选择和制备疫苗组分的方法及基于其的疫苗的制作方法

专利名称：选择和制备疫苗组分的方法及基于其的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，更具体地说涉及免疫学和微生物学领域。本发明进一步涉及抗微生物感染疫苗的领域且尤其是细菌疫苗诸如肺炎球菌疫苗。更具体地，本发明涉及鉴定、选择和分离疫苗组分来产生用于被动和/或主动免疫抗可被调理吞噬作用细胞识别且优选地吸收且更优选地杀死的微生物的疫苗的方式和方法。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)为引起严重感染诸如肺炎、败血病、脑膜炎和中耳炎的病原体，且每年导致超过三百万人死亡，其中一百万为儿童。肺炎链球菌的抗菌抗性问题已通过有限量国际性识别的多-抗性菌株的成功传播被增强。这些菌株使得肺炎球菌疾病的治疗难以进行，且这些进一步加强了对作为预防与肺炎球菌感染有关的高发病率和死亡率的可选择手段的接种的需求。开发90种最普遍的荚膜多糖(Pneumovax 23)中23种的抗-肺炎球菌疫苗的最初努力没有获得成功，因为疫苗多糖不能引发处于最危险的肺炎球菌感染中的人的免疫应答幼年儿童，无免疫应答的病人，和老年人。技术的发展可以将荚膜多糖连接于高免疫原性的载体蛋白。这些包含连接于流感嗜血杆菌(Haemophiluss influenzae)B型-多糖的破伤风类毒素的疫苗技术的实施导致所携带的流感嗜血杆菌B型达到不能检测的水平，并且由这些接种群体中的生物体所引起的疾病被消除。最近，多糖结合肺炎球菌疫苗(Prevnar)已经在美国由Wyeth Lederle Vaccines许可生产。Prevnart已经于2001年在荷兰准予生产。疫苗制剂在儿童中是免疫原性的，且包含7种与高免疫原性的(非-肺炎球菌)载体蛋白连接的最普遍的夹膜多糖。然而，与流感嗜血杆菌疫苗不同，这些疫苗仅包括90种已知肺炎球菌荚膜血清型中的7种，并且在美国、以色列和南非进行的三个试验的临床资料表明应用这些疫苗由非-疫苗血清型代替疫苗血清型(1，2，3，4，5)引起集群的变化。由于与基于抗原的窄谱多糖有关的明显弱点，注意力已集中于非多糖荚膜相关的肺炎球菌蛋白，其中许多与感染的发病机理有关。这些蛋白被认为是未来疫苗的重要组分，因为它们涵盖了肺炎球菌的所有血清型。蛋白位点比编码荚膜多糖产物的基因的变化更少，且它们更可能激发儿童的免疫应答(6，7，8，9)。
此外，迄今开发的所有疫苗均是系统性疫苗，即必须注射的疫苗。可以例如鼻内施用的粘膜疫苗能优选地便于施用，特别是用于儿童。
在我们正在进行的对肺炎链球菌的分子流行病学和发病机理的研究中，我们发展了一种用于提取表面结合的肺炎球菌蛋白以及随后的所述蛋白结合于抗体的检验方法。抗体-抗原复合体被鉴定，所述抗原被分离和鉴定且抗所述抗原产生的抗体随后检验了它们对微生物的调理作用能力。抗原，其结合于对在其表面上有此抗原的微生物具有调理作用能力的抗体，被通过例如凝胶点样的高分辨率的双向PAGE和质谱鉴定进行鉴定。此方法给我们提供了分离和鉴定具有疫苗潜能的肺炎球菌成熟蛋白(PpmA)的手段(10，11)。
用于表面-结合球菌蛋白，ppmA及其蛋白产物(PpmA)的序列以及其治疗潜能的鉴定技术描述在下面欧洲专利申请nr.99202640.1中。
许多微生物的特征在于它们经巨噬细胞噬菌作用后被杀死。许多微生物需要通过调理素的调理作用来增强它们的噬菌作用。调理作用是使微生物通过吞噬细胞更易于被吸收的作用。在所述作用中，调理作用抗体和/或蛋白结合于所述微生物，由此促进了所述微生物被所述吞噬细胞的吸收。调理吞噬作用在活的巨噬细胞中测定且包括测定巨噬细胞对用调理作用抗体预处理的微生物的吸收。利用此方法，可进行表面抗原即与特异性诱导调理吞噬作用的微生物的表面结合的天然或人工抗原的选择。当然，具有调理吞噬作用诱导能力的表面抗原可选自表面蛋白的集合。此典型地表明所述表面蛋白分离自微生物且随后被纯化和检验。
在本申请中，我们公开了一种用于鉴定具有调理吞噬作用诱导能力的表面蛋白的方法，其不需要如上述专利申请99202640.1中应用的表面抗原混合物。在这里我们公开了组合选择的方法，特别是用功能性试验用于调理吞噬作用的硅片上选择。通过在硅片上检索编码膜锚的序列基序，或更优选地检索细胞壁结合结构域，鉴定了具有调理吞噬作用潜能的蛋白。所述在硅片上选择之后是所述选择蛋白的至少一部分的重组制备。所述重组蛋白随后用于免疫动物，和/或接触抗体集合。在小鼠中，用所述重组蛋白质或用抗所述蛋白的抗体进行主动和被动免疫方法来检验所述重组蛋白质的调理作用潜能。所选蛋白或其部分的保护能力可以在接种攻击实验中进行测定。
根据此方法，三种蛋白已被确定为可能的噬菌作用诱导的疫苗组分且公开在本发明中。所述蛋白之一为称作肺炎球菌IgA1蛋白酶(IgA1蛋白酶)的蛋白，一种可将人二聚体IgA分子转化为单体的蛋白酶。另一种蛋白肽基脯氨酰异构酶，其被我们命名为链球菌性脂蛋白旋转异构酶A(SlrA)。另一种蛋白为肺炎球菌表面粘附蛋白A(PsaA)。
PpmA蛋白已被分类为异构酶。在我们用微生物表面上的同源功能检索其它蛋白的过程中，我们发现一种具有肽基脯氨酰异构酶活性的蛋白，SlrA。在此申请中，同源定义为连续的同源性和/或功能性同源性。
SlrA，尽管属于除PpmA外的另一蛋自家族，其看起来是也一种诱导调理吞噬作用的抗原。令人惊讶地，上述蛋白没有通过任意其它的方法被鉴定为调理吞噬作用增强蛋白。例如，如实施例1所述，在芬兰进行的对儿童的大量血清学调查中发现抗SlrA，或IgA1蛋白酶的抗体滴度和急性中耳炎(中耳感染)的第一急性发作之间没有相关性。在缺乏这些相关性的情况下，这些蛋白没有被认为对于抗链球菌感染保护是重要的。
因为调理吞噬作用活性与体内保护相关联，这些数据表明SlrA，IgA1蛋白酶和PsaA具有激发免疫防护的潜能。往往通过研究缺失所述蛋白的微生物的复制体外检验微生物毒性的丧失。肺炎链球菌重组菌株中SlrA，IgA1蛋白酶，或PsaA的缺乏不影响所述微生物的体外特性。因此，所述蛋白没有被通过本领域目前的方法选作疫苗组分。
我们在一个实施方案中公开了鉴定调理吞噬作用诱导抗原作为疫苗组分用于抗微生物免疫的方法，包括(在硅片上)通过与微生物表面结合的分子诸如膜锚定基序和/或细胞壁结合结构域，选择编码至少部分细菌蛋白的核苷酸序列，和产生至少部分所述蛋白，和将抗体集合与所述蛋白接触并测定至少一种抗体和至少一种抗原之间的结合，以及测定具有此抗原的微生物的所述结合抗体的调理作用能力。
可用于硅片上选择的基序包括，例如，lipobox(通过脂基与膜锚定)，肽聚糖结合结构域(PBD)，胆碱结合结构域(CBD)或LPxTG基序(细胞壁结合结构域)。上述的基序的特征如下PBD[YV]-X(0，4)-G-D-[ST]-[VLIA]-X(0，2)-[VLIA]CBDG-X(0，5)-G-X-[WYI]-[WYT]-[YVL]-[FV]Lipobox(+信号肽)<M-X(1，10)-[RK]-X-{DERRK}(7，17)-[LVFTIMG]-[ASTIVGMLCPFL]-[AGLISVTFP]-CLPxTGL-P-X-T-G其中X表示任意天然存在的氨基酸，且其中方括号表示一个位置其可用方括号间表示的任一氨基酸填充。下标数字表示相应氨基酸被重复所标数字的次数。
