高效14价肺炎球菌结合疫苗的制作方法

专利名称：高效14价肺炎球菌结合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体为预防肺炎球菌感染的高效14价肺炎球菌结合疫苗。
背景技术：
肺炎球菌(6". p; e^7077he)，如图1所示，对全世界造成的威胁正日益加剧。由于抗生素耐药性传染病的扩散，以及肺炎球菌肺炎经常在流感感染之后出现，肺炎球菌疾病在流感期间发作的可能性进一步增加。由肺炎链球菌引发的疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎球菌己成为全球儿童的头号杀手，具体统计如图2所示。
据世界卫生组织2005年统计数据显示，平均每年有160万人死于这种疾病，其中包括70-100万5岁以下的儿童。2004年世界卫生组织调查了全球肺炎球菌疾病死亡分布情况如图3所示。
据统计，在美国每年约有15-57万例肺炎球菌性肺炎，约有2600-6200例肺炎球菌性脑膜炎，两者每年造成约4万人死亡。肺炎病死率约10%，而50岁以上老人的病死率高达28%。肺炎球菌败血症的病死率约25-30%。美国的细菌性中耳炎有50_67%是由肺炎球菌引起，主要危害婴幼儿， 一般难以彻底治愈，且复发率高。在法国每年有12.5万人因肺炎球菌引起肺炎，近万人死亡。
世界卫生组织统计多数死亡病例发生在贫困国家，在发达国家小于2岁儿童和老年人是肺炎球菌疾病的主要疾病负担。在肺炎球菌疾病负担最高的10个国家中，有5个位于亚洲，分别是孟加拉、中国、印度、印度尼西亚与巴基斯坦。2岁以下儿童在死亡病例中所占的比例尤高。在欧洲和美国，肺炎链球菌是社区获得性成人细菌性肺炎最主要的病因。在这些区域，侵袭性肺炎球菌疾病的年发病率为10-100例/10万人口。我国肺炎的病死率为16. 4%，其中50岁以上中老年人及1岁以下婴幼儿分别高达28. 6%和22. 0%。我国肺炎球菌在健康儿童中的携带率较高，资料统计显示，在北方地区健康儿童中的携带率为24.2%，南方地区为31.3%。而该病是导致5岁以下儿童死亡的重要原因。主要原因在于宝宝免疫系统的发育尚不完善，宝宝免疫力较弱。并且年龄越小的宝宝，免疫力越弱，特别是2岁以下的宝宝，其免疫力存在兵力不足、基础不牢、稳定性差三大弱点。
结合疫苗是目前最先进的疫苗技术，在特异抗原上加上蛋白质载体，可增加其免疫原性。蛋白质载体具有T细胞依赖特性，蛋白结合疫苗可将非T细胞依赖性质的多糖抗原转变为T细胞依赖性质的抗原，激发机体的T辅助细胞产生一系列的免疫增强效应。荚膜多糖结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，增加其免疫原性。结合疫苗接种后产生的抗体在质量和数量上是一代疫苗的400-1000倍，如图4及图5所示的的IgG部分，产生免疫保护更广更强，保护时间更长久，达到高效保护。
肺炎球菌大约有90种血清型(菌株)，我国的统计资料显示肺炎球菌感染菌株前几个血清型依次为5、 6、 1、 19、 23、 14、 2、 4型。据一项收集了 860株肺炎球菌分离株的研究显示，有109株(12.7%)表现为血清群6，在中国肺炎球菌血清型6的红霉素耐药性达100%,其中的6A、6B和6C型分别为62株(56. 9%)、38株(34. 9%)和9株(8. 2%)。
中国生物技术集团成都生物制品研究所生产的23价肺炎球菌疫苗是选取了23种本土最容易致病的病菌，分离提纯肺炎球菌荚膜上的多糖，按比例混合制成疫苗，起到抗肺炎的作用，保护率为50-70%。这意味着2岁以上的人群每接种两个人大概只有一个人产生保护，而肺炎的高峰发病年龄为6-12月龄。
细菌的多糖是一种胸腺非依赖性抗原，这种抗原与胸腺依赖性抗原的主要区别在于前者不需要T淋巴细胞的辅助来产生抗体。因此多糖疫苗存在以下问题(l)在幼小动物或婴幼儿体内只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强；(2)产生低亲和力的抗体，主要为IgM; (3)只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强效应；(4)容易产生免疫耐受；(5)普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用。
多糖疫苗对婴幼儿不起作用是因为2岁以下儿童的免疫系统尚未发育健全，可能与人类IgG2类B淋巴细胞株的发育迟缓有关，而细菌多糖只能刺激比较成熟的B淋巴细胞。然而儿童肺炎好发年龄段确在2周岁以下，高峰发病年龄为6-12月龄，因此2岁以下婴幼儿只能使用含胸腺依赖性抗原的疫苗。
