专利名称：天花粉蛋白自杀基因enh－tcs及其重组载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种天花粉蛋白自杀基因ENH-TCS，和其重组载体及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术：
“自杀基因”是近年来发展的一种较有前途的肿瘤基因治疗方法，其中以肿瘤专一的调控元件进行的研究更显其优越性。但通常的“自杀基因”表达后的产物，仅能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增加药物的特异性，多需通过与其它药物的协同作用，才能达到杀灭癌细胞的目的。如Huber等构建的VZV-TK和甲肽蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)转录调节序列组建的嵌合基因(Brain，E.H.，A.Cynthia，A.K.Richards & Thomas，1991，Retroval-mediatedgene therapy of the treatment of hepatocellular carcinomaan innovatie approachtherapy.Proc Natl Acad Sci USA，888039)，该“自杀基因”特异性表达了水痘带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(VZV-TK)，由后者催化无毒的药物前体6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷(AraM)生成具有细胞毒性的三磷酸腺嘌呤阿拉伯糖核苷(AraATP)，达到杀灭癌细胞的目的。
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物栝蒌块根中分离纯化到的一个单链的真核核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)(Zhang，J.S.，W.Y.Liu，1992，.The mechanism of action of Trichosanthon oneukaryotic ribosome RNA N-glycosidase activity of the cytotoxin，Nucleic AcidsRes，20(6)1271-1275)。作为引产中药应用已有千余年历史(上海实验生物研究所第二研究室，1976，天花粉蛋白的引产原理的探讨，中国科学，2200-211)。另外，天花粉蛋白还具有免疫调节(叶敏、季永镛、沈瑞珍，1986，小鼠对天花粉蛋白体外免疫应答的基本特点，实验生物学报，1981-90)、抗HIV(Mcgrath，M.S.，K.M.Hwang，S.E.Caldwell，I.Gaston，K.C.Luk，P.V.Wu，L.Ng，S.J.Crowe，Danies，J.Marsh，T.Deinhart，P.V.Lekas，J.C.Vennari，H.W.Yeung，J.D.Lifson，1989，GLQ223an inhibitor of human immunodefenfiency virus replicationin acutely and chronically infected cells of lymphocyte and mononuclear phygocytelineage.Proc Nat Acad Sci USA，862844-2848)和抗肿瘤作用(孔梅、柯一保、周美云、聂慧玲，1998，天花粉蛋白诱发白血病细胞K562凋亡的研究，实验生物学报，31(3)233-243)等方面。
分子生物学领域工作者利用熟知的方法，或可从基因库或cDNA库中筛取；或利用PCR方法直接扩增获得；也可以利用化学方法人工全合成天花粉蛋白的基因。天花粉蛋白基因在大肠杆菌(Nie，H.L.，X.F.Cai，X.H.He.X.Y.Ke，Y.B.Ke，S.X.Tam，1998，Position 120-123，a potential active site of trichosanthin.LifeSciences，62(6)491-500)和酵母(Kumagai，M.H.，T.H.Turpen，N.Weinzettl，1993，Rapid hgh-lever expression of biological active a-trichosanthin in transfectedplants by an RNA viral vector.Proc Natl Acad Sci USA，90427-430)中均已获得了表达。基于TCS的RIP化学本质，至今没有用高等哺乳动物细胞表达天花粉蛋白的报道。