当然，所述抗体集合可通过在动物体内形成抗体来制备，通过利用所述微生物的至少部分所述的选择蛋白免疫例如兔或小鼠或大鼠或其它动物。因此，此申请也教导了鉴定调理吞噬作用诱导的抗原作为疫苗组分用于免疫处理抗微生物的方法，如上所述其中所述抗体集合是通过用所述微生物的至少一种抗原免疫动物产生的。抗所述蛋白的抗体也可选自抗体的预-存在集合或其功能部分，衍生物或其类似物。此方法可用于任意的微生物，其通过免疫系统的防御取决于调理吞噬作用。因此，本申请教导了鉴定调理吞噬作用诱导的抗原作为用于免疫处理如所描述的抗微生物的疫苗组分的方法，其中所述微生物为例如链球菌属的成员，例如肺炎链球菌，或草绿色链球菌，或犬链球菌，或Streptococcus suis的成员，或葡萄球菌属的成员，例如金黄色葡萄球菌，或表皮葡萄球菌，或凝固酶阴性的葡萄球菌的成员，或粘膜炎莫拉氏菌，或脑膜炎奈瑟氏球菌，或Neisseria ghonorrhoeae，或幽门螺旋杆菌，或流感嗜血杆菌或空肠弯杆菌的成员，或假单胞菌属，或芽孢杆菌属的成员。
一旦鉴定，所述部分同源的蛋白或其部分被重组制备并且检验其诱导调理吞噬作用的能力。因此，本申请也教导了至少编码蛋白的功能部分的核苷酸序列，所述蛋白诱导具有此种蛋白的微生物的调理吞噬作用，其中所述蛋白与通过如上所述方法选择的蛋白具有部分同源性。所述核苷酸序列可插入到重组载体中且由此可提供重组细胞。所述重组细胞产生基于所述核苷酸序列的蛋白，因此，本申请也教导了至少包含编码蛋白的功能部分的核苷酸序列的重组载体，所述蛋白诱导具有此种蛋白的微生物的调理吞噬作用，其中所述蛋白与通过如上所述方法选择的蛋白具有部分同源性。本申请也教导了表达至少部分核苷酸的重组细胞，以及通过所述重组细胞产生的纯化蛋白。所述抗原或蛋白或其部分可用作用于免疫处理抗微生物的疫苗组分，因此本申请教导了用于免疫处理抗可通过调理吞噬作用细胞被杀死的微生物的疫苗组分，所述疫苗组分包括所述蛋白，和/或其抗原部分。在一个实施方案中，所述疫苗组分可包括至少肺炎肺炎链球菌的链球菌性脂蛋白旋转异构酶A(SlrA)的功能部分。因此，本专利申请公开了所述疫苗组分，至少包括肺炎肺炎链球菌的链球菌性脂蛋白旋转异构酶A(SlrA)的功能部分。在另一实施方案中，所述疫苗组分可至少包括肺炎链球菌的肺炎球菌IgA1蛋白酶(IgA1)的功能部分。因此，本专利申请公开了所述疫苗组分，至少包括肺炎肺炎链球菌的肺炎球菌IgA1蛋白酶(IgA1)的功能部分。
在又一个实施方案中，所述疫苗组分可至少包括肺炎链球菌的肺炎球菌表面粘附蛋白A(PsaA)的功能部分。因此，本专利申请公开了所述疫苗组分，至少包括肺炎肺炎链球菌的肺炎球菌表面粘附蛋白A(PsaA)的功能部分。
术语蛋白的“至少功能部分”是指仍能引起接种受试者的免疫应答的最小用量的氨基酸。术语“抗原部分”同样用于本说明书中来鉴定蛋白的此种功能部分。通常，此部分将至少超过10个氨基酸，且优选地约50-100个氨基酸。
我们在本专利申请中公开了所述蛋白在小鼠模型中通过系统接种和粘膜接种两种进行主动和被动免疫的保护能力。
也许在疫苗中超过一种表面蛋白或其功能部分的组合是有益的，以及同样至少一种表面蛋白或其功能部分PpmA或与其它蛋白组合来诱导更好的免疫力是有益的。因此，在另一实施方案中，所述疫苗组分还可至少包括肺炎链球菌的肺炎球菌成熟蛋白A(PpmA)或另一种蛋白的抗原部分。利用所述疫苗组分，可制备疫苗用于治疗可通过调理吞噬作用细胞被杀死的微生物的感染。
因此，本申请教导了一种包括至少一种疫苗组分和/或其同源的和/或功能性同源蛋白或其蛋白片段用于治疗可通过调理吞噬作用细胞被杀死的微生物的感染的疫苗。当然，一种所述疫苗可与药用载体和/或佐剂一起配制。优选地所述佐剂包括革兰氏阳性细菌的细胞壁物质，更优选的其包括所谓的血影细胞(空的细菌细胞，其仍然具有完整的细胞壁结构)。其进一步优选地将抗原与这些血影细胞连接，例如通过利用蛋白锚，诸如AcmA蛋白锚进行连接。其它助剂可以选自本领域已知的佐剂制品，诸如乳剂与维生素E。因此，本申请同样教导了所述疫苗也包括药用载体和/或佐剂。
为进行被动免疫，抗各所述蛋白的特异性抗体被施用于小鼠且测定抗用强毒肺炎链球菌攻击感染的所述被动免疫的保护。当然，本方法现在可用于所有的微生物，其宿主的免疫应答基于所述微生物被吞噬细胞杀死，例如但不限于例如链球菌属的成员，例如肺炎链球菌，或草绿色链球菌，或犬链球菌，或Streptococcus suis的成员，或葡萄球菌属的成员，例如金黄色葡萄球菌，或表皮葡萄球菌，或凝固酶阴性的葡萄球菌的成员，或粘膜炎莫拉氏菌，或脑膜炎奈瑟氏球菌，或Neisseria ghonorrhoeae，或幽门螺旋杆菌，或流感嗜血杆菌或空肠弯杆菌的成员，或假单胞菌属，或芽孢杆菌属的成员。
此处所述的术语“抗体”是指单克隆抗体，多特异性抗体(例如，双-特异性)，人抗体，人源化抗体，camelised抗体，嵌合抗体，单-链Fvs(scFv)，单链抗体，合成的抗体，单结构域抗体，Fab片段，F(ab)片段，二硫化物-连接的Fvs(scFv)，以及抗-独特型(抗-Id)抗体，以及任意上述的抗原表位-结合片段。尤其是，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合部位的分子。免疫球蛋白分子可以是任意的型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
本发明的抗体包括，但不限于，单克隆抗体，多特异性抗体，合成的抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，单-链Fvs(scFv)，单链抗体，Fab片段，F(ab′)片段，二硫化物-连接的Fvs(scFv)，以及抗-独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，本发明抗体的抗-Id抗体)，以及任意上述的抗原表位-结合片段。尤其是，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有免疫特异性结合于本发明疫苗组分的抗原结合部位的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任意型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
本发明的抗体可以是任意动物来源的包括鸟和哺乳动物(例如，人，鼠，驴，羊，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马，或鸡)。优选地，本发明的抗体是人或人源化的单克隆抗体。如在此处应用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体且包括由人免疫球蛋白文库(包括但不限于与人免疫球蛋白序列同源的免疫球蛋白序列的合成文库)分离的抗体或来自表达来自人基因的抗体的小鼠。
在特定的实施方案中，高效价抗体可用于本发明的方法。例如，高效价抗体可通过遗传改造合适的抗体基因序列并在合适的宿主中表达抗体序列来产生。可选择产生的抗体来鉴定在BIAcore分析中具有例如高kon值的抗体(参见下文)。
在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体或其片段具有下述的亲合常数或Ka(kon/koff)至少102M-1，至少5×102M-1，至少103M-1，至少5×103M-1，至少104M-1，至少5×104M-1，至少105M-1，至少5×105M-1，至少106M-1，至少5×106M-1，至少107M-1，至少5×107M-1，至少108M-1，至少5×108M-1，至少109M-1，至少5×109M-1，至少1010M-1，至少5×1010M-1，至少1011M-1，至少5×1011M-1，至少1012M-1，至少5×1012M-1，至少1013M-1，至少5×1013M-1，至少1014M-1，至少5×1014M-1，至少1015M-1，或至少5×1015M-1。在又一个实施方案中，用于本发明方法的抗体或其片段具有下述的解离常数或Kd(koff/kon)小于10-2M，小于5×10-2M，小于10-3M，小于5×10-3M，小于10-4M，小于5×10-4M，小于10-5M，小于5×10-5M，小于10-6M，小于5×10-6M，小于10-7M，小于5×10-7M，小于10-8M，小于5×10-8M，小于10-9M，小于5×10-9M，小于10-10M，小于5×10-10M，小于10-11M，小于5×10-11M，小于10-12M，小于5×10-12M，小于10-13M，小于5×10-13M，小于10-14M，小于5×10-14M，小于10-15M，或小于5×10-15M。