蛋白质载体可将胸腺非依赖性的多糖抗原转变为胸腺依赖性抗原，激发机体的T辅助细胞产生一系列的免疫增强效应。2000年，美国惠氏公司第一个7价肺炎球菌结合疫苗上市；美国惠氏公司开发婴幼儿更有针对性的7(4、 6B、 9V、14、 18C、 19F和23F)价肺炎球菌蛋白疫苗，对5岁以下儿童也有效。荚膜多糖蛋白结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，可增加其免疫原性，可用于6周龄以上的儿童。
但是我国的资料显示肺炎球菌感染菌株血清型依次为5、 6、 1、 19、 23、14、 2、 4，惠氏7价肺炎球菌结合疫苗对我国常见致病菌型覆盖率只有33.9%。惠氏7价肺炎球菌结合疫苗需要接种4针剂，每针860元，价格昂贵，不利于.推广。这些结果表明引起肺炎球菌疾病的细菌不断变化。我国流行的肺炎球菌菌株也跟美国有所差异，肺炎球菌大约有90种血清型(菌株)。主要流行的荚膜血清型随着年龄、时间和地域而有所不同，美国惠氏公司的7价结合疫苗不太适合我国大范围的儿童肺炎预防。

发明内容
本发明的目的是针对以上所述肺炎球菌疫苗存在的不足，提供一种综合考虑国内普遍流行菌型、儿童和老人易感菌型、耐药菌型及交叉保护等因素，能覆盖我国绝大部分常见致病菌型或耐药性菌型，对易受肺炎困扰的老年人能产生有效保护，并且适合2岁以下儿童的，覆盖率高，价格低的高效14价肺炎球.菌结合疫苗。 .
本发明是这样实现的高效14价肺炎球菌结合疫苗，是以分离提纯14种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合后等量混合而成；所述的14种血清型肺炎球菌的血清型为1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、19A、 19F和23F;载体蛋白选用白喉菌素无毒变异蛋白CRM197、破伤风毒素蛋白和流感嗜血杆菌D蛋白。 .
所述的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合是用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)和三乙胺活化，通过异脲键连接结合。
所述的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合的具体步骤是在10ml浓度为10mg/ml.的14种血清型肺炎球菌的荚膜多糖中分别加入用lml乙腈溶解的浓度为100mg/ml 1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)， lmin后加入4ml浓度为0.2mol/L的三乙胺活化，2.5min后加入5g载体蛋白，室温下反应1小时，4。C再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A，及A，同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液即为结合疫苗。
所述的血清型6A、 6B、 14、 19A、 19F和23F型分离提纯的荚膜多糖采用
1 -氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通过异脲键偶联流感嗜血杆菌
D蛋白。.
所述的血清型1、 2及7F型分离提纯的荚膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化， 通过异脲键偶联破伤风类毒素蛋白。
所述的血清型4、 5、 9N、 9V和18C型分离提纯的荚膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通过异脲键偶联白喉毒素无毒变异蛋白。
本发明是鉴于肺炎对我国高发肺炎菌株特点研制的一种能覆盖我国绝大部分常见致病菌型或耐药性菌型的14价肺炎球菌结合疫苗。与现有的肺炎球菌结合疫苗相比，本发明的优点是(1)血清型分别为十四种(l、 2、 4、 5、 6A、 6B、7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F)肺炎球菌，交叉保护率达90%以上；(2)对易受肺炎困扰的老年人能产生有效保护，并且适合2岁以下儿童。


图l为肺炎球菌的扫描电镜图2为2004年全球5岁以下儿童死亡原因调査数据图(图中显示肺炎是全
球儿童的头号杀手)；
图3为世界卫生组织2004年统计的全球5岁以下儿童因肺炎死亡的地区分布图，其中东南亚所占比率仅次于非洲；
图4为小鼠实验中，偶联有蛋白载体的PPS4-CRMm与PPS4免疫产生的抗体对比图，(图中偶联有蛋白载体的PPS4-CRMw7是PPS4免疫产生的抗体的IOOO倍左右)；.
