专利名称：造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术，主要涉及一种造血干/祖细胞在体外扩增培养的生物技术方法，尤其是涉及造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，能有效地提高造血干/祖细胞体外扩增倍数。
目前上述两类技术方法一般采用的是一次性扩增法，造血干/祖细胞从进入培养体系(种植)到扩增结束(收获)，是一次性的。这种扩增方法虽然操作比较简单些，但往往限制了扩增时间，目前一般只能持续扩增10天左右，否则会造成扩增体系中的细胞因子耗竭或细胞因子活性降低而不利于继续提高造血干/祖细胞的扩增倍数和功能的激活。最近国外有在扩增中采取分阶段扩增、但未有同时应用骨髓间充质干细胞共培养的报道。
本发明解决造血干/祖细胞体外扩增效率问题的技术方案是采用已建系的骨髓间充质干细胞(CD45-CD34-SH2+SH4+CD90+)为培养体系的滋养细胞，与造血干细胞共培养，结合分阶段扩增的方法，构成了一个培养扩增技术的完整体系。
本发明提出的体外扩增程序是以造血干/祖细胞体外扩增态势(前6天内不扩增甚至数量下降，是对体外培养体系的适应期；6天后造血干/祖细胞开始扩增，是扩增期)为依据，为达到模拟体内造血干/祖细胞生长发育环境，并在适当延长体外扩增时间内能依然保持扩增支持体系活性的目的，把体外扩增程序分二个阶段进行，第一阶段是先在小容量培养条件下进行，加快造血干/祖细胞对条件的适应，第二阶段是转移至大容量培养条件下进行，加快造血干/祖细胞的增殖和分化速率。由此适当延长体外有效扩增时间，进一步提高造血干/祖细胞的扩增倍数。
本发明提供的造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增程序，每个阶段培养培养骨髓间充质干细胞6-7天，至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。
实现本发明技术的具体步骤为(1)用培养液在小容量和大容量的培养袋中培养骨髓间充质干细胞约6-7天，直至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。
(2)去除培养袋中的培养液，再加入相应体积的造血干/祖细胞扩增培养液备用，该培养液可以是ADM培养液(Modified Ex-Vivo Expansion Medium)。造血干/祖细胞扩增培养液中加有三种细胞生长因子SCF、G-CSF和MGDF，每种细胞因子浓度为100 ng/mL。
(3)从不同来源(脐带血或骨髓)分离单个核细胞或纯化CD34+细胞，首先种植到上述含有骨髓间充质干细胞层的小容量培养袋中，用小体积ADM培养液在5％CO2和37℃下培养6-7天。然后收获培养扩增的细胞，并转移到上述含有人骨髓间充质干细胞层的大容量培养袋中，用大体积ADM培养液继续培养6-7天。
本发明技术的有益效果是分阶段扩增和骨髓间充质干细胞共培养相结合的技术适当延长了造血干/祖细胞的体外扩增时间，并保证了延长的扩增期内扩增支持体系的活性，有效地提高了造血干/祖细胞的体外扩增倍数。脐带血造血干/祖细胞的扩增中，CD34+细胞培养的有核细胞扩增了674倍(比报道单用骨髓基质细胞共培养的高5.7倍，比单用分阶段培养的高1.5倍)，CD34+细胞扩增了39.7倍(比报道单用骨髓基质细胞共培养的高3.6倍，比单用分阶段培养的高1.4倍)，粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和高增殖潜能祖细胞集落形成细胞HPP-CFC分别扩增了92倍和71倍(比单用分阶段培养的分别高1.4倍和1.5倍)。新扩增技术具有明显的扩增优势。
图2为两种培养体系中粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和高增殖潜能祖细胞集落形成细胞(HPP-CFC)的扩增。