在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体或其片段在体外微量中和测定中具有下述的中值有效浓度(EC50)小于0.01nM，小于0.025nM，小于0.05nM，小于0.1nM，小于0.25nM，小于0.5nM，小于0.75nM，小于1nM，小于1.25nM，小于1.5nM，小于1.75nM或小于2nM。中值有效浓度为抗体或抗体片段在体外微量中和测定中中和50％传染性微生物的浓度。在优选的实施方案中，用于本发明方法的抗体或其片段在体外微量中和测定中具有下述的EC50小于0.01nM，小于0.025nM，小于0.05nM，小于0.1nM，小于0.25nM，小于0.5nM，小于0.75nM，小于1nM，小于1.25nM，小于1.5nM，小于1.75nM，或小于2nM。
用于本发明方法的抗体包括修饰的衍生物，即通过将所有类型的分子与抗体共价连接进行。例如，然而并非限于，抗体衍生物包括已被修饰的抗体，例如，通过糖基化作用，乙酰化，peg化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团的衍生作用，蛋白水解裂解，连接于细胞配体或其它蛋白，等等。通过已知的技术可进行任意的化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，在衣霉素存在下合成，等等。另外，衍生物可含有一或多个非-典型的氨基酸。
本发明也提供了本发明的抗体或其包含本领域技术人员公知的框架区的片段。在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体的一或多种框架区，优选地，所有的框架区，或其片段是人的。在其它的特定实施方案中，本发明的抗体的片段区域或其片段是人源化的。在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体是合成的抗体，单克隆抗体，内抗体，嵌合抗体，人抗体，人源化嵌合抗体，人源化抗体，糖基化的抗体，多特异性抗体，人抗体，单链抗体，或特异性抗体。
在本发明的特定实施方案中，用于本发明的抗体在哺乳动物优选为人体中具有下述半衰期大于12小时，大于1天，大于3天，大于6天，大于10天，大于15天，大于20天，大于25天，大于30天，大于35天，大于40天，大于45天，大于2个月，大于3个月，大于4个月，或大于5个月。可通过本领域技术人员公知的技术制备在体内延长半衰期的抗体或其抗原结合片段。例如，具有体内延长半衰期的抗体或其抗原结合片段可通过修饰(例如，取代，缺失或添加)鉴定为与Fc结构域和FcRn受体间相互作用有关的氨基酸残基来产生(例如，参见PCT公开WO 97/34631和U.S专利申请10/020,354，名称为″Molecules with Extended Half-Lives，Compositions and UsesThereof′，2001年12月12日申请的，Johnson等，其引入作为参考)。此抗体或其抗原结合片段可利用本领域技术人员公知的方法检验其与本发明疫苗组分的结合活性以及体内效力，例如，通过在此处描述的免疫测定进行。
此外，在体内具有延长半衰期的抗体或其抗原结合片段可通过连接于所述抗体或抗体片段聚合物分子诸如高分子量聚乙二醇(PEG)来制备。PEG可通过PEG位点特异性结合于所述抗体或抗体片段的N-或C-末端或通过赖氨酸残基上的ε-氨基连接于具有或不具有多功能接头的所述抗体或抗体片段。可利用导致生物活性损失最小的线性或分支聚合物的衍生作用。通过SDS-PAGE和质谱法密切监控结合的水平以确保PEG分子与抗体的正确结合。可通过例如，尺寸排阻或离子交换层析由抗体-PEG结合物中分离未反应的PEG。PEG衍生化的抗体或其抗原结合片段可利用本领域技术人员公知的方法检验其与本发明疫苗组分的结合活性以及体内效力，例如，通过在此处描述的免疫测定进行。
在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体为包含免疫特异性结合于本发明疫苗组分的抗体或其片段和异源多肽的融合蛋白。优选地，与抗体或抗体片段融合的异源多肽可用于靶向抗体易于感染的细胞。
在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体或其片段破坏或阻止微生物抗原和其宿主细胞受体之间的相互作用。
在特定的实施方案中，用于本发明方法的抗体是单-链抗体。单-链抗体的设计和构建描述在Marasco等，1993，Proc Natl Acad Sci 907889-7893中，其在此引入作为参考。
在特定的实施方案中，用于本发明的抗体结合于胞内的抗原表位，即，为内抗体。内抗体含有能够免疫特异性结合抗原的至少一部分抗体且优选地不含编码其分泌物的序列。此种抗体将结合其胞内抗原。在一个实施方案中，内抗体包括单链Fv(“sFv”)。sFv为含有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，Fv多肽进一步在VH和VL结构域之间含有多肽接头其使得sFv能够形成用于抗原结合的目的结构。sFv的综述参见Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg以及Moore eds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。在进一步的实施方案中，内抗体优选地不编码可操作的分泌序列且因此保持在细胞中(通常参见Marasco，WA，1998，″内抗体Basic Research andClinical Gene Therapy Applications″Springer纽约)。
内抗体的制备是本领域技术人员公知的且描述在例如U.S专利6,004,940；6,072,036；5,965,371中，其在此引入作为参考。此外，内抗体的构建描述在Ohage和Steipe的1999，J.Mol.Biol.2911119-1128；Ohage等，1999，J.Mol.Biol.2911129-1134；以及Wirtz和Steipe，1999，Protein Science 82245-2250中。重组分子生物技术诸如那些描述抗体重组制备(参见下文)的技术也可用于内抗体的产生。
在一个实施方案中，本发明的内抗体保持至少完全抗体的约75％的抗原结合有效性(即，具有保守的以及可变区)。更优选地，内抗体保持至少完全抗体的85％的结合有效性。更优选地，内抗体保持至少完全抗体的90％结合有效性。更优选地，内抗体保持至少完全抗体的95％结合有效性。
