专利名称：小鼠胆固醇酯合成酶－2基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和DNA重组技术领域。更具体地，本发明涉及小鼠胆固醇酯合成酶-2的启动子，以及它们的用途。
背景技术：
小鼠胆固醇酯合成酶-2基因启动子即小鼠酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-2启动子(以下简称小鼠ACAT-2基因启动子)，它调控小鼠胆固醇酯合成酶-2基因的表达。
胆固醇既是生物膜的重要成分，也是合成胆汁酸、甾体激素和脂蛋白的前体，最近发现它还参与了信号传导过程，因此是哺乳动物生命过程中不可缺少的。但是动物体内胆固醇过高或过低都将影响其正常的生命过程，甚至产生严重病变。过高会诱发动脉粥样硬化或胆结石；过低，则引起大脑神经发育不全，产生痴呆症，近期的研究还表明高胆固醇是阿尔海默氏疾病的危险因素。胆固醇分子极其疏水，体内不能利用其作为碳源和能源，因此，生物体内胆固醇及其酯类必须处于严格的平衡之中。
酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)(EC2.3.1.26)是细胞中以脂肪酸和胆固醇为底物催化形成胆固醇酯的内质网膜蛋白。ACAT通过将胆固醇转变为胆固醇酯，避免了过高的游离胆固醇对细胞的毒性。
早在上世纪50年代人们就提出ACAT酶的存在并认识到其重要性，但直到1993年，才由美国Dartmouth医学院的TY Chang教授实验室首先克隆了人ACAT-1的cDNA。在此基础上，其它物种的ACAT-1 cDNA相继被克隆。1998年三家实验室分别克隆到了不同种属的ACAT-2 cDNA，它们是人(Oelkers P，Behari A，CromleyD et al.1998，J.Biol.Chem.，27326765-26771)、猿(Anderson RA，JoyceC，Davis M，Reagan JW et al.1998，J.Biol.Chem.，27326747-26754.)和小鼠(Cases S，Novak S，Zheng Y et al.1998，J.Biol.Chem.，27326755-26764)。
迄今为止，在哺乳动物中发现了两种形式的ACAT。ACAT-1广泛分布于各种组织细胞中，主要参与体内的胆固醇代谢平衡；ACAT-2则主要在肝肠细胞中表达，参与外源胆固醇的吸收和脂蛋白的装配。
小鼠ACAT-2基因定位在第十五号染色体上，和人ACAT-2基因定位在第十二号染色体上的位置相同。该区域上集中了一些和感应低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白高脂肪、高胆固醇摄入有关的基因。小鼠的ACAT-2 cDNA编码525个氨基酸，有一些高度疏水序列，预示着ACAT-2有多个跨膜区。
近来，小鼠的ACAT-2基因敲除成功(ACAT-2-/-)。ACAT-2-/-小鼠在肝脏及小肠中完全丧失了ACAT活性。这进一步从基因组水平证实了ACAT-2在小鼠胆固醇吸收中的重要作用。
随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，心血管疾病和神经蜕变性疾病越来越成为威胁人们生命健康的重要杀手，大量流行病学和分子水平的研究已证明这些疾病与生物体内胆固醇水平密切相关。最新文献认为，肝肠细胞特异表达的acat-2参与外源胆固醇的吸收和脂蛋白的装配，直接影响血液中胆固醇水平，而以acat-2为作用靶蛋白的药物，会在控制人体胆固醇水平的同时又不破坏细胞内的胆固醇平衡，所以对acat-2的研究越来越受到人们的重视。
自从知道人体内存在两种形式的ACAT后，药用ACAT抑制剂的研究发展很快。筛选ACAT的特异的抑制剂成为一些制药公司竞相研究的热点。目前通过建立的几种体外、体内测活方法筛选到大量ACAT的抑制剂，这些抑制剂作用机理是1、增加细胞内的胆固醇外流，造成内质网中ACAT可利用的胆固醇剥脱；2、有些抑制剂是胆固醇或单链不饱和脂肪酸的类似物，可竞争抑制ACAT与其天然底物的结合；3、直接抑制动脉壁中ACAT的活性。但目前大部分的抑制剂还属于非特异性的(Cases S，Novak S，Zheng Y et al.1998，J.Biol.Chem.，27326755-26764)。而且，由于天然形式的ACAT蛋白还没有纯化成功，因此寻找ACAT特异有效的抑制剂还很困难。现在，虽然有不少关于人ACAT抑制剂方面的研究，但小鼠ACAT-1敲除实验研究表明，仅仅选择性地抑制ACAT-1，会形成高脂血症。抑制ACAT-2是否会对治疗高脂血症和动脉粥样硬化有利，目前仍不得而知。由于acat-2只在胆固醇代谢的中枢器官-肝脏和小肠中特异表达，因此用小鼠做模型，研究开发针对acat-2的药物，将在控制生物体内胆固醇水平的同时，使其具有最小的毒副作用；对acat-2表达调控的多个方面进行分子水平的研究探索具有重要意义。
启动子在基因的表达调控中起关键作用，然而，在本申请之前，还没有获得小鼠胆固醇酯合成酶-2启动子以及有关的调控序列。
因此，本领域迫切需要开发小鼠的胆固醇酯合成酶-2启动子序列以及有关的调控序列。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的小鼠胆固醇酯合成酶-2启动子序列以及有关的调控序列。
