肿瘤微环境的促成因素的研究方法及其应用的制作方法

专利名称：肿瘤微环境的促成因素的研究方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤微环境促成因素的研究方法及其应用。
背景技术：
肺瘤是严重危害人类的一种疾病，随着社会经济的发展，城市化进程的加 快，工业化程度的提高，以及诊疗技术的提高，肿瘤的发病率也在提高，因此， 抑制肿瘤的发生、发展，消除患者的病痛也成为科研工作者所致力研究的课题。
肿瘤的治疗方法目前有放疗、化疗、手术治疗、介入治疗以及生物治疗、基 因治疗和中医药治疗等方法。由于肿瘤的发病原因以及患者患病时的情况各有
不同，因此各种肺瘤的治疗方法针对不同的肿瘤往往有局限性，往往不能取得 好的效果。近年来科学界开始认识到肿瘤的发生发展不是一个孤立的过程，而 是与多种因素相互作用形成并发展的。而肿瘤细胞所处的微环境为肿瘤的生长 提供了适宜的环境，为肿瘤的生长提供了必要的营养和支持等。因此研究并设 法阻断肿瘤的微环境成为当今科学界研究的热门课题。但相应抗体/西己体/多肽封 闭FGFR2,以及携带相应杀伤性药物阻断FGFR2的表达还需进一步摸索最适实 验条件。

发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供肿瘤微环境的促成因素的研究 方法，包括如下步骤
(1) 成纤维细胞的分离，获得来源于癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维
细胞；
(2) 观察癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维细胞的分布，分析FGFR2(成纤维细胞生长因子受体2)阳性细胞在癌组织及正常组织中的分布情况，比 较癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维细胞之间基因表达的差异。
所述步骤(l)进一步为分别取癌组织和相应癌旁正常组织，用IV型月交 原酶消化，收集单细胞，培养细胞，获得来源于癌组织和相应癌旁正常组织的 成纤维細胞。
所述步骤(2)进一步为应用免疫荧光染色观察癌组织和相应癌旁正常组 织的成纤维细胞的分布，应用免疫组化实验进一步分析成纤维细胞生长因子受 体2(FGFR2)阳性细胞在癌组织及正常组织中的分布情况；应用基因芯片技术 和定量PCR技术比较癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维细胞之间基因表达的 差异。
本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤发生发展的方法，即通过抑制成 纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用来阻断肿瘤孩t环境 的促成，从而抑制肺瘤的发生。所述的抑制成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2) 阳性的成纤维细胞的作用包括如下方法
使用抗体/配体封闭FGFR2;
使用抗体/配体携带的杀伤性药物或核酸物质进行FGFR2阻抑或杀伤； 使用多肽类物质封闭FGFR2;
使用小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA干扰/阻断FGFR2。 本发明的又一目的是提供抑制肿瘤发生发展的药物，所述药物包含抑制成 纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用的成分。所述成分 包括能封闭FGFR2的抗体/配体、能阻抑或杀伤FGFR2的抗体/配体携带的杀伤 性药物或核酸物质、能封闭FGFR2的多肽类物质、能干^/阻断FGFR2的小干 扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一种或多种。
在本发明中，"成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞"是 指散在分布于肿瘤细胞内的表达FGFR2的成纤维细胞，它为肿瘤的发生发展提 供适宜的微环境，通过本发明的肿瘤微环境的促成因素的研究方法，得出， FGFR2 ( + )的成纤维细胞能为癌症的发生发展提供适宜的肿瘤微环境。本发明中所说的"癌组织"包括胃癌、肺癌、食管癌、肝癌，乳腺癌等。在本 发明的实施例部分，仅仅以食管癌为例，但并不局限于食管癌方面。我们在前
期试验中已发现在胃癌、肺癌、食管癌、肝癌，乳腺癌中都存在FGFR2(+)的成 纤维细胞。食管癌仅仅是一个优选实施例而已，在抑制肿瘤方面，其他癌症与 食管癌都有相同之处。
此外，关于免疫荧光染色，免疫组化实验、基因芯片、实时定量PCR等各 种测定系统对本领域普通技术人员都是已知的。本领域普通技术人员能够根据 需要按照测定目的而改进此类公知方法。
"使用抗体/配体封闭FGFR2"中FGFR2是受体，当它与相应配体结合时 会产生一系列生物效应，如果釆用相应抗体或者非特异性配体可以阻断FGFR2 与相应配体结合的过程，从而阻断生物学效应。
当抗体或者非特异配体携带杀伤性药物或核酸物质时可以直接发挥杀伤细 胞作用，所以可以使用本发明中所说的"使用抗体/配体携带的杀伤性药物或核酸 物质进行FGFR2阻抑或杀伤"的方法。
"使用多肽类物质封闭FGFR2，，是指除抗体或者非特异性配体以外的其他能 够封闭FGFR2的多肽类物质。
"使用小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA干扰/阻断FGFR2"是指 用RNA干扰技术干扰阻断FGFR2的蛋白表达，具体来说，可以用到siRNA、 miRNA或shRNA。 siRNA、 miRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小 分子RNA。RNA干扰(RNAi),即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA( siRNA) 代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能， 基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因治疗开辟了新的途径。siRNA是 小或短干扰RNA ( small/short interfering RNA, siRNA),是一类20-25个核苷酸 长度的双链RNA分子，其主要在RNAi通路中起作用，干扰特异基因的表达。 此外siRNA在RNAi相关的通路中也起作用，如抗病毒机制，基因组染色体结 构的塑造等。其结构是一段完全互补的RNA双链，两端各有两个未互补的的石成 基。在遗传学中，微RNA (microRNAs， miRNA)是长度在21-23个核苷酸之间的单链RNA片段，调节基因的表达。miRNA由基因编码，从DNA转录而来， 但不翻译成蛋白。初级转录产物(primary transcripts, pri-miRNA)缩短其颈环 结构得到功能性的miRNA。成熟的miRNA分子与一个或更多个mRNA分子部 分互补，其主要功能是下调基因的表达。shRNA是小发卡或短发卡RNA( a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA),是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默輩巴基因的表达。利用载体把shRNA 导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；这种装载了 shRNA载 体可被传递到子代细胞中去，从而4植因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构 可被细胞机制切割成siRNA,然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上
