专利名称：一种次级淋巴趋化因子slc的制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，是人次级淋巴趋化因子SLC的一种新的制备方法。
背景技术：
趋化因子是由一类结构上相关、功能上不同的小分子细胞因子(8-12KDa)组成的家族。它们在多种组织细胞和白细胞内表达。趋化因子在机体生理和病理状况下，都起着重要的作用。在炎症、肿瘤、自身免疫病、血管生成、变态反应、干细胞的分化、次级淋巴器官的发育、AIDS等病毒感染中均有趋化因子及受体的参与。至今已发现近50种趋化因子。绝大多数趋化因子的一级结构中有4个保守的半胱氨酸，根据半胱氨酸的数目和相对位置，按系统命名法将趋化因子分为四大亚家族CXC趋化因子，其前两个半胱氨酸之间有一个其它的氨基酸相隔；CC趋化因子，前两个半胱氨酸相邻；C趋化因子，只有第二和第四位的两个半胱氨酸；CX3C趋化因子，前两个半胱氨酸被其它3个氨基酸隔开。有的亚家族若有多种趋化因子，则再根据被发现的先后进行编排。
最近发现一种次级淋巴趋化因子SLC(Secondary Lymphiod tissure Chemokine)也称CCL21，其由111个氨基酸组成，氨基酸序列从N端至C端为SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSTPATLFLPRKRSQAELCADRKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPA QGCRKDRGASKTGKKGKCSK GCKRTERSQTPKGP。它是一种特殊的趋化因子，除了具有4个保守的半胱氨酸外，C末端还有2个半胱氨酸，研究证明，该趋化因子对新分离的和培养的T淋巴细胞以及成熟的树突状细胞有很强的趋化作用，还能指导髓祖先细胞的动员(Murphy P等人Pharmacological Reviews.2000，52(1)145-176)。制备方法国外有报道利用昆虫细胞表达SLC(NagiraM等人The Journal Of BiologicalChemistry 1997.272，19518-19524)，他们将重组SLC注射到小鼠肺肿瘤实体内，有40％的肿瘤消失，显示出SLC潜在的治疗肿瘤效果，但是用昆虫细胞表达的成本高，细胞培养繁锁；国内已有单位用大肠杆菌表达SLC(王东宁等人生物工程学报2001 17(4)392-395)。而用大肠杆菌表达的产物，不易纯化。
发明内容
本发明提供一种成本低廉、操作方便的次级淋巴趋化因子SLC的制备方法。所选用的表达系统为毕赤酵母，毕赤酵母表达系统容易操作，成本低，安全性高，能高密度发酵，产物易纯化。
制备方法包括如下步骤一、构建SLC重组表达质粒PPIC9K/SLC1、合成引物正向引物为5′GGCTCGAGAAAAGAAGTGGAGGGGCTCAG3′反向引物为5′CCGAATTCCTATGGCCCTTTAGGGGTC3′上述引物的5′端分别引入XnoI和ECoRI酶切位点(横线所示)；2、将上述引物以人肺cDNA库为模板进行PCR扩增，得DNA片段，其中有含XhoI和EcoRI酶切位点的SLC DNA片段；3、将所得DNA片段和酵母载体PPIC9分别用XhoI和ECoRI酶切后，用T4DNA连接酶连接，经转化和酶切及测序其重组质粒，获得正确序列的SLC重组质粒PPIC9/SLC，再用BamHI/EcoRI酶切下0.6Kb片段，插入到载体PPIC9K的相应酶切位点，获得重组表达质粒PPIC9K/SLC。
二、构建表达SLC的毕赤酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC将上述重组表达质粒PPIC9K/SLC用BgI II限制性内切酶进行线性化处理，并用电穿孔转化毕赤酵母受体细胞GS115，经G418(新霉素相关氨基糖苷类抗生素)抗药筛选，获得工程菌GS115/PPIC9K/SLC。
三、制备SLC将酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC用BMGY培养基培养，再用BMM诱导培养基培养，离心后分别取上清液以及由上清液上柱纯化得到的SLC洗脱液两种样品液进行除盐，再分别测定活性，结果表明，发酵上清液及纯化的SLC对从外周血分离到的T淋巴细胞均显示出明显趋化活性。
图1重组表达质粒PPIC9K/SLC的构建流程图