图5为在小鼠实验中，荚膜多糖结合疫苗免疫42天后产生的IgG统计对比图。 '
图6、小鼠实验中，成都23价疫苗、惠氏7价结合疫苗和高效14价结合疫苗免疫后产生的抗体浓度统计对比图(其中，+成都23价一代疫苗，
惠氏7价二代疫鶴和"*^高效M价肺炎球菌结合疫苗)；
图7、小鼠实验中，成都23价疫苗和高效14价结合疫苗不同剂量免疫后产生的抗体滴度统计对比图(+—代23价疫苗0.5呢，
二代M价结合疫ffl 0. 5ug， --代23价疫苗lug 和
4， 二代14价结合疫苗JUg);
图8、小鼠实验中，成都23价疫苗、惠氏7价结合疫苗和高效14价结合疫苗免疫后产生的IgG/IgM比率统计对比图(其中+成都23价一代疫苗，—*-惠氏7价二代疫苗和+高效M价肺炎球菌结合疫苗)。
具体实施例方式
以下具体结合实施例对本发明进行详细的说明。
高效14价肺炎球菌结合疫苗，是以分离提纯14种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合后等量混合而成。14种血清型肺炎球菌选取中国本土最常见的血清型为1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、19F和23F的肺炎菌。载体蛋白选取国际认可蛋白载体白喉菌素无毒变异蛋白.CRM，97、破伤风毒素蛋白和流感嗜血杆菌D蛋白。白喉菌素无毒变异蛋白CRM朋、破伤风毒素蛋白和流感嗜血杆菌D蛋白与荚膜多糖结合，能提高抗原的免疫原性，从而启动婴幼儿的免疫机制，同时蛋白载体具有活化免疫细胞的作用，6周龄以上的婴儿就可接种，及早产生抗体，预防肺炎球菌感染。
荚膜多糖与载体蛋白的偶联结合为分别将14种血清型(1、 2、 4、 5、 6A、6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F)肺炎球菌的荚膜上提取的荚膜多糖用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼(CDAP)和三乙胺活化法偶联结合载体蛋白(白喉菌素无毒变异蛋白CRMw7、破伤风毒素蛋白和流感嗜血杆菌D蛋白)。该反应为异脲键连接反应。在高pH时，CDAP与多糖残基上的羟基反应，转化成氰酸酯，载体蛋白上的氨基与其迅速反应，形成异脲键。该方法操作简单，容易重复。具体步骤如下在检测合格10ml浓度为10mg/ml的上述14种血清型肺炎链球菌的荚膜多糖中分别加入用lml乙腈溶解的浓度为100mg/ml CMP， lmin后加入4ml浓度为0.2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g载体蛋白，室温下反应1小时，4r再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印haroseCL-4B层析介质纯化，以波长A娜及A，同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液即为结合疫苗。
高效14价肺炎球菌结合疫苗的具体制作方法如下
(1) 选取14种血清型(1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、
19F和23F)的肺炎球菌培养。
(2) 分别提纯以上14种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖肺炎球菌灭活后离心收集上清液，经超滤浓縮，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70%的)预冷乙醇，离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按l: 2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清，补加乙醇(终浓度80%搅拌)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后即为精制荚膜多糖，置-2(TC保存备用。
(3) 取检测合格的各型肺炎链球菌的荚膜多糖，用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟'化硼(CDAP)和三乙胺活化法结合载体蛋白得到结合疫苗。
实施例l: 14种血清型肺炎球菌的培养
综合考虑国内普遍流行菌型、儿童和老人易感菌型、耐药菌型及交叉保护
等因素，选取14种血清型(1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、19F和23F)的肺炎球菌培养；
(1)菌种1、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F共计14个血清型别菌种，可以购自中国药品生物制品检定所(中国医学细菌保藏
管理中心)，保藏编号分别为31401、 31402、 31404、 31405、 31406、 31409、 31414、31419、 31423、 31426、 31451、 31456、 31457和31468。可以先采用荧光标记的方法鉴别，先采用来自兔的血清型特异的一抗孵育，然后采用Rhodamine Red-X标记的羊抗兔IgG(二抗)进行孵育，正常结果为可见红色的链球状荧光。
(2) 培养基固体培养基为含10%脱纤维羊血的普通琼脂培养基；液体培养基PN96含胰蛋白胨、氨基酸、葡萄糖、维生素、过氧化氢酶及多种无机盐离子。以上培养基可以购自北京双旋微生物培养基制品厂。