在产生内抗体中，编码目的VH和VL链两者的可变区的多核苷酸可通过利用例如杂交瘤mRNA或脾mRNA作为模板PCR扩增这些结构域来克隆(Huse等，1989，Science 2461276)。在一个优选的实施方案中，编码VH和VL结构域的多核苷酸通过编码接头的多核苷酸序列相连接来制备单链抗体(sFv)。sFv典型地包括具有序列VH-接头-VL或VL-接头-VH的单肽。选择接头来允许重链和轻链在它们的适当构象方向结合在一起(参见例如，Huston等，1991，Methods inEnzym.20346-121)。在进一步的实施方案中，接头可跨越融合位点至每一可变域之间的距离(例如，3.5nm)以使天然Fv构象的变形最小化。在此实施方案中，接头为至少5个氨基酸残基，至少10个氨基酸残基，至少15个氨基酸残基或更多个氨基酸残基的多肽。在进一步的实施方案中，接头不引起结合位点的VH和VL结构域的空间干扰。在此实施方案中，接头为35个氨基酸或更少，30个氨基酸或更少，或25个氨基酸或更少。因此，在最优选的实施方案中，接头为15-25氨基酸残基长。在进一步的实施方案中，接头为亲水性的且充分地柔性使得VH和VL结构域可接受检测抗原所必需的构象。内抗体可具有插入在相同的VH和VL结构域之间的不同接头序列。可凭经验通过评价每一抗原结合的水平来测定特定VH和VL结构域对的具有合适特性的接头。接头实例包括，但不限于，表1A中公开的那些序列。
表1A序列(Gly Gly Gly Gly Ser)3Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGlu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser ThrGlu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val AspGly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys GlyLys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg SerLeu AspGlu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp在一个实施方案中，内抗体在细胞质中表达。在其它实施方案中，内抗体定位在不同的胞内位置。在这些实施方案中，特异性定位序列可连接内核苷酸多肽来将内抗体定位于特定的位点。内抗体可定位于，例如，下列的胞内位置内质网(Munro等，1987，Cell 48899-907；Hangejorden等，1991，J.Biol.Chem.2666015)；核(Lanford等，1986，Cell 46575；Stanton等，1986，PNAS 831772；Harlow等，1985，Mol.Cell Biol.51605)；核仁区域(Seomi等，1990，J.Virology 641803；Kubota等，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.162963；Siomi等，1998，Cell 55197)；内体区室(Bakke等，1990，Cell 63707-716)；线粒体基质(Pugsley，A.P.，1989，″Protein Targeting″，Academic Press，Inc.)；高尔基体(Tang等，1992，J.Bio.Chem.26710122-6)；脂质体(Letourneur等，1992，Cell 691183)；和原生质膜(Marchildon等，1984，PNAS 817679-82；Henderson等，1987，PNAS 89339-43；Rhee等，1987，J.Virol.611045-53；Schultz等，1984，J.Virol.133431-7；Ootsuyama等，1985，Jpn.J.Can.Res.761132-5；Ratner等，1985，Nature 313277-84)。定位信号实例包括，但不限于，表2A中公开的那些序列。
表2A部位序列内质网 Lys Asp Glu Leu内质网 Asp Asp Glu Leu内质网 Asp Glu Glu Leu内质网 Gln Glu Asp Leu内质网 Arg Asp Glu Leu核 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
核 Pro Gln Lys Lys Ile Lys Ser核 Gln Pro Lys Lys Pro核 Arg Lys Lys Arg核仁区域 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg ArgArg Ala His Gln核仁区域 Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg ArgArg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg核仁区域 Met Pro Leu Thr Arg Arg Arg ProAla Ala Ser Gln Ala Leu Ala Pro ProThr Pro内体 Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile区室 Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro线粒体基质 Met Leu Phe Asn Leu Arg Xaa XaaLeu Asn Asn Ala Ala Phe Arg HisGly His Asn Phe Met Val Arg AsnPhe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Xaa原生质膜 GCVCSSNP原生质膜 GQTVTTPL原生质膜 GQELSQHE原生质膜 GNSPSYNP原生质膜 GVSGSKGQ原生质膜 GQTITTPL原生质膜 GQTLTTPL原生质膜 GQIFSRSA原生质膜 GQIHGLSP原生质膜 GARASVLS原生质膜 GCTLSAEEVH和VL结构域由通常具有保守的结构二硫键的免疫球蛋白结构域组成。在其中内抗体在还原环境(例如，细胞质)中表达的实施方案中，此种结构特征不存在。内抗体多肽序列可以产生突变来补偿免疫球蛋白结构由于缺乏二硫键形成导致的免疫球蛋白稳定性的降低。在一个实施方案中，内抗体的VH和/或VL结构域含有一或多个点突变因此使得它们在还原环境中的表达被稳定化(参见Steipe等，1994，J.Mol.Biol.240188-92；Wirtz和Steipe，1999，Protein Science 82245-50；Ohage和Steipe，1999，J.Mol.Biol.2911119-28；Ohage等，1999，J.Mol Biol.2911129-34)。
制备抗体的方法本发明方法所用的抗体或其片段可通过本领域任意已知的合成抗体方法来制备，尤其是，通过化学合成或优选地，通过重组表达技术。本发明疫苗组分的多克隆抗体可通过本领域公知的各种方法来制备。例如，本发明的抗原可施用于各种宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等来诱导含有抗原特异性多克隆抗体的血清的产生。各种助剂可用来提高免疫应答，取决于宿主种类，且包括但不限于，弗氏(完全和不完全的)，矿物胶诸如氢氧化铝，表面活性物质诸如溶血卵磷脂，复合多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，钥孔血兰素，二硝基酚，细菌血影细胞，以及可能有用的人助剂诸如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌。这些助剂也是本领域众所周知的。就血影细胞来说，抗原优选地与血影细胞结合，例如通过蛋白锚，其中AcmA蛋白质锚是尤其优选的。