图3为体外骨髓间充质干细胞共培养下的造血干/祖细胞扩增态势。
图4为扩增细胞移植小鼠后各种细胞数量变化态势。
图5为造血干/祖细胞体外扩增实验照片。
具体实施实例本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1本发明技术采取的具体方法(1)用α-20培养液(AMEM/20％FBS)在小体积和大体积的Teflon培养袋中培养骨髓间充质干细胞约7天，直至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。
(2)去除培养袋中的α-20培养液，再加入相应体积的ADM培养液(造血干/祖细胞扩增培养液)备用。造血干/祖细胞扩增培养液中加有三种细胞生长因子SCF、G-CSF和MGDF，每种细胞因子浓度为100ng/mL。
(3)从不同来源(脐带血或骨髓)分离单个核细胞或纯化CD34+细胞，首先种植到上述含有骨髓间充质干细胞层的小容量培养袋中，用小体积ADM培养液在5％CO2和37℃下培养7天。7天后收获培养扩增的细胞，并转移到上述含有人骨髓间充质干细胞层的大容量培养袋中，用大体积ADM培养液继续培养7天。
实施例2脐带血造血干/祖细胞的体外扩增效果1.1 有核细胞的扩增从冻存的脐带血分离单个核细胞，并进一步分选出CD34+细胞，然后按本扩增技术体系进行体外扩增。
在单个核细胞扩增培养中，有核细胞的数量都是先开始逐步下降，然后在第6-7天开始出现回升趋势，直至14天后收获细胞。CD34+细胞扩增培养中前期没有单个核细胞扩增那样的明显下降现象，但也是在第6-7天后出现扩增趋势，结果参见
图1，图中—◆—为共培养体系，—■—为非共培养体系，图1a是单个核细胞培养的有核细胞扩增趋势(0-7天)，图1b是单个核细胞培养的有核细胞扩增趋势(7-14天)，图1c是CD34+细胞培养的有核细胞扩增趋势(0-14天)。14天后单个核细胞扩增培养中有核细胞扩增倍数是346；CD34+细胞扩增培养中有核细胞扩增倍数是674(表1)。
表1 单个核细胞和CD34+细胞培养中有核细胞的扩增扩增细胞起始细胞(×106) 扩增细胞(×106) 扩增倍数单个核细胞 13.9 4,804345.6CD34+细胞 0.41 276.2673.71.2 GM-CFC和HPP-CFC的扩增单个核细胞培养和CD34+细胞培养的粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和高增殖潜能祖细胞集落形成细胞(HPP-CFC)扩增效率见图2，图中A起始集落B非共培养扩增集落 C共培养扩增集落，图2a为GM-CFC的扩增，图2b为HPP-CFC的扩增。
单个核细胞的起始GM-CFC和HPP-CFC分别是23×104和14×104；CD34+细胞的起始GM-CFC和HPP-CFC分别是9.4×104和1.8×104。经过14天的扩增后，单个核细胞扩增的GM-CFC和HPP-CFC分别是2048×104和716×104(分别扩增了89倍和51倍)；CD34+细胞扩增的GM-CFC和HPP-CFC分别是864×104和128×104(分别扩增了92倍和71倍)。
1.3 扩增细胞的流式细胞仪分析扩增后的细胞用相应的单克隆抗体标记后进行流式细胞仪分析，其结果如表2。
表2 扩增细胞膜表面抗原表型的比例(％)扩增细胞 CD33CD15CD14CD34CD34扩增倍数单个核细胞81 67 36 0.7790.2CD34+细胞 89 77 40 5.9 39.7扩增后的细胞中，大部分是CD33+和CD15+细胞。但是其所占的比率有所不同在单个核细胞扩增的细胞中CD33+和CD15+细胞分别为81％和67％，CD34+细胞扩增的细胞中CD33+和CD15+细胞分别为89％和77％。
其次占比较大比例的是CD14+细胞，在单个核细胞和CD34+细胞扩增的CD14+细胞分别为36％和40％。