本发明的另一目的是提供生产这些调控序列的方法以及所述调控序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种启动子，它包含小鼠胆固醇酯合成酶-2启动子的核苷酸序列。
在一优选例中，所述的启动子包含选自下组的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1中47-1137位所示的核苷酸序列(对应于图1中的-1080至-1)；或(b)SEQID NO1中98-558位所示的核苷酸序列(对应于图1中的-1030bp至-569)。
在本发明的第二方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的启动子。
在一优选例中，所述的载体还含有所述的启动子可操作地连接的外源基因。
在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体。较佳地，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。更佳地，所述的宿主细胞是小鼠、大鼠和人的细胞。
在本发明的第四方面，提供了本发明所述的启动子的用途，它被用于筛选治疗胆固醇相关疾病的药物。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选治疗胆固醇相关疾病的药物的方法，包括步骤(a)在适合生长的条件下，培养宿主细胞，所述的宿主细胞含有一表达载体，所述表达载体含有本发明所述的启动子和与该启动子可操作性相连的报告基因，其中在第一组宿主细胞的培养基中添加候选物质，在第二组宿主细胞的培养基中不添加候选物质；(b)测定第一组和第二组宿主细胞中报道基因的表达量，其中第一组宿主细胞中报告基因的表达量高于第二组就表示该候选物质是治疗胆固醇相关疾病的药物。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了小鼠胆固醇酯合成酶-2启动子的序列。
图2显示了5’-RACE鉴定小鼠ACAT-2基因启动子转录起始位点的电泳图和相关序列。其中转录起始位点用“*”标出。
图3显示了对小鼠ACAT-2基因启动子最大转录活性区段的确定。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离克隆得到ACAT-2基因的启动子序列，并对其进行了分析，确定该启动子的转录起始位点，分别构建不同长度的小鼠ACAT-2基因启动子的表达载体，转染哺乳动物细胞瞬时表达，用以分析小鼠acat-2启动子的转录活性和主要转录活性所在的区段，同时找出起主要作用的转录因子结合元件。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“胆固醇酯合成酶-2启动子”、“ACAT-2基因启动子”、“acat-2启动子””可互换使用，指具有acat-2启动子序列(SEQ ID NO1)或其启动活性片段的多聚核苷酸。
本发明还涉及上述启动子的多核苷酸变异体。这些多核苷酸变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变该启动子的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含50个核苷酸，较好是至少100个核苷酸，更好是至少150个核苷酸，最好是至少200个核苷酸以上至胆固醇酯合成酶-2启动子的全长。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或克隆本发明的启动子的核苷酸序列。
本发明的人acat-2启动子的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用小鼠基因组DNA或含小鼠染色体的人工染色体克隆作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到本发明启动子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的启动子。
本发明也涉及包含本发明启动子的构建物或载体，以及用所述构建物或载体转化或转导的宿主细胞，以及经重组技术产生外源蛋白的方法。
适用于本发明的外源基因没有特别限制，几乎所有的外源基因都可用于本发明。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)各种报告基因，如GFP、荧光素酶报告基因，和各种功能基因等。应注意，外源基因还包括来自宿主本身的基因。例如，对于某些遗传病(例如因某蛋白表达不足或不表达所导致的疾病)，可以从病人本身分离得到有关基因，然后将其与本发明的胆固醇酯合成酶-2启动子元件相连，形成含外源基因的构建物，然后将所述构建物用于基因治疗。