具体实施例方式本发明所用的载体PPIC9和PPIC9K购自Invitrogen公司，所用大肠杆菌宿主菌株TOP10和毕赤酵母宿主菌GS115也购自Invitrogen公司。具体操作步骤如下一、构建SLC重组表达质粒PPIC9K/SLC(见图1)1、合成引物
为了从人肺cDNA库中分离到次级淋巴趋化因子SLC基因片段，根据表达载体PPIC9K的克隆位点和SLC基因的结构设计一对引物，其正向引物和反向引物的5′端分别引进XhoI和ECoRI酶切位点(CTCGAG和GAATTC)，正向引物为5′GGCTCGAGAAAAGAAGTGGAGGGGCTCAG3′，反向引物为5′CCGAATTCCTATGGCCCTTTAGGGGTC3′。
2、PCR扩增以人肺cDNA库为模板进行PCR扩增，其循环扩增的条件为94℃4分钟；94℃45秒，58℃45秒，72℃2分钟，30个循环；72℃10分钟。扩增后的产物，经1％Agarose凝胶电泳分离纯化。
3、构建重组质粒PPIC9K/SLC(详见分子克隆分册第二版)按常规将纯化的PCR产物和载体PPIC9分别用XhoI/ECoRI进行双酶切和纯化，再用T4DNA连接酶进行连接，其连接反应后的混合液以CaCl2法转化大肠杆菌TOP10。其转化子的质粒DNA经XhoI/ECoRI酶切初步鉴定后，用AOXI的序列分析引物5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC3′进行核苷酸序列分析，获得SLC基因序列正确的重组载体转化子TOP10/PPIC9/SLC。由于表达载体PPIC9K含2个XhoI酶切位点，所以用BamHI/ECoRI分别对载体PPIC9K和PPIC9/SLC进行双酶切，分别用1％Agaose凝胶电泳分离及纯化。再将纯化的PPIC9K大片段与PPIC9/SLC的小片段用T4DNA连接酶连接，以CaCl2法转化大肠杆菌TOP10，经酶切鉴定，获得的阳性重组子为含重组质粒PPIC9K/SLC的大肠杆菌。
二、构建表达SLC的毕赤酵母工程菌GS115/PPIC9K/SLC(详见Invitrogtn的毕赤酵母表达操作手册)取少量重组大肠杆菌(含PPIC9K/SLC质粒)种于3mlLB(含100μg/ml氨苄青霉素)培养基中，37℃培养过夜，以1％的接种量种于50mlLB(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养14小时，按碱法提取质粒DNA。该质粒DNA用BglII限制性内切酶进行线性化，用两倍体积的乙醇沉淀DNA，离心后将线性化重组表达载体PPIC9K/SLC的DNA溶于无菌水中，最终浓度为0.4mg/μl，以电穿孔法转化毕赤酵母菌GS115。GS115感受态细胞的制备如下取GS115单菌落种于5mlYEPD(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)培养基中，28-30℃振荡培养过夜，取15μl过夜培养物转种于40mlYEPD中，继续培养至OD600约1.3-1.6，离心(5000转/分)收集菌体，分别用预冷的无菌水和1mol/L山梨醇各洗一次，用预冷的1mol/L山梨醇将菌体悬浮成200μl，取80μl菌体悬浮液与4μg/10μl线性化载体PPIC9K/SLC的DNA混匀，转入预冷的0.2cm电击杯(BioRad公司)中，在电击仪上，设定电压为1300V，电容为25μF，电阻为200Ω，进行电穿孔转化，电转化后，立即于电击杯中加入0.9ml预冷的1mol/L山梨醇，取出全部的细胞液，涂于4块MD平板上[1.34％YNB，(4×10-5)％生物素，2％葡萄糖，1mol/L山梨醇，2％琼脂]，置于28-30℃培养至长出菌落。
由于PPIC9K/SLC重组载体含有细菌卡那霉素基因，线性化的SLC表达单元中仍含有卡那霉素基因，当它转入酵母细胞后，能使酵母细胞对G418产生抗性，而对G418抗性程度大致取决于卡那霉素基因的整合数，因此可以通过不同浓度的G418来筛选多拷贝的转化子。将转化子用无菌牙签点于含G418的YEPD平板，最终在G418浓度为1.5mg/ml平板上获得10个GS115/PPIC9K/SLC克隆。