Chem.505834-5838)；诱导β-折叠的类似物(Kemp等人，1988，Tetrahedron Lett.295081-5082)；诱导β-转角的类似物(Kemp等人，1988，Tetrahedron Lett.295057-5060)；诱导α-螺旋的类似物(Kemp等人，1988，TetrahedronLett.294935-4938)；诱导γ-转角的类似物(Kemp等人，1989，J.Org.Chem.54109-115)和由下列参考文献提供的类似物Nagai和Sato，1985，Tetrahedron Lett.26647-650；DiMaio等人，1989，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1687页；以及Gly-Ala转角类似物(Kahn等人，1989，Tetrahedron Lett.302317)；酰胺键同配物(Jones等人，1988，Tetrahedron Lett.293853-3856)；四唑(Zabrocki等人，1988，J.Am.Chem.Soc.1105875-5880)；DTC(Samanen等人，1990，Int.J.ProteinPep.Res.35501-509)；和Olson等人，1990，J.Am.Chem.Sci.112323-333和Garvey等人，1990，J.Org.Chem.56436中教导的类似物。在Kahn的美国专利5440013(出版于1995年8月8日)中描述了β-转角的和β-凸起的构象限制模拟物。
本发明还提供本发明多肽或肽的修饰或衍生方法。肽的修饰对普通技术人员来说是公知的，并且包括磷酸化、羧甲基化和酰化。修饰可通过化学或酶方式来进行。在另一方面，可以制备糖基化或脂肪酰化的肽衍生物。在本领域中，糖基化或脂肪酰化的肽的制备方法是公知的。也可以制备脂肪酰基肽衍生物。例如但不限于，游离氨基(N-末端的或赖氨酰基上的)可被酰化，如十四烷酰化。在另一实施方案中，可以将包含结构式为-(CH2)nCH3的脂族侧链的氨基酸引入肽中。适于本发明使用的这种和其它肽-脂肪酸缀合物公开于英国专利GB8809162.4、国际专利申请PCT/AU89/00166和上文中的参考文献5中。
在编码这种多肽的核酸中可以进行突变使特定的密码子改变为编码不同氨基酸的密码子。这种突变通常通过改变尽可能最少的核苷酸来进行。这种类型的取代突变可被进行而使所得蛋白质中的氨基酸以非保守的方式(即，由属于具有特定大小或特性的氨基酸类别的氨基酸的密码子改变为属于另一类别的氨基酸所特有的密码子)或以保守方式(即，由属于具有特定大小或特性的氨基酸类别的氨基酸的密码子改变为属于相同类别的氨基酸所特有的密码子)改变。这种保守改变通常使所得蛋白质的结构和功能上发生较少的变化。非保守改变更有可能改变所得蛋白质的结构、活性或功能。应当认为本发明包括含有不明显改变所得蛋白质活性或结合特性的保守改变的序列。序列中氨基酸的取代可选自该类氨基酸的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组胺酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。不希望这种变化影响通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的表现分子量或等电点。
特别优选的取代为-Lys取代Arg和Arg取代Lys，这样的取代可保持正电荷；-Glu取代Asp和Asp取代Glu，这样的取代可保持负电荷；-Ser取代Thr，这样的取代可保持游离的-OH；和-Gln取代Asn，这样的取代可保持游离的NH2。
合成的DNA序列允许方便构建表达类似物或“突变蛋白”的基因。Noren等人，Science，244182-188(1989年4月)描述了将非天然氨基酸定点引入蛋白质中的一般方法。该方法可用于产生基于非天然氨基酸的类似物。
在本发明中，可以使用本领域常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在文献中充分说明了这些技术。例如，参见Sambrook等人，“Molecular CloningA Laboratory Manual”(1989)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”I-III卷[Ausubel，R.M.，ed.(1994)]；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”I-III卷[J.E.Celis，ed.(1994)]；“Current Protocols in Immunology”I-III卷[Coligan，J.E.，ed.(1994)]；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait ed.1984)；“Nucleic AcidHybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；“TranscriptionAnd Translation”[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)]；“Animal CellCulture”[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“Immobilized Cells AndEnzymes”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“A Practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)。
在另外的实施方案中，焦谷氨酸可作为肽的N-末端残基包含在内。尽管焦谷氨酸经不起通过Edman降解所得序列的检验，但是通过将取代仅限制到所给出的具有N-末端焦谷氨酸的珠粒上的50％的肽，珠粒上仍将保留足够的非焦谷氨酸的肽。普通技术人员会容易地意识到该技术可用于任何在N-末端掺入耐受Edman降解的残基的肽的测序。下文详细描述了表征表现出所需活性的各个肽的其它方法。在50％肽中存在特定的N-末端基团时，含有被保护的N-末端基团如焦谷氨酸的肽的具体活性会通过比较完全(100％)被保护的肽与未被保护(0％)的肽的活性将会容易地得到证明。
用于衍生化的化学部分适于衍生化的化学部分可选自水溶性聚合物中。所选择的聚合物应当是水溶性的以便其连接的成分不会沉淀在水性环境如，生理环境中。优选地，对于成品制剂的治疗使用来说，聚合物将是可药用的。本领域技术人员能够根据诸如聚合物/成分缀合物是否将在治疗上使用之类的考虑来选择所需的聚合物，如果用于治疗，则要考虑所需剂量、循环时间、对蛋白水解作用的耐受性以及其它因素。对于本发明的一种或多种成分来说，使用本文提供的测定方法是可以确定的。
例如，水溶性聚合物可选自聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可能在生产中具有优势。
聚合物可以具有任意的分子量，并且可以是分枝的或不分枝的。就聚乙二醇来说，为了易于操作和制备，优选的分子量在约2kDa到约100kDa之间(术语“约”表示在聚乙二醇的制备中一些分子比所述的分子量更重而另一些则更轻)。可使用其它大小的聚乙二醇，这取决于所需的治疗全貌(如，所需的持续释放期，对生物活性的影响，如果有的话，操作的难易度，抗原性的有无或大小和聚乙二醇对治疗性蛋白或类似物的其它已知影响)。
如此连接的聚合物分子的数量是可变的，并且本领域技术人员能够确定其对功能的影响。可以对相同或不同的化学部分(例如，聚合物，如不同重量的聚乙二醇)进行单衍生化，或者可以将衍生作用进行二、三、四或某些组合。聚合物分子与一种或多种成分分子的比例是可变的，它们在反应混合物中的浓度也是可变的。一般来说，最佳比(从反应的效率来说，没有过量的未反应的一种或多种成分和聚合物)将通过各种因素来确定，如所需的衍生化程度(如，单、二、三等)、所选聚合物的分子量、聚合物是分枝的还是不分枝的以及反应条件。
聚乙二醇分子(或其它化学部分)应当连接到一种或多种成分上，所述成分被认为对蛋白质的功能性或抗原性区域有影响。对本领域技术人员来说，有许多可以使用的连接方法，如参见引入本文供参考的EP0401384(PEG偶合到G-CSF上)，也可参见Malik等人，1992，Exp.Hematol.201028-1035(报告了用tresyl chloride使GM-CSFpegylation)。例如，聚乙二醇可以经氨基酸残基通过反应基团如游离氨基或羧基来共价结合。反应基团是那些可以与活化的聚乙二醇分子结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基和N-末端的氨基酸残基；具有游离羧基的氨基酸残基包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C-端的氨基酸残基。巯基也可用作连接聚乙二醇分子的反应性基团。出于治疗目的，连接在氨基上是优选的，如连接在N-末端或赖氨酸基团上。
本发明提供一种分离的核酸，它编码有含有胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列的多肽。本发明提供一种分离的核酸，它编码含有如图2所述的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，核酸是SEQ ID NOS 12，14-17和19-21所述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。核酸是DNA、cDNA、基因组DNA、RNA。另外，分离的核酸可有效地连接到RNA转录的启动子上。期待使用该核酸来竞争性抑制凝集素活性。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘粒。可与另一DNA节段连接以便复制所连接的节段。
“DNA”指以其单股形式或双股螺旋存在的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，并且不将它限制到任何特定的三级结构。因此，该术语包括双股DNA，特别是在线性DNA分子(如限制片段)、病毒、质粒和染色体中发现的。在特定双股DNA分子结构的讨论中，本文可按照仅在沿DNA的非转录股(即，具有与mRNA同源序列的股)的5’到3’方向上给出序列的正常惯例来描述序列。