(RNA-induced silencing complex, RISC )，该复合物能够结合到目的mRNAs并 将其降解。shRNA是由RNA聚合酶III转录的，哺乳细胞中的shRNA产物有时 会促使细胞产生干扰素反应(细胞遇到病毒侵袭时做出的自我防卫反应)，而 miRNA中却不会遇到这种问题(miRNA是由RNA聚合酶II转录，与转录 mRNA的聚合酶相同)。shRNA也被用于植物和其它系统中，在这些系统中不需 要U6启动子的驱动。在植物中，常用的增强表达的启动子是CaMV35S
(cauliflower mosaic virus 35S ),在这种情况下，RNA聚合酶II参与了转录，起 始RNA干扰。
当然，许多其他方案也适合于抑制本发明中所述的能为癌症的发生发展提 供适宜的肺瘤微环境的FGFR2 ( + )的阳性肿瘤成纤维细胞，所以上述方法仅仅 是用来举例。
本发明的肿瘤微环境的促成因素的研究方法解决了在肿瘤生长的微环境中 发挥重要作用的因素到底是什么的难题，正确得出FGFR2是肿瘤成纤维细胞的 标志物，在肿瘤生长的微环境中发挥重要作用。本发明还提供了一种抑制肿瘤 发生的方法及其药物的新思路，对于肿瘤的治疗有重要的指导意义和实用价值。


图1是来源于食管癌组织的成纤维细胞TF的特性的免疫荧光染色后在荧光显微镜下的结果图2是MTT实验比较NF、 TF细胞的增殖率及流式细胞术检测两个样本
NF、 TF、肺瘤细胞DNA含量的实验结果图；ESCC表示食管鳞癌； 图3是TF、 NF中差异表达基因的确认实验结果图； 图4是FGFR2是TF细胞特异性标志的实验分析图； 图5是在肿瘤组织中检测FGFR2阳性细胞的相关实验结果图； 图6是来源于成纤维细胞的条件培养基CM对食管癌细胞的生长、迁移与
侵袭的影响的实验结果图，其中，Cell growth rate表示细胞生长速率，Invaded
cells per field表示每^L野的侵袭细胞数。
具体实施例方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一 步阐述本发明的具体实施例。 实施例1:食管癌的成纤维细胞的分离
六对原发食管癌及癌旁非肿瘤组织取自中山大学肿瘤防治中心(广州，中 国)食管癌患者肿瘤切除术中，患者术前均未做过任何辅助治疗。用手术刀片 将食管癌组织及其相应的癌旁正常食管组织分别切成约lmr^小块，0.1%IV型胶 原酶37。C消化30分钟。用20nm的无菌筛网过滤消化后细胞，收集得到单细胞悬 液。用DMEM培养液洗涤细胞两次，每次1,500 rpm离心5分钟。然后用5 ml含 20。/。FBSDMEM培养基重悬细胞，接种在6 cm细胞培养脏中。37。C培养箱孵育 30分钟后，依据细胞粘附性的差异，即成纤维细胞贴壁时间(约20-30分钟)短 于肿瘤细胞(约60分钟)，弃掉细胞培养液，将未贴壁的细胞(主要是肿瘤细 胞)移除，重新加入新鲜的20。/。FBS DMEM培养基，分别获得来源于食管癌组 织的成纤维细胞(TF)及来源于癌旁正常食管组织的成纤维细胞(NF),继续 传代培养，用于后续实验。
通过短期的细胞原代培养，已成功分离6对来源于食管肿瘤组织的成纤维细 胞TF和其对应的来源于正常食管组织的成纤维细胞NF。 TF、 NF应用10。/。FBS DMEM培养基至少可连续传10代。TF、 NF细胞均呈梭形，细胞形态有别于巨噬细胞及食管癌细胞，如图1A所示，图1A为NF、 TF、巨噬细胞及肿瘤细胞典型的 细胞形态学特征。
实施例2:免疫荧光染色
将细胞接种于24mmx24mm盖玻片上培养24小时后，用4%多聚曱醛室温固 定20分钟。PBS洗涤细胞，加入含有5。/o牛血清白蛋白的PBS溶液(PBS-B), 37°C 封闭细胞30分钟以去除非特异性染色。加入一抗(fibronectin, E-cadherin， CD68, cytokeratin等)4。C孵育过夜。PBS洗涤细胞，加入FITC (荧光素异好u氰酸酯) 或TRITC (四曱基异硫氰酸罗丹明)标记的荧光二抗，室温避光孵育l小时。加 入DAPI (4 ， "二M—2—苯基吲哚)复染，于荧光显微镜下观察结果并拍照。
为确定来源于食管癌组织的TF为单一的成纤维细胞，没有巨噬细胞及食管 癌细胞的污染，应用巨噬细胞特异性标记物CD68,上皮细胞特异性标记 E-cadherin、cytokeratin以及分别进行免疫荧光染色区分三种细胞。结果如图l B-E 所示，图1B、 C、 D、 E是应用各种细胞标记物进行免疫荧光染色鉴别细胞类型 的细胞形态图，分别是巨噬细胞-CD68、肿瘤细胞-E-cadherin、 cytokeratin和 TF、 NF-fibronectin的细胞标记物进行免疫焚光染色鉴别细胞的细胞形态图。该 结果显示，TF仅成纤维细胞标记物fibronectin着色，说明TF为单一的成纤维细胞 (图1B画E)。
细胞增殖实验显示在相同条件下TF细胞生长快于NF细胞，实验结果如图 2A,图2A是MTT实验比较NF、 TF细胞的增殖率的实验结果图。以每孔"103细 胞数将成纤维细胞接种于96孔细胞培养板。依照MTT试剂盒实验流程分别进行 三次平行实验。统计学分析表明TF、 NF的细胞增殖率存在显著性差异(尸〈0.05)。 流式细胞分析细胞周期显示TF S和G2/M期细胞比率(S: 23.8 ± 6.1; G2/M: 20.6 ± 7.8)高于NF细胞(S: 7.2 土 2.3; G2/M: 9.8 ±2.2,尸< 0.05),提示TF与其对应的 NF相比，具有更强的细胞分裂增殖能力。
实施例3:流式细胞本险测DNA含量
9收集约l-2xl(^细胞，70%乙醇固定细胞，碘化丙腚(PI)染色进行流式细 胞分析。ModfitLT2.0分析细胞周期的变化；计算DNA指数(DI)进行NF、 TF 及肿瘤细胞倍体分析，DI值为待测细胞G1期DNA含量均值与正常外周血淋巴细 胞G1期DNA含量的比值。分别进行三次实验验证结果。图2B、 C、 D为相关实 验结果。图2B是流式细胞术柱状图，显示TF细胞周期中S及G2-M期细胞比率明 显高于NF。图2C、图2D是流式细胞术检测两个样本NF、 TF、肿瘤细胞DNA含 量的实-睑结果图，该结果显示TF、 NF细胞倍体均为二倍体细胞，NF平均DNA 指数(1.024 )和TF平均DNA指数(1.036)都显著低于其对应的食管癌细胞(1.306 )。 以上结果说明来源于食管癌组织的TF为单一的成纤维细胞。
实施例4:基因芯片分析
应用Affymetrix公司人类基因组U133 Plus 2.0 GeneChip芯片检测NF和TF之 间表达差异基因。该芯片包含大于47,000个转录本及变异体，代表了38,500个人 类特异基因。微阵列芯片分析按照说明书进行，即将6个TF(或NF)总RNA混合起 来，以2吗混合后的总RNA为模板，逆转录为cDNA，将生物素标记的cDNA进 行纯化、酶切，于42。C与U133 Plus 2.0 GeneChip杂交16小时。应用GeneArray scanner扫描已洗涤及染色的芯片；Microarray Analysis Suite软件分析探针结合的 强度；应用U133Plus2.0中100个看家基因平均强度对结果进行标准化处理。标 准化后的表达值即可用于NF和TF之间基因表达差异的比较。以表达倍数的差异 区分表达上调和下调的基因，以转录本的表达差异大于1.5倍作为基因表达差异 的标准。互联网在线分析工具包括GO Consortium提供的FatiGO, Gene Ontology, 以及Affymetrix公司网站提供的用于差异基因功能鉴另"、分类的NetAffe分析中心 数据库。
基因芯片结果提示TFs可通过以下机制促进食管癌细胞侵袭性生长及转移