(3) 肺炎球菌发酵罐中培养启开(l、 2、 4、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、18C、 19A、 19F和23F)血清型肺炎链球菌的冻干菌种，分别接种于10%脱纤维羊血普通琼脂培养基，在C02环境中37t:培养后，将固体培养物(中国药品生物制品检定所109培养基)接种两代液体培养基(中国药品生物制品检定所N96培养基)静止培养，染色镜检为革兰"阳性"双球菌。在同一菌株内，由肺炎球菌所表达的荚膜多糖的量也不一样，大多数肺炎球菌分离物能在至少两种形式之间发生表型变化，这两种形式可以通过菌落的不透明性进行区分，不透明型(0)菌落与相同菌株的透明(T)变体在所合成的荚膜的量方面不同，(0)型的菌落通常能产生大量的CPS。选择荚膜光滑透明的(0)型的菌落进行生化反应后，进行血清凝集。经血清凝集实验后，种子批菌种进行固体培养基传代并进行检定。判断合格后，接种于改良的综合培养基上。
(4) 按接种量约108CFU/ml培养基计，将菌液接种于含45L液体培养基的发酵罐内于37。C进行搅拌培养，自培养2h后起每隔lh取样一次，测定菌液浓度，用50%葡萄糖溶液调节糖浓度，以7.5mol/L NaOH调节pH至7.5。间歇通入压缩空气7 9h终止培养，当细菌培养到0D大于等于1.5时，停止继续培养，用甲醛灭菌，离心，去除菌体，收集上清。菌液浓度测定采用分光光度计在600nm波长下测OD值。
实施例2:提纯肺炎球菌荚膜多糖及其质量鉴定1.肺炎球菌荚膜多糖的纯化(1)灭菌后的菌液用离心机进行离心去除菌体，得到原液-粗聚多糖，离心分离出来的菌体用甲醛杀菌。(2)得到原液聚集多糖粗液后，加入十六烷基三甲
基溴化铵进行沉淀复合多糖工作，并进行沉淀离心聚集多糖。(3)完成沉淀离心收集复合多糖后，进行氯化钙解离纯化。随后，加入浓度为95%的酒精进行去核酸。之后，继续加入浓度为95%酒精进行沉淀多糖。(4)完成沉淀收多糖后，加入苯酚进行酚弃去蛋白质，去除原液多糖抗原中多余的蛋白成分。(5)完成酚弃去蛋白后，利用高速离心机进行超速离心去除内毒素。之后，进行再用酒精进行沉淀多糖和多糖纯化，完成精制多糖工序处理。(6)经过以上工序处理后，得到纯化精制的多糖原液。到此时，多糖原液收取处理工作完成，只需再进行真空干燥去除部分水分和除菌过滤处理。
2.荚膜多糖质量鉴定
(1) 生化检测分别用蒸馏水按6mg/ml稀释精制多糖，0. 22mn滤膜过滤即为送检样品。蛋白含量用Lorry法测定，核酸含量用分光光度法测定，总氮用凯氏定氮法测定，磷含量用钼酸铵法测定，o-乙酰基用碱性盐酸羟胺-三氯化铁法测定，糖醛酸含量用咔唑-乙醇溶液法测定，氨基己糖含量用二氨基苯甲醛显色法测定，甲基戊糖含量用半胱氨酸显色法测定，分子大小应用SDS-聚丙烯酰胺胶过滤。
(2) 鉴别实验和血清学特异性实验采用各型多糖的成对抗体结合ELISA夹心法鉴别各型多糖抗原。
(3) 毒性实验:用5只体重约350g豚鼠，每只腹腔注入3. 45mg (2. 5ml)单价多糖，观察7天不得引起明显的症状和死亡；5只体重约20g小白鼠每只腹腔注入0.69mg (0.5ml)单价多糖，观察7d不得引起明显的症状和死亡为合格产品。
实施例3:载体蛋白(流感嗜血D蛋白、破伤风类毒素蛋白与白喉毒素无毒变异蛋白CRM加)的质量控制
采用己通过临床实验验证的安全有效的流感嗜血D蛋白、破伤风类毒素蛋白与白喉毒素无毒变异蛋白CRMw作为我们结合疫苗的蛋白载体，参照现有国际公认的质量标准，对其特性和纯度进行质量复核采用HPLC法测定流感嗜血D蛋白、破伤风类毒素蛋白与白喉毒素无毒变异蛋白CRM^的纯度，纯度在90%以上为合格；确保各蛋白的氨基酸序列正确无误；确保不与白喉类毒素在同一车间生产；采用SDS-PAGE图谱分析测定纯化后的蛋白组成；脂多糖的含量小于8%为质量合格；载体蛋白的家兔热原实验必须合格。
实施例4:荚膜多糖与载体蛋白偶联结合。
在动物实验中多种因素影响着结合疫苗的免疫原性，如蛋白载体的选择、结合物中游离多糖的含量、结合前多糖分子的大小、结合疫苗的浓度以及结合疫苗中的糖蛋白比等因素。本发明依据肺炎球菌荚膜多糖结构及蛋白载体的特性，选择适宜的蛋白载体和结合工艺匹配各型肺炎球菌的多糖，具体如下
一、荚膜多糖6A、 6B、 14.、 19A、 19F和23F型，采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化法偶联结合流感嗜血杆菌 D蛋白
(1) 分别取检测合格10mg/ml的6A、 6B、 14、 19A、 19F和23F型肺炎链球菌荚膜多糖10ml。
(2) 对于6A、 6B加入用lml乙腈溶解的浓度为100mg/ml的CDAP， kiin后加入4ml浓度为0.2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流感嗜血杆菌D蛋白，室温下反应l小时，4。C再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A,及A28Q同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液作为结合疫苗备用。
(3) 对于14型荚膜多糖加入用0. 3ml乙腈溶解的浓度为100mg/ml CDAP，lmin后加入0. 3ml浓度为0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流感嗜血杆菌D蛋白，室温下反应l小时，4'C再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A鹏及A280同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液作为结合疫苗备用。
(4) 对于19A、 19F和23F型荚膜多糖加入用0. 4ml乙腈溶解的浓度为100mg/ml的CDAP， lmin后加入0. 8ml浓度为0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流感嗜血杆菌D蛋白，室温下反应l小时，4t:再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A娜及A28。同歩监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液作为结合疫苗备用。