当表达控制序列控制和调节DNA序列的转录和翻译时，将DNA序列“有效地连接”到表达控制序列上。术语“有效地连接”包括在被表达的DNA序列前面具有合适的起始信号(如，ATG)和维持正确的读框以允许在表达控制序列的控制下表达DNA序列并产生由该DNA序列编码的所需产物。如果需要插入重组DNA分子中的基因不含有合适的起始信号，则可以将这样的起始信号在该基因前面插入。
另外，本发明也提供包含上述核酸分子的载体。启动子可以是或者等同于细菌、酵母、昆虫或哺乳动物的启动子。另外，载体可以是质粒、粘粒、酵母人造染色体(YAC)、噬菌体或真核病毒DNA。
可以使用可用于表达蛋白的本领域已知的其它为数众多的载体骨架。这些载体包括但不限于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、猿猴病毒40(SV40)、巨细胞病毒(CMV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、莫洛尼鼠类白血病病毒、DNA递送系统，即脂质体和表达质粒递送系统。此外，一类载体包含由病毒衍生的DNA元件，病毒如牛乳头瘤病毒、多形瘤病毒、杆状病毒、逆转录病毒或Semliki Forest病毒。这些载体可以商购或者由所述序列通过本领域公知的方法来装配。
本发明也提供生产多肽的宿主载体系统，它包含合适宿主细胞的载体。合适的宿主细胞包括但不限于原核细胞或真核细胞，如细菌细胞(包括革兰氏阳性细胞)、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞和动物细胞。许多哺乳动物的细胞都可用作宿主，包括但不限于小鼠成纤维细胞NIH 3T3、CHO细胞、HeLa细胞、Ltk细胞、Cos细胞等。
在表达本发明的DNA序列中，可以采用各种各样的宿主/表达载体的组合。例如，有用的表达载体可以由染色体、非染色体和合成DNA序列的节段组成。合适的载体包括SV40和已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒col E1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物，质粒如RP4的衍生物；噬菌体DNAS，如噬菌体λ的各种衍生物，如NM989，和其它噬菌体DNA，如M13和丝状单股噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；真核细胞中可以使用的载体，如在昆虫或哺乳动物细胞中可以使用的载体；由质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体，如已被修饰以利用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒等。
可在这些载体中使用各种各样的表达控制序列-控制与其有效连接的DNA序列的表达的序列-来表达本发明的DNA序列。这些可以使用的表达控制序列包括如SV40、CMV、牛痘、多形瘤或腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶(如，Pho5)的启动子、酵母α-交配因子的启动子和其它已知的控制原核细胞或真核细胞或其病毒基因表达的序列及其各种组合。
各种各样的单细胞宿主细胞也可以用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可包括公知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌如酵母的菌株和动物细胞如CHO，R1.1，B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(如，COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(如，SF9)和组织培养中的人细胞和植物细胞。
应该理解对于表达本发明的DNA序列来说不是所有的载体、表达控制序列和宿主都能发挥同样好的功能。即使表达系统相同所有宿主也不能发挥同样好的功能。然而，在不脱离本发明范围的情况下，本领域技术人员不需要过多的实验就能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主来完成所需的表达。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，因为载体必须在宿主中发挥功能。也应考虑载体的拷贝数目、控制拷贝数目的能力和载体所编码的任何其它蛋白的表达，如抗生素标记物。
在选择表达控制序列时，通常将考虑各种因素。例如，这些因素包括系统的相对强度、其控制能力及其与被表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别是考虑潜在的二级结构。将通过考虑下列因素来选择合适的单细胞宿主如，它们与所选载体的相容性、其分泌特性、其正确折叠蛋白的能力、其发酵的要求以及对被表达的DNA序列所编码的产物的宿主的毒性和表达产物纯化的难易。
本发明进一步提供一种制备多肽的方法，它包括使上述宿主载体系统在适宜的允许多肽产生的条件下生长并回收所产生的多肽。
本发明进一步提供一种能够特异性识别分离的多肽或与其结合的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。此外，所述抗体可以用可检测的标记物标记，所述标记物是放射性的、可比色的、荧光的或发光的标记物。所述标记抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，所述标记抗体是纯化的标记抗体。标记抗体的方法是本领域公知的。
术语“抗体”的实例包括天然存在的和非天然存在的抗体。具体地说，术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体及其片段。此外，术语“抗体”包括嵌合抗体和全合成抗体及其片段。所述抗体包括但不限制于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和Fab表达文库。
可以使用本领域已知的各种方法来制备多肽或其衍生物或类似物的多克隆抗体(例如，参见抗体--实验室手册，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，NewYork，1988)。为了制备抗体，可通过给各种宿主动物注射截取的CbpA或其衍生物(例如片段或融合蛋白)使其被免疫，所述宿主动物包括但不限制于兔子、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案中，可将多肽缀合到免疫原性载体，例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)上。依赖于宿主的种类，各种佐剂可用于增强免疫反应。
为了制备单克隆抗体或其片段、其类似物或其衍生物，可使用由任何在培养物中的传代细胞系产生抗体分子的技术(例如，参见抗体--实验室手册，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York，1988)。这些技术包括但不限制于最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(1975，Nature 256495-497)以及trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，今日免疫学472)和制备人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本发明另一实施方案中，可在无菌动物中，利用最新技术(PCT/US90/02545)生产单克隆抗体。按照本发明，人抗体可使用并且可通过使用人杂交瘤(Cote等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2023)或通过在体外用EBV病毒转化人B细胞(Cole等人，1985，单克隆抗体和癌症治疗，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)获得。事实上，按照本发明，可使用所开发的通过将对多肽具有特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适宜的生物活性的人抗体分子的基因拼接起来制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，J.Bacteriol.159-870；Neuberger等人，1984，Nature 312604-608；Takeda等人，1985，Nature 314452-454)；所述抗体包含在本发明范围内。所述人或人源化嵌合抗体优选用于治疗人类疾病(如下所述)，因为人或人源化抗体比异种抗体诱导免疫反应，特别是其本身的过敏反应的可能性要小得多。本发明另一实施方案是利用构建Fab表达文库中所述的技术(Huse等人，1989，Science 2461275-1281)来快速和方便地鉴定具有所需的对多肽的特异性的单克隆Fab片段、或其衍生物或类似物。
包含抗体分子独特型的抗体片段可通过已知技术来产生。例如，这些片段包括但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段；可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab’片段和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。
在抗体的产生中，可通过本领域已知的技术来筛选所需抗体，如，放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉积素反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(如，凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测原发抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测继发抗体或试剂与原发抗体的结合来检测原发抗体。在另一实施方案中，标记继发抗体。本领域中已知有多种免疫测定中检测结合的方法并且在本发明的范围之内。
为了在体外进行检测，可用标记物标记抗体，标记物如酶、荧光团、发色团、放射性同位素、染料、胶体金、乳胶粒和化学发光剂。另外，为了在体内进行检测，可用如放射性同位素(优选锝或碘)；磁共振位移试剂(如钆和锰)；或不透射线的试剂来标记抗体。