1) 通过分泌MM尸7,MAff70,MXK^5和Z^4M53， CXDJW, CZDJW4促进细胞黏附， 增加细胞运动性，改变肿瘤微环境的相互作用(肿瘤-间质，肿瘤-肿瘤)；
2) 促进胂瘤细胞上皮-间质细胞转换(EMT)，在TFs中多种上调的基因与EMT相关，如L五F/,FiW，7WC，FZDS(表l)，表1为TF和NF中差异表达的基因。
在TF中多种差异表达基因与免疫反应相关，包括多种趋化因子。除参与免 疫应答及炎症反应之外，由肿瘤间质细胞分泌的趋化因子还可通过肿瘤-间质 细胞相互作用参与肿瘤的血管生成、生长增殖、侵袭及转移。在TFs中表达上调 的多种基因产物，包括/丄-S、 W0O4S、 CXCZJ( COJ均为可为肿瘤细胞提供适 宜微环境的细胞因子(表l)。
表l
基因名称Log ratioaGenBank #
勿應裙遂
FGFR2Fibroblast growth factor receptor 26.8丽—022969.1
RGS1Regulator of G-protein signalling 15.4S59049.1
TFAP2CTranscription factor AP-2 gamma5.2U85658.1
FGF18Fibroblast growth factor 184.0BC006245.1
RSG4Regulator of G-protein signalling 43.6AL514445
WISP1WNT1 inducible signaling pathway protein 13.1NM—003882.1
RASGRP2RAS guanyl releasing protein 23.0NM—005825.1
TAF4TATA box binding protein (TBP)-associated factor 43.0NM—003185.1
TFAP2ATranscription factor AP-2 alpha2.6BF343007
HBEGFHeparin-binding EGF-like growth factor2.5NM一OO 1945.1
WNT2Wingless-type MMTV integration site family member 22.4NM—003391.1
FRS2Fibroblast growth factor receptor substrate 22.4NM—006654.1
LEF1lymphoid enhancer-binding factor 12.2AF288571.1
WNT5AWingless-type MMTV integration site family, member 5A2.1NM—003392.1
IGFBP2Insulin-like growth factor binding protein 22.0NM—000597.1
CDK5R1Cyclin-dependent kinase 5， regulatory subunit 1 (p35)2.0AL567411
PDGFAplatelet-derived growth factor alpha polypeptide1.9NM—002607.1
AREGschwannoma-derived growth factor1.5NM—001657.1
RGS5regulator of G-protein signaling 51.5AF493929.1
NF2Neurofibromin 2-3.6NM—000268.1
CENPFCentromere protein F-2.7NM—016343.1
CENPECentromere protein E-2.0NM—001813.1
BRCA2Breast cancer 2, early onset-2.0NM—000059.1
BRCAlbBreast cancer 1， transcript variant BRCAlb-2.0NM—007295.1
BRCA1breast cancer 1, early onset-1.7NM—007295.1CEP55centrosomal protein 55kDa-1.7NM—018131.1
RASSF2Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 2-1.6NM—014737.1
CENPFcentromere protein F-1.6NM—005196.1
MAD2L1MAD2 (mitotic arrest deficient, yeast, homolog)-like 1-1.5NM—002358.2
CDKN3cyclin-dependent kinase inhibitor 3-1.5AF213033.1
细胞外基质
PKP2Plakophilin 26.3NM—004572.1
FBN2Fibrillin 24.4X62009.1
NRXN3Neurexin 33.9AF123462
ICAM1Intercellular adhesion molecule 1 (CD54)3.6AI608725
CLDN1Claudin 13.5AF101051.1
COL10A1Collagen, type X, alpha 13.4AI376003
CDH1Cadherin 13.3NM_004360.1
CLDN14Claudin 143.3AF314090.1
ICAM4Intercellular adhesion molecule 42.5NM—001544.2
ADAMTS9ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 92.5AB037733.1
TNCTenascin C2.3BF434846
LAMB3Laminin, beta 32.2L25541.1
C0L11A1Collagen, type XI， alpha 12.1NM—001854.1
COL4A6Collagen, type IV, alpha 62.0AI889941
MXRA5matrix-remodelling associated 51.9AF245505.1
FZD8frizzled homolog 81.9AB043703.1
MMP10matrix metallopeptidase 101.8NM—002425.1
CDH13cadherin 131.7NM_001257.1
FN1fibronectin 11.7W73431
MFAP2microfibrillar-associated protein 21.6NM—017459.1
MMP1matrix metallopeptidase 11.6丽—002421.2
MATN2matrilin21.5NM—002380.2
COL7A1collagen, type VII, alpha 11.5NM—000094.1
ADAM19ADAM metallopeptidase domain 191.5AF311317.1
COL5A3collagen, type V, alpha 31.5NM—015719.1
IL32Interleukin 325.6NM—004221.1
CD14CD 14 molecule5.3NM—000591.1
IGKCImmunoglobulin kappa constant4.9BC005332.1
HLA-DRAMajor histocompatibility complex, class II， DR alpha4.6M60334.1
12IFI6Interferon, alpha-inducible protein 64.0M87789.1
NFATC1Nuclear factor of activated T-cells， calcineurin-dependent 13.8AW027545