二、 血清型l、 2及7F多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化法偶联结合破伤风类毒素蛋白
对于1、 2和7F型荚膜多糖加入用0. 4ml乙腈溶解的浓度为100mg/ml的CDAP， lmin后加入0. 8ml浓度为0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g流破伤风类毒素蛋白，室温下反应l小时，4。C再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A鹏及A28。同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液作为结合疫苗备用。
三、 荚膜多糖4、 5、 9N、 9V和18C型，采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化法，偶联结合白喉毒素无毒变异蛋白
对于4、 5、 9N、 9V和18C型荚膜多糖加入用0. 4ml乙腈溶解的浓度为100mg/ml的CDAP， lmin后加入0. 8ml浓度为0. 2mol/L的三乙胺活化，2. 5min后加入5g白喉毒素无毒变异蛋白，室温下反应1小时，4。C再反应10 15小时，加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A鹏及A280同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液作为结合疫苗备用。
以上的氯化钠溶液的浓度可以为％0. 09，以波长A鹏及A28。同步监测的仪器
可以为分光光度计。
实施例5:免疫亲和层析法纯化偶联物(荚膜多糖-流感嗜血杆菌D蛋白、荚膜
多糖-破伤风类毒素与荚膜多糖-白喉毒素无毒变异蛋白)单克隆抗体的制备
首先取荚膜多糖-流感嗜血杆菌D蛋白、荚膜多糖-破伤风类毒素和荚膜多糖-白喉毒素无毒变异蛋白作为抗原，免疫小鼠，而后取小鼠脾与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合细胞，进行抗体鉴定、评估，通过腹水生产，抗体纯化来进行成品鉴定后备用。
琼脂糖活化(1)取20ml的S印harose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的浓度为0. lmol/L、 pH值为9.0的NaHC03液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。(2)在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2mol/L NaOH，使pH保持在11左右，反应10min。在1 2min迅速调整pH值为8. 0 11. 0维持10min。 (3)将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的浓度为0. lmol/L、 pH值为9. 0的NaHC03溶液抽洗。
偶联单克隆抗体
20ml S印harose 4B液体相当于一半的固相载体。(D事先将需要偶联的抗体(荚膜多糖-流感嗜血杆菌D蛋白抗体、荚膜多糖一破伤风类毒素蛋白抗体和荚膜多糖-白喉毒素无毒变异蛋白抗体)分别200mg置于0. lmol/L pH 9.0 NaHC03液中透析数小时(一般偶联量为10 30mg/g载体)。(2)将活化的琼脂糖迅速倒入抗体液中(在1.5min内，从抽洗到偶联)，4"C缓慢搅拌12小时，使抗体与活化的
琼月旨结合。
装柱
(l)选柱；不宜过大， 一般以1.5X15cm的层析柱可装偶联抗体的琼脂糖约30ml。 (2)装柱将已与抗体偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以lml/min的速度流出。(3)洗柱以0. 2mol/LpH9. 0 NaHC03(含0. lmol/L NaCl)洗涤至洗出液的0D28。<0. 02为止。收集全部的洗脱液，测得的OD，值乘以洗脱液的总毫升数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。
吸附与解吸附
(1)加入待纯化的各型多糖与载体蛋白的偶联物3ml，浓度为1 2%，缓慢加入待纯化的抗原，用浓度0.01mol/L、 pH值为7.4的PBS液洗脱，流速为lml/min，至洗出液0D28。<0. 02为止。(2)加浓度为0. lmol/L、 pH值为2. 4的甘氨酸-HC1缓冲液，流速lml/min，收集解吸附下来的成分，立即以lmol/L NaHC03中和，以免抗体变性。(3)以两倍体积的7mol/L尿素洗涤，再用浓度为0. 01mol/L、 pH值为7.4的PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入浓度为 0.02% NaN3的于4t:保存。防止冷冻和干裂。
实施例6:荚膜多糖结合疫苗鉴定
(1) 蒽酮法测定多糖含量。
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或 羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与 糖的含量成正比。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 630nm，在此波长下进行比色。通过制作标准曲线计算可溶性糖的含量.