这些研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、当暴露于紫外光下时有荧光的化学药品等。许多荧光材料都是已知的并且可用作标记物。它们包括如荧光素、若丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。具体的检测材料是在山羊中制备的并经异硫氰酸酯与荧光素缀合的抗兔抗体。多肽也可用放射性元素或用酶标记。可通过目前可利用的计数方法来检测放射性标记物。优选的同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
同样也可以使用酶标记物并且可通过任何目前采用的比色、分光光度、荧光分光光度、电流或气流技术来检测。通过与桥接分子如碳化二亚胺、异硫氰酸酯、戊二醛等反应，将酶与所选颗粒缀合。在这些方法中可以使用的许多酶都是已知的并且可以使用。优选的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。通过举例的方式提及美国专利3654090、3850752和4016043中公开了候补的标记材料和方法。
在本发明的另一实施方案中，可以制备适于医学专家使用的商购试验试剂盒以确定预定的结合活性或者预定的与被怀疑的靶细胞结合活性能力的存在或缺乏。根据以上所讨论的试验技术，一类试剂盒至少包含标记的多肽或其结合配对物，例如其特异性抗体和用法说明，当然，这取决于所选方法，如“竞争性的”、“夹心的”、“DASP”等。该试剂盒也可以包含外围试剂如缓冲剂、稳定剂等。
因此，可以制备证明有利于预定的细菌结合活性的细胞的存在或能力的试验试剂盒，它包含(a)预定量的至少一种标记的免疫化学反应性成分，该成分是通过将本发明的多肽或其特异性结合配对物直接或间接连接到可检测标记物上获得的；(b)其它试剂；和(c)使用所述试剂盒的说明。
本发明提供拮抗剂或阻断剂，它包括但不限于肽片段、模拟物、核酸分子、核酶、多肽、小分子、碳水化合物分子、单糖、寡糖或抗体。本发明也包括竞争性阻断或抑制肺炎球菌的药剂。本发明提供一种药剂，它包含无机化合物、核酸分子、寡核苷酸、有机化合物、肽、肽模拟化合物或抑制该多肽的蛋白质。
本发明提供一种疫苗，它包含具有SEQ ID NOS1，3-7，9-11，22和23中所述氨基酸序列的多肽和可药用佐剂或载体。所述多肽可包含图2所述的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。本发明提供一种疫苗，它包含多肽和可药用佐剂或载体，所述多肽具有包含图2所述保留区的氨基酸序列。例如，保留区包括但不限于氨基酸序列158-172；300-321；331-339；355-365；367-374；379-389；409-427和430-447。本发明提供一种疫苗，它包含编码该多肽的分离的核酸和可药用佐剂或载体。
可通过用免疫原量的多肽或其衍生物或片段和佐剂进行免疫(接种疫苗)来诱导抗革兰氏阳性菌，特别是肺炎球菌的自动免疫，其中所述多肽或其抗原衍生物或片段是所述疫苗的抗原组分。
可在与制备疫苗的佐剂的混合物中制备本发明多肽或其衍生物或片段。优选地，用作所述疫苗抗原组分的本发明多肽的衍生物或其片段是粘附素。更优选地，用作所述疫苗抗原组分的多肽或肽衍生物或其片段是与所有或很多革兰氏阳性菌种的菌株共有的或与密切相关的细菌菌种共有的抗原。最优选地，所述疫苗的抗原组分是粘附素，它是一种共同抗原。
可通过本领域已知的方法，例如转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶菌体融合)、基因枪的应用或DNA载体转运蛋白，将包含本发明以核酸为主药的疫苗的载体引入需要的宿主(例如参见Wu等人，1992，J.Biol.Chem.267963-967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.26314621-14624；Hartmut等人，1990年3月15日中请的加拿大专利申请2,012,311)。
所述疫苗可通过任何非肠道途径给药，所述非肠道途径包括但不限制于肌肉内、腹膜内、静脉内等。优选地，因为理想的疫苗接种结果是阐明与抗原并因此与病原生物体的免疫反应，所以直接或通过寻靶或选择病毒载体间接给予到淋巴组织，例如淋巴结或脾是理想的。因为免疫细胞在不断地复制，所以它们是以逆转录病毒载体为主药的核酸疫苗的理想的靶细胞，因为逆转录病毒需要复制细胞。
可通过将抗本发明多肽的抗血清、多克隆抗体或中和单克隆抗体给予怀疑受到革兰氏阳性菌，优选链球菌，并且更优选肺炎球菌感染的受治疗动物而使该动物获得被动免疫。尽管被动免疫不会带来长期的保护作用，但它可能是治疗尚未接种疫苗的受治疗者细菌感染的有价值的工具。对于革兰氏阳性抗生素耐药菌株的治疗来说，被动免疫是特别重要的，因为没有其它治疗可以利用。优选地，所给予的用于被动免疫治疗的抗体是自体抗体。例如，如果所述受治疗者是人，为了使针对抗体的免疫反应的可能性降低到最小，优选地，所述抗体是由人体获得的或者是“人源化的”。本发明主动性或被动性疫苗或给予粘附素可用于保护受治疗动物使其免受革兰氏阳性菌，优选链球菌，并且更优选肺炎球菌的感染。
本发明提供一种药物组合物，它包含一定量本文所描述的多肽和可药用载体或稀释剂。
例如，这种用于阻止肺炎球菌附着到粘膜表面的药物组合物可包括抗凝集素区和/或可溶性过剩凝集素区蛋白质的抗体。通过任一机理阻断附着都能阻断感染的最初步骤，由此减少移生作用。这又转过来减少人与人之间的传播并预防症状性疾病的发展。
本发明提供一种诱导已经接触到或感染了肺炎球菌的受治疗者的免疫反应的方法，它包括给予所述受治疗者一定量的药物组合物，由此诱导免疫反应。
本发明提供一种预防受治疗者被肺炎球菌感染的方法，它包括给予所述受治疗者一定量的阻止肺炎球菌附着有效量的药物组合物，由此预防肺炎球菌感染。
本发明提供一种预防受治疗者被肺炎球菌感染的方法，它包括给予所述受治疗者一定量预防包含抗体和可药用载体或稀释剂的药物组合物，由此预防肺炎球菌感染。
本发明提供一种治疗感染了或接触到肺炎球菌的受治疗者的方法，它包括给予所述受治疗者治疗有效量本发明的疫苗，由此治疗所述受治疗者。
本发明提供一种抑制已经接触到或感染了肺炎球菌的受治疗者宿主细胞移生的方法，它包括给予所述受治疗者一定量的包含由SEQ IDNOS 1，3-5，7或9-11中所述氨基酸序列组成的多肽的药物组合物，由此诱导免疫反应。所述阻断移生作用的治疗性肽是由呼吸粘膜递送的。包含由图2中所述氨基酸序列组成的多肽的药物组合物。
本文所使用的“药物组合物”是指通过例如阻止肺炎球菌移生提供治疗效果或益处的、治疗有效量的本发明多肽产品以及适宜的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂和/或载体。本文所使用的“治疗有效量”是指提供对所述疾病治疗效果和给药方案的量。所述组合物是液体或冻干或用其它方法干燥的制剂并且包括由各种缓冲剂内含物(例如Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子浓度组成的稀释剂、添加剂如阻止表面吸收的白蛋白或明胶、去污剂(例如吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如、硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯类)、填充物质或张力调节剂(例如乳糖、甘露糖醇)、聚合物如聚乙二醇共价连接到蛋白质上、与金属离子络合或将所述物质掺入聚合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的特定制剂中或加到其上、或者加到脂质体、微乳液、微团、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。所述组合物将影响治疗剂的物理状态、溶解度、稳定性、体内释放率和体内清除率。组合物的选择将依赖于具有治疗活性的蛋白质的物理或化学性质。例如，由膜结合型活性物衍生的产物可能需要含去污剂的制剂。控释或缓释组合物包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明也包括由聚合物(例如泊咯沙姆或poloxamines)包被的微粒组合物和偶联到针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体上或偶联到组织特异性受体的配体上的活性物。本发明组合物的其它实施方案包括微粒形式的保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂用于各种途径包括非肠道、肺、鼻和口服给药。
此外，本文所使用的“可药用载体”是本领域技术人员公知的并且包括但不限制于0.01-0.1M并且优选0.05M的磷酸盐缓冲剂或0.8％的盐水。因此，所述可药用载体可以是水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、悬浮液或乳液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂如那些以林格氏葡萄糖为主药的电解质补充剂等。也可以存在防腐剂和其它添加剂如抗微生物剂、抗氧化剂、对照剂、惰性气体等。
术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。佐剂可充当缓慢释放抗原的组织库并且也可以充当非特异性增强免疫反应的淋巴系统激活剂(Hood等人，Immunology，Second Ed.，1984，Beniamin/CummingsMenlo Park，California，p.348)。通常，在不存在佐剂的情况下，单独用抗原进行初级激发将不能引起体液或细胞免疫反应。佐剂包括但不限制于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂甙、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)。优选地，所述佐剂是可药用的。
控释或缓释组合物包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明也包括由聚合物(例如泊咯沙姆或poloxamines)包被的微粒组合物和偶联到针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体上或偶联到组织特异性受体的配体上的化合物。本发明组合物的其它实施方案包括微粒形式的保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂用于各种途径包括非肠道、肺、鼻和口服给药。