IL8Interleukin 83.8AF043337.1
CXCL14Chemokine (C-X-C motif) ligand 143.8AF144103.1
IL24Interleukin 243.6NM_006850.1
ILIAInterleukin 1, alpha3.6Ml 5329.1
IL1BInterleukin 1， beta3.3NM—000576.1
S100A8SI00 calcium binding protein A83.0NM—002964.2
TNFSF4Tumor necrosis factor superfamily, member 42.8NM_003326.1
IGLJ3Immunoglobulin lambda joining 32.8X57812.1
CF1Complement factor I2.7BC020718.1
CCL5Chemokine (C-C motif) ligand 52.6NM—002985.1
TNFRSF13BTumor necrosis factor receptor superfamily, member 13B2.5NM—012452.1
FCGR1AFc fragment of IgG， high affinity la, receptor (CD64)2.5X14355.1
IL11Interleukin 112.4NM—000641.1
TNFSF18Tumor necrosis factor superfamily, member 182.1NM—005092.1
IFNE1Interferon epsilon 12.1NM—176891.1
CXCL2chemokine (C-X-C motif) ligand 21.5M57731.1
该基因在肿瘤成纤维细胞和癌旁成纤维细胞中的表达量以2为底的对数的比值)
实施例5:实时定量PCR(qPCR)和半定量RT-PCR
TRIzol试剂提取成纤维细胞总RNA,以6个TF (或NF)混合后的总RNA为 模板逆转录cDNA ,应用SYBR Green PCRKit进行qPCR。扩增反应包括95。C孵 育15s, 60°C1分钟，72°C l分钟，共40个循环反应。应用ABI PRISM 7900HT序 列检测系统对反应产物进行定量测定，分别进行三次平行实验。以Ct法(厶AGr 法)比较TF中華巴序列含量相对于NF和内参照(GAPDH)的变化，对应的表达水 平以相应的倍数变化体现，用以下公式计算2-AACT=2-[ACT(TF)-ACT(NF)]andeaChA CT^AGr與-ACTG^dh。对于半定量RT-PCR,分别来源于NF和TF的cDNA应用 TaqDNA Polymerase进4亍PCR^应，以18s作为内参照。
分析比较TF和NF之间基因表达的差异，用以深入研究TF在食管癌发生发展 中的特殊作用。将来源于6个食管癌的TF和6个食管组织的NF分别混合起来，应 用Affymetrix human genome U133 plus 2.0基因芯片分析混合后的TFs和NFs基因表达谱的差异。共25,206个转录本在TF和NF中表达，与NF相比，在TF中有423 个(0.9%)基因表达上调，214个(0.45%)基因表达下调，以差异=1.5或=-1.5为判 定标准。其中292个基因(181个上调和111个下调基因)为已知功能基因(表l)， TF中126个(126/292，43,2o/o)差异表达基因的功能与细胞增殖、细胞外基质及胞外 基质重建及免疫反应相关。与细胞增殖相关的基因中，37个基因在TF中表达增 高，24个基因表达降低(表l);在细胞外基质及胞外基质重建相关基因中，37 个基因在TF中表达增.高，3个基因表达P争低(表l);同样，与免疫反应相关的 大部分基因(22/25)在TFs中表达增高(表l)。在上述TF表达差异基因中随即选 取20个基因(13个上调，7个下调)，应用实时定量PCR(qPCR)4企测基因在TFs 和NFs中的表达水平，验证基因芯片结果。除CCNB2之外，其余基因qPCR实验 结果均与基因芯片结果相一致，见图3A。图3是TF、 NF中差异表达基因的确认。 其中，A图是应用qPCR检测FGFR2、 WNT2、 WNT5A、 WISP1、 MMP1、 MMPIO、 IGFBP2、 IL8、 FZD9、 CD14、 IL32、 CXCL14、 PKP2、 ISL1、 HIST1H4K、 BRCA2、 BRCA1、 CCNA2、 CCNB2、 CDC2在TF、 NF中的相应表达水平。以NF细月包的 表达量为标准，误差线代表标准差。
在TFs中多数上调的基因都具有癌基因的特性，如生长因子(FGFM和 ^S^(3F)、转录调节因子(7K4尸Z4， 7F^P2C, Z4i^)及Wnt信号途径成员(『ZSP厶 W\TT2， W V7X4,丄五尸/)。此外，多种肿瘤抑制基因在TFs下调，如5AC47,5及C42， A^2，M4D2丄7 (表l)。 一些编码分泌性蛋白的基因如fF V72, ^7V7X4,『ZS尸/， /G^S尸2在TFs中表达增高，结果图见图3B,图3B是应用RT-PCR检测5对NF、 TF 中WNT2、 WISP1、 WNT5A、 IGFBP2、 MMP1、 MMPIO、 IL8的表达差异，以 18SrRNA的表达作为内参照。这些分泌性蛋白均可促进细胞生长增殖，提示TF 可以促进肺瘤细胞的生长。
实施例6:免疫组织化学(IHC)
将石蜡包埋的食管癌组织标本进行二曱苯脱腊及再水化，0、.3%过氧化氬作 用20分钟以封闭内源性过氧化氢酶活性，将组织切片置于IO mM柠檬酸盐溶液中微波炉加热10分钟进行抗原热修复，10%正常兔血清室温封闭10分钟，l:500稀 释的鼠抗人FGFR2单克隆抗体4。C孵育过夜，以P/。BSA孵育切片作为阴性对照。 PBS洗涤组织切片，1:100稀释的兔抗鼠二抗室温孵育30分钟，DAB显色，二曱 苯固定，中性树脂封片。对于组织切片的免疫荧光双染色实验，组织切片的处 理步骤同上所述，然后应用鼠抗FGFR2—抗和兔抗Fibronectin—抗4。C共同孵育 过夜。洗涤切片之后，应用FITC标记的抗鼠荧光二抗和TRITC标记的抗兔荧光 二抗室温共同孵育H、时，PBS充分洗涤组织切片，DAPI复染后观察结果。
在TF和NF之间，FGFR2表达差异最显著，提示FGFR2可能为TF的特异标记 物。如图4所示，图4结果显示FGFR2是TF细胞特异性标志。图4A是RT-PCR比较 6对NF、 TF中FGFR2的表达差异，以18S rRNA的表达作为内参照的结果图。图 4B是蛋白印记分析比较6对NF、 TF中FGFR2蛋白水平表达差异，B-Actin作为内 参的结果图。图C是免疫染色仅在TF中检测到FGFR2特异性抗体的表达，而在 NF中未检测到其表达(左)；在NF、 TF中均检测到成纤维细胞标记物fibronectin 的表达(右)。图D是正常食管组织中的成纤维细胞表达fibronectin (右)但不 表达FGFR2 (左)。图E是食管癌肿瘤组织中FGFR2阳性细胞的分布(左，箭头) 以及fibronectin阳性细胞的分布(右，箭头)。FGFR2在6个TF中的表达都明显 高于其对应的NF(图4A)，免疫印记实验(图4B)及免疫荧光染色(图4C)也得到相同 的结果。免疫组化实验进一步分析FGFR2阳性细胞在食管癌组织及正常食管组 织中的分布情况。在12个正常的食管组织中未见FGFR2(+)细胞(图4D);在20个 食管癌组织标本中，18个癌组织中检测到FGFR2(+)细胞表达，且在癌间质中(包 括成纤维细胞)未见FGFR2(+)细胞表达(图5A)。图5是在肿瘤组织中检测FGFR2 阳性细胞的结果图。图5A中，FGFR2阳性细胞仅在肿瘤细胞内部分布(红色箭 头)但在肿瘤间质中未见表达(黑色箭头)。图5B中，在肿瘤细胞内部及肿瘤 间质中均可检测到fibronectin的表达。图5C中，fibronectin (绿色)和FGFR2 (红 色)双染，图中为2个TF和1个NF细胞。细胞核用DAPI复染(蓝色)。图5D中， 食管癌组织标本中fibronectin (绿色)和FGFR2 (红色)免疫双染色。FGFR2阳 性的TF细胞存在于肺瘤细胞内部(箭头所指黄色信号)，肿瘤间质中的成纤维细胞均表达fibronectin (绿色)。图5E中，食管癌组织标本中CD68 (绿色)和 FGFR2 (红色)免疫双染色。FGFR2阳性的TF细胞并不表达巨噬细胞的标记物 CD68。 FGFR2阳性细胞散在分布于食管癌细胞中，且在癌组织中细胞仅有0.2-2% 为FGFR2(+)细胞(图5A)。 Fibronectin阳性细胞存在于肿瘤组织中及肿瘤间质细胞 中(图5A)，并且Fibronectin阳性细胞在肿瘤细胞中也为散在分布，约为1-5%, 与FGFR2(+)细胞分布类似。应用FGFR2 (绿色)和fibronectin (红色)抗体进行 免疫荧光双染色，验证肺瘤细胞中FGFR2(+)细胞是否为成纤维细胞，结果显示 多数FGFR2(+)细胞同时为Fibronectin阳性染色(图5B和5C)。
