专利名称：微小rna在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微小RNA及其应用领域，具体涉及微小RNA-15a (miR-15a)和微小 RNA-16-1 (miR-16-l)在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用。
背景技术：
miRNA是基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子，在肿瘤的发生过程起到调控的枢纽 作用。某些miRNA可能是潜在的癌基因或者抑癌基因，通过寻找具有癌基因和抑癌基因性 质的imRNA，不仅可为肿瘤的诊断也能为肿瘤的生物治疗提供新的耙标。miRNA相关的肿瘤基因治疗包括敲除或敲减癌基因性miRNA，引入抑癌基因性miRNA 两方面。 一方面引入与具有癌基因特性miRNA互补的合成反义寡核苷酸(Anti-miRNA Antisense Oligonucleotides, AMOs)，可有效的灭活肿瘤中的miRNA，延缓其生长(WeierJ, Hunziker J, Hall J. Anti2miRNA oligonucleotides (AMOs) : ammunition to target miRNAs implicated in human disease[J]. Gene Ther, 2006, 13 (6) : 496-502.)。使用与胆固醇耦联的 AMOs注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miR-16, miR-122， miR-192和miR-194的活性 (Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R,et al. Silencing of microRNAs in vivo with"antagomirs" [J] .Nature, 2005 ， 438 (7068) :685-689.)，因而可能成为一种有希望的治疗药物。临床上， 可以通过经常的或者持续的2'-0-甲基化或者锁定核酸(LNA)等修饰的反义寡核苷酸给药 使rmRNA失活。这些修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。另一方面，过 表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNA，如let-7家族也可以用于治疗某些特定的肿瘤。 利用病毒或者脂质体的表达系统可以瞬时引入大量imRNA。这些技术可以保证在某些组织 特异性的启动子控制之下，表达pre-miRNA及其两侧序列，并且刺激内源性的miRNA加工， 产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。miR-15a和miR-16-l位于13q14.3， 一个30kb的缺失区域，65。/。的B-CLL这两种基因表达 水平下调(Amelia C, George AC, Muller F, et al. MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2 [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (39) :13944-13949.)。下调的原因之 一是大约40X的肿瘤标本发生13ql4区域缺失(Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13ql4 inchronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl cad Sci USA, 2002, 99 (24) : 15524-15529.)。 CLL
病例13ql4纯合性或杂合性丢失是CLL最常见的染色体异常，50%的套细胞淋巴瘤，16~40% 的多发性骨髓瘤和60。/。的前列腺癌13ql4丢失。表明13ql4存在一个或多个肿瘤抑制基因， 与人类肿瘤的病原学发生有关。另一种可能的解释是，部分白血病患者的miR-15a/nuR-16-l 前体下游7bp处发生C—T突变，这一突变影响miRNA的加工成熟(Calin GA, Ferracin M， Cimino A, et al. A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J]. New Engl J Med， 2005, 353 (17) :1793-1801.)。 Amelia等(Amelia C, George AC, Muller F, et al. MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting Bcl-2 [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005, 102 (39) :13944-13949.)发现，在CLL中，miR-15a和miR-16-l 的表达与Bcl-2的表达成负相关，两种miRNA均可在转录后水平负性调节Bcl-2。 miR-15和 miR-16靠5'端的9个碱基序列相同，且这9个碱基与Bcl-2的3287-3279碱基互补。将 miR-15/miR-16转染入MEG-01细胞，可以发现细胞的凋亡，pro-caspase9和PARP的清除。
现有的研究表明mOl-15a/16-l可能与血液肿瘤的发生相关，但目前还没有此两种微小 RNA可用于肿瘤，尤其是淋巴瘤治疗和/或预防的证据。
发明内容
本发明的目的是将miR-15a和imR-16-l用于制备预防或治疗淋巴瘤的药物。
为此，本发明提供了以下技术方案 一种微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物
中的应用，所述药物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前
体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。
优选地，所述微小RNA或其前体经过公知的改良性修饰。
作为上述应用的一种具体化，本发明提供一种治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，该 组合物包括有效量的微小RNA和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，所述微小RNA为 微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中 两种以上的混合物。
作为上述组合物的一种优选还包括能够诱导肿瘤凋亡的化疗药物。所述的化疗药物 更优选能够诱导淋巴瘤细胞凋亡的药物如阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、甲氨 喋呤、三氧化二砷或它们中两种以上的混合物等。
所述微小RNA或其前体可通过化学合成得到，为增强其稳定性、生物利用度、组织靶 向性等药学特征，可对其进行公知的改良性修饰，如硫代修饰或甲氧修饰等；或者通过构 建真核表达载体得到，也即药物的活性成分中包括含有上述微小RNA序列的表达载体，该载体在体内表达后起到相应的药效作用。所述真核表达载体可为质粒载体或病毒载体，以 及其它可通过本领域公知手段获得的载体形式。
优选地，所述真核表达载体为质粒载体或病毒载体。