当给药时，化合物通常迅速从粘膜表面或循环中清除并且因此可引起相对短效的药理学活性。所以，要求经常给予相对大剂量的生物活性化合物来维持疗效。已知通过共价连接水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素钠、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸修饰的化合物在静脉注射后明显显示比相应的未修饰化合物更长的半衰期(Abuchowski等人，1981；Newmark等人，1982；和Katre等人，1987)。该修饰也可以增加所述化合物在水溶液中的溶解度、消除聚集作用、增强化合物的物理和化学稳定性并且大大降低化合物的免疫原性和反应性。结果，与未修饰化合物相比，可通过给予更少次数或更低剂量的所述聚合物-化合物加合物获得所需要的体内生物学活性。
剂量足够的量包括但不限制于大约为1μg/kg-1000mg/kg。所述量可以为10mg/kg。组合物的可药用形式包括可药用载体。
如上所述，本发明提供包含药物组合物的治疗组合物，其中所述药物组合物包含载体、疫苗、多肽、核酸和抗体、抗-抗体和与肺炎球菌竞争病原活性如附着到宿主细胞上的药剂。
包含活性组分的治疗组合物的制备是本领域公知的。典型地，所述组合物可制备成递送到鼻咽部的多肽气雾剂或可注射的液体溶液或悬浮液，然而，也可以制备成适用于在注射前溶于或悬浮于液体中的固体形式。该制剂也可以被乳化。通常，将活性治疗成分与可药用并且可与活性成分相容的赋形剂混合。例如适宜的赋形剂是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，所述组合物可包含少量增强活性成分有效性的辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂。
可将活性组分配制成以中和的可药用盐形式存在的治疗组合物。可药用盐包括酸加成盐(用多肽或抗体分子的游离氨基形成的)，它是与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的。由游离羧基形成的盐也可以衍生于无机碱如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物或有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
当组合物中至少大约75％(重量)的所述蛋白质、DNA、载体(依赖于A和B所属种类的范畴)是“A”时，包含“A”(其中“A”是单一的蛋白质、DNA分子、载体等)的组合物基本上不含“B”(其中“B”包含一个或多个污染蛋白质、DNA分子、载体等)。优选地，在组合物中，“A”包含至少大约90％(重量)的A+B，最优选地，至少大约99％(重量)。
本文所使用的术语“治疗有效量”是指足够减少至少大约15％，优选至少大约50％，更优选至少大约90％并且最优选预防宿主的活性、功能和反应方面的临床上明显不足的量。另外，治疗有效量足够引起宿主临床上明显病症的改善。在本发明的上下文中，宿主反应方面的不足可由持续或传播细菌感染来证明。宿主临床上明显病症的改善包括细菌载荷的减少、细菌从移生的宿主细胞中的清除、与感染有关的发烧或炎症的减少或者与细菌感染有关的任何症状的减少。
按照本发明，可通过非肠道、透过粘膜，例如通过口、鼻、肺或直肠，或者透皮引入本发明治疗组合物的成分。优选地，给药途径是非肠道的，例如通过静脉内注射并且也包括但不限制于动脉内、肌肉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。可优选通过口或肺递送来激活粘膜免疫；因为肺炎球菌通常移生在鼻咽和肺粘膜中，所以粘膜免疫可能是特别有效的预防性治疗。当在本发明治疗组合物中使用时，术语“单位剂量”是指适宜作为单次剂量用于人的物理上分立的单位，各单位包含为产生所需要治疗效果而计算的预定量的活性物质和所需要的稀释剂，即载体。
在另一实施方案中，所述活性化合物可在泡囊特别是脂质体中递送(参见Langer，科学2491527-1533(1990)；Treat等人，脂质体在传染病和癌症的治疗中，Lopez-Berestein和Fidler(编者)，Liss，纽约，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，出处同上，pp.317-327；参见上文)。
在另一实施方案中，所述治疗化合物可在控释系统中递送。例如，可利用静脉输注、可植入的渗透泵、透皮贴片、脂质体或其它给药方式给予所述多肽。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，如上所述；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等人，外科88507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一实施方案中，可使用高分子材料(参见控释的医学应用，Langer和Wise(编者)，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1974)；控释药物的生物利用度、药品设计和性能，Smolen和Ball(编者)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也参见Levy等人，科学228190(1985)；During等人，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一实施方案中，可将控释系统放置在治疗靶，即脑的附近，因此仅需要小部分所述系统剂量(例如参见Goodson，控释的医学应用，如上所述，vol.2，pp.115-138(1984))。优选地，将控释装置引入治疗对象不适宜免疫激活部位或肿瘤的附近。在Langer的评论中讨论了其它控释系统(科学2491527-1533(1990))。
优选地，以给予上述活性组分作为细菌感染有效治疗方案的治疗对象是人，但是也可以是任何动物。因此，本领域的普通技术人员都能迅速领会，本发明所述方法和药物组合物特别适于给予任何动物，特别是哺乳动物并且包括但不限制于家养动物如猫或犬，农场动物如但不限制于牛、马、山羊、绵羊和猪，野生动物(不管是野外的还是在动物园中的)，研究动物如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、猪、狗、猫等，即供兽医使用。
在本发明治疗方法和组合物中，提供治疗有效剂量的活性组分。治疗有效剂量可由普通医学工作者根据病人的特点(年龄、体重、性别、状况、并发症，其它疾病等)确定，这是本领域技术人员公知的方法。此外，随着进行其它常规研究，将出现有关治疗各种病人各种疾病适宜的剂量水平的更具体的资料，并且根据治疗情况、被治疗者的年龄和一般健康状况，普通技术人员能够确定适宜的给药剂量。通常，对于静脉内注射或输注来说，剂量可以低于腹膜内、肌肉内或其它给药途径。给药计划表可依赖于循环半衰期和所使用的制剂而改变。将治疗有效量的所述组合物以与剂量制剂相容的方式给予。所需要给予的活性组分的精确量依赖于医师的判断并且是每个个体所特有的。然而，适宜的剂量可大约为每天每公斤体重0.1-20，优选大约为0.5-10并且更优选1-几微克活性组分并且依赖于给药途径。适宜的初次给药和加强注射的方案也是可改变的，但是其特征是在初次给药后，间隔一小时或多小时，通过随后注射或其它给药途径给予多次量。或者，可以考虑连续静脉内输注的方法来足以维持血中10纳摩尔-10微摩尔的浓度。
与其它化合物一起给予就细菌感染的治疗而言，可以与一种或多种用于治疗细菌感染的药物组合物一起给予本发明活性组分，所述药物组合物包括但不限制于(1)抗生素；(2)细菌粘附素的可溶性碳水化合物抑制剂；(3)细菌粘附素的其它小分子抑制剂；(4)细菌代谢、转运或转化的抑制剂；(5)细菌溶胞的刺激物或(6)针对其它细菌抗原上的抗菌抗体或疫苗。其它有效的活性组分包括抗炎剂如甾体或非甾体抗炎药物。可同时给药(例如本发明活性组分和抗生素混合物的给予)，或者可依次给药。
因此，在具体的实施方案中，所述治疗组合物可进一步包括治疗有效量的活性组分和一种或多种下列活性组分抗生素、甾族化合物等。制剂的实例如下制剂静脉内制剂I组分 mg/ml头孢噻肟 250.0多肽 10.0葡萄糖USP45.0亚硫酸氢钠USP3.2
乙二胺四乙酸二钠USP0.1注射用水适量加至 1.0ml静脉内制剂II组分 mg/ml氨苄青霉素 250.0多肽 10.0亚硫酸氢钠USP 3.2乙二胺四乙酸二钠USP0.1注射用水适量加至 1.0ml静脉内制剂III组分 mg/ml庆大霉素(硫酸盐) 40.0多肽 10.0亚硫酸氢钠USP 3.2乙二胺四乙酸二钠USP0.1注射用水适量加至 1.0ml静脉内制剂IV组分 mg/ml多肽 10.0葡萄糖USP 45.0亚硫酸氢钠USP 3.2乙二胺四乙酸二钠USP0.1注射用水适量加至 1.0ml静脉内制剂V组分 mg/ml多肽拮抗剂 5.0亚硫酸氢钠USP 3.2
乙二胺四乙酸二钠USP 0.1注射用水适量加至 1.0ml因此，在要求减少或抑制由细菌介导的细菌与宿主细胞、或其抗体、或其配体或该配体的抗体结合引起的感染的特定实例中，引入多肽来阻断细菌与宿主细胞的相互作用。
本文也考虑通过肺递送本发明的具有凝集素活性并且发挥本发明粘附素抑制剂(或其衍生物)作用的多肽。将粘附素抑制剂(或其衍生物)递送到哺乳动物的肺中，在肺中，它能干扰细菌，即链球菌并且优选肺炎球菌与宿主细胞结合。在本领域发现了其它关于通过肺递送的蛋白质制剂的报道[Adjei等人，药物研究，7565-569(1990)；Adjei等人，International Journal of Pharmaceutics，63135-144(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人，Journal of Cardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)；143-146(1989)(内皮素-1)；Hubbard等人，Annals of InternalMedicine，Vol.III，pp.206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，J.Clin.Invest.841145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等人，“蛋白质的气雾化作用”，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug DeliveryII，Keystone，Colorado，March，(1990)(重组人生长激素)；Debs等人，J.Immunol.1403482-3488(1988)(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)；Platz等人，美国专利5,284,656(粒细胞集落刺激因子)]。在1995年9月19日颁布给Wong等人的美国专利5,451,569中描述了用于通过肺递送药物的方法和组合物。