(2) Lowry法测定蛋白含量。
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物 使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在吸收峰波长下进行比色，利用光吸 收值与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
(3) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定多糖结合疫苗分子量。
SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏 水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物， 每克蛋白质一般结合1.4g SDS。 SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物 均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间 原有的电荷差异。在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄 烟形的长椭园棒(短轴均为1.8nm，长轴则随蛋白质的分子量成正比变化)，克服 了蛋白质间原有的形状差异。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受 原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。用本法测定蛋白质的分子 量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的相对位置，就能得知分子 量。本实验采用SDS-不连续垂直电泳法l)凝胶脱尽底色后，色带清晰显出。 按实样描下或摄下电泳图谱；2)根据各蛋白迁移距离和染料迁移距离的比值，求 出各蛋白的相对迁移率(mr)，然后作出lgMr-mr关系图，从图中找出未知蛋白相 对迁移率对应的分子量。实施例7: 14种多糖-蛋白结合物原液的质量控制
多糖与载体蛋白结合工艺反应步骤较多，条件要求高。为了确保多糖-蛋白 结合物的稳定性、安全性和批间一致性，建立以下相应的质量控制方法。由于结 合反应可能影响多糖的结构，多糖-蛋白结合后(单价结合物未混合前)进行多糖 的鉴别实验。此外，对纯化后的多糖-蛋白结合物进行以下检测①采用适宜的 检测方法，确保多糖-蛋白结合物原液经过纯化后，多糖-蛋白结合反应中所使用 的试剂(CDAP或三乙胺等化学试剂)已被清除；②分别测定结合物中结合多糖和 结合蛋白的含量，通过结合物中多糖/蛋白比作为判断结合反应的一个间接标志； ③活化终止后，确保结合物中多糖或载体蛋白不再残留有活化后未结合的功能基 团；④采用凝胶过滤的方法将结合多糖和游离多糖分离，确保未被结合的游离多 糖含量不超过5%;⑤采用质谱(HPLC)的方法测定多糖-蛋白结合物中结合蛋白和 未结合蛋白的含量；确保未被结合的载体蛋白含量不超过5%;⑥采用SDS-聚丙 烯酰胺凝胶垂直电泳对各批次多糖结合疫苗原液进行相对分子大小的测定;⑦按 现行版《中国药典》的要求，对多糖结合疫苗原液进行热原实验及内毒素含量测 定，确保疫苗的毒性实验合格。
实施例8:单种多糖结合抗原在小鼠模型中的初期模拟实验
14种多糖结合抗原分别免疫接种幼鼠后，对产生的抗体成分、浓度、亲和 力、吞噬能力进行比较，从而确定合适的免疫剂量。
(1) 多糖结合疫苗免疫原性实验
12-14g雌性3周龄BALB/c.幼鼠，随机分为两组，每组20只，分别腹腔注 射不同糖蛋白比结合疫苗，于第0周和第4周程序注射2次，每只幼鼠0. 5ml 含(lug偶联物)。每个实验组分别于第一针注射前和第二针注射后的14天取10 只幼鼠采血，分离血清，置-2(TC保存备用。
(2) 小鼠血清各型荚膜多糖特异性
IgG抗体检测采用间接ELISA法，将各型肺炎多糖溶解于0. 05mol/L pH 9. 6. 的碳酸盐缓冲溶液中，以20ug/ml浓度包被酶标板，2y。的BSA液封闭。实验时将 待检血清20倍稀释后加入酶标板，置37'C反应40min，常规洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。用四氨基联苯胺显色，酶标仪450nra波长处读取A.值。
(3)体液免疫应答的评价
免疫接种之后进行体液免疫应答的评价，从而定量血清抗PPS免疫球蛋白 的浓度。例如在PPS4评价实验中，用间接ELISA法检测IgG浓度。收集各实 验组血清中anti-PPS抗体的浓度，计算95%的置信区间内的算术平均及标准差。 对各免疫接种组，在免疫前抗体水平和免疫接种后抗体水平(将数据转换对数形 式后)进行比对，以消除小鼠个体间的差异。用标准t检验比较成对的不同免疫 接种组间的差异，微软Excel表格软件用来编辑数据及统计分析。