一种构建物的例子就是与胆固醇酯合成酶-2启动子相连的外源基因。至于胆固醇酯合成酶-2启动子与外源基因的位置关系，启动子应位于外源基因的上游本发明中，含acat-2启动子元件的核苷酸序列可优选地插入到载体，例如表达载体中。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、真核(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点、胆固醇酯合成酶-2启动子之外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含胆固醇酯合成酶-2启动子和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地与待表达的外源基因相连接，以指导所述外源基因mRNA合成。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达外源蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。优选哺乳动物细胞，如小鼠，大鼠和人的细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达外源基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长和表达的条件下进行培养。
在本发明的一个实施例中，通过PCR扩增得到了小鼠ACAT-2基因启动子序列，同时发现ACAT-2基因和小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-6)基因头尾相连，二者之间的距离约1.1Kb，进而对小鼠ACAT-2基因启动子的序列分析结果显示，这段序列中虽然没有典型的TATA Box和CCAAT Box，但却有许多对各种组织特异的潜在的转录因子的结合位点，包括一个HNF-1α，两个Cdx-2，两个GATA-1；一个反向的P300；一个C/EBP；一个DeltaE等，说明这段序列是典型的转录启动子区。
本发明还应用5’-RACE(Rapid amplication of the 5’-cDNA end)的方法，鉴定了小鼠ACAT-2基因启动子的转录起始位点为腺嘌呤A。
在另一实施例中，本发明分别将不同长度的小鼠ACAT-2基因启动子的表达载体，转染哺乳动物细胞瞬时表达，分析了小鼠acat-2启动子的转录活性和主要转录活性所在的区段，同时找到了起主要作用的转录因子结合元件。
本发明的胆固醇酯合成酶-2启动子具有广阔的应用前景。ACAT-2启动子无论对基础理论研究还是对胆固醇相关疾病(包括动脉粥样硬化症、阿尔海默氏疾病)的诊断、治疗及药物筛选都具有重要意义；尤其在利用小鼠做为药物筛选模型方面具有很大的适用价值。例如，通过作用于该启动子，在特定时期、特定组织里能改变acat-2的表达水平，为治疗胆固醇相关疾病(如动脉粥样硬化症和阿尔海默氏疾病等)提供一条可能的途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1小鼠ACAT-2基因启动子的克隆、鉴定为获得小鼠ACAT-2基因启动子，参照Mouse GenomeWalkerTMKits(购自CLONTECH公司)，设计并合成两条小鼠ACAT-2基因特异的引物GSP1和GSP2，引物序列如下GSP15’-CCCTTCTCTCCTCCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO2)GSP25’-TGCATGGTGCCAGTGTAGAGC-3’(SEQ ID NO3)用GSP1和Kit中提供的接头引物(Adaport primer)AP1，以MouseGenome WalkerLibraaries(购自CLONTECH公司)为模板，进行首轮聚合酶链式反应(PCR)。巢式PCR的引物为GSP2和AP2，循环参数参阅产品说明书，得到的PCR产物即为小鼠ACAT-2基因启动子，其长度约为1.1Kb。将该产物克隆到T-EasyVector(购自Promega)，测序并分析该序列的转录因子结合位点。
测得的ACAT-2启动子的序列如图1和SEQ ID NO1所示。
实施例2小鼠ACAT-2基因启动子转录起始位点的确定为确定ACAT-2基因5’端转录起始位点，采用5’-RACE的方法，以小鼠ACAT-2cDNA为模板，设计引物mA2-1和mA2-2，它们的序列如下mA2-15’-CCCTTCTCTCCTCCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO4)mA2-25’-TGCATGGTGCCAGTGTAGAGC-3’(SEQ ID NO5)以2μg小鼠肠组织的总RNA为模板，参照BOEHRINGER公司5′/3′RACE Kit中所述的方法，进行逆转录反应、加尾反应和两轮PCR反应，得到一条约130bp的产物(图2，上方)。将该产物克隆到T-Easy Vector(购自Promega)中，然后挑选4株阳性克隆测序分析，确定腺嘌呤A为小鼠ACAT-2基因启动子的转录起始位点(见图2，下方)。
实施例3
小鼠ACAT-2基因启动子的序列分析这段序列中虽然没有典型的TATA Box，也没有CCAAT Box，但详细分析发现，该段序列中集中了一些转录因子结合元件的特征序列-770～-757bp处有一个HNF-1α结合位点的特征序列；-664～-660处和-897～-893处各有一个Cdx-2结合位点；在-421～-410和-249～-236处有两个GATA-1结合位点；-206～-188处有一个反向的P300结合位点；-721～-710处有一个C/EBP结合位点；-642～-614处有一个DeltaE结合位点，说明这段序列是典型的转录启动子区(参见图1)。