所有这样的装置均要求使用适于分配粘附素抑制剂(或其衍生物)的制剂。典型地，各制剂对于所使用的装置类型是特异性的并且除了治疗中所使用的通常的稀释剂、佐剂和/或载体外，可包括应用适宜的推进剂材料。也可以考虑使用脂质体、微囊或微球、包合配合物或其它类型的载体。依赖于化学修饰的类型或所使用装置的类型，也可以将通过化学方法修饰的粘附素抑制剂制备在不同的制剂中。
典型地，适用于利用喷射式或超声波式喷雾器来应用的制剂将包含以每ml溶液大约0.1-25mg生物活性粘附素抑制剂的浓度溶解在水中的粘附素抑制剂(或其衍生物)。所述制剂也可以包括缓冲剂和单糖(例如用于稳定粘附素抑制剂和调节渗透压)。所述喷雾器制剂也可以包含表面活性剂，用于减少或预防形成气雾剂时由溶液雾化引起的粘附素抑制剂在表面聚集。
利用计量剂量的吸入器装置来应用的制剂通常包含细碎的粉剂，其中所述粉剂包含在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中的粘附素抑制剂(或其衍生物)。所述推进剂可以是用于该目的的任何常规物质如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。适宜的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。
液体气雾剂制剂在生理上可接受的稀释剂中包含粘附素抑制剂和分散剂。本发明干粉气雾剂制剂由细碎的固体形式的粘附素抑制剂和分散剂组成。对于液体或干粉气雾剂制剂来说，必须将所述制剂气雾化。即，必须将所述制剂破碎成液体或固体微粒以便确保气雾化的剂量真正到达鼻通道或肺粘膜。本文所使用的术语“气雾剂微粒”用于描述适用于鼻或肺给药，即能够到达粘膜的液体或固体微粒。其它考虑如递送装置的结构、制剂中的其它组分和微粒特点是重要的。通过肺给药的这些特征是本领域公知的并且制剂的使用、雾化方法和递送装置的结构至多要求由本领域普通技术人员进行常规实验。在特定的实施方案中，所述微粒的中数动态直径将为5微米或更小以便确保所述药物微粒到达肺泡[Wearley，L.L.，Crit.Rev.in Ther.Drug CarrierSystems 8333(1991)]。
气雾剂递送系统如加压计量剂量的吸入器和干粉吸入器公开于Newman，S.P.，气雾剂和肺，Clarke，S.W.和Davia，D.(编者)，pp.197-22中并且可与本发明联合使用。
在另一实施方案中，如下文所详细讨论的，本发明的气雾剂制剂除了粘附素抑制剂外，可包括其它治疗学或药理学活性组分，如包括但不限制于抗生素、甾体化合物、非甾体抗炎药等。
液体气雾剂制剂本发明提供用于治疗由细菌，例如链球菌，特别是肺炎球菌感染的患者的气雾剂制剂和剂量形式。通常所述剂量形式在可药用稀释剂中包含粘附素抑制剂。可药用稀释剂包括但不限制于无菌水、盐水、缓冲的盐水、葡萄糖溶液等。在特定实施方案中，可以在本发明或本发明的药物制剂中使用的稀释剂是磷酸盐缓冲的盐水或通常pH在7.0-8.0范围的缓冲的盐水溶液或水。
本发明的液体气雾剂制剂可不包含或包含可药用甾体、稀释剂、增溶剂或乳化剂、表面活性剂和赋形剂。所述制剂可包括载体。所述载体是可溶解在循环系统中并且是生理上可接受的大分子，其中生理可接受是指本领域技术人员允许将所述载体作为治疗方案的一部分注射给患者，优选地，所述载体在循环系统中是相对稳定的，具有适宜的血浆清除半衰期。所述大分子包括但不限制于大豆卵磷脂、油酸和脱水山梨糖醇三油酸酯，优选脱水山梨糖醇三油酸酯。
本实施方案的制剂也可以包括用于维持pH、稳定溶液或用于调节渗透压的其它药剂。所述药剂的实例包括但不限制于盐如氯化钠或氯化钾和碳水化合物如葡萄糖、半乳糖或甘露糖等。
本发明进一步考虑包含粘附素抑制剂和另一种治疗有效药物如抗生素、甾体化合物、非甾体抗炎药等的液体气雾剂制剂。
气雾剂干粉制剂也考虑将本发明的气雾剂制剂制备成包含细碎粉剂形式的粘附素抑制剂和分散剂的干粉制剂。
通过粉末吸入器装置分配的制剂将包括含有粘附素抑制剂(或其衍生物)的细碎干粉并且也可包含促进粉末从装置中分散量如占制剂重量50-90％的填充剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。最有利地，应该将粘附素抑制剂(或其衍生物)制备成平均粒径10mm(或微米)，最优选0.5-5mm的微粒形式以便最有效地递送到远端肺。在另一实施方案中，所述干粉制剂可包括含有粘附素抑制剂、分散剂和填充剂的细碎干粉。与本发明制剂联合使用的填充剂可包含促进粉末从装置中分散量的乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。
本发明进一步考虑包含粘附素抑制剂和另一种治疗有效药物如抗生素、甾体化合物、非甾体抗炎药等的干粉制剂。
本文所涉及的口服固体剂量形式通常描述于Remington’sPharmaceutical Science，18th Ed.1990(Mark Publishing Co.Easton PA18042)第18章，将其引入本文供参考。固体剂量形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、锭剂或糖锭剂、扁囊剂或小药丸。脂质体或类蛋白质包囊也可以用于制备本发明组合物的制剂(例如美国专利4,925,673中报道的类蛋白质微球)。脂质体包囊可以使用并且所述脂质体可用各种聚合物衍生(例如美国专利5,013,556)。Marshall，K.在由G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的Modern Pharmaceutics第10章，1979中描述了治疗剂的可能的固体剂量形式，将其引入本文供参考。通常，所述制剂将包含所述组分(或其通过化学方法修饰的形式)和用于避免胃环境破坏和允许在肠中释放生物活性物质的惰性组分。
特别地，本文也考虑上述衍生组分的口服剂量形式。所述组分可通过化学方法修饰使得经口递送所述衍生物是有效的。通常，所述化学修饰是使至少一个部分连接到所述组分分子上，其中所述部分可能(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠摄入血流中。也期望增加所述组分的整体稳定性和增加体循环时间。所述部分的实例包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，1981，“可溶性聚合物-酶加合物”InEnzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts，编者，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.367-383；Newmark等人，1982，J.Appl.Biochem.4185-189。可使用的其它聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane。如上所述，药用优选的是聚乙二醇部分。
对于所述组分(或其衍生物)来说，释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员可获得在胃中不溶解而在十二指肠或肠道其它部位释放所述物质的制剂。优选地，所述释放将通过保护蛋白质(或其衍生物)或通过将生物活性物质释放到胃环境以外如肠中，避免胃环境的有害作用。
为了确保获得充分的胃耐受性，不能渗透到至少pH5.0环境中的包衣是必需的。用作肠衣的更普通的惰性组分的实例是乙酸偏苯三酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP55、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和虫胶。这些包衣可以以混合膜的形式使用。
包衣或包衣混合物也可用于没有准备好预防被胃环境破坏的片剂。这可以包括糖衣或使片剂容易吞咽的包衣。胶囊剂可由用于递送干治疗剂，即干粉的硬壳(如明胶)组成；对于液体形式的治疗剂来说，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是稠淀粉或其它可食用纸。对于丸剂、锭剂、模压片或片剂的磨碎物来说，可以使用湿法制粒技术。
肽治疗剂可以以颗粒或粒径大约为1mm的小药丸形式包含在由细小的多粒子组成的制剂中。通过胶囊给药的所述物质的制剂也可以是粉剂、轻轻压制的充填剂或者甚至可以是片剂。可通过压制法制备治疗剂。
也可以包含着色剂和调味剂。例如，可将蛋白质(或其衍生物)制备成制剂(如通过脂质体或微球包囊)，然后进一步包含在可食用产品，如含有着色剂和调味剂的冷藏饮料中。
可以用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，特别是甘露糖醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些可通过商业渠道获得的稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在固体剂量形式的治疗剂制剂中可包含崩解剂。用作崩解剂的材料包括但不限制于淀粉，包括以淀粉为基础的商业用崩解剂Explotab。也可以使用羟基乙酸淀粉钠、安伯来特、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉、藻酸钠、明胶、桔子皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵状物和膨润土。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶可用作崩解剂和粘合剂并且这些可包括粉状树胶如琼脂、卡拉牙胶或西黄耆胶。藻酸及其钠盐也可以用作崩解剂。粘合剂可用于将治疗剂粘合在一起形成硬片剂并且包括来自天然产物如阿拉伯胶、西黄耆胶、淀粉和明胶的材料。其它的粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可在乙醇溶液中用于将治疗剂制粒。