为了检测并评价免疫接种后脾脏中诱导产生的抗体分泌细胞，在第1剂免 疫接种前和第2剂免疫接种半月后的两个时间点收获脾脏。分离淋巴细胞，用 ELISpot分析评价疫苗。
实施例9:混合多糖结合抗原在小鼠模型中的初期模拟实验
14种多糖结合疫苗等量混合，每一针剂含混合后的多糖结合疫苗2ug。免疫 接种小鼠后，对产生的抗体成分、浓度、亲和力和调理吞噬能力进行分析。从而 确定效果最佳的肺炎球菌结合疫苗组分。高效14价肺炎球菌多糖结合疫苗在小 鼠实验中免疫效果优于惠氏的7价多糖结合疫苗及成都的23价多糖疫苗，如见 图6、图7和图8所示。
疫苗的配方研究对疫苗的配方进行研究，确保疫苗中添加的稳定剂成分、 缓冲液、佐剂等对疫苗在稳定性、保存期、免疫原性和安全性方面的正面影响远 远大于负面影响。
药理、毒理和生物分布进行肺炎球菌结合疫苗的药理学实验，包括疫苗 发生的作用原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等 实验；建立一套适当的实验及检测方法来评价疫苗，通过评价优化免疫程序和接
种途径。
实施例10:血清型为4型的荚膜多糖结合疫苗先将血清型为4型的肺炎球菌，单独培养扩增；提纯其荚膜上的多糖，4 型肺炎球菌灭活后离心收集上清，经超滤浓縮，加入适量预冷乙醇(70%)，离心 收集，粗制多糖；粗糖以适宜的浓度溶于乙酸钠溶液中，然后按l: 2比例以冷
酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后 液体等量加2mol/L氯化钙溶液，加入适量乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清， 补加乙醇(终浓度80%搅拌)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥 后即为精制多糖，置-2(TC保存备用。
采用国外已通过临床实验验证的安全有效的白喉毒素无毒变异蛋白 (CRM197)，参照国外相应的质量标准，对其特性和纯度进行质量复核；取检测合 格的4型肺炎链球菌荚膜多糖(10mg/ml， 10ml)，采用CDAP(l-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼)和三乙胺活化法结合载体蛋白 (白喉菌素无毒变异蛋白 CRM197)。 首先加入用lml乙腈溶解的100mg/ml CDAP， lmin后加入4ml 0. 2mol/L的三乙 胺活化，2.5min后加入5g载体蛋白，室温下反应1小时，4'C再反应12小时， 加入1. 5ml 0. 5mol/L，用pH7. 5 0. 75mol/L HEPES溶解的乙醇胺终止反应，再 经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A娜及A28Q同步监测，氯化钠溶液洗 脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液即为结合疫苗。
血清型4荚膜多糖结合疫苗小鼠模型评价
① 小鼠及免疫接种10-11 weeks雌性BALB/c小鼠(广东省实验动物中心)， 皮下接种lug PPS4、 PPS4-CRM^(溶解在200ul无菌无内毒素的PBS中)。28天后 同样的抗原进行第二次免疫接种，二次接种14天后心脏穿刺取血。
② 间接ELISA测定anti-PPS4抗体浓度对PPS4-IgM及PPS4-IgG特异的 间接ELISA法用来测定免疫血清anti-PPS4抗体浓度。纯化的anti-PPS4单克隆 抗体IgM9.2和IgG44.2是分析检测中的标准对照物。在酶标板的实验孔中，每 孔加入馳1 10ug/ml的纯化PPS4(溶解在0. lmol/L pH 9. 6 NaHC(V溶液中)包 被，用含1% BSA和0. 1%叠氮钠的'200ul PBS室温孵育lh封闭。用含0. 1% Tween-20 的PBS洗板。实验孔加入适宜稀释a00-1000倍)的100ul样品，利用标准品做 标准曲线。洗板后加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗，37。C孵育lh。最后洗板， 用Sigma-104磷酸酶底物显色，酶标仪上405nm波长读取吸光值。通过标准曲线函数计算抗体浓度。结果显示偶联有蛋白载体的PPS4-CRMiy7免疫产生的抗体是 PPS4免疫的1000倍左右，见图4及图5所所示的IgG部分。
③ IgG纯化二次免疫14天后的血清样品，用PPS4-CRM，免疫接种的 PPS4-IgG抗体浓度约为77. 3±26. 9ug/ml。用lml G蛋白HiTrap亲和色谱柱纯 化血清IgG。随后G蛋白柱洗脱，收集含IgG的部分，YM10膜过滤富集。富集的 IgG用PBS溶解。 .