发明内容
本发明是用甲肽蛋白(AFP)基因上游的增强子调控元件，构建了诱导型、人肝癌细胞中特异表达天花粉蛋白的自杀基因ENH-TCS，其核苷酸序列见序列表中的<210>1，并进一步构建了其质粒载体pTRE-ENH-TCS，该载体转染进肝癌细胞后，可在控制条件下使TCS在肝癌细胞中得到表达。
AFP基因启动及调控元件，已广泛用于构建“自杀基因”组织专一的真核表达载体。本发明选择了AFP基因上游-3.5kb处一段约0.6kb的增强子区域序列ENH。是我们自行设计引物，利用PCR方法从肝癌细胞中扩增出的一段DNA，该调控元件须在肝癌细胞特异的核蛋白的存在下才起作用。即使为正常肝细胞和其他肿瘤细胞获取，也不会对细胞产生明显的影响，这是该载体在肝癌细胞中特异表达的基础。
本发明使用了Tet-On受四环素控制的表达系统(Gossen，M.，H.Bujard，1992，Tight control of gene expression in mammalian cells bytetracycline-responsive promoters.Proc Natl Acad Sci USA，895547-5551)，可以在合适的时间加入四环素诱导目的基因的表达，便于操作和检测。该系统原始质粒为pTRE。
将构建好的质粒载体pTRE-ENH-TCS转染进人肝癌细胞，培养液中加入浓度2μg/ml的四环素诱导24小时后，RT-PCR检查到含有TCS基因的特异条带，表明肝癌细胞中的TCS得到表达；同时显微镜观察到肝癌细胞出现死亡现象。用于诱导的四环素浓度越高、时间越长，细胞死亡越严重。10μg/ml四环素诱导24小时的肝癌细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率达到18.4％，转染进空载体pTRE-ENH的对照肝癌细胞凋亡率仅为1.75％。我们还对10μg/ml四环素诱导24小时后的肝癌细胞进行电子显微镜观察，细胞显示明显的凋亡形态(结果未给出)。肺癌细胞同样转染进pTRE-ENH-TCS，四环素诱导后，生长依旧，形态未见明显改变(结果未给出)。不含TCS的空载体pTRE-ENH转染进的肝癌细胞，四环素诱导后，情况也无显著变化。
肝癌细胞对培养液外源TCS不敏感(熊用周、吕淑霞，1981，天花粉蛋白对体外培养不同种类细胞的作用，实验生物学报，14259-269)。但本发明表明导入肝癌细胞内的TCS基因，一旦得到表达，却能起到使细胞彻底崩溃的作用。天花粉蛋白是个RIP蛋白，RIP作用机理是利用体外无细胞体系进行(Endo，Y.，K.Tsurugi，1988，The RNA n-glycosidase activity of ricin a-chain，thecharacteristics of the enzymatic activity of ricin a-chain with ribosomes and withrRNA.J Biol chem，2638735-8739)，为结构功能关系而开展的表达研究也是利用原核细胞大肠杆菌进行(Nie，H.L.，X.F.Cai，X.H.He.X.Y.Ke，Y.B.Ke，S.X.Tam，1998，Position 120-123，a potential active site of trichosanthin.LifeSciences，62(6)491-500)(Wong，K.B.，Y.B.Ke，Y.C.Dong，X.B.Li，Y.W.Guo，H.W.Yeung，P.C.Shaw，1994，Structure/function relationshjp study of Gln156，Glu160 and Glu189 in the active site of trichosanthin.Eur J Biochem，221787-791)。本发明是首次将TCS基因在高等哺乳类动物细胞、特别是人源细胞中进行表达，至今尚未见类似报道。结果明确表明TCS可以在高等动物细胞中得到表达，而表达的结果符合RIP本质特性，造成细胞的自我损伤至到凋亡。达到真正含义的细胞“自杀”。
图1是构建的表达质粒pTRE-ENH-TCS；图2为转染表达载体后细胞的PCR分析示意图；其中1表示DNA分子量标准，自上而下依次为2.0kb，1.6kb，1.2kb，0.8kb，0.6kb，0.4kb，0.2Kb2表示转染空载体的对照7721细胞3表示转染表达载体的SPCA-1细胞4表示转染表达载体的77211细胞图3为内源TCS表达后肝癌细胞的光学显微镜检查结果图。