三、SLC在毕赤酵母中的表达和纯化及活性的测定1、SLC在毕赤酵母中的分泌表达分别取少量上述10个重组酵母转化子和含空载体PPIC9K的GS115对照菌株种于50mlBMGY[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.34％YNB，1％甘油，100mmol/L，PH6.0磷酸钾缓冲液，(4×10-5％)生物素]培养基中，28℃振荡培养至OD600约2-6，离心收集菌体，转入20ml BMM[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，1.34％TNB，0.5％甲醇，100mmol/LPH6.0磷酸钾缓冲液，(4×10-5％)生物素]诱导培养基中，28-30℃振荡培养3天，离心取上清经SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮兰染色，10个SLC重组酵母转化子都显示一条深色的约12KD的蛋白带，而对照菌株没有这条带，该蛋白带就是重组SLC，说明这种毕赤酵母工程菌能高水平分泌表达SLC。
2、分离纯化选上述10个克隆中表达SLC最好(电泳条带显色最深)的GS115/PPIC9K/SLC工程菌用同样的方法进行发酵培养，将发酵液离心后取上清液，先对5mM Tris-Hcl PH8.0缓冲液进行透析，透析后的样品以20mM Tris-Hcl PH8.0平衡的CM柱进行层析，用20mMTris-Hcl PH8.0+150mMNacl洗脱液进行洗脱，收集其洗脱峰，再经分子筛Superdex75柱分离，以20mM PBS PH8.0+150mMNacl洗脱，收集洗脱峰的蛋白样品液。经SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮兰染色，只见一条SLC的蛋白带，表明SLC被纯化。
3、SLC趋化活性的测定取枸橼酸钠抗凝的人外周血3ml，用Hanks液稀释至5ml，然后将它缓慢加到有3ml淋巴分离液的离心管中，2000转/分离心20分钟，收集单个核细胞层的细胞，以Hanks液洗涤一次，用RPM1640培养基悬浮细胞，计数细胞浓度。取24孔细胞培养板，往孔内加500μl趋化样品液，该样品液为上述工程菌发酵后，离心所得上清液经G25胶除盐，0.22μm膜过滤除菌处理所得，将Bodyman小室(美国BD公司)架于孔内，然后往小室内加入分离的单个核细胞30000个/200μl，将细胞置于37℃保温4小时，收集培养板孔内的细胞，用细胞计数仪计算孔内的细胞数。同时将含空载体PPIC9K的GS115酵母菌发酵液的上清液，用同样的方法处理，作为阴性对照。结果显示该毕赤酵母工程菌发酵上清液中含有SLC，其对新分离外周血的淋巴细胞有明显的趋化作用，趋化细胞数是阴性对照的5倍。发酵上清液经透析和柱层析纯化后所得的SLC蛋白峰洗脱液采用同样的方法测定SLC趋化活性，以PBS缓冲液为阴性对照。结果表明，纯化的SLC蛋白样品液对外周血分离的淋巴细胞有明显的趋化活性，趋化细胞数量为阴性对照的5倍，说明本纯化方法是切实可行的。本发明制备方法简便，表达水平高，容易纯化，成本低廉。
权利要求
1.一种次级淋巴趋化因子SLC的制备方法，包括构建SLC重组表达质粒、构建表达SLC的工程菌及工程菌表达SLC产物的纯化，其特征在于SLC的表达系统为毕赤酵母工程菌。
2.按权利要求1所述的次级淋巴趋化因子SLC的制备方法，其特征在于构建的SLC重组表达质粒为PPIC9K/SLC。
3.按权利要求2所述的次级淋巴趋化因子SLC的制备方法，其特征在于工程菌表达SLC产物纯化采用CM阳离子交换柱及Superdex-75分子筛。
4.按权利要求1、2、3所述的次级淋巴趋化因子SLC的制备方法，其特征在于所用的毕赤酵母菌为GS115细胞株，构建的表达SLC的毕赤酵母工程菌为GS115/PPIC9K/SLC。
5.权利要求1、2、3所述次级淋巴趋化因子SLC制备方法所制备的SLC用于制备抗肿瘤药物的用途。
6.权利要求4所述次级淋巴趋化因子SLC制备方法所制备的SLC用于制备抗肿瘤药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程技术领域,是人次级淋巴趋化因子SLC的一种新的制备方法。本发明选用的表达系统为毕赤酵母表达系统,包括如下步骤:(1)合成正、反向引物,以人肺cDNA为模板进行PCR扩增,构建SLC重组表达质粒
文档编号C12P21/02GK1422959SQ0215123
公开日2003年6月11日 申请日期2002年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者武圣明, 高卜渝, 袁汉英 申请人:武圣明, 高卜渝, 袁汉英