扩增后CD34+细胞的比例都已大幅度减少，单个核细胞和CD34+细胞扩增的CD34+细胞分别为0.77％和5.9％。虽然扩增后CD34+细胞在总细胞中的比例下降了，但根据扩增细胞中的CD34+细胞比例，计算CD34+细胞的总量，也表现出扩增趋势单个核细胞和CD34+细胞扩增的CD34+细胞分别扩增了90.2倍和39.7倍。
实施例3体外扩增小鼠造血干/祖细胞及重建小鼠造血功能采集小鼠骨髓并分离单个核细胞，并分选CD34+/c-kit+细胞。采用本扩增技术进行小鼠造血干/祖细胞体外扩增小鼠移植模型实验。
2.1 有核细胞的扩增在单个核细胞扩增培养中，有核细胞的数量也是先开始逐步下降，到第4天开始出现回升，直至14天后收获细胞。CD34+/c-kit+细胞扩增培养中虽然没有明显下降的现象，但有核细胞开始增长的时间也在4天之后，结果参见图3，其中图3a为单个核细胞扩增，图3b为CD34+/c-kit+细胞扩增。
概括图3的扩增结果，单个核细胞扩增培养中有核细胞扩增倍数是10.8；CD34+/c-kit+细胞扩增培养中有核细胞扩增倍数是76.1。2.2 GM-CFC和HPP-CFC的扩增分别对单个核细胞和CD34+/c-kit+细胞及其扩增后的GM-CFC和HPP-CFC进行了比较分析(表3)经过14天的扩增后，单个核细胞扩增的GM-CFC和HPP-CFC分别扩增了65.9倍和38.8倍；CD34+/c-kit+细胞扩增的GM-CFC和HPP-CFC分别扩增了71.7倍和51.8倍。
表3 GM-CFC和HPP-CFC的扩增
2.3 扩增细胞的流式细胞仪分析单个核细胞和CD34+/c-kit+细胞扩增后的细胞用相应的单克隆抗体标记后进行流式细胞仪分析，其中单个核细胞的扩增细胞分析结果见表4。
表4 扩增后细胞类群的比例
扩增后的大部分细胞是CD15+和细胞CD14+。但是其所占的比率有所不同单个核细胞扩增的细胞中CD15+和CD14+细胞分别为49％和13％，CD34+/c-kit+细胞扩增的细胞中CD15+和CD14+细胞分别为41％和17％。
扩增后CD34+细胞的比例都已减少，单个核细胞和CD34+/c-kit+细胞扩增的细胞中CD34+细胞分别为0.41％和3.8％。但根据扩增细胞中的CD34+细胞比例，计算CD34+细胞的总量，则表现出扩增趋势单个核细胞和CD34+/c-kit+细胞扩增的CD34+细胞分别扩增了4.8倍和2.9倍。
2.4 扩增细胞移植后对亚致死剂量照射小鼠的快速植入和长期造血60Coγ射线致死剂量照射后，未移植扩增细胞的对照组小鼠在第18-20天死亡率达到100％，而移植扩增细胞的两个实验组小鼠在相同时期的平均死亡率分别为16.7％(单个核细胞的扩增细胞)和20％(CD34+/c-kit+细胞的扩增细胞)。血液分析系统的检测结果见图4，其中—◆—单个核细胞的扩增细胞移植实验组，—■—CD34+/c-kit+细胞的扩增细胞移植实验组，—▲—对照组。未移植扩增细胞的对照组小鼠的各种血细胞数量在照射后的3-6天内快速下降，然后下降速度趣缓，直至死亡。
移植了扩增细胞的实验组小鼠中，虽然在照射后的3-6天内各种细胞的数量也出现大幅度下降，但之后开始出现回升趋势单个核细胞的扩增细胞移植实验组中，各种细胞数量都在移植后的第6天之后开始回升，其中血小板、白血细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单个核细胞的数量上升速度很快，并且血小板、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单个核细胞在第24天恢复甚至超过了基数水平。
在CD34+/c-kit+细胞的扩增细胞移植实验组中，各种细胞数量上升的速度相对比较缓慢，但基本上在第6天之后一直处于上升趋势，并且上升的态势比较稳定。