单克隆抗体可以利用多种本领域已知的技术制备包括利用杂交瘤，重组体以及噬菌体展示技术或者其组合。例如，单克隆抗体可以利用包括本领域已知以及教导的杂交瘤技术产生，例如Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)；Hammerling，等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)所描述的。本发明使用的术语“单克隆抗体”不局限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆，包括任何真核，原核或者噬菌体克隆而非其生产方法的抗体。利用杂交瘤技术产生以及选择特异性抗体的方法为本领域的常规并且众所周知的技术。可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生通常包含高水平抗体的腹水。在某些实施方案中，产生单克隆抗体的方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中，优选地通过将分离自用抗原免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合然后筛选源于融合的杂交瘤获记分泌能结合所述抗原的抗体的杂交瘤克隆产生杂交瘤。识别本发明特异性抗原的抗体片段可以由本领域技术人员公知的任何技术产生。例如，本发明的Fab以及F(ab′)2片段可以通过利用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或者胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段蛋白水解裂解免疫球蛋白分子产生。F(ab′)2片段包含可变区，轻链恒定区以及重链的CH1结构域。此外，用于本发明的抗体还可以利用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域显示在噬菌体粒子的表面上其携带编码其的多核苷酸序列。尤其是，编码VH以及VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如人或者鼠淋巴组织的cDNA文库)扩增。编码VH以及VL结构域的DNA通过PCR与scFv接头一起重组并克隆入噬菌体载体(例如pCANTAB 6或者pComb 3 HSS)。载体电穿孔进入大肠杆菌并且用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体通常为包括fd以及M13的丝状噬菌体并且VH以及VL结构域通常重组融合到噬菌体基因III或者基因VIII。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以例如利用标记抗原或者结合或者捕获到固体表面或者珠子的抗原用抗原进行选择或者鉴定。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括公开在如下文献中的方法Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 18241-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24952-958；Persic等，1997，Gene 1879-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57191-280；PCT申请No.PCT/GB91/01 134；PCT公开Nos.WO 90/02809，WO91/10737，WO 92/01047，WO 92/18619，WO 93/1 1236，WO 95/15982，WO 95/20401以及WO97/13844；和美国专利5,698,426，5,223,409，5,403,484，5,580,717，5,427,908，5,750,753，5,821,047，5,571,698，5,427,908，5,516,637，5,780,225，5,658,727，5,733,743以及5,969,108。
如上述参考文献所述，选择噬菌体以后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整的抗体，包括人抗体，或者任一其它期望的抗原结合片段，并且表达在任一期望的宿主中，包括例如，如下所述的哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母以及细菌。
重组产生Fab，Fab′以及F(ab′)2片段的片段还可以利用本领域已知的方法诸如PCT公开WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)864-869；Sawai等，1995，AJRI 3426-34；以及Better等，1988，Science 2401041-1043的方法进行应用。为了产生完整的抗体，包括VH或者VL核苷酸序列的PCR引物，限制性位点以及保护限制性位点的侧翼序列可用于扩增scFv克隆中的VH或者VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，PCR扩增的VH结构域可以克隆入表达VH恒定区，例如，人γ4恒定区的载体，并且PCR扩增的VL结构域可以克隆入表达VL恒定区，例如，人κ或者λ恒定区的载体。优选地，表达VH或者VL结构域的载体包括EF-lα启动子，分泌信号，可变域克隆位点，恒定结构域以及诸如新霉素的选择标记。VH以及VL结构域也可以克隆入表达必须恒定区的一个载体。然后将重链转化载体以及轻链转化载体利用本领域技术人员已知的技术共转染细胞系产生表达全长抗体例如，IgG的稳定或者瞬时细胞系。对于一些包括体内应用人抗体以及体外检测分析的应用而言，可能优于使用人或者嵌合抗体。完全人的抗体尤其是人受试者的治疗所希望的。人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括如上所述利用来源于人免疫球蛋白序列或者与人免疫球蛋白序列同源的合成序列的抗体文库的噬菌体展示方法。也参见美国专利4,444,887以及4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741。