实施例7:来源于成纤维细胞的CM对食管癌细胞生长的影响
条件培养基(CM)的制备应用10% FBS DMEM培养基常规培养食管癌细 胞系(KYSE30、 KYSE510)和成纤维细胞(NF、 TF), 48小时后待细胞达到近80% 汇合率时，分别收集每种细胞的培养基，1000g离心30分钟，收集上清液作为条 件培养用于后续实验。
来源于成纤维细胞的CM对食管癌细胞生长的影响将食管癌细胞KYSE30、 KYSE510分别以每孔1.5 x 103个细胞数接种于96孔细胞培养^1中，分别加入来源 于成纤维细胞NF、 TF的两种不同的条件培养基，确定它们对于食管癌细l包生长 增殖的影响，将加入来源于KYSE30和KYSE510的条件培养基作为对照组。MTT 检测细胞增殖率依上述实验方法进行。
来源于成纤维细胞的CM对食管癌细胞迁移的影响应用细胞划痕实-验检测 细胞的运动迁移能力。将食管癌细胞KYSE30、 KYSE510以适当密度接种于6孔 细胞培养板，用无菌吸头在单层细胞上划一条直线，分别加入来源于成纤维细 胞NF、 TF的两种不同的条件培养基，加入来源于KYSE30和KYSE510的条件培 养基作为对照组。细胞的运动迁移能力依据划痕愈合的时间来判定，在0至24小 时内选择不同的时间点在倒置显微镜下观察划痕愈合情况，随机选取三个4见野 进行拍照。
来源于成纤维细胞的CM对食管癌细胞侵袭能力的影响细胞侵袭实验按照BD公司BioCoatMatrigel Invasion Chamber试剂盒实验流程进行。将2.5 x 105个 KYSE30和KYSE510细胞接种于上层小室，小室下层分别加入来源于KYSE30、 KYSE510、 NF、 TF的条件培养基，22小时后，具有侵袭能力的食管癌细胞穿过 基质胶包被的薄膜或进入下层小室，将薄膜切下，固定染色，在显微镜下计数 穿膜细胞。分别进行三次平行实验验证结果。
统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值士标准差表示，f检验检测不同数据的组间差异，以 尸<0.05判定显著性差异。
来源于TF的条件培养基(CM)可促进食管癌细胞的生长、迁移及侵袭分 别应用来源于TF和NF的条件培养基CM培养食管癌细胞KYSE30和KYSE510,研 究TF产生的分泌蛋白对肿瘤细胞的生物学作用。图6是来源于成纤维细胞的条件 培养基CM对食管癌细胞的生长、迁移与侵袭的影响的实验结果。图6A为MTT 实验分析TF培养基、NF培养基与对照培养基对食管癌细胞生长的影响。图6B为 细胞划痕实验显示，KYSE30 (左)和KYSE510 (右)细胞在TF上清液培养24 小时伤口愈合，而在NF条件培养基中的细胞伤口未愈合。图6C为KYSE30和 KYSE51 O细胞分别在TF培养基和NF培养基中基底膜侵袭情况。柱状图显示在TF 培养基和NF培养基中侵入基底膜的肺瘤细胞数，*P<0.05。细胞增殖实验显示， 与NF相比，来源于TF的培养基可以显著的促进食管癌细胞KYSE30和KYSE510 的生长；而应用来源于KYSE30和KYSE510的CM培养细胞，其生长速率与应用 NF来源的CM相比未见明显差异(图6A)。应用同样方法进行了细胞划痕实验研究 细胞迁移能力的改变，图6B显示用TF的CM培养的KYSE30和KYSE510细胞与NF 的CM相比24小时内伤口已基本愈合。同时，用TF的CM培养的KYSE30和 KYSE510细胞与NF的CM相比具有更强的侵袭能力，分别为79%和78%(图6<:)， 说明TF的培养基增强了食管癌细胞潜在的侵袭转移能力。
实施例8: —种抑制肿瘤发生发展的方法，通过抑制成纤维细胞生长因子受 体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用来阻断肺瘤微环境对胂瘤发生发展的促进作用，从而抑制肿瘤的发生。使用抗体/配体封闭FGFR2，阻断FGFR2与特 异性配体结合，从而阻断下游促进肿瘤发生发展的生物效应。
收集来源于食管癌肿瘤成纤维细胞(TF)的细胞培养液，加入FGFR2抗体使 达到不同的浓度(1 ug/ml， 0.5 ug/ml， 0.25 ug/ml， 0.13 ug/ml， 0.06 ug/ml， 0.03 ug/ml),设置空白对照。
细胞增殖试验分别将以上经过处理的培养液加入到在九十六孔板中培养 的食管癌细胞抹KYSE30，KYSE510中，分别设置三个复孔。如前述方法每天在 同一时间加入CCK-8(Tojindo， Japan) 10ul/孔，37。C培养2小时后读取OD450吸 光度值，绘制细胞生长曲线。
克隆形成实验将食管癌细胞KYSE30,KYSE510按照1000个细胞/孔分别 种植在六孔板中，待细胞贴壁后吸出细胞培养液，更换以上经抗体处理过的肿 瘤成纤维细胞培养液，设置空白对照，每孔设置三个复孔，37。C培养14天后， 取PBS洗两遍，50%冰曱醇固定30分钟，结晶紫染色后PBS洗两遍，风干后计 数克隆形成数。
软琼脂集落形成实验在六孔板上铺0.6%的软琼脂，将食管癌细胞 KYSE30,KYSE510分别与以上经不同处理的肿瘤成纤维细胞的培养液以及软琼 脂相混合，接种于已经铺有软琼脂的孔中，使软琼脂的终浓度是0.4%。 37。C培 养两周，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。显微镜下计数集落形成数目。 拍照留存。
划痕试验将食管癌细胞林KYSE30，KYSE510培养在六孔板中，使细胞生 长达到95%以上，取无菌吸头制造划痕，取上述处理的细胞培养液分别加入到 六孔板的细胞培养孔中，设置空白对照孔，每孔设复孔。细胞经培养l-2天后放 置在显微镜下观察划痕有无消失，比较每孔中划痕的宽度有无缩小，拍照留存。
细胞侵袭实-睑细胞侵袭实-睑按照BD公司BioCoat Matrigel Invasion Chamberi式剂盒实验流程进行。将2.5 x 1C)5个KYSE30和KYSE510细胞接种于上 层小室，小室下层分别加入经以上经抗体处理的细胞培养液，22小时后，具有 侵袭能力的食管癌细胞穿过基质胶包被的薄膜或进入下层小室，将薄膜切下，固定染色，在显微镜下计数穿膜细胞。分别进行三次平行实验验证结果。
统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值土标准差表示，淞验检测不同数据的组间差异，以 尸<0.05判定显著性差异。