实施例4小鼠ACAT-2基因启动子的真核表达质粒的构建为确定小鼠ACAT-2基因启动子的主要转录活性区段，利用高灵敏度的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic(购自Promega公司)，分别将不同长度的小鼠ACAT-2基因启动子区段接在报告基因上游，构建一系列重组表达质粒。(参见图3)实施例5细胞培养、DNA转染和小鼠ACAT-2基因启动子主要转录活性区段及主要转录因子结合元件的确定。
在本实施例中，分别将不同长度的小鼠ACAT-2基因启动子接入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上游，用磷酸钙方法分别转染大鼠肝细胞(LW-13)、人肝癌母细胞瘤细胞(HepG2)和人结肠癌细胞(Caco-2)，分别测定相对荧光素酶活性。以确定小鼠acat-2启动子的转录活性和主要转录活性所在的区段，同时找出起主要作用的转录因子结合元件。
大鼠肝细胞LW-13的培养按Cell Res.1992，2139-152中所述的方法进行；人肝母细胞瘤细胞HepG2的培养按Busch，S.J.，Barnhart，R.L.，Martin，G.A.，Flanagan，M.A.，和Jackson，R.L.，J.Biol.Chem.1990，26522474-22479所述的方法；人结肠癌细胞Caco-2的培养按Levy，E.，Mehran，M.，和Seidman，E.，FASEB J.1995，9626-635所述的方法。DMEM培养基中含10％FBS(其中Caco-2为20％FBS)、10μg/ml streptomycin和10u/ml penicillin，培养条件皆为湿度95％，5％ CO2，37℃。
转染前两天将细胞接种到12孔板，每孔细胞数为100,000-300,000，转染时细胞丰度达50-80％，其中Caco-2细胞的转染分未分化和分化4天两种情况。将pGL3-mD50(简称mD50)、pGL3-mD51(mD51)、pGL3-mD52(mD52)、pGL3-mD53(mD53)和阴性对照质粒pGL3-Basic(Basic，不含启动子)以磷酸钙方法分别转染LW-13、HepG2和Caca-2细胞，进行瞬时表达研究。转染参数为每孔2μg样品DNA、1ug内标质粒pCH110和200μl转染液，37℃转染细胞12小时，44小时后收集细胞。
收集细胞后测定相对荧光素酶(luciferase)活力，方法参照Promega公司的产品说明书。根据相对荧光素酶活力判断其上游启动子的转录活性，而共表达的β-半乳糖苷酶活性作为内标，用以校正因细胞培养的微环境(细胞密度、细胞微分布、培养瓶内壁等)不同而造成的转染效率差异。相对荧光素酶活力的计算公式为 其中 测定时以荧光素酶基因上游不带启动子的pGL3-Basic作阴性对照，同一批样品之间的β-半乳糖苷酶基因转染效率(β-半乳糖苷酶活力O.D.420/对应的蛋白量)的波动应小于15％，每一实验作三份平行样品。
实验结果如图3所示。结果表明在大鼠肝细胞LW-13、人肝母细胞瘤细胞HepG2、人结肠癌细胞Caco-2中，小鼠ACAT-2基因启动子的主要转录活性区段都在-1030bp～-569bp之间。当插入片段的5’端从-1030bp处缩短至-868bp时，其转录活性略有下降；当插入片段的5’端从-1030bp处缩短至-569bp时，其转录活性明显下降。这些结果说明，-1030bp～-569bp，即SEQ ID NO1中98-558位是小鼠ACAT-2基因启动子的主要转录活性区段，同时说明，在该启动子中，一个HNF-1α和两个Cdx-2是主要的转录因子结合元件。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所<120>小鼠胆固醇酯合成酶-2基因启动子<130>024546<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1199<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>1tacacagcta gttagaaaga ttgctgttgg cttgtgtact aataaaacag tattgggggg60gtgtctctgg cttacgtctc tgcgtctgtc tcattcagat ctggggcctc gtgctcactg 120tctcccattg gtcatagtgt ttctaccttc cctgcagagc acagccagcc tcttccattg 180cccttggaat acagtagact gccactgcca caggcagcaa gccctttctt tatcctcacc 240cggataccca cccggagctc ccttgtggga ctgactgaga tcctggtctc agtccgagat 300cacagtgatt acaatcttgc ttctatcact gacctctgga ctgatggagg aggaggatta 360atagttaatc cccagcagga atttgccaaa gtggaactcc