人抗体还可以利用不能表达功能内源性免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。例如，人免疫球蛋白重以及轻链基因复合物可以随机或者通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重以及轻链基因外可以向小鼠胚胎干细胞引入人可变区，恒定区以及多变区。通过同源重组分别或者同时引入人免疫球蛋白位点可以使小鼠免疫球蛋白重以及轻链基因无功能。尤其是，同型接合缺失JH区域可以阻止内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并注入胚泡产生嵌合小鼠。然后饲养嵌合小鼠产生表达人抗体的同型接合后代。以正常方式用选择的抗原，例如，本发明的全部多肽或者一部分免疫转基因小鼠。针对抗原的单克隆抗体可以利用传统的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。转基因小鼠停泊的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重组并随后经历类别转换以及体细胞突变。因此，利用这种技术，有可能产生治疗有用的IgG，IgA，IgM以及IgE抗体。对于产生人抗体的这种技术的综述参见Lonberg以及Huszar的(1995，Int.Rev.Immunol.1365-93)。对于这种产生人抗体以及人单克隆抗体的技术以及产生这种抗体的方案的详细讨论，参见例如，PCT公开WO 98/24893，WO 96/34096以及WO 9633735；以及美国专利5,413,923，5,625,126，5,633,425，5,569,825，5,661,016，5,545,806，5,814,318以及5,939,598。此外，诸如Medarex，Inc.(Princeton，NJ)，Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)的公司可以利用类似于上述的技术提供针对所选择的抗原的人抗体。嵌合抗体为其中不同部分的抗体源自于不同的免疫球蛋白分子诸如抗体具有来源于非人(例如，鼠)抗体的可变区以及人免疫球蛋白恒定区的抗体的分子。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison，1985，Science 2291202；Oi等，1986，BioTechniques 4214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125191-202；以及美国专利5,807,715，4,816,567和4,816,397。包括一或者多种来自人的CDRs以及来自非人免疫球蛋白分子的框架区域的嵌合抗体可以利用本领域已知的多种技术产生包括，例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；以及美国专利5,225,539，5,530,101，以及5,585,089)，饰面或者重修表面(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)489-498；studnicka等，1994，Protein Engineering 7(6)805-814；以及Roguska等，1994，PNAS 91969-973)，以及链改组(美国专利5,565,332)。在优选实施方案中，抗体包括一或者多种CDRs以及人框架区域。常常，框架区域中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应的残基取代改变优选地改进抗原结合。这些框架取代由本领域已知的方法鉴定，例如通过模仿CDR和框架的相互作用鉴定抗原结合的重要框架残基以及序列比较鉴定特定位置的异常框架残基(参见例如，Queen等，美国专利5,585,089；以及Riechmann等，1988，Nature 332323)。
编码用于本发明的抗体的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法获得以及确定多核苷酸的核苷酸序列。这种编码抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸组装而来(例如，Kutmeier等1994，BioTechniques 17242所述)。
或者，编码抗体的多核苷酸可以从来自适合来源的核酸产生。如果不能获得包含编码特定抗体核酸的克隆，但是抗体分子的序列已知，编码免疫球蛋白的核酸可以利用可杂交于序列的3’以及5’末端的合成引物通过PCR扩增或者通过利用特定基因序列的特异性寡核苷酸探针克隆化学合成或者从合适的来源获得(例如，抗体cDNA文库，或者从核酸，优选地聚A+RNA产生的cDNA文库，所述核酸分离自表达抗体的任一组织或者细胞，诸如选择表达本发明抗体的杂交瘤细胞)以鉴定编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。通过PCR产生的扩增核酸可以利用本领域公知的任一方法克隆到可复制的克隆载体中。一旦确定了抗体的核苷酸序列，抗体的核苷酸序列可以利用本领域操纵核苷酸序列的已知方法操作，例如，重组DNA技术，位点定向诱变，PCR等等(参见例如，Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring，NY以及Ausubel等，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NEt所述的技术)，产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代，缺失和/或插入。
在特异性实施方案中，利用常规重组DNA技术将一种或者多种CDRs插入框架区域内。框架区域可以是天然存在或者为共有序列框架区域，并且优选地人框架区域(参见例如，Chothia等，1998，J.Mol.Biol.278457-479列举的人框架区域)。优选地，通过框架区域以及CDRs组合产生的多核苷酸编码特异性结合本发明疫苗组分的抗体。在某些实施方案中，可以在框架区域内进行一或者多个氨基酸的取代，并且优选地氨基酸取代改进抗体与其抗原的结合。另外，这种方法可用来产生参与链内二硫键的氨基酸取代或者一或者多个可变区半胱氨酸残基的缺失产生缺乏一或者多个链内二硫键的抗体分子。其它多核苷酸的改变也包括在本发明以及本领域技术人员已知的范围内。
用于本发明方法的重组表达抗体，其衍生物或者类似物(例如，本发明抗体的重或者轻链或者其部分或者本发明的单链抗体)，需要构建包含编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得这种多核苷酸，产生抗体分子的载体可以利用本领域已知的技术通过重组DNA技术产生。表达载体通过传统方法转入寄主细胞并且通过传统方法培养转染的细胞产生本发明的抗体。本发明的抗体不是只用于被动接种，还可以用于诊断目的以及分析系统中检测细菌和/或其所针对的抗原的存在。这种诊断可用于(例如)检验材料(诸如食品，药物组合物或者空气过滤器)细菌的存在。也可以开发可以检测抗体本身检查受试者血液中抗体的的存在或者计算滴度的检验系统，所述受试者已经用本发明的疫苗免疫。本领域技术人员能产生诱导本发明蛋白的调理吞噬作用的类似化合物。这可以例如通过筛选肽文库以及检验结合如上所述的一种或者多种抗体进行。如此类似物具有与同样的所述蛋白基本上相同的生物学特性，即能够产生类似的免疫应答未必定量。也可能遗传操作从本说明书提供的序列开始的类似化合物。这种类似化合物将具有与说明书中给出的序列相比超过50％的序列同一性。序列同一性可以通过Altschul等(1990)的分别用于核酸或者氨基酸序列的TBLASTN或者TBLASTP程序限定以及确定，或者优选标准程序BestFit，其属于Wisconsin Package，Version 8，1994九月，(GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA，Wisconsin 53711)。核苷酸序列上的序列同一性可以通过利用BLASTN计算机程序计算(其例如由National Center for BiotechnologicalInformation公开，可通过因特网http//www.ncbi.nlm.nih.gov/获取)采用11字长(W)，期望为10(E)，一对匹配残基为5的效益记分(M)，错配-4的处罚记分(N)以及100的截止值的默认设置值。序列同一性可以在核苷酸序列和/或编码氨基酸序列的水平。优选地核酸和/或氨基酸序列与在下面的说明书中提供的序列共有至少50％，或者60％的序列同一性，最优选地至少约70％，或者80％或者90％的序列同一性。