在治疗剂的制剂中可包含润滑剂用于预防在制备制剂过程中发生粘着。可在治疗剂和模具壁之间使用一层润滑剂，并且这些润滑剂包括但不限制于硬脂酸包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用水溶液润滑剂如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可加入助流剂，它可以改善药物在制备制剂过程中的流动性并且有助于压片过程中的重排。助流剂可包括淀粉、滑石粉、焦二氧化硅和水合硅铝酸盐。
为了有助于治疗剂溶解到水环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠和二辛基磺酸钠。也可以使用阳离子去污剂并且可包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可作为表面活性剂包含在制剂中的潜在的非离子去污剂包括lauromacrogol 400、polyoxyl 40 stearate、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯，多乙氧基醚40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或以不同比例的混合物形式存在于蛋白质或其衍生物的制剂中。
例如潜在地增强多肽(或其衍生物)摄取的添加剂是脂肪酸如油酸、亚油酸和亚麻酸。
肺递送本文也考虑通过肺递送本发明的多肽(或其衍生物)。当吸入时，所述多肽(或其衍生物)被递送到哺乳动物的肺中并且覆盖肺泡的粘膜表面。有关这方面的其它报道包括Adjei等人，1990，药物研究，7565-569；Adjei等人，1990，International Journal of Pharmaceutics，63135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人，1989，Journal ofCardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)143-146(内皮素-1)；Hubbard等人，1989，Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212(a1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，1989，J.Clin.Invest.841145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等人，1990，“蛋白质的气雾化”，Proceedings ofSymposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重组人生长激素)；Debs等人，1988，J.Immunol.1403482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子-α)和Platz等人，美国专利5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。在1995年9月19日颁发给Wong等人的美国专利5,451,569中描述了用于通过肺递送药物的方法和组合物。
在本发明实施中考虑使用各种用于通过肺递送治疗剂产品的机械装置，包括但不限制于雾化器、计量剂量的吸入器和粉剂吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。
典型地，适用于利用喷射式或超声波式喷雾器来应用的制剂将包含以每ml溶液大约0.1-25mg生物活性蛋白质的浓度溶解在水中的多肽(或其衍生物)。所述制剂也可以包含缓冲剂和单糖(例如用于稳定蛋白质和调节渗透压)。所述喷雾器制剂也可以包含表面活性剂，用于减少或预防形成气雾剂时由溶液雾化引起的蛋白质在表面聚集。
利用计量剂量的吸入器装置来应用的制剂通常包含细碎的粉剂，其中所述粉剂包含在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中的多肽(或其衍生物)。所述推进剂可以是用于该目的的任何常规材料如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。适宜的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。
由粉末吸入器装置分配的制剂将包括含有多肽(或其衍生物)的细碎干粉并且也可包含促进粉末从装置中分散量，例如占制剂重量的50-90％的填充剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。最有利地，应该将蛋白质(或其衍生物)制备成平均粒径为10mm(或微米)，最优选0.5-5mm的微粒形式以便最有效地递送到远端肺中。
鼻递送本文也考虑通过鼻或鼻咽递送多肽(或其衍生物)。通过鼻递送使得在将治疗剂产品给予到鼻后，多肽直接通过上呼吸道粘膜，不必使所述产品沉积在肺中。用于通过鼻递送的制剂包括与葡聚糖或环糊精形成的制剂。
下列实施例用于更充分地说明本发明的优选实施方案。然而，它们不以任何方式限制本发明范围。
实验细节部分实施例1胆碱结合蛋白A(CbpA)的肽截取物产生包含CbpA N-末端截取片段的多肽(血清型4)。用PCR引物SJ533和SJ537扩增全长CbpA，基于CbpA多肽衍生的N-末端氨基酸序列来设计引物。5’正向引物SJ533＝5’GGC GGA TCC ATG GA(A，G)AA(C，T)GA(A，G)GG3’。这种简并引物是由氨基酸序列XENEG设计的，结合有BamHI和NcoI限制位点以及ATG起始密码子。3’反向引物SJ537＝5’GCC GTC GAC TTA GTT TAC CCA TTC ACCATT GGC 3’。该引物结合有SalI限制位点以便克隆，并且结合有来自CbpA的天然终止密码子，该引物基于4型和R6x序列。
在50℃退火温度下用高保真性酶(Boehringer Mannheim)以及用引物SJ533和SJ537扩增30次来由作为模板的基因组DNA产生PCR产物。所得PCR产物用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.)纯化，然后用BamHI和SalI限制酶消化并克隆到用BamHI、XbaI和SmaI限制酶消化的pQE30表达载体(Qiagen，Inc.)中。多肽R2利用位于第二重复区(即，图1所示的C区)末端的天然存在的PvuII位点(4型序列的核酸1228)来产生CbpA基因的截取形式，仅仅含有该基因的5’部分。为了产生截取克隆，用PvuII和XbaI消化全长克隆PMI580(4型)或PMI581(R6x)，所得片段被连接到表达载体PQE30中并转化到合适的宿主中。表达和纯化该蛋白质。在该例中，表达载体所利用的终止密码子位于插入物的下游，所以被表达的蛋白由于在克隆位点的5’末端有附加的核酸而比插入物的预测尺寸要大。在SEQ IDNO 1中描述了多肽R2的氨基酸序列。多肽R1使用类似的策略来表达CbpA N-末端区域中的第一重复区，即多肽R1的A区。这里利用了两个氨基重复区之间的天然存在的XmnI位点(4型序列的核酸856)。用XmnI和AatII消化CbpA全长克隆PMI580。用AatII和SmaI消化载体pQE30。再一次连接两个型号的片段，转化到大肠杆菌中并筛选插入的克隆。选择一个阳性克隆并由该色斑纯化重组蛋白质。
使用大肠杆菌pQE30载体并用Qia表达系统(Qiagen)来表达和纯化所有多肽。使用抗组氨酸抗体和蛋白质特异性抗体，通过宿主和Western分析检测His标记的蛋白质的氨基端。R1和R2的纯化为了诱导产生并纯化来自大肠杆菌的重组蛋白质，单一集落选自含有重组质粒的平板培养的细菌并在6.0ml含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB缓冲液中于37℃温度下培养过夜。将该6ml培养物加到1L具有上述浓度下的抗生素的LB中。在37℃温度下振摇培养物直到A600＝～0.400。在该1L培养物中加入1M IPTG到最终浓度为1mM。然后在37℃下振摇培养物3-4小时。在J-6B型离心机中以4000rpm转速旋转此1L培养物15分钟。弃去上清液并在-20℃温度下贮存丸状沉淀。
将1L丸状沉淀重新悬浮在25ml的50mM NaH2PO4、10mM Tris、6MGuCl、300mM NaCl，pH8.0(缓冲液A)中。将该混合物在室温下旋转30分钟并使用微型管尖以50％Cuty Cycle和7的输出功率在VibraCell超声处理器(Sonics and Materials，Inc.，Danbury，CT)上超声两次共30秒。混合物在JA20旋转装置中以10K转速旋转5分钟并取出上清液。将上清液加载到与GradiFrac系统(Pharmacia Biotech，Upsala，瑞典)连接的10ml Talon(Clonetech，Palo Alto，CA)树脂柱上。将该柱用100ml缓冲液A平衡并用另外的200ml该缓冲液洗涤。以100ml的总体积使用100％50mM NaH2PO4、8M脲、20mM MES，pH6.0(缓冲液B)作为最终靶缓冲液按照pH梯度来洗脱。以约30％缓冲液B洗脱蛋白质。收集洗脱峰并合并。
为了重折叠，使用具有1400分子量截断值的透析管在室温下用2L体积的PBS透析约3小时。然后在4℃温度下在2L的PBS中将样品透析过夜。使用Centriprep-30旋转柱通过将PBS加到旋转的余留物中并重新旋转来在蛋白质浓缩期间完成另外的缓冲液交换。使用BCA蛋白质测定方法确定蛋白质浓度并使用Coomassie染色的4-20％SDS-PAGE凝胶来显示纯度(图3)。实施例2多肽R1和R2的凝集素活性LNnt是一种存在于真核细胞上的肺炎球菌受体的碳水化合物类似物。已经显示CbpA缺损的肺炎球菌突变体不能粘附到真核细胞或固定化糖上，表明CbpA是粘着配体。CbpA是一种模块蛋白，它可被划分为两个区N-末端功能区和C-末端胆碱结合区(图1)。分析多肽R1和R2的生物学活性以确定完整的CbpA的活性是否集中在唯一的N末端(由R2模拟的)或其片段(由R1模拟的)中。确定了在缺乏胆碱结合区(CBD)时仅有的N-末端区(R2)是否包含凝集素结合生物活性。使用全长CbpA和多肽R2(缺失脯氨酸富含区中PvuII位点以外的CBD区的截取物)进行了试验。