本发明所述的药物组合物适合用于预防和/或淋巴瘤，尤其Burkitt淋巴瘤的治疗。 本发明的基本原理本发明首先化学合成miR-15a和miR-16-l寡核苷酸，检测其对 Raji细胞有无凋亡诱导作用。化学合成的寡核苷酸片段小，容易转染入细胞。为研究成熟 的miR-15a/16-l与其前体对Raji细胞的影响有无功能上的差异性。本发明还构建了miR-15a 前体真核表达载体。通过将体外扩增合成的imR-15a前体序列构建于pGCSIL-GFP真核表 达载体，转染细胞后，在U6启动子的作用下转录为"茎环"结构的pre-miR-15a，通过细胞 内自身的RNA聚合酶III D1Cer的作用下剪接加工成为成熟的nnR-15a，从而发挥对靶基因 的调控作用。
本发明采用荧光定量PCR法检测转染后各组细胞内成熟miR-15a的表达量，实验证明 细胞内miR-15a的表达水平，在转染表达pre-miR-15a重组质粒后显著增高，细胞内Bcl-2 蛋白的表达水平显著下降，而各组Bcl-2mRNA的表达水平未见显著性差异，可见imR-15a 是在转录后水平对Bcl-2进行调控，即抑制Bcl-2mRNA翻译，从而下调Bcl-2蛋白的表达， 而不是直接降解Bcl-2 mRNA;进而采用台盼蓝拒染法和CCK8法均检测到miR-15a组、 miR-16-l组及pre-miR-15a组细胞48h和72h增殖活性显著下降，Hoechst染色从形态学上 可见miR-15a、 miR-16-l及pre-miR-15a处理组有明显的凋亡小体；FCM结果也显示该组 的细胞凋亡率要高于其他组，即miR-15a和miR-16-l促进了 Raji细胞的凋亡。结果表明， miR-15a和miR-16-l可通过抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，促进Raji细胞凋亡，降低细胞 的增殖活性，抑制细胞的生长，可用于制备相关的预防或治疗肿瘤的药物。
许多化疗药物均是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而产生抗癌效应的。Bcl-2家族是细胞凋 亡的重要调控基因，在细胞凋亡的过程中处于调控机制的终末部分，该基因家族在维持细 胞生理分化、发育和细胞数量的动态平衡中具有重要作用，其表达状态在一定程度上影响 着肿瘤的发生、发展及多药耐药性的产生。Bcl-2基因家族是目前最受重视的调控细胞凋亡 的基因家族，Bcl-2是Bcl-2家族中研究最广泛深入的成员之一，能够抑制p53对基因损伤反 应而诱导的凋亡，其过表达可导致细胞耐受不同的药物。在Bcl-2过表达的细胞中药物仍能 进入细胞内诱导细胞损伤，但这种损伤不能有效地转换成凋亡信号,以致肿瘤细胞的生理性 凋亡受抑，增加了肿瘤细胞的生存时间，结果在化疗期间表达BcI-2的肿瘤细胞仍能以较快 的速率重新生长。Bd-2的过表达在白血病细胞的凋亡中起重要作用，化疗药物本身抗凋亡的活性主要依赖于Bcl-2家族蛋白的表达。Bcl-2蛋白过度表达还可明显降低肿瘤细胞对阿糖 胞苷(Ara-C)、甲氨喋呤及环磷酰胺等多种化疗药物的敏感性。Ara-C是DNA多聚酶抑制 齐U，通过对DNA多聚酶的抑制，而影响DNA的复制。Ara-C是治疗急性白血病首选且非常
有效的化疗药物，是核苷类抗代谢药物的典范，其杀灭白血病细胞的能力与其诱导肿瘤细 胞的凋亡有关。
在本发明中，我们以转染随机序列(或阴性对照质粒)的细胞作为参照物，比较在不 同浓度的Ara-C作用下，转染miR-15a/16-l寡核苷酸(或表达pre-miR-15a重组质粒)的 Raji细胞与对照细胞之间细胞活力的差异。结果发现，转染miR-15a/16-l (或表达 pre-miR-15a重组质粒)的Raji细胞，在不同浓度Ara-C (0 80pg/ml)作用下，细胞活力 的抑制明显强于对照细胞，miR-15a/16-l+Ara-C组的IC50值明显降低。CCK8法检测显示 miR-15a/16-1 (或表达pre-miR-15a重组质粒)与Ara-C联用组的细胞增殖活力要远远低于 两者分别单用的组别(PO.05) 。 Hoechst染色可见到经转染miR-15a/16-l (或表达 pre-miR-15a重组质粒)的Raji细胞在使用Ara-C后出现大量凋亡小体。FCM检测细胞凋 亡率结果显示miR-15a/16-l+Ara-C组(或pre-miR-15a+Ara-C组)的细胞凋亡率明显增高， 较单用Ara-C或随机序列+Ara-C组(或阴性对照质粒+Ara-C组)的细胞凋亡率有显著性差 异(PO.05)。提示miR-15a/16-l可以通过调控Bcl-2的表达，而改变Raji细胞对Ara-C 的敏感性。由此，我们有足够的理由相信miR-15a/16-l或其前体可与能够诱导肿瘤凋亡的 化疗药物(例如Am-C)组成一种药物组合物，用于更好预防或治疗相关的肿瘤病症。
本发明具有如下的有益效果首先是为预防或治疗淋巴瘤提供了新的可选途径，通过 大量的实验证明了部分微小RNA应用于制备预防或治疗淋巴瘤的药物是切实可行的；其次 是证明了部分微小RNA可用作已知化疗药物的辅助性成分，或与己知的化疗药物联用，能 在抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡方面发挥更好的疗效。
图l转染24h后荧光显微镜下图(x100) A，B均为阴性对照质粒组。
图2转染miR-15a和miR-16-寡核苷酸RT-PCR测得Raji细胞的Bcl-2 mRNA表达水平；
M: marker, 1:空白对照组，2:随机序列组，3: miR-15a组，4: miR-16-l组。
图3转染表达pre-miR-15a重组质粒RT-PCR测得Raji细胞的Bcl-2 mRNA表达水平；
M: marker, 1:空白对照组，2:阴性对照质粒组，3: pre-miR-15a组。
图4转染miR-15a/16-l 48h流式细胞仪检测Raji细胞中Bcl-2蛋白的表达；
A:空白对照组，B:随机序列组，C: miR-15a组，D: miR-16-l组。图5转染表达pre-miR-15a重组质粒48h流式细胞仪检测Raji细胞中BcI-2蛋白的表达；
A:空白对照组,B:阴性对照质粒组，C: pre-miR-15a组。
图6台盼蓝拒染法检测miR-15a和miR-16-l对Raji细胞的生长抑制作用；
a:转染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸 b:转染表达pre-miR-15a重组质粒
*与空白对照组和随机序列组(或空白对照组和阴性对照质粒组)相比，P < 0.05。
图7转染miR-15a和miR-16-l作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光染色
x400);
A空白对照组；B随机序列组；CmiR-15a组；DmiR-16-l组。
图8转染表达pre-miR-15a重组质粒作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光染色 x400);
A空白对照组；B阴性对照质粒组；Cpre-miR-15a组。
图9流式细胞仪检测miR-15a和miR-16-1作用于Raji细胞48h的凋亡图(Annexin V/PI双
染法)；
A空白对照组；B随机序列组；CmiR-15a组；DmiR-16-l组。
图10流式细胞仪检测miR-15a和miR-16-l作用于Raji细胞48h的凋亡图(PI染色法)；
A空白对照组；B阴性对照质粒组；Cpre-miR-15a组。
图11 CCK8法检测miRNA联合Ara-C后Raji细胞活力的抑制；
a: miR-15a或miR-16-l寡核苷酸联合Ara-C; b:表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C。
图12 miR-15a和miR-16-l联合Ara-C对Raji细胞的生长抑制作用；
*与其它组相比，P<0.05。
图13表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C对Raji细胞的生长抑制作用； *P<0.05 (与其它组相比)。
图14转染miR-15a/16-l并联合Ara-C作用于Raji细胞48h的形态学改变(Hoechst荧光 染色 x400);