结果分别应用经抗体处理过的来源于TF的细胞培养液培养食管癌细胞 KYSE30和KYSE5 IO，结果显示经不同浓度抗体处理过的细胞培养液与对照相比 较，对食管癌细胞的生长、迁移以及侵袭有抑制作用。细胞增殖实验、克隆形 成实验、软琼脂集落形成实验显示，与未经抗体处理的对照相比，经过抗体处 理的细胞培养液培养的肿瘤细胞生长明显减慢，克隆形成数减少，软琼脂中生 长能力明显降低。细胞划痕实验显示，KYSE30和KYSE510细胞在未经抗体处理 的TF上清液培养24小时伤口愈合，而在经抗体处理过的培养液中细胞伤口未愈 合。细胞侵袭试验显示细胞经抗体处理后的培养液中培养后，侵入基底膜的细 胞数目明显少于对照的未经抗体处理的培养液中培养的细胞。说明经FGFR2抗 体处理后P争低了食管癌细胞潜在的侵袭转移能力。
实施例9:使用抗体/配体携带的杀伤性药物进行FGFR2阻抑或杀伤，通过 抗体、配体与FGFR2结合，使其携带的药物直接发挥杀伤FGFR2阳性的肿瘤 成纤维细胞。
收集来源于食管癌肿瘤成纤维细胞(TF)的细胞培养液，加入FGFR2抗体携 带的杀伤性药物，使达到不同的浓度(1 ug/ml， 0.5 ug/ml， 0.25 ug/ml， 0.13 ug/ml， 0.06 ug/ml， 0.03 ug/ml),设置空白对照。
细胞增殖试验分别将以上经过处理的培养液加入到在九十六孔板中培养 的食管癌细胞林KYSE30,KYSE510中，分别设置三个复孔。如前述方法每天在 同一时间加入CCK-8(Tojindo， Japan) 10ul/孔，37。C培养2小时后读取OD450吸 光度值，绘制细胞生长曲线。
克隆形成实验将食管癌细胞KYSE30，KYSE510按照1000个细胞/孔分别 种植在六孔板中，待细胞贴壁后吸出细胞培养液，更换以上经抗体携带杀伤性药物处理过的肿瘤成纤维细胞培养液，设置空白对照，每孔设置三个复孔，37°C 培养14天后，取PBS洗两遍，50%冰甲醇固定30分钟，结晶紫染色后PBS洗 两遍，风干后计数克隆形成数。
软琼脂集落形成实验在六孔板上铺0.6%的软琼脂，将食管癌细胞 KYSE30，KYSE510分别与以上经不同处理的肿瘤成纤维细胞的培养液以及软琼 脂相混合，接种于已经铺有软琼脂的孔中，使软琼脂的终浓度是0.4%。 37。C培 养两周，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。显微镜下计数集落形成数目。 拍照留存。
划痕试验将食管癌细胞株KYSE30，KYSE510培养在六孔板中，使细胞生 长达到95%以上，取无菌吸头制造划痕，取上述处理的细胞培养液分别加入到 六孔板的细胞培养孔中，设置空白对照孔，每孔设复孔。细胞经培养l-2天后放 置在显微镜下观察划痕有无消失，比较每孔中划痕的宽度有无缩小，拍照留存。
细胞侵袭实验细胞侵袭实-验按照BD7仝司BioCoat Matrigel Invasion Chamber试剂盒实验流程进行。将2.5 x 1()S个KYSE30和KYSE510细胞接种于上 层小室，小室下层分别加入经以上经抗体处理的细胞培养液，22小时后，具有 侵袭能力的食管癌细胞穿过基质胶包被的薄膜或进入下层小室，将薄膜切下， 固定染色，在显微镜下计数穿膜细胞。分别进行三次平行实骀、验证结果。
统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值士标准差表示，,检验检测不同数据的组间差异，以 尸<0.05判定显著性差异。
结果分别应用经抗体处理过的来源于TF的细胞培养液培养食管癌细胞 KYSE30和KYSE510,结果显示经不同浓度抗体携带杀伤性药物处理过的细胞培 养液与对照相比较，对食管癌细胞的生长、迁移以及侵袭有抑制作用。细胞增 殖实验、克隆形成实验、软琼脂集落形成实验显示，与未经处理的对照相比， 经过抗体携带杀伤性药物处理的细胞培养液培养的肺瘤细胞生长明显减'f曼，克 隆形成数减少，软琼脂中生长能力明显降低。细胞划痕实验显示，KYSE30和 KYSE510细胞在未经抗体携带杀伤性药物处理的TF上清液培养24小时伤口愈合，而在经抗体携带杀伤性药物处理过的培养液中细胞伤口未愈合。细胞Zf曼袭 试验显示细胞经抗体携带杀伤性药物处理后的培养液中培养后，侵入基底膜的 细胞数目明显少于对照的未经抗体携带杀伤性药物处理的培养液中培养的细
胞。说明经FGFR2抗体携带杀伤性药物处理后P争低了食管癌细胞潜在的侵袭转 移能力。
实施例10:使用多肽类物质封闭FGFR2;除抗体或者非特异性配体以外的 其他能够封闭FGFR2的多肽类物质，阻断FGFR2与特异性配体结合，从而阻 断下游促进肿瘤发生发展的生物效应。
收集来源于食管癌肿瘤成纤维细胞(TF)的细胞培养液，加入能够封闭 FGFR2的多肽物质使达到不同的浓度，设置空白对照。
细胞增殖试验分别将以上经过处理的培养液加入到在九十六孔板中培养 的食管癌细胞抹KYSE30,KYSE510中，分别设置三个复孔。如前述方法每天在 同一时间加入CCK-8(Tojindo， Japan) 10ul/孔，37。C培养2小时后读取OD450吸 光度值，绘制细胞生长曲线。
克隆形成实验将食管癌细胞KYSE30,KYSE510按照1000个细胞/孔分别 种植在六孔板中，待细胞贴壁后吸出细胞培养液，更换以上经多肽封闭处理过 的肿瘤成纤维细胞培养液，设置空白对照，每孔设置三个复孔，37。C培养14天 后，取PBS洗两遍，50%水甲醇固定30分钟，结晶紫染色后PBS洗两遍，风干 后计数克隆形成数。
软琼脂集落形成实验在六孔板上铺0.6%的软琼脂，将食管癌细胞 KYSE30，KYSE510分别与以上经不同处理的胖瘤成纤维细胞的培养液以及软琼 脂相混合，接种于已经铺有软琼脂的孔中，使软琼脂的终浓度是0.4%。 37。C培 养两周，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。显微镜下计数集落形成数目。 拍照留存。
划痕试验将食管癌细胞林KYSE30,KYSE510培养在六孔板中，使细胞生 长达到95%以上，取无菌吸头制造划痕，取上述处理的细胞培养液分别加入到六孔板的细胞培养孔中，设置空白对照孔，每孔设复孔。细胞经培养l-2天后放 置在显微镜下观察划痕有无消失，比较每孔中划痕的宽度有无缩小，拍照留存。
细胞侵袭实验细胞侵袭实验按照BD公司BioCoatMatrigel Invasion Chamberi式剂盒实验流程进行。将2.5 x 1()S个KYSE30和KYSE510细胞接种于上 层小室，小室下层分别加入经以上经多肽封闭处理的细胞培养液，22小时后， 具有侵袭能力的食管癌细胞穿过基质胶包被的薄膜或进入下层小室，将薄膜切 下，固定染色，在显微镜下计数穿膜细胞。分别进行三次平行实验验证结果。
统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值士标准差表示，f检验检测不同数据的组间差异，以 尸<0.05判定显著性差异。
结果分别应用经多肽封闭处理过的来源于TF的细胞培养液培养食管癌细 胞KYSE30和KYSE510,结果显示经不同浓度多肽处理过的细胞培养液与对照相 比较，对食管癌细胞的生长、迁移以及侵袭有抑制作用。细胞增殖实验、克隆 形成实验、软琼脂集落形成实验显示，与未经多肽封闭处理的对照相比，经过 封闭处理的细胞培养液培养的肺瘤细胞生长明显减慢，克隆形成数减少，软琼 脂中生长能力明显降低。细胞划痕实验显示，KYSE30和KYSE510细胞在未经多 肽处理的TF上清液培养24小时伤口愈合，而在经多肽处理过的培养液中细l包伤 口未愈合。细胞侵袭试验显示细胞经多肽处理后的培养液中培养后，侵入基底 膜的细胞数目明显少于对照的未经多肽处理的培养液中培养的细胞。说明经多 肽封闭FGFR2处理后降低了食管癌细胞潜在的侵袭转移能力。
实施例ll:使用小干扰核糖核酸siRNA或微核糖核酸miRNA或者发夹核 糖核酸shRNA干齿阻断FGFR2。 siRNA、 miRNA或shRNA干扰阻断FGFR2 的蛋白表达，从而减少或消除肿瘤成纤维细胞表面的FGFR2受体，阻碍其对肿 瘤细胞的影响作用。