④ 调理吞噬实验流式细胞术被用来分析工gG的调理吞噬情况，由于标记 有异硫氰酸荧光素的肺炎球菌会发生荧光淬灭，实验中细菌表面用荧光 Alexa488标记。准备高度荚膜包被的血清型4肺炎球菌，使其处在细菌生长第 三期即平衡期。细菌表面用EZ-LinkSulfoNHS-LC-Biotin生物素酰化，并用PBS 洗三遍。生物素酰化的肺炎球菌6(TC孵育lh灭活，洗一次，与荧光素Alexa488 孵育，洗一次后，用含有钙离子、镁离子、1% BSA的HBSS重悬，-2(TC冷冻储 存。荧光素Alexa488在加入4mg/ml台盼蓝的情况下很容易就终止。标记的具荚 膜完整性及抗原性的PPS4与PPS4-IgG 44. 2或PPS4-IgM 9. 2孵育，结合带有藻 红蛋白的适当二抗，上流式细胞仪检测，或者玫瑰红标记荧光显微镜上观察。标 记有荧光素Alexa488的细菌，用Nikon-E600荧光显微镜被来显影确认 anti-PPS4抗体的结合，或者通过双色荧光流式细胞术来确认，并证实细菌在热 灭活后保持荚膜抗原性。 '
小鼠巨噬细胞系RAW264.7用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养(来自 ATCC)，培养三天后传代使用。细胞在吞噬实验使用前标记7-氨基放线菌素D进 行活力评定，活力在90%以上为合格。用5ul荧光素Alexa488调理标记的细菌， 和未标记的细菌与20ul来自免疫小鼠的纯化IgG或20ul纯化的小鼠PPS4-IgG 44.2单克隆抗体结合做内部对照，加入含1% BSA的HBSS至终体积50ul，在两 个测试中PPS4-IgG终浓度为0.25 2.0ug/ml。混合物在水浴摇床中37。C孵育 55min。混合物中加入RAW264. 7细胞(50ul，细胞密度5X 107ml)37。C继续孵育 30min。然后在4。C细胞用冷的含1% BSA的HBSS洗两次，0. 5ml PBS重悬。每个 测试加入等体积的8mg/ml的台盼蓝，混合孵育15s，立即上流式细胞仪检测。 结果显示多糖结合疫苗接种后产生的抗体活性滴度，是多糖疫苗的10-100倍。对于另外13种血清型(1、 2、 5、 6A、 6B、 7F、 9N、 9V、 14、 18C、 19A、 19F和23F)的肺炎球菌的荚膜多糖结合疫苗制作和效果检测如实施例10所述的
实施方案基本一致。
权利要求
1、高效14价肺炎球菌结合疫苗，其特征在于是以分离提纯14种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合后等量混合而成；所述的14种血清型肺炎球菌的血清型为1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F；载体蛋白选用白喉菌素无毒变异蛋白CRM197、破伤风毒素蛋白和流感嗜血杆菌D蛋白。
2、 如权利要求l所示的，高效14价肺炎球菌结合疫苗，其特征在于所 述的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合是用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三 乙胺活化，通过异脲键连接结合。
3、 如权利要求2所示的，高效14价肺炎球菌结合疫苗，其特征在于所 述的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合的具体步骤是在10ml浓度为10mg/ml的 14种血清型肺炎球菌的荚膜多糖中分别加入用lml乙腈溶解的浓度为100mg/ml l-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼，lmin后加入4ml浓度为0. 2mol/L的三乙胺 活化，2. 5min后加入5g载体蛋白，室温下反应1小时，4匸再反应10 15小时， 加入乙醇胺终止反应，再经S印harose CL-4B层析介质纯化，以波长A卿及A28。 同步监测，氯化钠溶液洗脱，收集两波长重叠峰处的洗脱液即为结合疫苗。
4、 如权利要求2所示的，高效14价肺炎球菌结合疫苗，其特征在于所 述的血清型6A、 6B、 14、 19A、 19F和23F型分离提纯的荚膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通过异脲键偶联流感嗜血杆菌D蛋白。
5、 如权利要求2所示的，高效14价肺炎球菌结合疫'苗，其特征在于所 述的血清型1、 2及7F型分离提纯的荚膜多糖采用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通过异脲键偶联破伤风类毒素蛋白。
6、如权利要求2所示的，高效14价肺炎球菌结合疫苗，其特征在于所述的血清型4、 5、 9N、 9V和18C型分离提纯的荚膜多糖釆用1-氨基-4-二甲基-吡啶-四氟化硼和三乙胺活化，通过异脲键偶联白喉毒素无毒变异蛋白。
全文摘要
高效14价肺炎球菌结合疫苗，是以14种血清型肺炎球菌提取的荚膜多糖与载体蛋白偶联结合而成；所述的14种血清型肺炎球菌的血清型为1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F；载体蛋白为白喉菌素无毒变异蛋白CRM₁₉₇、破伤风毒素蛋白和流感嗜血杆菌D蛋白。与现有的肺炎球菌结合疫苗相比，本发明的优点是(1)血清型分别为(1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F)十四种肺炎球菌，交叉保护率达90％以上；(2)对易受肺炎困扰的老年人能产生有效保护，并且适合2岁以下儿童。
文档编号A61K47/42GK101590224SQ200910040659
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者勇 胡 申请人:广州精达医学科技有限公司