A:空白对照组，B:随机序列组，C: miR-15a组，D: miR-16-l组，E: Ara-C组，F:随机序 歹lJ+Ara-C组，G: miR-15a+Ara-C组，H: miR-16-l+Ara-C组。
图15转染表达pre-miR-15a重组质粒并联合Ara-C作用于Raji细胞48h的形态学改变 (Hoechst荧光染色 x400); A:空白对照组，B:阴性对照质粒组，C: pre-miR-15a组，D: Ara-C组，E:阴性对照质 粒+Ara-C组，F: pre-miR-15a+Ara-C组。图16转染miR-15a/16-l并联合Ara-C 48h后Raji细胞凋亡图。(流式细胞仪一AnnexinV/PI 双染法检测)；
A:空白对照组，B:随机序列组，C: miR-15a组，D: miR-16-l组，E: Ara-C组，F:随机 序列+Ara-C组，G: miR-15a+Ara-C组，H: miR-16-l+Ara-C组。
图17转染表达pre-miR-15a重组质粒并联合Ara-C 48h后Raji细胞凋亡图。(流式细胞仪 —PI染法检测)；
A:空白对照组，B:阴性对照质粒组，C: pre-miR-15a组，D: Ara-C组，E:阴性对照 质粒+Ara-C组；F: pre-miR-15a组+Ara-C组。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。 一、实验方法
1. miR-15a、 miR-16-l及pre-miR-15a (miR-15a前体)寡核苷酸的设计与合成
根据MiRBase (http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna)提供的miRNA基因序列， 获取人miR-15a、 miR-16-l和pre-miR-15a的序列。采用BLAST软件进行分析，确定随机对照 序列，nuR-15a、 miR-16-l寡核苷酸是由上海生物工程技术服务有限公司合成的单链全硫代
修饰。序列如下所示
化学合成的三条RNA:
miR-15a: 5,-uagcagcacauaaugguuugug-3' (22bp)
miR-16-l: 5，-uagcagcacguaaauauuggcg-3' (22bp)
scrambled sequence: 5'-cauuaaugucggacaacucaau-3' (22bp)
pre-miR-15a (对应的基因序列) (83bp) 5，-ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttgtggattttgaaaaggtgcaggccatattgtgctgcctcaaaaatacaagg-3'
negative control sequence: (83bp)
5'-3gCttttCC3咖3ttCtCCg犯CgtgtC3CgttCtCttg犯3Cgtg3C3CgttCgg3g肌gggttctCCgMCgtgtC3Cgt-3'
2. 质粒构建
2.1获得目的片段
(1)从"The miRNA Registry"数据库(http:〃mk:rorna.sanger.ac.uk/)中获得pre-miR-15a序 列，采用BLAST软件进行分析，确定阴性对照序列。设计并合成pre-miR-15a序列的获得 片段(pre墨miR-15 a-1: 5 ， -cgggt^gg|ccttggagtaaagtagcagcacataatggtttg tggattttgaaaaggtgc-3 ，； pre-miR-15a-2: 5，-ccggaattccttgtatttttgaggcagcacaatatg gcctgcaccttttcaaaatccac-3，)， 并弓i入v4ge
8/、&o7 /酶切位点。(2)PCR扩增获得目的片段反应体系为pre-miR-15a-l,2各5pL, ddH20 6单，10xbuffer2nL， MgCl20,5pL， DNTPs (2.5mM) 0.8|aL， pfti polymerase 0.2pL。反 应条件94。C30s; 94。C 30s; 55°C 30s; 72°C 30s; 72。C 2min， 20个循环。(3)酶切PCR 片段使用Jge//￡coR /进行酶切消化，酶切反应体系PCR产物(100ng/^iL)5nL, 10xbuffer 5pL， 100xBSA0.5nL， (10卵)lpL， / (10 U尔L) lpL, ddH20定容至50pL。
置于37。C， lh。 2.2重组质粒的构建
(1X4ge/和￡coi /酶切pGCSIL-GFP载体以使其线性化。酶切反应体系纯化的DNA 质粒(1 lug/)Ltl) 2pL， 10xbuffer 5|iL, 100xBSA0.5(iL, ^ge/ (lOU/pL) 1^iL,fc(^/ (10 U/^L) lpL,ddH20定容至5(^L。置于37'C， lh。 (2)氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态 细胞。从于37^培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到含100mlLB的烧瓶中。 37。C剧烈振摇培养3 h后，转到冰预冷的50 ml聚丙烯管中，冰上放置10mm。 4 。C， 4000rpm， 10min，回收细胞。倒出培养液，10 ml冰预冷的CaC2 (O.lmol/L)重悬每份 沉淀，4。C,4000rpm， 10mm，回收细胞。倒出培养液，CaCl2 (O.lmol/L)重悬每份沉淀。 -70°(3冻存。(3)连接。反应体系酶切回收的载体DNA (100ng/nl) lpL，退火的双 链DNA (100 ng/|al) lpL， 10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液lpL, T4噬菌体DNA连接 酶lpL， ddH20定容至10pL。置于4'C 12h。 (4)转化。无菌吸头取感受态细胞悬液200pL 至无菌微量离心管，加入2^L连接液，混匀，置冰上30mm。 42'C温浴90s,迅速冷却2min。 加入800pL SOC培养基，37'C摇床温浴45min。取150jiL转移至含MgS04 (20 mmol / L) 和Amp抗性(100叫/ml)的LB琼脂培养基上。37"培养16h。 2.3阳性克隆的PCR鉴定
利用载体上的序列作为引物进行PCR鉴定阳性克隆。引物序列为上游引物5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3，，下游引物5'- GTAATACGGTTATCCACGCG -3，。 PCR反应体系:上、下游引物各0.4^L， 10xbuffer2^iL， MgCL2 0单，DNTPs (2.5 mM) 0.8(xL， Taq polymerase 0.2(iL， Template l(xL， ddH20定容至20pL。 2.4测序
挑选阳性克隆PGCSIL-GFP-pre-miR-15a菌液送测序(美季公司进行ABI 3733型测序 仪进行测序分析)。 3.从大肠杆菌中提取质粒
使用商用试剂盒或公知常用的质粒提取法提取质粒。
94. 细胞培养
Raji细胞系购于上海细胞库。将Raji细胞接种于含体积分数10。/。新生牛血清、100U/mL 青霉素禾P100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积分数5%(:02的培养箱371:连续培养。
5. 实验分组及细胞转染 5.1实验分组
实验在研究miR-15a/16-l寡核苷酸诱导Raji细胞凋亡部分分4组空白对照组、随机 序列组、miR-15a组和miR-16-l组；
在研究表达pre-imR-15a重组质粒诱导Raji细胞凋亡部分分3组空白对照组、阴性 对照质粒组、pre-miR-l5a组；