其中3A表示TCS基因表达载体转染，加10μg/ml四环素诱导24小时后，细胞大量死亡。
3B表示空载体转染，同祥加10μg/ml四环素诱导24小时后，对照细胞生长正常。
图4为流式细胞仪分析示意图。
其中4A表示导入TCS基因的肝癌细胞，经10μg/ml四环素诱导48小时，18.4％的细胞发生凋亡。
4B表示导入空载体的对照细胞，经同样诱导后，仅有1.75％细胞出现凋亡。
图5为转染表达载体后细胞的RT-PCR分析示意图。
其中1表示转染表达载体的SPCA-1细胞，10μg/ml四环素诱导24小时后2表示转染表达载体的7721细胞，2μg/ml四环素诱导24小时后3表示转染表达载体的7721细胞，10μg/ml四环素诱导24小时后4表示转染表达载体的7721细胞，50μg/ml四环素诱导24小时后5表示转染空载体的对照7721细胞，10μg/ml四环素诱导24小时后6表示DNA分子量标准，自上而下依次为2.0kb，1.6kb，1.2kb，0.8kb，0.6kb，0.4kb，0.2kb具体实施方式
实施例1.表达载体pTRE-ENH-TCS的构建利用分子生物学领域工作者均熟知的常规方法，进行DNA抽提、酶切、纯化和重组等操作；涉及的工具酶为Gibco BRL产品；RNA抽提是用华舜生物工程有限公司的Trizol试剂盒，反转录酶和相关试剂也为该中心产品。
TCS基因如上面说明，TCS基因可用多种方法获得。我组已克隆了相应的质粒pET-TCS，(Nie，H.L.，X.F.Cai，X.H.He.X.Y.Ke，Y.B.Ke，S.X.Tam，1998，Position 120-123，a potential active site of trichosanthin.Life Sciences，62(6)491-500)，该质粒经NcoI和BamHI双酶切得到即可得到约0.8kb的基因片段，低熔点琼脂醣凝胶电泳纯化。
AFP基因调控元件ENH的获取参考文献(Watanabe，K.，A.Saito，Y.Tamaoki，1987，Cell-specivic enhancer activity in a far upstream region of the humana-fetoprotein gene.J Biol Chem 2624812-4818)自行设计了两个引物(N端引物为5’CCGAATTCAAGCTTATGATTCCC 3’；C端引物为5’CAACCATGGCAAGGGCCACATCTC 3’，以7721人肝癌细胞总DNA为模板，利用PTC-150 minicycler(基因公司)PCR仪，扩增得到长度约为0.6kb的DNA片段，经RcoRI与NcoI双酶解后，低熔点琼脂醣凝胶电泳纯化。此即为含AFP增强子ENH片段。ENH先后用Klenow酶补平、EcoRI水解后成ENH’，供空白载体构建用。
为连接和测序工作的方便，使用了中介质粒pBluscript(stratgene公司)。
pBluscript-ENH-TCS质粒和pBluscript-ENH质粒的制备pBluscript经EcoRI和BamHI双酶解后，与AFP增强子ENH片段和TCS基因片段一起连接成pBluscript-ENH-TCS，其中ENH-TCS总长1.4kb，测序结果表明DNA序列符合原设计要求，见序列表中的<210>1。
质粒pBluscript经EcoRI和SmaI双酶解后，与ENH’片段连接成生成不含TCS基因的pBluscript-ENH。
Tet-On基因表达系统(CLONTECH产品)。按供应商说明操作。
pTRE-ENH-TCS的制备pBluscript-ENH-TCS经EcoRI和BamHI双酶解得到1.4kb的ENH-TCS片段，克隆进pTRE载体的相应位点即得，此为专一在肝癌细胞中表达TCS基因用的质粒。经QIAGEN公司的Tip-100质粒纯化试剂盒纯化后供转染用。
对照用载体pTRE-ENH的制备pBluscript-ENH经EcoRI和BamHI双酶解得到的片段，克隆进经同样双酶解后的pTRE载体得到，此为不含TCS基因的空载体对照。用上述相同方法纯化后供转染。
表达载体构建的具体过程；见图1。
实施例2.细胞培养和pTRE-ENH-TCS转染人肝癌细胞株(7721)和人肺腺癌细胞(SPCA-1)于372，5％CO2条件下培养在含10％灭活小牛血清的RM1640培养液内。
转染按Tet-On试剂盒说明方法进行。
先将Tet-on系统中提供的质粒pTet-On转染细胞(在细胞中引入Tet On调节蛋白)；在含G418(华瞬生物工程有限公司)400μg/ml存在下的培养液中培养二月，筛选出稳定的对四环素反应因子的、G418抗性细胞克隆；抗性细胞在无G418条件下继续培养增殖；按试剂盒说明，将质粒pTRE-ENH-TCS和pTRE-ENH分别与Tet-on系统中提供的质粒PTK-Hyg共转染，分别导入肝癌细胞和肺癌细胞。