测定中用已知的可被CbpA识别的糖缀合物LNnT-白蛋白、3’唾液酸乳糖-白蛋白和阴性对照白蛋白包被组织培养孔。然后用白蛋白封闭培养板、洗涤并在15分钟内加入全长CbpA多肽R2或者多肽R1(0.8μg/ml)，然后不用洗涤，在30分钟内加入荧光素标记的R6肺炎球菌，洗涤并目视记数粘附细菌。
在没有添加任何肽的情况下R6和碳水化合物的结合是阳性对照并且标定为100％(表1)。在三个独立的实验中，全长CbpA或多肽R2竞争性地抑制肺炎球菌与LNnT包被的表面结合。与对照相比，全长CbpA抑制率为71％、64％和63％；多肽R2抑制率为65％、53％和74％。CbpA和R2的等同活性表明胆碱结合区对于CbpA的LNnT凝集素活性来说不是必需的，并且R2是候选的LNnT凝集素。
相对于与LNnT的结合来说，与全长CbpA(74和66％)相比，R2不抑制肺炎球菌与3’唾液酸乳糖的结合(79％和101％)。这表明CBD缺失时丧失了唾液酸的识别活性。相比之下，R1似乎具有识别唾液酸的活性，享有CbpA的特性但在R2中明显掩盖了这种特性。这表明多肽折叠成功能区受该多肽组成和长度的影响。发现在其它菌株中序列有轻微的变化(见图2)。假定R1和R2之间具有高度的序列同源性，进一步的可能是对于凝集素活性同时需要R1和R2或者R1和R2是两种特异性稍微不同的凝集素(±唾液酸)。
表1CbpA的可溶性形式对R6肺炎球菌与纯化糖缀合物的结合的抑制作用
N＝LNnt进行3次试验，每次3个孔N＝唾液酸乳糖进行2次试验，每次3个孔凝集素活性与细胞结合活性的相关性含有碳水化合物(糖蛋白和糖脂)和细菌的携带人细胞的表面分子通过碳水化合物与这些糖缀合物结合，尽管蛋白质或脂的骨架非常不同。因此，在体外具有凝集素活性的携带细菌的多肽可以粘附到人细胞表面。体外凝集素活性和细胞结合作用之间的这种直接的关联对于肺炎球菌来说是已知的。例如，LNnt竞争性抑制肺炎球菌与TNF激活的A549人肺细胞的结合并阻止肺炎球菌在体内的发展。为了证实CbpA截取物的凝集素活性可反映细胞结合活性，试验了CbpA和截取物对肺炎球菌与肺细胞结合的抑制作用(表2)。全长CbpA和多肽R2竞争性抑制肺炎球菌与肺细胞的粘附，与对照相比，其抑制率分别为58％和63％。多肽R1无效，表明R2的LNnt结合活性对于肺炎球菌与肺细胞的结合来说是必需的并且也解释了这种关系。
表2R6肺炎球菌与TNF激活的人肺细胞的结合
N＝每个试验进行2次，每次2或3个孔LNnT凝集素活性取决于R2CbpA的N-末端区包含各自有大约110个氨基酸的两个重复区(见图1，多肽R2中的A区和C区)。为了研究两个区对生物活性R1的相对贡献，将仅仅含有A区的与R2和全长CbpA进行比较。在粘附测定中试验时，多肽R1完全未抑制与LNnT的粘附(野生型的91、92和112％)。然而，多肽R1显示出对与唾液酸乳糖的结合有某些抑制作用(对照的68和40％)。这表明LNnT的凝集素活性需要多肽R2并且R2是候选的LNnT凝集素区。相比之下，R1似乎具有识别唾液酸的活性。CbpA N-末端区的抗体阻断细胞结合假定CbpA的N-末端区结合细胞，对N-末端区活性的干扰会阻止或逆转细菌与细胞和纯化的糖缀合物的结合。一种这样的干扰机制是抗体。
表3抗CbpA R2抗体对R6肺炎球菌与LNnt包被表面结合的抑制作用
5μl未稀释的兔抗体+5μl 2×107R6x预培养物，室温下6×30分钟，然后加到LNnT包被孔中进行粘附测定。显示了两次独立的实验。
试验了产生于CbpA重组N-末端区(R2)的抗血清阻断肺炎球菌粘附LNnT的能力。在室温下培养兔多克隆抗CbpA抗血清(5μl)和5μl2×107标记的细菌30分钟。将混合物在固定化LNnT上涂敷30分钟，然后用PBS洗涤3次以除去未结合的细菌。用显微镜数与培养板结合的细菌并以6个孔的平均值加标准偏差显示结果。表3所示结果表明针对R2多肽所产生的抗血清阻断了肺炎球菌与LNnT的结合。图5显示免疫前与抗CbpA R2抗体抑制肺炎球菌R6x与模型受体LNnT结合的滴定曲线。1∶100和1∶200稀释度的抗R2对肺炎球菌粘附的阻断率超过70％。进一步稀释到1∶400消除了表明该作用特异性的活性。
用于制备表3和图5所示抗CbpA抗血清的CbpA是针对血清型4的CbpA产生的。在粘附抑制测定中使用的肺炎球菌R6x菌株是由血清型2衍生的。抗体阻断异种血清型细菌粘附的能力表明血清型之间的交叉保护活性。这种活性对于有效的疫苗免疫原来说是非常需要的。CbpA N-末端天然构象抗体的活性按Rosenow等人所述方法，可由其天然宿主(肺炎球菌)在胆碱亲和柱上纯化CbpA。另外，多聚组氨酸标记可以连接到基因的末端以便通过几个组氨酸残基延伸转录的蛋白。这些残基便于在镍亲和基质上纯化。与较短的截取物相反，全长多肽的纯化有利于保留天然三级结构。通过这些生化方法特别是由肺炎球菌也可由大肠杆菌或其它宿主细菌纯化的CbpA保留其天然三级结构。用作免疫原，天然折叠的CbpA产生抗体，它们潜在地不同于通过用可发生不同的折叠的截取物免疫产生的抗体。类似地，用作治疗剂的CbpA可具有不同于截取物的三级结构，所述截取物会改善其阻断粘附的能力。基于这些考虑，作为允许其折叠成它的天然三级结构然后通过生化方法切掉C末端(CBD)生产CbpA可能是有利的全长蛋白质的。例如，用羟胺处理将在血清型R6x和血清型4胆碱结合蛋白A的氨基酸位点475切割CbpA，分离N和C末端。N末端片段适于用作治疗剂或免疫原。
另外，天然CbpA可用作免疫原和活性结构的抗血清。通过吸附除去BD抗体来在该混合物中富含生物活性的抗N末端抗体。通过在R1下与1×108CbpA缺陷性细菌一起培养200μl血清1小时来制备这种抗体。在该突变体上的其它胆碱结合蛋白吸附抗CBD抗体，然后通过离心和除去细菌来从抗血清中移出所述抗体。
为了证明吸附的抗CbpA抗体的生物活性，确定吸附的抗血清阻断肺炎球菌粘附到模型受体LNnT上的能力。与1∶600稀释的抗血清一起培养R6x肺炎球菌然后加到用LNnT白蛋白包被的孔中。
表4吸附的抗CbpA抗血清阻断粘附
这些结果表明其天然构象的Cbp/AN末端区域的抗体强烈阻断粘附。该活性大于图5中截取物的活性，截取物在1∶600稀释度时没有活性。图5中的滴定研究进一步表明吸附的抗CbpA抗血清的这种活性。通过三角形显示肺炎球菌4型与LNnT包被孔基线粘附的。用各种稀释度的未吸附(正方形)或吸附(菱形)的抗血清预先培养肺炎球菌表明使粘附减少。两种抗血清在粘附上类似减少的事实表明大多数N-末端CbpA残基的抗体(即，通过吸附除去胆碱结合区的抗体)的阻断活性不降低生物活性。实施例3抗R2抗血清的被动保护兔免疫血清的产生在Covance(Denver，PA)产生了抗多肽R2(CbpA截取物)和CbpA的兔免疫血清。收集免疫前血清后，用250μg在完全弗氏佐剂中的含有氨基末端重复区(上文制备483∶58)的R2使新西兰白兔免疫。在第21天给该兔125μg在不完全弗氏佐剂中的R2进行加强并在第31天抽血。第二只兔子用纯化的CbpA进行类似的免疫。小鼠的被动保护腹膜内注射100μl 1∶2稀释的在无菌PBS中的兔抗R2或免疫前血清(免疫前和第31天的免疫血清)使C3H/Hej小鼠(5只/组)被动免疫。给予血清1小时后，用1600CFU肺炎链球菌血清型6B(菌株SP317)攻击小鼠。监测小鼠14天的存活情况。用针对多肽R2产生的兔免疫血清免疫的小鼠在攻击后有80％存活(图4)。所有用免疫前兔血清免疫的小鼠到第7天都死亡。
该数据表明特异于CbpA的抗体对系统肺炎球菌感染具有保护作用。该数据进一步表明胆碱结合区对于保护来说不是必需的，因为特异于截取的蛋白质多肽R2的抗体(缺失保守的胆碱结合重复区)对于保护来说是足够的。另外，针对CbpA血清型4的血清对血清型6B的攻击有保护作用。实施例4抗R1抗血清的自动保护作用腹膜内注射CbpA截取蛋白质R1(15μg在50μl PBS中，加50μl完全弗氏佐剂)使C3H/HeJ小鼠(10只/组)免疫。一组10只假免疫的小鼠接受PBS和佐剂。第二次免疫在4周后给予，腹膜内注射15μg有不完全弗氏佐剂的蛋白质(假免疫的接受PBS和IFA)。在第3、6和9周抽取血液(后眼眶取血)进行免疫反应分析。在9周时从10只CbpA免疫的小鼠中收集的血清的ELISA终点抗CbpA截取物滴度为4,096,000。在假免疫小鼠的血清中未检测到抗体。在第10周用560CFU肺炎链球菌血清型6B(菌株SPSJ2p，由P.Flynn，St.Jude Children’sResearch Hospital，Memphis，TN提供)攻击小鼠。在14天内检测小鼠的存活情况。用CbpA截取蛋白质R1免疫的小鼠在攻击后有80％存活。所有假免疫的小鼠在第8天死亡(图7)。
该数据表明用CbpA重组片段免疫诱导产生能够抵抗系统性肺炎球菌感染和死亡的特异性抗体。该数据进一步表明胆碱结合区对于保护作用不是必需的，因为免疫原是截取的蛋白质R1。另外，结果暗示一个氨基端重复区可能足以诱导保护反应。也表明了交叉保护作用，因为基于血清型4 DNA序列产生了重组肺炎球菌蛋白质，用血清型6B分离物攻击后观察到了保护作用。实施例5预防幼年大鼠的鼻咽菌落集群在体外，CbpA的N末端区竞争性抑制肺炎球菌附着。为了证明具有该活性的肽的治疗实用性，给予幼年大鼠截取的肽，然后用肺炎球菌攻击并评价鼻咽的菌落集群情况。
用10μl含有0.8μg多肽R2或R1或不含蛋白质的PBS经鼻腔处理大鼠。15分钟后，经鼻腔引入3型肺炎球菌(菌株SIII)(10μl含有1×105cfer)。为了确定多肽竞争性抑制肺炎球菌粘附和移生的能力，在72小时时洗涤鼻腔并且确定每个动物中回收的肺炎球菌的数目，每组4只动物。仅仅接受SIII的大鼠每10μl有2200、6500、6900和8700(平均6075)个菌落。用截取物R2处理的动物显示最大的减少(3600、3500、2500、2100)，平均10μl有2925个细菌(对照的48％)。用截取物R1处理的动物也显示菌落集群减少(5000、4800、3500、1600)，平均为3725(对照的61％)。
该实验表明将本发明的肽给予在治疗研究中指定的动物可使该动物抵抗随后的肺炎球菌攻击。讨论通过实验表明，多肽R21)作为疫苗抗原给药时诱导产生保护性抗体并且是一种用于疫苗制剂的优选组合物；和2)作为肽递送到呼吸道和/或鼻咽受侵袭体中时，竞争性地预防肺炎球菌附着并且是一种用于对抗移生作用或侵袭性疾病防治剂的优选组合物。而且，CbpA截取物起凝集素作用而没有CBD。识别两种碳水化合物LNnT，由含有图1中两个N-末端重复区(A和C)的肽识别和唾液酸，由仅仅含有单个N-最末端重复区(A)的肽识别。含有N-末端重复区多肽R1和R2的截取物在细胞培养测定中也表明有凝集素活性。