在研究rmR-15a/16-l寡核苷酸增强Ara-C诱导Raji细胞凋亡部分分8组空白对照组、 随机序列组、miR-15a组、miR-16-1组、Ara-C组、随机序列+Ara-C组、miR-15a + Ara-C 组和miR-16-l + Ara-C组；
在研究表达pre-miR-15a重组质粒增强Ara-C诱导Raji细胞凋亡部分分6组空白对 照组、阴性对照质粒组、pre-miR-15a组、Ara-C组、阴性对照质粒+ Ara-C组和pre-miR-15a + Ara-C组 5.2细胞转染
(1) 根据分组,在转染前一天，以4-8xl()S/mL的细胞密度接种到96孔培养板上；
(2) 溶液a的配制按每孔12.5pL无血清培养基+0.5^L Lipofectamine 2000进行；
(3) 溶液b的配制按每孔12.5pL无血清培养基+0.2pg质粒(或寡核苷酸)进行,配 好后室温下放置5min;
(4) 将溶液a与溶液b混合，室温下置20min;
(5) 与此同时，将96孔板中的细胞换用无血清培养基，终体积为125^L;
(6) 将溶液a与溶液b的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37'C， 5%
的C02中保温5-6h;
(7) 6h后，更换含有血清的全培养基，在37。C, 5%的032培养箱中培养。 转染效率的检测转染24h后,在荧光显微镜下选10个200倍视野，每个视野中统计200
个细胞中带绿色荧光的细胞数，计算荧光细胞的百分比。
6. 半定量RT-PCR检测转染细胞Bcl-2 mRNA表达水平
将转染48h的各组细胞在无菌条件下进行离心收集。应用细胞总RNA抽提纯化试剂盒和RT-PCR试剂盒测定Bcl-2 mRNA的水平。 6.1细胞总RNA的提取和纯化
1) 收集离心细胞，去其上清，用PBS洗两次后，将细胞转移入1.5mL离心管中，每管 加Trizol试剂lmL，摇匀，室温下置15min后，反复吹打裂细胞；
2) 将各管内消化好的细胞裂液吸到一DEPC处理过的1.5mLEP管中，加氯仿0.2mL (Trizol:氯仿约为5: 1)，轻摇15s，并在冰上孵育15min;
3) 12， 000rpm， 15min， 4°C，离心。然后取上清无色水相到DEPC处理过的EP管， 加0.5mL异丙醇，室温下置10min;
4) 12， 000ipm， 10min， 4'C，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清；
5) 加入用DEPC水新配制的经预冷的75V。乙醇1.0mL，轻轻洗涤沉淀，12， OOOrpm， 5min， 4。C离心；
6) 去上清，时离心，用小Tip吸干液体；使沉淀自然干燥，DEPC处理水20-30pL加 入，混匀，55-60。C7乂浴10min溶总RNA;
7) 用紫外分光光度仪测总RNA纯度和浓度，用琼脂糖胶电泳鉴定RNA是否水， 鉴定后于-7(TC保存备用。
6.2细胞总RNA的鉴定
浓度分析和纯度鉴定从提取的RNA中吸取lpL，以DEPC水稀释至100juL，用紫外分 光光度仪分别测总RNA的浓度，光吸收度A260和A280的比值(A260/A280)。 6.3逆转录反应
取上述RNA样品，将其稀释成l吗/jaL，在PCR管中加入下列试剂的混合物
RNA3pL (3)_ig)
Random Primer (lO^M)2|oL
dNTP Mixture (2,5岸)2^L
5xFirst- Strand Buffer化L
DTT (0.1M)l^L
RNase inhibitor (10U/)_iL)0.5^
M-MLV (200U)
RNase-free ddH20定容至50pL
在PCR仪上按照下列条件反应42。C温浴50min,95。C加热5min, 时离心，-20。C保存备用。
6.4 PCR扩增
Bcl-2引物序列如下上游引物5'-GTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，下游引物5'-CT TCAGAGACAGCCAGGAG-3 ',产物长度212bp.内对照卩-actin弓|物序列:上游弓|物5'-TGTA TGCCTCTGGTCGTACC AC-3 ，,下游5 ， - AC AGAGTACTTGCGCTC AGGAG-3 ，,产物长度 592bp。
取上述产物cDNA先扩增内参P-actin，然后根据p-actin的结果，确定cDNA合成是否成 功，对合成成功的标本进行PCR反应，在扩增管中依次加入下列试剂
cDNA (模板) 2jiL
上游引物(lOpM) lpL
下游引物(10nM) 2pL
dNTP Mixture (2.5mM) 4pL
10xTaq buffer (含MgCl2) 5jiL
Taq酶(2.5U尔L) l(aL
ddH20 36^L 上述试剂混匀，按如下扩增条件PCR: 94°C变性lmin,55。C复性45s,72。C延伸lmin， 循环30次，72'C保温5min。 PCR产物在3。/。的琼脂糖凝胶上电泳观察并照相，于Gel-DoclOOO 型紫外凝胶图像分析仪上观察、分析。
7.荧光定量PCR检测法(Hairpin-it miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit)检测
miR-15a的表达水平 7.1RNA提取(方法同前) 7. 2 RT反应合成cDNA
按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为 20pL体系。
5 xRT Buffer 5^L DTT (0.1M) 2.5pL dNTP (10mM) 0.75jaL Mg2+ (25mM) 3|_iL miR-RT primers (l,) 1.25|^L 脂asin (40U/nL) 0.25pL
12MMLV Reverse Transcriptase (200U/nL) 0.5|iL RNA Sample (0.2 ng to 200 ng total RNA) XpL Rnase Free H2O to 20pL 在逆转录反应之前须将除了逆转录外的各种试剂和逆转录rmx混匀，用手指轻弹装试 剂的管子。反应条件为16。C30min， 42。C30min， 85°C10min。反应产物于-20。C保存。 7.3 Real-Time PCR检测miR-15a的表达情况
按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为
20laL体系。
2xReal-time PCR Buffer 1 O^L
miR specific Primer set (5jxM) O,L
miRNA RT product 2pL
Taq DNA polymerase (5U/(iL) 0.2nL dd H20 To 20pL
反应条件为95。C预热3min，如下反应进行40个循环95。C变性12s， 55。C复性25s,72T: 延伸25s。
8. 间接免疫荧光及流式细胞仪检测Bcl-2蛋白表达情况
离心收集转染后48h的各组细胞，用4%多聚甲醛室温固定30min,PBS洗后加体积分数 30/oH2O2，室温10min,PBS洗3次，每次5min,加10g/LTritonX-100,室温10min,PBS洗后加血清 室温封闭40min，甩去不洗，滴加鼠抗人Bcl-2抗体，4'C过夜，次日复温30min, PBS洗,加入 2(^LCy3标记的羊抗鼠二抗孵育细胞，室温避光反应30min,PBS洗3次，每次5min,PBS混匀 后上机，流式细胞仪(FCM)测定Bcl-2蛋白表达的阳性率。
9. 台盼蓝细胞计数法
将对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，按照上述步骤进行转染，分别于24，48和72h 收获细胞,常规台盼蓝(0.5%)染色,用血球计数板计数活细胞数目,实验重复三次.