收集来源于食管癌肿瘤成纤维细胞(TF)的细胞培养液，加入能够干扰/阻断 FGFR2的小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA使达到不同的浓度，设置空白对照。
细胞增殖试验分别将以上经过处理的培养液加入到在九十六孔板中培养 的食管癌细胞株KYSE30,KYSE510中，分别设置三个复孔。如前述方法每天在 同一时间加入CCK-8(Tojindo, Japan) 10 ul/孔，3TC培养2小时后读取OD450吸 光度值，绘制细胞生长曲线。
克隆形成实验将食管癌细胞KYSE30，KYSE510按照1000个细胞/孔分别 种植在六孔板中，待细胞贴壁后吸出细胞培养液，更换以上经小干扰核糖核酸 siRNA或miRNA或者shRNA处理过的肿瘤成纤维细胞培养液，设置空白对照， 每孔设置三个复孔，37。C培养14天后，取PBS洗两遍，50%冰甲醇固定30分 钟，结晶紫染色后PBS洗两遍，风干后计数克隆形成数。
软琼脂集落形成实验在六孔板上铺0.6%的软琼脂，将食管癌细胞 KYSE30，KYSE510分别与以上经不同处理的肿瘤成纤维细胞的培养液以及软琼 脂相混合，接种于已经铺有软琼脂的孔中，使软琼脂的终浓度是0.4%。 37°。培 养两周，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。显微镜下计数集落形成数目。 拍照留存。
划痕试验将食管癌细胞株KYSE30,KYSE510培养在六孔板中，使细胞生 长达到95°/。以上，取无菌吸头制造划痕，取上述处理的细胞培养液分别加入到 六孔板的细胞培养孔中，设置空白对照孔，每孔设复孔。细胞经培养l-2天后放 置在显微镜下观察划痕有无消失，比较每孔中划痕的宽度有无缩小，拍照留存。
细胞侵袭实验细胞侵袭实-验按照BD7^司BioCoat Matrigel Invasion Chamber试剂盒实验流程进行。将2.5 x 10S个KYSE30和KYSE510细胞接种于上 层小室，小室下层分别加入经以上小千扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA 处理的细胞培养液，22小时后，具有侵袭能力的食管癌细胞穿过基质月交包净皮的 薄膜或进入下层小室，将薄膜切下，固定染色，在显樣"竟下计lt穿膜细胞。分 别进行三次平行实验验证结果。
统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值士标准差表示，f检验检测不同数据的组间差异，以i^0.05判定显著性差异。
结果分别应用经小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理过的来源 于TF的细胞培养液培养食管癌细胞KYSE30和KYSE510，结杲显示经不同浓度小 干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理过的细胞培养液与对照相比较， 对食管癌细胞的生长、迁移以及侵袭有抑制作用。细胞增殖实验、克隆形成实 验、软琼脂集落形成实验显示，与未经小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者 shRNA处理的对照相比，经过小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理 的细胞培养液培养的肿瘤细胞生长明显减慢，克隆形成数减少，软琼脂中生长 能力明显降低。细胞划痕实验显示，KYSE30和KYSE510细胞在未经小干扰核糖 核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理的TF上清液培养24小时伤口愈合，而在经 小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理过的培养液中细胞伤口未愈 合。细胞侵袭试验显示细胞经小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理 后的培养液中培养后，侵入基底膜的细胞数目明显少于对照的未经小干扰核糖 核酸siRNA或miRNA或者shRNA处理的培养液中培养的细胞。说明经小干扰核 糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA干,阻断FGFR2处理后P争低了食管癌细胞潜 在的侵袭转移能力。
实施例12、 一种抑制肿瘤发生的药物，该药物包含抑制成纤维细胞生长因 子受体2(FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用的成分。在本实施例中，抑制成纤 维细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用的成分是干扰/阻断 FGFR2的小干扰核糖核酸siRNA。
培养并收集来源于食管癌肿瘤成纤维细胞(TF)的细胞培养液，加入该抑制肿 瘤发生的药物，抑制成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的 作用的成分是干扰/阻断FGFR2的小干扰核糖核酸siRNA。设置空白对照。
细胞增殖试验分别将以上经过处理的培养液加入到在九十六孔板中培养 的食管癌细胞林KYSE30，KYSE510中，分别设置三个复孔。如前述方法每天在 同一时间加入CCK-8(Tojindo, Japan) 10 ul/孔，37。C培养2小时后读取OD450吸光度值，绘制细胞生长曲线。
克隆形成实验将食管癌细胞KYSE30, KYSE510按照1000个细胞/孔分别 种植在六孔板中，待细胞贴壁后吸出细胞培养液，更换以上经处理过的肿瘤成 纤维细胞培养液，设置空白对照，每孔设置三个复孔，37。C培养14天后，取PBS 洗两遍，50%水曱醇固定30分钟，结晶紫染色后PBS洗两遍，风干后计数克隆 形成数。
软琼脂集落形成实验在六孔板上铺0.6%的软琼脂，将食管癌细胞 KYSE30，KYSE510分别与以上经不同处理的肿瘤成纤维细胞的培养液以及软琼 脂相混合，接种于已经铺有软琼脂的孔中，使软琼脂的终浓度是0.4%。 37。C培 养两周，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。显微镜下计数集落形成数目。 拍照留存。
划痕试验将食管癌细胞林KYSE30，KYSE510培养在六孔板中，使细胞生 长达到95%以上，取无菌吸头制造划痕，取上述处理的细胞培养液分别加入到 六孔板的细胞培养孔中，设置空白对照孔，每孔设复孔。细胞经培养l-2天后放 置在显微镜下观察划痕有无消失，比较每孔中划痕的宽度有无缩小，拍照留存。
细胞侵袭实验细胞侵袭实验按照BD公司BioCoat Matrigel Invasion Chamberi式剂盒实验流程进行。将2.5 x 1()S个KYSE30和KYSE510细胞接种于上 层小室，小室下层分别加入经以上经处理的细胞培养液，22小时后，具有侵袭 能力的食管癌细胞穿过基质胶包被的薄膜或进入下层小室，将薄膜切下，固定 染色，在显微镜下计数穿膜细胞。分别进行三次平行实验验证结果。
统计学分析应用SPSS 13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值士标准差表示，f检验检测不同数据的组间差异，以 尸<0.05判定显著性差异。
结果分别应用经处理过的来源于TF的细胞培养液培养食管癌细胞KYSE30 和KYSE510，结果显示经FGFR2封闭处理过的细胞培养液与对照相比较，对食 管癌细胞的生长、迁移以及侵袭有抑制作用。细胞增殖实验、克隆形成实验、 软琼脂集落形成实验显示，与未经FGFR2封闭处理的对照相比，经过FGFR2封闭处理的细胞培养液培养的肿瘤细胞生长明显减慢，克隆形成数减少，软琼脂