也可以查询直向同源蛋白，即来自其它生物体与肺炎链球菌D39和/或肺炎链球菌TIGR4，诸如其它肺炎链球菌株，或者其它链球菌，乃至葡萄球菌，摩拉克氏菌，奈瑟氏菌及其他细菌乃至非细菌性的生物体密切相关或不相关的蛋白。在这点上直向同源蛋白是指来自其它蛋白具有相同的共同起源但是突变(自然的)后的序列不同的物种的蛋白。这些序列可以例如通过将本发明的序列与诸如GenBank的序列数据库可获得的其它序列相比较或者通过PCR介导的扩增方法从其它生物体分离直向同源蛋白而很容易发现，在所述PCR介导的扩增方法中基于说明书的序列设计引物(简并的)。这些方法是本领域技术人员已知的。
通过上述方法获得的蛋白应该进一步检验其调理吞噬作用诱导特性。经由上述方法获得的好象是调理吞噬作用诱导的任一蛋白被认为是本发明的蛋白并且被认为是适于包含在本发明的疫苗中。同样部分的这些保留能够诱导调理吞噬作用的功能特性的蛋白被认为是包括在本发明的范围内。
作为疫苗组分的调理吞噬作用诱导蛋白还可以与其它调理吞噬作用诱导蛋白和/或其它蛋白一起产生较好的疫苗。本专利申请公开了SlrA，IgA1蛋白酶以及PsaA以及PpmA和/或其它蛋白与所述蛋白的组合的应用。优选地，本发明的疫苗包括2的更多种调理吞噬作用诱导蛋白，其中PpmA以及SlrA的组合不管是否存在其它抗原是最优选的。
本发明通过实施例进行进一步地说明。
实施例1抗肺炎链球菌表面蛋白的抗体滴度与发生第一急性中耳炎之间的相互关系在芬兰的部分群体调查如图1-5中具有首次发生中耳炎的患者所显示的，抗PpmA、SlrA以及IgA1蛋白酶的IgG滴度，全部低于抗肺炎链球菌的α-烯醇酶的滴度。由于缺少抗体滴度和保护的相互关系，SlrA和IgA1蛋白酶被认为没有对于保护性免疫的附加价值，因此不会被选作疫苗组分。
实施例2肺炎链球菌表面蛋白的免疫保护潜能为测定肺炎链球菌表面蛋白的保护潜能，进行主动和被动免疫/攻击两种实验。
方法小鼠菌株对MF1杂交的雌性小鼠进行免疫处理，小鼠购自Harlan Olac，Bicester，UK。所有小鼠圈养且没有特定的病原体。用6周龄小鼠(25-30g)开始进行主动免疫处理以及用9周龄小鼠(30-35g)进行被动免疫处理。
菌株肺炎链球菌D39，血清型2，获自国家典型培养物中心(NCTC7466；中央公共卫生实验室，伦敦)。肺炎链球菌TIGR4，血清型4，获自基因组研究所。细菌培养在添加5％(vol/vol)去纤维蛋白的马血液(BAB)的2号血琼脂基体(Oxoid，Basingstoke，UK)上。通过接种4-5个菌落到25ml脑-心脏浸出液液体培养基(BHI，Oxoid)中来制备原种培养物。
培养物37℃静止培养过夜，之前将1ml含有15％无菌丙三醇的等分样品于-70℃冷冻直至使用。通过证明对抗生素乙基氢化叩卟啉(Optochin)(Difco，Detroit，USA)的敏感性进行菌株确认。通过利用抗-2或4型夹膜抗血清(Statens Seruminstitut，哥本哈根，丹麦)检验特异性多糖夹膜类型的存在来进行血清型的验证。
为对CFU进行计数，通过在无菌圆底96孔微量滴定平皿(LifeTechnologies，Paisley，英国)中添加20μl至180μl的无菌PBS来制备系列稀释的样品。20μl体积的各稀释液一式三份点样在2个分离的BAB平皿上。下列公式用来计算每一毫升样品的集落形成单位的数目CFU/毫升＝每部分的平均菌落数×50×稀释系数。
接种物的制备用胰岛素注射器(F.Baker Scientific，Runcorn，英国)将100μl含有大约105CFU肺炎链球菌的无菌PBS注射到小鼠的腹膜腔中。在昏睡中，通过颈部脱臼杀死小鼠，小心地打开胸腔并去除部分肋骨来提供至心脏的通道。将23规格的针插入右心室中并且慢慢地将血液收集到连接的注射器中。50μl的感染血液在10ml BHI中37℃静止过夜来进行细菌传代培养。细菌通过在3,000rpm离心10min收集(Heraeusmedifuge)，再悬浮在包含20％v/v FCS的新鲜BHI中然后在37℃培养直到达到对数中期(根据光密度判断)。将1ml等分试样的悬浮液储藏在-70℃，直到应用。在-70℃24h后通过活菌计数测定悬浮液的存活力并且证实乙基氢化叩卟啉的灵敏性。存活力不受在-70℃贮藏至少3月的影响。
鼻内感染迅速融化等分试样的标准接种物。通过在13,000rpm离心(Eppendorf微量离心机)沉淀900μl的样品并再悬浮在900μl的无菌PBS中。细菌稀释在无菌PBS中产生1×106CFU/50μl并被活菌计数证实(如前所述)。小鼠用2.5％v/v异氟烷经氧(1.5L/min)与NO2(1L/min)轻度麻醉，利用标定汽化器施用并用无掐捏反射反应证实麻醉。一旦麻醉，动物保持鼻子正直，并通过添加一系列小滴的50μl接种物到鼻孔用于小鼠无意地吸入向鼻内引入肺炎球菌。接种后小鼠仰卧直到回收时并且重新确定接种物的活菌数。在随后的14天期间频繁监控小鼠小鼠(一天至少3次)的感染病征。在达到预确定的终点(垂死的)小鼠通过颈部脱臼处死并记录存活时间。
被动免疫接种通过在56℃培养30分钟灭活补充血清并以预定稀释度应用。感染之前24h以及Ih，小鼠通过腹膜内注射200μl血清进行接种。如先前所述感染小鼠。通过感染之前1h在37℃稀释血清中培养使细菌受调理。在随后的14天期间频繁监控小鼠(一天至少3次)的感染病征。在达到预确定的终点(垂死的)通过颈部脱臼处死小鼠并记录存活时间。
主动免疫将小鼠随机分成6组并且最初接种之前24h从尾部静脉采集血样。按照厂家说明书以1∶1的比率在福氏完全佐剂或者不完全佐剂(Sigma)或者Hunter′s TiterMax(CytRx Corp.，Norcross，GA)或者Quill A(Accurate Chemical Scientific Corporation，Westbury，NY 11590)中制备疫苗。通常每只小鼠施用50μg的蛋白。将100μl的疫苗皮下注射每只小鼠。9天后从一半小鼠的尾部静脉采集血样。通过交错取血然后在接种以及感染之前我们可以对所有小鼠取血但是在接种方案期间仍然监控免疫应答这将使我们和对取血/小鼠(3)的总数以及取血之间的最小时间间隔(14天)的限制相符。采集血样后24h，如前所述反复接种但是如果利用弗氏，则采用FIA(福氏不完全佐剂)。加强免疫后9天，从那些上次加强前未取血的小鼠采集血样。24h后如先前所述反复接种。28天后从所有小鼠尾部静脉采集血样。24h过后如前所述用大约106CFU肺炎链球菌D39或者TIGR4感染小鼠。至少每日3次监控小鼠的感染病征。在达到预确定的终点(垂死的)，通过颈部脱臼处死小鼠。
小鼠强毒接种物的制备在这些实验过程中，最多25个小鼠用于产生小鼠强毒接种物。-80℃延长冷冻后，接种物必须制备/传代的次数取决于生物体的毒性和活力。
感染实验为了优化我们实验室中的肺炎感染模型，即建立最佳数量的将产生具有最长潜伏期的稳定肺炎的生物，我们用5种由103到107cfu的不同稀释度的生物感染4小鼠组。我们优化了两个异源链球菌肺炎菌株(D39和TIGR4)所需的感染剂量。这些菌株在它们的毒力和抗原特性方面不同。(4×5×2＝40只小鼠)。
被动免疫对于用兔多克隆抗-血清被动免疫而言，测定下列血清。
预-免疫血清PpmA多克隆血清PpmA6小鼠每组；用肺炎链球菌的野生强毒株以及缺失PpmA的菌株D39攻击。
主动免疫表1.主动免疫时间表
表2.被动免疫时间表