10. CCK8法测细胞生长抑制率及IC50值 将对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，按照上述步骤进行转染，置于37'C、饱和
湿度、5。/。C02条件下常规培养24、 48和72h后，向每孔内加入30pL CCK8，再置于37。C孵 育4h。然后直接在联检测仪上450nm波长处测A柳值，以A45q间接反映细胞存活数量。 实验重复3次，据此可推算miR-15a和miR-16-l转染后各时间点对Raji细胞的抑制率。 按上述方法分组及转染Raji细胞，分别与不同浓度的Ara-C (0、 5、 10、 20、 40、80吗/ml)孵育，24h后CCK8法测各组A45o值，并计算以下参数
药物浓度为N时的OD值-空白孔OD值
① 细胞活力 X100%
药物浓度为0时的OD值-空白孔OD值
② 半数抑制浓度(IC50):采用概率单位法PROBIT (Probability umt)。
11. Hoechst染色试剂盒观察凋亡细胞形态
收集经脂质体转染48小时的细胞，离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml 固定液，混匀，固定10分钟。离心去固定液，PBS洗两遍。最后一次离心后吸去大部分液 体保留约50)^1液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，晾干.均匀滴上0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色5分钟,晾干。PBS洗两遍。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片匕盖十.-洁 净盖玻片，避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。
12. 流式细胞仪检测细胞凋亡率
12.1 AnnexinV/PI双染法
离心收集转染后48h的各组细胞，PBS洗涤2次，离心去上清，195|iL Annexin V-FITC 结合液重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5pL,避光孵育10min，离心去上清，190|iL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10pL碘化丙啶染色液，冰浴避光放置，随即进行流式细胞 仪检测，用MULTCYCLE软件分析处理结果.
12.2 PI染色法
离心收集转染后48h的各组细胞,PBS洗涤2次，离心去上清，用-2(TC预冷的体积分数 70。/。乙醇在4t:固定30min，然后弃去乙醇，力Q500nL PBS混匀细胞，然后加入碘化丙啶(PI)， 避光染色15min。置流式细胞仪测定各组细胞凋亡率，用MULTICYCLE软件分析处理结果。
13. 统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行数据的统计学分析。实验数据以均值±标准差表示，多组间数 据比较，采用完全随机区组设计的单因素方差分析，组间的比较选用可进行多个样本均数 间每两个均数比较的q检验或Bonferroni检验，IC50值计算采用Probit单位概率法。 二、 miR-15a和miR-16-l抑制Raji细胞生长 1、 pre-miR-15a重组质粒的成功构建
质粒测序结果如下GACCC，测序结果显示所得重组质粒成功插入pre-miR-15a序列。
2、 细胞转染效率
将转染阴性对照质粒24h后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察，可见到部分细胞呈现 绿色荧光(转染质粒中含有编码绿色荧光蛋白的基因)，在荧光显微镜下选10个200倍视野 每个视野中统计200个细胞中带绿色荧光的细胞数，计算荧光细胞的百分比即转染率，其值 为(39±2.4%)。后面的实验均按该转染效率下的脂质体与质粒比例进行转染。图l为转染 24h后在倒置荧光显微镜下见到的图片。
3、 荧光定量PCR法检测miR-15a的表达水平
转染表达pre-miR-15a重组质粒24h后，各组Gr值及摩尔数见表1。经统计学分析， pre-miR-15a组的rmR-15a &值及摩尔数较空白对照组和阴性对照质粒组明显增加，差异有 统计学意义(P<0.05)。
表l转染pre-miR-15a24h后Raji细胞中miR-15a的表达量i士 s ， n=3)
分组c丁值Moles (nmol)
空白对照组23.98±0.381.51e+001土0.64
阴性对照质粒组23.16±0.423.02e+001±0.38
pre-miR-15a组19.06±0.35^0.93e+002±0.49*
*与其他组相比，P<0.05
4、 RT-PCR检测转染后Bcl-2 mRNA表达水平
由Bcl-2扩增产物的凝胶电泳(图2， 3)可见，内对照P-actin在各处理组均有表达,Bcl-2 扩增产物电泳区带约在210bp位置，与设计引物的理论值一致。对电泳产物分析，计算Bcl-2 mRNA/(3-actin的光密度0D比值，反映各组相对丰度。转染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸48h 后，各处理组Bcl-2表达的相对丰度依次为空白对照组0.985±0.006，随机序列组 0.978±0.009， miR-15a组0.974士0.010， miR-16-l组0.989士0.003，各组间差异无显著性 (P〉0.05)。转染pre-miR-15a表达质粒48h后，各处理组Bcl-2表达的相对丰度依次为空 白对照组0.976±0.005,阴性对照质粒组0.985±0.007， pre-miR-15a组0.969士0.009，各组间亦无 显著性差异(P〉0.05)。表明miR-15a和miR-16-l不降解Bcl-2mRNA。
5. 间接免疫荧光及流式细胞仪检测Bcl-2蛋白表达情况(图4,5)
图4，5的结果显示，Raji细胞经转染miR-15a和miR-16-l (或pre-miR-15a表达质粒)48h后,Bcl-2蛋白的表达量均降低，与空白对照组和随机序列组(或空白对照组和阴性对照质粒 组)比较,差异有显著性(P<0.05);而空白对照组与随机序列组(或空白对照组与阴性对 照质粒组)间差异无显著性(P〉0.05)，各组Bcl-2蛋白表达量见表2， 3。 表2转染miR-15a/16-l寡核苷酸48hBc-2 表3转染表达pre-miR-15a重组质粒48h
蛋白表达量(iis， n=3) Bcl-2蛋白表达量(I±s， n=3)
分组/荧光阳性率 Bcl-2蛋白表达量(％) 空白对照组 95.8±0.6 随机序列组 94.9±0.9 miR-15a组 65.6±1.1* miR-16-l组 63.8士1.3*
分组/荧光阳性率 Bcl-2蛋白表达量(。/。) 空白对照组 97.8±0.6 阴性对照质粒组 96.8±0.9 pre-miR-15a组 58.4±1.1*
*与其它组相比，PO.05 *与其它组相比，PO.05
6、 台盼蓝拒染法检测miR-15a和miR-16-l对淋巴瘤细胞Raji的生长抑制作用 结果显示,终浓度为0.6pmolZL的miR-15a和miR-16-l寡核苷酸(或pre-miR-15a表达质
粒)转染Raji细胞后，24h作用效果不明显，差异无显著性(P>0.05) ,48h和72h可发挥 对细胞的生长抑制作用,且随着作用吋间的增加,效果逐渐增强，48h作用效果明显,有明显的 时效关系(图6)。