中生长能力明显降低。细胞划痕实验显示，KYSE30和KYSE510细胞在未经 FGFR2封闭处理的TF上清液培养24小时伤口愈合，而在经FGFR2封闭处理过的 培养液中细胞伤口未愈合。细胞侵袭试验显示细胞经FGFR2封闭处理后的培养 液中培养后，侵入基底膜的细胞数目明显少于对照的未经FGFR2封闭处理的培 养液中培养的细胞。说明经FGFR2封闭处理后降低了食管癌细胞潜在的侵袭转 移能力。
实施例13、使用FGFR2的抑制剂(小分子化合物)阻断FGFR2与相应配 体结合，从而阻断下游促进肿瘤发生发展的生物效应。
收集来源于食管癌肿瘤成纤维细胞(TF)的细胞培养液，加入FGFR2的抑制 剂(小分子化合物)阻断FGFR2与相应配体结合抗体，设置空白对照。
细胞增殖试验分别将以上经过处理的培养液加入到在九十六孔板中培养 的食管癌细胞抹KYSE30，KYSE510中，分别设置三个复孔。如前述方法每天在 同一时间加入CCK-8(Tojindo, Japan) 10 ul/孔，37。C培养2小时后读取OD450吸 光度值，绘制细胞生长曲线。
克隆形成实验将食管癌细胞KYSE30, KYSE510按照1000个细胞/孔分别 种植在六孔板中，待细胞贴壁后吸出细胞培养液，更换以上经处理过的肿瘤成 纤维细胞培养液，设置空白对照，每孔设置三个复孔，37。C培养14天后，取PBS 洗两遍，50%水曱醇固定30分钟，结晶紫染色后PBS洗两遍，风干后计数克隆 形成数。
软琼脂集落形成实验在六孔板上铺0.6%的软琼脂，将使馆癌细胞 KYSE30,KYSE510分别与以上经处理的肿瘤成纤维细^<的培养液以及软琼脂相 混合，接种于已经铺有软琼脂的孔中，使软琼脂的终浓度是0.4%。 37""C培养两 周，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。显微镜下计数集落形成数目。拍照 留存。
划痕试验将食管癌细胞株KYSE30,KYSE510培养在六孔板中，使细胞生长达到95%以上，取无菌吸头制造划痕，取上述处理的细胞培养液分别加入到 六孔板的细胞培养孔中，设置空白对照孔，每孔设复孔。细胞经培养l-2天后放 置在显微镜下观察划痕有无消失，比较每孔中划痕的宽度有无缩小，拍照留存。
细胞侵袭实验细胞侵袭实验按照BD公司BioCoat Matrigel Invasion Chamberi式剂盒实验流程进行。将2.5 x 1()S个KYSE30和KYSE510细胞接种于上 层小室，小室下层分别加入经处理的细胞培养液，22小时后，具有侵袭能力的 食管癌细胞穿过基质胶包被的薄膜或进入下层小室，将薄膜切下，固定染色， 在显微镜下计数穿膜细胞。分别进行三次平行实验验证结果。
统计学分析应用SPSS13.0统计学软件对实验结果进行分析。计量资料数 据以至少三次平行实验的均值士标准差表示，f检验检测不同数据的组间差异，以 尸<0.05判定显著性差异。
结果分别应用经FGFR2的抑制剂(小分子化合物)阻断FGFR2与相应配
果显示经处理过的细胞培养液与对照相比较，对食管癌细胞的生长、迁移以及 侵袭有抑制作用。细胞增殖实验、克隆形成实验、软琼脂集落形成实验显示， 与未经处理的对照相比，经过处理的细胞培养液培养的肿瘤细胞生长明显减慢， 克隆形成数减少，软琼脂中生长能力明显降低。细胞划痕实验显示，KYSE30和 KYSE510细胞在未经处理的TF上清液培养24小时伤口愈合，而在经处理过的培 养液中细胞伤口未愈合。细胞侵袭试验显示细胞经处理后的培养液中培养后， 侵入基底膜的细胞数目明显少于对照的未经处理的培养液中培养的细胞。说明 经FGFR2的抑制剂(小分子化合物)阻断FGFR2与相应配体结合处理后降低了 食管癌细胞潜在的侵袭转移能力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的-普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1、一种肿瘤微环境的促成因素的研究方法，其特征在于，包括如下步骤(1)成纤维细胞的分离，获得来源于癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维细胞；(2)观察癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维细胞的分布，分析成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)阳性细胞在癌组织及正常组织中的分布情况，比较癌组织和相应癌旁正常组织的成纤维细胞之间基因表达的差异。
2、 根据权利要求l所述的一种肿瘤微环境的促成因素的研究方法，其特征 在于，所述步骤(l)进一步为分别取癌组织和相应癌旁正常组织，用IV型 胶原酶消化，收集单细胞，培养细胞，获得来源于癌组织和相应癌旁正常组织 的成纤维细胞。
3、根据权利要求1所述的一种肿瘤微环境的促成因素的研究方法，其特 征在于，所述步骤(2)进一步为应用免疫焚光染色观察癌組织和相应癌旁正 常组织的成纤维细胞的分布，应用免疫组化实验进一步分析成纤维细胞生长因 子受体2(FGFR2)阳性细胞在癌组织及正常组织中的分布情况；应用基因芯片 技术和定量PCR技术比较癌组织和相应癌旁正常組织的成纤维细胞之间基因表 达的差异。
4、 一种抑制肿瘤发生发展的方法，其特征在于，通过抑制成纤维细胞生长 因子受体2(FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用来阻断肿瘤微环境的促成，从而 抑制肿瘤的发生。
5、 根据权利要求4所述的抑制肿瘤发生发展的方法，其特征在于，所述的 抑制成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用包括采用如下方法使用抗体/配体封闭FGFR2;使用抗体/配体携带的杀伤性药物或核酸物质进行FGFR2阻抑或杀伤； 使用多肽类物质封闭FGFR2; 或使用小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA干扰/阻断FGFR2。
6、 一种抑制肿瘤发生发展的药物，其特征在于，所述药物包含抑制成纤维 细胞生长因子受体2 (FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用的成分。
7、 根据权利要求6所述的一种抑制肿瘤发生发展的药物，其特征在于，所 述成分包括能封闭FGFR2的抗体/配体、能阻抑或杀伤FGFR2的抗体/配体携带 的杀伤性药物或核酸物质，能封闭FGFR2的多肽类物质、能干扰/阻断FGFR2 的小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一种或多种。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤微环境的促成因素的研究方法通过该研究方法，发现FGFR2阳性的成纤维细胞是肿瘤微环境的促成因素。本发明还公开了一种抑制肿瘤发生发展的方法和药物，通过杀伤或者抑制肿瘤组织中的成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用来阻断肿瘤微环境对肿瘤的促进作用，进而达到抑制肿瘤生长或者杀伤肿瘤细胞的作用；本发明的药物包含抑制成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)阳性的成纤维细胞的作用的成分。本发明解决了在肿瘤生长的微环境中发挥重要作用的因素到底是什么的难题，提供了一种抑制肿瘤发生的方法及其药物的新思路，对于肿瘤的治疗有重要的指导意义和实用价值。
文档编号A61K38/00GK101586142SQ20091004053
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者利 付, 关新元, 张春玉, 焱 李 申请人:中山大学肿瘤防治中心