用PCR方法，从转染进pTRE-ENH-TCS的7721细胞和SPCA-1细胞中，均检测到含有TCS基因的1.4kb条带，说明TCS基因已被转入细胞。用pTRE-ENH转染后的细胞，PCR反应后，可见有一约0.6kb的ENH片段被扩增出。见图2。
实施例3.TCS基因在肝癌细胞里的诱导表达导入了pTRE-ENH-TCS或pTRE-ENH的肝癌细胞和肺癌细胞，加入不同浓度四环素(2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)后继续培养。对照肝癌细胞也同样按步骤处理。
24小时后，光学显微镜检查肝癌细胞明显出现死亡，48小时后，死亡情况加剧；四环素浓度越高，细胞死亡也越严重；而肺癌细胞和用空载体转染后的对照肝癌细胞生长未见受到明显影响。
图3为用10μg/ml四环素诱导24小时后的肝癌细胞和对照细胞生长情况的光学显微镜照片(×400)。图4是用流式细胞仪检测到此时细胞凋亡情况。
用四环素浓度为10μg/ml组诱导24小时后的肝癌细胞，电子显微镜也观察到细胞出现凋亡形态，而肺癌细胞及用空载体转染后的肝癌细胞形态未见明显改变。
抽提细胞总RNA，RT-PCR检测结果显示四环素浓度在低达2μg/ml情况下诱导24小时后，即能在肝癌细胞来源的cDNA中扩增出含有TCS基因的条带；而肺癌细胞来源的cDNA中不能出现此特异条带。表明TCS仅在肝癌细胞中得到特异的表达。见图5。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>天花粉蛋白自杀基因ENH-TCS及其重组载体和应用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1380<212>DNA<213>天花粉蛋白(Trichosanthin)<400>1ttg ata tcg aat tca agc tta tga ttc cca aat atc tat ctc tag cct 48caa tct tgt tcc aga aga taa aaa gta gta ttc aaa tgc aca tca acg 96tct cca ctt gga ggg ctt aaa gac gtt tca aca tac aaa ccg ggg agt144ttt gcc tgg aat gtt tcc taa aat gtg tcc tgt agc aca tag ggt cct192ctt gtt cct taa aat cta att act ttt agc cca gtg ctc atc cca ccc240tat ggg gag atg aga gtg aaa agg gag cct gat taa taa tta cac taa288gtc aat agg cat aga gcc agg act gtt tgg gta aac tgg tca ctt tat336ctt aaa cta aat ata tcc aaa act gaa cat gta ctt agt tac taa gtc384ttt gac ttt atc tca ttc aga cca ctc agc ttt atc cag gcc act tat432ttg aca gta tta tgc gaa aac ttc cta act ggt ctc ctt atc ata gtc480
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权利要求
1.一种天花粉蛋白自杀基因ENH-TCS，其核苷酸序列为<210>1。
2.含有权利要求1所述的天花粉蛋白自杀基因ENH-TCS的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于该重组载体为pTRE-ENH-TCS。
4.根据权利要求1所述的天花粉蛋白自杀基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种天花粉蛋白自杀基因ENH－TCS，其核苷酸序列为<210>1，含该天花粉蛋白自杀基因ENM-TCS的重组载体以及该天花粉蛋白自杀基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。
文档编号C12N15/29GK1504571SQ0215090
公开日2004年6月16日 申请日期2002年11月28日 优先权日2002年11月28日
发明者聂慧玲, 柯一保, 朱丽华, 董晓琴 申请人:中国科学院上海生命科学研究院