7、 CCK8法检测miR-15a和miR-16-l对Raji细胞生长的影响
表4显示转染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸的Raji细胞增殖能力最差，其24h,48h 和72hOD值均明显低于空白对照组和随机序列组(P<0.05)，其中转染24h后，miR-15a 组与随机序列组之间经Bonferroni检验即显示差异有显著性,P岣.005， miR-16-l组与随机序 列组之间差异亦有显著性，P=0.014;表5显示pre-miR-15a组细胞的增殖能力较空白对照 组和阴性对照质粒组弱，差异有显著性(PO.05)，其中转染24h后，pre-nnR-15a与阴性 对照质粒组之间经Bonferroni检验显示差异有显著性,P二0.004;说明miR-15a和miR-16-l 能够抑制Raji细胞的生长与增殖，且24h,48h和72h均可发挥作用,随作用时间的增加,效果 逐渐增强,72h作用效果最明显,且有明显的时效关系。
表4转染miR-15a和miR-16-l后CCK8法检测Raji细胞吸光度A值(7±、11=5)
分组_^_^_^_
空白对照组 1.209±0.029 1.419±0.018 1.599±0.015
随机序列组 1.208±0.021 1.417±0.013 1.604±0.014
miR-15a组 1.115±0.015* 1.207士0.038* 1.242±0.035*
16miR陽16-l组 1.137±0.016* 1.211±0.040* 1.241±0.032
*与其他组相比^<0.05
表5转染表达pre-miR-15a重组质粒后CCK8法检测Raji细胞吸光度A值(± s, ir分组 24h48h72h
空白对照组 1.432±0.0161.541±0.0131.652±0.010
阴性对照质粒组 1.439±0.0131.543±0.0051.646±0.007
pre-miR-15a组 1.328±0.00741.298±0.005*1.288±0細*
*与其他组相比，PO.05 8、 Hoechst染色检测细胞凋亡形态
图7， 8为转染后48hHoechst染色图。miR-15a组和miR-16-l组及pre-miR-15a组均可 见明显的凋亡细胞核膜完整，体积变小，核质固缩；而其他组未见明显凋亡细胞。 9、流式细胞仪检测细胞凋亡率
转染miR-15a和miR-16-l寡核苷酸后48h，流式细胞仪一AnnexinV/PI双染法显示 miR-15a组的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为9.74%和9.65%,， miR-16-1组的早期凋亡率 和晚期凋亡率分别为9.70%和9.34%，与空白对照组和随机序列组比较差异有显著性
(P<0.05)。而空白对照组和随机序列组的凋亡率差异无显著性(P>0.05)，见表6。转染表 达pre-miR-15a重组质粒后48h,pre-miR-15a组的凋亡率为12.43%，显著高于空白对照组 和阴性对照质粒组(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照质粒组间差异无显著性(P〉0.05)， 见表7。可见，miR-15a和miR-16-1可诱导Raji细胞的凋亡(图9， 10)。
表6转染miR-153和1^11-16-1后48h流式细胞仪一AnnexinV/PI双染法
_检测Raji细胞的凋亡(7± s ， n=5)_
分组/凋亡率_早期凋亡率/%_晚期凋亡率/%
空白对照组 0.70±0.2 1.73±0.3
随机序列组 2.18±0.4 1.54±0.3
miR-15a组 9.74±0.5* 9.65士0.4"^
miR-16-l组_9,70±0.8*_9.34士0.6*_
永与其它组比,P0.05 表7转染表达pre-miR-15a重组质粒后48h流式细胞仪一PI染法
_检测Raji细胞的凋亡(5土s， n=5)
分组/凋亡率 凋亡率/%空白对照组
阴性对照质粒组
pre-miR-15a组
1.26±0,34.69±0,612.43±1.2*
*与其它组相比，PO.05三、miR-15a和miR-16-l可增强Raji细胞对阿糖胞苷敏感性1.CCK8法检测IC50值变化
1.1转染miR-15a/16-l寡核苷酸入Raji细胞后Ara-C IC50值的变化
转染miR-15a的Raji细胞在0、 5、 10、 20、 40、 80jng/ml 6种浓度的Ara-C作用24h后，
细胞活力分别为(97.15±5.87 % ) 、 ( 67.0±3.96% ) 、 ( 37.23±2,98% ) 、 ( 20.15±2.24% )、(0.85±0.02%)、 (0.01±0.01%),转染miR-16-l的Raji细胞活力分别为(96.85±6.14% )、(66.38±4.53%)、 (37.77±3.61%)、 (20.85±3.01%)、 ( 1.69±0.75%)、 (0.31±0.06%)，明显低
于相应Am-C浓度作用下，转染随机序列的Raji细胞活力分别为(99.54±6.23 % )、(73.00±4.09%)、 (51.06±3.52%)、 (26.46±2.96%)、 (4.62±1.38%)、 (1.92±0.96%),尸值均
<0.05，见图lla。可见，转染miR-15a/16-l寡核苷酸入Raji细胞后可使Ara-C的IC50值
明显降低，各组IC50值见表8。
1.2 转染表达pre-miR-15a重组质粒入Raji细胞后Ara-C IC50值的变化
转染表达pre-miR-15a重组质粒的Raji细胞在0、 5、 10、 20、 40、 80|ug/ml 6种浓度的Ara-C作用24h后，细胞活力分别为(96.08±6.3% )、 (67.85±4.9%)、 (38.46±2.1%)、
(14.62±2.4%)、 (1.00±0.4%)、 (0.08±0.08%),明显低于相应Ara-C浓度作用下，转染阴性对照质粒的Raji细胞活力分别为(96.00±5.3 % ) 、 ( 72.00±4.8% ) 、 (51.38±4.4% )、
(26.00±3.8%)、 (8.00±2.1%)、 (2.23±1.6%),尸值均<0.05，见图llb。可见，转染表达pre-miR-15a重组质粒入Raji细胞可使Ara-C的IC50值明显降低，各组IC50值见表9。
表8转染miR-15a/16-l寡核苷酸入
表9表达pre-miR-15a重组质粒入
Raji细胞Ara-C IC50值的变化Raji细胞Ara-C IC50值的变化组别IC50值(ug/mL)分组IC50值(ug/mL)
空白对照组15.43±1.21空白对照组15.37±0.69
随机序列组14.92±1.08阴性对照质粒组15.14±0.79
miR-15a组10.41±0.96*pre-miR-15a组10.02士0.84'
miR-16-l组10.86±0.78*
*与其它组相比，P<0.05
*与其它组相比，P<0.052. 台盼蓝拒染法检测细胞生长抑制情况
2.1 miR-15a/16-l寡核苷酸联合Ara-C后对Raji细胞的生长抑制作用
实验结果显示，终浓度为0.6pmol/L的miR-15a/16-l寡核苷酸转染Raji细胞后，miR-15a+Ara-C组和miR-16-l+Ara-C组的细胞数较单用miR-15a组、单用miR-16-l组、单用Ara-C组及随机序列+Ara-C组明显降低，miR-15a/16-l寡核苷酸作用24h时开始发挥作用，且随着作用时间的增加，其效果逐渐增强,72h作用效果明显.(图12)2.2表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C后对Raji细胞的生长抑制作用