caaggcactc acctgcccta 420ctgcctacca gaaagaaaca aatgtgctca ggctctgtat ggtttatcca gactacctcc 480agactacctt atttgtgctg gcaatcacct gatgacgtag ggacattttg tcccataatt 540tttttttttt tcagaagaag cttaaaaagt ttggtccact ttcctgaagt tacataggta 600ggcaaggcaa cccctggcgc tatttactgt tgaataagtg tgtgtctgcc ctttctgctt 660atgtggtaac ccaaggtgta gggaagagct gacactgagg ggcctcgacc atcacacatg 720acacaaatag agctcctgac aaaaatattg ttgcacacac atgtcactac aggcctcatc 780ctgtgccctc agaaaaatga ctacaaggta cacgaagatg tttctggtcc ctccctgacc 840ttcagtcttg gtagagagag ccaggaagag ccaagctatg tgataagcct cggggaagca 900aagtccccct cacaacctga tgcacagact cactcccgaa agtgaaatag caatagcgtg 960aagctgatca tagtggttgt ggtgagagag ctgtgaaagc cgcaggcagg gccagagtat 1020
gagagacact gcctgcagat aacctatcta accctcaacg gggctccgga aaggacttta 1080gtccctggag ttgtcagatc tctgagtggg acacaagctc tgtaggtaga ttgagaaaga 1140aagaaaggaa gaagacagac aacagctgtg tgctgtccgc tctacactgg caccatgca 1199<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2cccttctctc ctccgaagct g 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3tgcatggtgc cagtgtagag c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cccttctctc ctccgaagct g 21<210>5
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5tgcatggtgc cagtgtagag c 2权利要求
1.一种启动子，其特征在于，它包含小鼠胆固醇酯合成酶-2启动子的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，它包含选自下组的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1中47-1137位所示的核苷酸序列，或(b)SEQ ID NO1中98-558位所示的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的启动子。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，它还含有所述的启动子可操作地连接的外源基因。
5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的外源基因是报告基因。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是小鼠、大鼠和人的细胞。
9.一种权利要求1所述的启动子的用途，其特征在于，用于筛选治疗胆固醇相关疾病的药物。
10.一种筛选治疗胆固醇相关疾病的药物的方法，其特征在于，包括步骤(a)在适合生长的条件下，培养宿主细胞，所述的宿主细胞含有一表达载体，所述表达载体含有权利要求1所述的启动子和与该启动子可操作性相连的报告基因，其中在第一组宿主细胞的培养基中添加候选物质，在第二组宿主细胞的培养基中不添加候选物质；(b)测定第一组和第二组宿主细胞中报道基因的表达量，其中第一组宿主细胞中报告基因的表达量高于第二组就表示该候选物质是治疗胆固醇相关疾病的药物。
全文摘要
本发明提供了小鼠胆固醇酯合成酶－2启动子序列及其主要的顺式作用元件，含所述序列的构建物和载体，以及它们的用途。本发明的胆固醇酯合成酶－2启动子可用于研究筛选治疗或辅助治疗动脉粥样硬化症的药物并在哺乳动物细胞中表达异源蛋白。
文档编号C12N15/54GK1502695SQ0215073
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月27日 优先权日2002年11月27日
发明者李伯良, 宋保亮, 王灿华, 杨新颖, 姚晓敏 申请人:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院上海生命科学研究院生物化