移植第8周后，对存活的小鼠进行细胞核染色体组型分析，发现移植单个核细胞的扩增细胞和CD34+/c-kit+细胞的扩增细胞的小鼠中，有核细胞XY染色体的检出率分别为25.4％和32.8％。实例总结(1)本扩增技术有效地提高了人脐带血造血干/祖细胞的扩增效率CD34+细胞培养的有核细胞扩增了674倍(报道的骨髓基质细胞共培养扩增119.6倍，报道的分阶段培养扩增438倍)，CD34+细胞扩增了39.7倍(报道的骨髓基质共培养扩增11.1倍，报道的分阶段培养扩增29倍)，GM-CFC和HPP-CFC分别扩增了92倍和71倍(报道的分阶段培养分别扩增65倍和49倍)，具有明显的扩增优势。
(2)本扩增技术扩增的造血细胞有效地加快了小鼠短期快速恢复和长期重建造血功能扩增细胞移植后可快速产生体内嗜中性粒细胞的植入。在单个核细胞的扩增细胞移植实验组中，各种细胞数量都在移植后的第6天之后开始回升，并在第24天前基本上恢复到了基数水平。在CD34+/c-kit+细胞的扩增细胞移植实验组中，各种细胞数量上升的速度相对比较缓慢，但基本上在第6天之后一直处于上升趋势。
2个月后存活小鼠的细胞核染色体组型分析表明，单个核细胞的扩增细胞和CD34+/c-kit+细胞的扩增细胞移植的小鼠中，有核细胞XY染色体的检出率分别为25.4％和32.8％，表明扩增的造血细胞在促进体内恢复长期重建造血功能起到了重要作用。参见图5，其中图5a是GM-CFC，图5b是HPP-CFC，图5c是在人骨髓间充质干细胞上培养的人脐带血造血干/祖细胞，图5d是在小鼠骨髓间充质干细胞上培养的小鼠造血干/祖细胞。
本发明提及的所有文献都在申请中引用作为参考，就如同每一篇文献都被单独引用作为参考那样。此外应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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权利要求
1.一种造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，采用已建系的骨髓间充质干细胞(CD45-CD34-SH2+SH4+CD90+)为培养体系的滋养细胞，其特征是滋养细胞与造血干细胞共培养，结合体外分阶段扩增程序进行。
2.如权利要求1所述的造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，其特征是体外扩增程序分二个阶段进行，第一阶段是先小容量培养扩增，第二阶段是将第一阶段扩增的细胞转移至大容量培养条件下进行扩增。
3.如权利要求1和2所述的造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，其特征是本发明技术的具体步骤为(1)用培养液在小容量和大容量的Teflon培养袋中培养骨髓间充质干细胞6-7天，直至骨髓间充质干细胞在培养袋中铺层。(2)去除培养袋中的，再加入相应体积的造血干/祖细胞扩增培养液备用。(3)从不同来源分离单个核细胞或纯化CD34+细胞，首先种植到上述含有骨髓间充质干细胞层的小容量培养袋中，用小体积培养液在5％CO2和37℃下培养6-7天。然后收获培养扩增的细胞，并转移到上述含有人骨髓间充质干细胞层的大容量培养袋中，用大体积培养液继续培养6-7天。
全文摘要
本发明提供一种造血干/祖细胞体外分阶段共培养扩增技术，采用已建系的骨髓间充质干细胞为培养体系的滋养细胞，与造血干细胞共培养，结合分阶段扩增的方法，构成了一个培养扩增技术的完整体系。本发明采用分阶段扩增和骨髓间充质干细胞共培养相结合的技术适当延长了造血干/祖细胞的体外扩增时间，并保证了延长的扩增期内扩增支持体系的活性，有效地提高了造血干/祖细胞的体外扩增倍数。
文档编号C12N5/0775GK1415747SQ0215076
公开日2003年5月7日 申请日期2002年11月23日 优先权日2002年11月23日
发明者王金福 申请人:浙江大学