实验结果显示，表达pre-miR-15a重组质粒联合10吗/ml的Ara-C后,Raji细胞的生长较其他组明显受到抑制(P<0.05)，于24h开始发挥作用，且随着作用时间的增加，其效果逐渐增强,72h作用效果明显.(图13)
3. CCK8法检测细胞增殖情况
3.1 CCK8法检测miR-15a/16-l寡核苷酸联合Ara-C对Raji细胞生长的影响
CCK8结果(表10)显示Raji细胞在经miR-15a/16-l寡核苷酸和10吗/mLAra-C联合处理后，细胞增殖活性大大降低，并明显低于其它组别(P<0.05);而Ara-C与随机序列联合作用导致的细胞增殖活力与单用Ara-C组相当，无显著差异(P>0.05)。这说明转染miR-15a或miR-16-l寡核苷酸可以增强Ara-C对Raji细胞生长的抑制作用。
表10 miR-15a和miR-16-l寡核苷酸联合Am-C CCK8法检测Raji细胞吸光度A值
(x ± s,n=5)
组别24h48h72h
空白对照组1.414±0.0121.459±0條1.532±0.010
随机序列组1.405±0.0041.457±0細1.535±0.007
miR-15a组1.291±0.0111.238±0遍1.201±0.006
miR-16-l组1.302±0.0081.251±0.0221.200±0.007
Ara-C组1.200±0.0121.151±0.0121.097士0.010
随机序列+Ara-C组1.199±0.0091.163±0.0101.098±0.009
miR-15a+Ara-C组1.014±0.020*0.844±0.012*0.631士0.01(f
miR-16-l+Ara-C组1.010士0.03(f0.851±0.014*0.639±0.010*
承其他组相比，P《.05。3.2 CCK8法检测表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C对Raji细胞生长的影响
CCK8结果(表ll)显示转染表达pre-miR-15a重组质粒并加用10吗/mL Ara-C后
19的Raji细胞增殖能力最差，pre-miR-15a+Ara-C组的CCK8值要显著低于空白对照组、阴性对照质粒组、pre-miR-15a组、Ara-C组、阴性对照质粒+Ara-C组(PO.05);而Ara-C联用阴性对照质粒与单用Ara-C相比细胞增殖活性无明显差别(P〉0.05)。这说明表达pre-nnR-15a重组质粒与化疗药物Ara-C联用后可以增强Ara-C对Ra力细胞生长的抑制作用。表11表达pre-miR-15a重组质粒联合Ara-C CCK8法检测Raji细胞吸光度A值
(x ± i1, n=5)
组别24h48h72h
空白对照组1.292±0.3811.436士0.2961.546±0.159
阴性对照质粒组1.237±0.4261.396±0.3611.458±0.312
pre-miR-15a组1.189±0.5671.215±0.6231.314±0.432
Ara-C组1.098±0.1691.148±0.3981.159±0.231
阴性对照质粒+Ara-C组0.967±0.3591.103±0.5781.116±0.553
pre-miR-15a+Ara-C组0.775±0.216*0.718±0.648*0.619±0.156*
求与其他组相比，PO，05。4. Raji细胞凋亡的形态学改变
经转染miR-15a/16-l寡核苷酸或表达pre-miR-15a重组质粒并联合Ara-C组经Hoechst
染色后均可见大量凋亡细胞核膜完整，体积变小，核质固縮；而其他组未见或仅见少量凋亡细胞(图14,15)。5.细胞凋亡率分析
5.1转染miR-15a/16-l寡核苷酸及联用Ara-C (流式细胞仪一AnnexinV/PI双染法)
各组细胞凋亡率见表12。 miR-15a或miR-16-l寡核苷酸与Ara-C (10吗/mL)联用时的细胞凋亡率最高，与单用miR-15a或miR-16-l寡核苷酸、单用Ara-C、随机序列联用Ara-C组相比有显著性差异(PO.05);而随机序列+Ara-C组与单用Ara-C组之间、miR-15a与miR-16-l之间比较细胞凋亡率未见显著性差异(P>0.05)。表明miR-15a/16-l寡核苷酸与Ara-C联用可显著增加细胞的凋亡率。(图16)
表12转染miR-15a/16-l及并联合Ara-C后48h流式细胞仪双染法检测Raj湖胞凋亡率
(7 ± s ， n=5 )
组别/凋亡率_早期凋亡率/%_晚期凋亡率/%
空白对照组 0.25±0.3 0.65±0.1
随机序列组 0.96±0.1 2.26±0.2miR-15a组miR-16-l组Ara-C组
随机序列+Ara-C组miR-15a+Ara-C组miR-16-l+Ara-C组
6.99逸44.73±0.510.88±0.314.39±0.520.93±0,6 :20.69±0.8 '
10.08±0.3
10.64±0.4
11.83±0.2
11.93±0,4
25,27±0.5*
23.13±0.7*
承与其他组相比,P0.055.2转染表达pre-miR-15a重组质粒及联用Ara-C (流式细胞仪一PI染法)
各组细胞凋亡率见表13。表达pre-miR-15a重组质粒与Ara-C (10吗/mL)联用的细胞凋亡率最高，与单用表达pre-rmR-15a重组质粒、单用阴性对照质粒、单用Am-C、阴性对照质粒联用Ara-C相比有显著性差异(PO.05);而单用Am-C与阴性对照质粒联用Am-C之间细胞凋亡率未见显著性差异(P>0.05)。表明表达pre-miR-15a重组质粒与Ara-C联用可显著增加细胞的凋亡率。(图17)
表13转染表达pre-miR-15a重组质粒及联合Ara-C后48h流式细胞仪单染法检测Raji细胞凋亡率(i±s, n=5)
组别/凋亡率
凋亡率/%
空白对照组1.93±0.1
阴性对照质粒组3.40±0.5
pre-miR-15a组12.24±1.0
Ara-C组20.87±0.5
阴性对照质粒+Ara-C组21.76±1.2
pre-miR-15a+Ara-C组32.56±1,4*
*与其它组相比，PO.05上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。<110><120><130〉〈160〉〈170><210〉<211〉<212〉<213〉<220〉<221〉<222〉〈223〉<400〉
序列表
暨南大学
微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用
090612
13
Patentln version 3. 31
22RNA
人工序列
micro腿(l).. (22)miR-15a序列1
U3gcagcac3 im肌gguuug ug 22
<210> 2
<211〉 22
〈212〉 RNA
<213〉人工序列
<220〉
<221〉 microRNA〈222〉 (1).. (22)〈223〉 microRNA 16-1序列〈400> 2
U3gc3gcacg im幼U3Uugg eg 22
<210> 3
<211〉 22
〈212〉 RNA
<213〉人工序列
〈220〉
<221> misc—feature〈222〉 (1).. (22)<223〉随机序列〈400〉 3