多肽R2活性的重要特征包括1)多肽R2和全长CbpA在识别纯化糖缀合物受体类似物、肺细胞和动物模型中有完全相关的生物活性。对于它们的抗体也证明了相关性；和2)4型衍生剂和在体外测定中使用其它血清型(如，6B和2)的细菌之间具有交叉保护作用，这对于可以使用的疫苗、预防和治疗方式来说是重要的。
尽管本文通过提及各种具体的材料、方法和实施例描述和说明了本发明，但可以理解本发明不局限于材料的特定组合和为此目的所选择的方法。本领域技术人员会意识到可以暗含某些细节的各种变化。同样地，在本文中引用的任何参考文献从与本发明公开内容的相关程度来看均被考虑引入本文供参考。
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1.一种分离的多肽，包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 1中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
3.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 3中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
4.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 6中描述的。
5.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 7中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
6.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 9中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
7.一种分离的多肽，包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，具有SEQ ID NO 24所述的氨基酸，其中该多肽显示其三级结构。
8.权利要求7的分离多肽，其中所述三级结构与存在于天然蛋白质中的结构相对应。
9.权利要求7的分离多肽，其中所述多肽通过用羟胺裂解全长胆碱结合蛋白A来制备，其中羟胺在氨基酸475处裂解胆碱结合蛋白A，由此产生胆碱结合蛋白A的N-末端截取物。
10.权利要求1的多肽的分离类似物。
11.权利要求10的分离多肽，其中类似物包含具有N-末端蛋氨酸或N-末端聚组氨酸的氨基酸序列。
12.权利要求1的分离多肽，其中所述片段是多肽的蛋白水解消化产物。
13.一种分离的多肽，包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列，其中多肽具有凝集素活性而不结合胆碱。
14.一种分离的免疫原性多肽，包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
15.权利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 1中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
16.权利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 3中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
17.权利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 7中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
18.权利要求14的免疫原性多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO 9中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
19.一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
20.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 12中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
21.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 14中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
22.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 17中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
23.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是SEQ ID NO 19中描述的，包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。
24.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是DNA。
25.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是cDNA。
26.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是基因组DNA。
27.权利要求19的分离的核酸，其中核酸是RNA。
28.权利要求19的分离的核酸，它可有效地连接到转录RNA启动子上的。
29.一种载体，包含权利要求19的核酸分子。
30.权利要求29的载体，其中启动子包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物启动子。
31.权利要求30的载体，其中所述载体是质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌噬菌体或真核病毒DNA。
32.一种生产多肽的宿主载体系统，它在合适的宿主细胞中包含权利要求30的载体。
33.权利要求32的宿主载体系统，其中合适的宿主细胞包含原核或真核细胞。
34.一种细胞系，它包含权利要求19的核酸。
35.一种获得纯化形式多肽的方法，该方法包括(a)将权利要求19的载体引入合适的宿主细胞中；(b)培养所得宿主细胞以便产生多肽；(c)回收步骤(b)中产生的多肽；和(d)纯化步骤(c)中回收的多肽。
36.一种能够特异性结合权利要求1或7的多肽的抗体。
37.权利要求36的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
38.权利要求36的抗体，其中抗体是多克隆抗体。
39.权利要求36的抗体，其中抗体是嵌合(双特异性)抗体。
40.一种药物组合物，它含有一定量的权利要求1的多肽和可药用载体或稀释剂。
41.一种在暴露于或感染了肺炎球菌的个体中诱导免疫反应的方法，包括给予所述个体一定量的权利要求40的药物组合物，由此诱导免疫反应。
42.一种预防个体被肺炎球菌感染的方法，包括给予所述个体有效预防肺炎球菌附着量的权利要求40的药物组合物，由此预防肺炎球菌感染。
43.权利要求42的方法，其中药物组合物被释放到呼吸道或鼻咽中。
44.一种预防个体被肺炎球菌感染的方法，包括给予所述个体一定量的含有权利要求36的抗体和可药用载体或稀释剂的药物组合物，由此预防肺炎球菌感染。
45.一种疫苗，它包含权利要求1的多肽和可药用佐剂或载体。
46.权利要求45的疫苗，其中多肽具有SEQ ID NOS1、3-7、9-11、22和23所述的任一氨基酸序列。
47.权利要求45的疫苗，其中多肽包含图2所述的胆碱结合蛋白AN-末端截取物的氨基酸序列。
48.一种疫苗，它包含具有含图2所述保守区的氨基酸序列的多肽和可药用佐剂或载体。
49.权利要求48的疫苗，保守区选自158-172、300-321、331-339、355-365、367-374、379-389、409-427和430-447的氨基酸序列。
50.一种疫苗，它包含编码权利要求1多肽的分离核酸和可药用佐剂或载体。
51.一种疫苗，它包含权利要求19的分离核酸和可药用佐剂或载体。
52.一种疫苗，它包含权利要求29的载体和可药用佐剂或载体。
53.一种治疗感染了或暴露于肺炎球菌的个体的方法，包括给予所述个体治疗有效量的权利要求45-51或52的疫苗，由此治疗个体。
全文摘要
本发明提供一种包含胆碱结合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列的分离多肽,其中的氨基酸是SEQ IDNOS:1、3－7或9－11所述的,也包括其片段、突变体、变体、类似物或衍生物。而且,本发明提供一种包含胆碱结合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列的分离多肽及其制备方法,其中的氨基酸是SEQ ID NO 24所述的,该多肽保留其天然的三级结构。本发明提供一种包含胆碱结合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列的分离多肽,其中多肽具有凝集素活性而不结合胆碱。本发明提供一种分离的免疫原性多肽,含有胆碱结合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列。本发明提供一种编码多肽的分离的核酸,所述多肽包含胆碱结合蛋白AN－末端截取物的氨基酸序列。最后,本发明提供药物组合物、疫苗和用其进行诊断和治疗的方法。
文档编号A61K39/395GK1342088SQ99810854
公开日2002年3月27日 申请日期1999年4月7日 优先权日1998年4月7日
发明者E·I·托曼恩, H·R·马舒尔, T·M·维泽曼, L·S·约翰逊, S·科尼格 申请人:圣朱德儿童研究医院, 医学免疫公司