cauuaauguc ggacaacuca au 22
<210〉 4
<211〉 83
〈212> 鹏
<213> Homo sapiens
<220>
<221〉 gene
<222> (1). . (83)
<223> pre-raiR-15a前体基因序列〈400〉 4
ccttggagta aagtagcagc acataatggt ttgtggattt tgaaaaggtg caggccatat 60
tgtgctgcct c肌aaat3ca 3gg 83
<210〉 5
<211〉 83
<212〉 DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<221〉 gene<222〉 (1). . (83)
〈223〉根据pre-miR-15a前体基因序列设计的阴性对照序列<400〉 5
agcttttcca aaaattctcc gaacgtgtca cgttctcttg aaacgtgaca cgttcggaga 60
agggttctcc gaacgtgtca cgt 83
<210〉 6
<211> 62
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature<222> (1).. (62)
<223> pre-miR-15a前体基因的获得片段1<400〉 6
cgggtaccgg tccttggagt aaagtagcag cacataatgg tttgtggatt ttgaaaaggt 60gc
<210〉 7<211〉 59<212〉 DNA<213>人工序列<220>
<221〉 misc—feature<222> (l)..卿
<223〉 pre-miR-15a前体基因的获得片段2<400〉 7
ccggaattcc ttgtattttt gaggcagcac aatatggcct gcaccttttc aaaatccac 59
<210> 8
<211〉 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc—feature<222> (1)..(24)
<223>包含pre-miR-15a前体基因序列的重组质粒构建过程所用阳性克隆鉴定引物1<400〉 8
cctatttccc atgattcctt cata 24
〈210> 9
〈211〉 20
<212〉 DNA
<213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature〈222〉 (1). . (20)
〈223〉包含pre-miR-15a前体基因序列的重组质粒构建过程所用阳性克隆鉴定引物2
<400〉9
gt犯tacggt tatccacgcg〈210〉10
<211>19
<212〉DNA
<213〉人工序列
<220>
<221〉misc—feature
〈222〉(l).. (19)
<223>Bcl基因检测引物1
<400〉10
gtggccttct ttgagttcg<210〉11
<211>19
<212〉DNA
<213>人工序列
<220〉
<221〉misc—feature
<222〉(l).. (19)
<223>Bel基因检测引物2
<400>11
CttC3gag3C 3gCC3gg3g<210>12
〈211〉22
〈212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<221〉misc—feature
〈222〉(l)..咖
<223〉P-actin引物1
<400>12
tgtatgcctc tggtcgtacc ac〈210〉13
〈211〉22
20
19
19
22
24<212> DNA<213>人工序列〈220〉
<221> misc—feature
<222〉 (1)..咖
<223> P-actin引物2
<400〉 13
acagagtact tgcgctcagg ag
权利要求
1、微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，其特征在于所述药物的活性成分包括微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。
2、 根据权利要求l所述微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，其特征在 于所述微小RNA或其前体经过公知的改良性修饰。
3、 根据权利要求2所述微小RNA在制备治疗和/或预防淋巴瘤药物中的应用，其特征在 于所述微小RNA或其前体为单链或由该单链和该单链的互补链构成的双链形式。
4、 一种治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于包括有效量的微小RNA和药 学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，所述微小RNA为微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小 RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物。
5、 根据权利要求4所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于所述药物的 活性成分还包括能够诱导肿瘤凋亡的化疗药物。
6、 根据权利要求5所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于所述化疗药 物为阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、柔红霉素、甲氨喋呤、三氧化二砷或它们中两种以上的 混合物。
7、 根据权利要求6中任一项所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于所 述微小RNA或其前体经过公知的改良性修饰。
8、 根据权利要求4-7中任一项所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于所 述微小RNA或其前体通过化学合成得到；或者通过构建真核表达载体得到。
9、 根据权利要求S所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于所述真核表达载体为质粒载体或病毒载体。
10、 根据权利要求4-7中任一项所述治疗和/或预防淋巴瘤的药物组合物，其特征在于所述淋巴瘤为Burkitt淋巴瘤。
全文摘要
本发明涉及微小RNA在制备治疗和/或预防肿瘤药物领域的应用。具体是将微小RNA-15a、微小RNA-16-1、微小RNA-15a的前体、微小RNA-16-1的前体或它们中两种以上的混合物用于制备此类的药物。本发明通过将上述寡核苷酸序列在淋巴瘤细胞中过表达，证明上述序列有抑制淋巴瘤细胞生长和促进其凋亡的作用，并进一步揭示它们与化疗药物如阿糖胞苷等的联用可增强原有药物的效力，从而确证了上述寡核苷酸序列在制备治疗和/或预防肿瘤药物领域的应用潜能。此类的药物可以是单独的包含上述任一种寡核苷酸序列或其混合物及药用载体的组合物，或者是还包括化疗药物的联用组合物。
文档编号A61K31/7068GK101590243SQ20091004047
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者何冬梅, 琴 谌 申请人:暨南大学