表3.制备接种物的时间表
结果用肺炎链球菌表面蛋白主动免疫CD-1小鼠以及用野生型肺炎链球菌强毒株感染。
SlrA的免疫保护潜能SlrA激发小鼠产生良好的保护性免疫应答，如表4和图6所示。
表4.用SlrA主动免疫后的存活时间(小时)n＝12
据统计，发现预防接种的和对照组小鼠之间在用强毒肺炎链球菌D39攻击后的存活时间有显著性差异。
Mann Whitney检验P值0.0175Gaussian近似P值P值归纳中值显著不同(P＜0.05)单侧P值栏A，B的秩和113，187Mann-Whitney U 35.00IgA1蛋白酶的免疫保护潜能IgA1蛋白酶激发小鼠良好的保护性免疫应答，如表5和图7所示。
表5.用IgA1蛋白酶主动免疫后的存活时间(小时)(n＝10)
据统计，发现预防接种的和对照组小鼠之间在用强毒肺炎链球菌D39攻击后的存活时间有显著性差异。
Mann Whitney检验P值0.0474Gaussian近似P值P值归纳中值显著不同(P＜0.05)单侧P值栏A，B的秩和69，121Mann-Whitney U 24.00结果显示于图7。
PsaA的免疫保护潜能PsaA激发小鼠良好的保护性免疫应答，如图8所示。
据统计，发现预防接种的和对照组小鼠之间在用强毒肺炎链球菌D39攻击后的存活时间有显著性差异。
Mann Whitney检验P值0.0409Gaussian近似P值
P值归纳中值显著不同(P＜0.05)栏A，B的秩和 195.5，300.5Mann-Whitney U 75.50接种至少一种表面蛋白的组合实验。
接种两种抗原蛋白导致小鼠在用强毒肺炎链球菌D39攻击之后产生良好的存活时间，如表6以及图9所示。
表6.用Ppma和SlrA主动免疫后的存活时间(小时)。
N＝12
PpmA对比PpmA+SlrA Mann Whitney试验P值0.0416Gaussian近似P值P值归纳中值显著地不同(P＜0.05)单侧P值栏A，C的秩和 119.5，180.5Mann-Whitney U 41.50SlrA对比PpmA+SlrA Mann Whitney试验P值0.3325Gaussian近似P值P值归纳 未作说明中值没有显著地差异(P＜0.05)单侧P值栏B，C的秩和 142，158Mann-Whitney U 64.00据统计，PpmA与SlrA混合组以及单独PpmA之间有显著的差异。此表明用超过一种蛋白或其部分接种产生的保护性免疫优于仅仅用一种抗原接种的免疫力。
CD-1小鼠用抗-PpmA血清被动免疫以及用PpmA-ve对照菌株感染对照-小鼠用兔-预免疫血清(PIS)接种(2×200μl)实验-小鼠用多克隆兔超免疫抗-rPpmA血清(APS)接种(2×200μl)。
表7.用PpmA-抗体(APS)或用标准预-免疫血清(PIS)被动免疫后的存活时间(小时)
被动免疫实验用肺炎链球菌D39鼻内感染小鼠Mann Whitney检验P值0.0376精确的P值P值归纳*中值显著地不同(P＜0.05)单侧P值栏A，B的秩和81，129Mann-Whitney U 26.00被动免疫实验用肺炎链球菌D39 ppmA-突变体鼻内感染小鼠Mann Whitney检验P值0.2644精确的P值P值归纳未作说明中值没有显著地不同(P＜0.05)单侧P值栏C，D的秩和96，114Mann-Whitney U 41.00表7和附图10中的结果清楚地表明用抗PpmA抗体被动免疫抗强毒链球菌菌株D39攻击感染的保护作用。它们也表明了抗缺失了PpmA的抗链球菌菌株的保护更弱。ppmA-ve D39菌株之前已被证明比D39毒性弱。
表8.对MF-1小鼠用PpmA被动免疫后的存活时间(小时)
表8和图11中的结果清楚地显示了被动免疫后抗攻击感染的保护。
实施例3硅片上(In silico)的研究测定PpmA的核苷酸序列在数据库中检索部分同源性。
用下述引物通过PCR由肺炎链球菌D39扩增PpmA的基因5′CCATGGCTAGCCACCATCACCATCACCATTCGAAAGGGTCAGAAGGTGC3′和5′TCATGGATCCGGACTATTCGTTTGATGTAC3′，其插入侧接的NheI和BamHI限制性位点，和N-末端His6标记。扩增的DNA被克隆到pETlla表达载体(Stratagene，LaJolla，CA)中并电转染到大肠杆菌BL21(DE3)中。通过用HisTrap试剂盒(Amersham Pharmacia)根据生产商的建议进行Ni+亲和层析来纯化重组蛋白。
纯化的重组蛋白质用抗10mM HEPES缓冲液，pH7.5，渗折，冻干并储藏在-20℃。
PpmA肺炎链球菌D39的ppmA核苷酸序列ATGAAGAAAAAATTATTGGCAGGTGCCATCACACTATTATCAGTAGCAACTTTAGCAGCTTGTTCGAAAGGGTCAGAAGGTGCAGACCTTATCAGCATGAAAGGGGATGTCATTACAGAACATCAATTTTATGAGCAAGTGAAAAGCAACCCTTCAGCCCAACAAGTCTTGTTAAATATGACCATCCAAAAAGTTTTTGAAAAACAATATGGCTCAGAGCTTGATGATAAAGAGGTTGATGATACTATTGCCGAAGAAAAAAAACAATATGGCGAAAACTACCAACGTGTCTTGTCACAAGCAGGTATGACTCTTGAAACACGTAAAGCTCAAATTCGTACAAGTAAATTAGTTGAGTTGGCAGTTAAGAAGGTAGCAGAAGCTGAATTGACAGATGAAGCCTATAAGAAAGCCTTTGATGAGTACACTCCAGATGTAACGGCTCAAATCATCCGTCTTAATAATGAAGATAAGGCCAAAGAAGTTCTCGAAAAAGCCAAGGCAGAAGGTCCTGATTTTGCTCAATTAGCCAAAGATAATTCAACTGATGAAAAAACAAAAGAAAATGGTGGAGAAATTACCTTTGATTCTGCTTCAACAGAACTACCTGAGCAAGTCAAAAAAGCCGCTTTCGCTTTAGATGTGGATGGTGTTTCTGATCTCATTACAGCAACTGGCACACAAGCCTACACTAGCCAATATTACATTGTAAAACTCACTAAGAAAACAGAAAAATCATCTAATATTGATGACTACAAAGAAAAATTAAAAACTGTTATCTTGACTCAAAAACAAAATGATTCAACATTTGTTCAAAGCATTATCGGAAAAGAATTGCAAGCAGCCAATATCAAGGTTAAGGACCAAGCCTTCCAAAATATCTTTACCCAATATATCGGTGGTGCAGATTCAAGCTCAAGCAGTAGTACATCAAACGAATAGPpmA氨基酸序列MKKKLLAGAITLLSVATLAACSKGSEGADLISMKGDVITEHQFYEQVKSNPSAQQVLLNMTIQKVFEKQYGSELDDKEVDDTIAEEKKQYGENYQRVLSQAGMTLETRKAQIRTSKLVELAVKKVAEAELTDEAYKKAFDEYTPDVTAQIIRLNNEDKAKEVLEKAKAEGADFAQLAKDNSTDEKTKENGGEITFDSASTEVPEQVKKAAFALDVDGVSDVITATGTQAYSSQYYIVKLTKKTEKSSNIDDYKEKLKTVILTQKQNDSTFVQSHGKELQAANIKVKDQAFQNIFTQYIGGGDSSSSSSTSNE*重组His标记的PpmAMAHHHHHHSKGSEGADLISMKGDVITEHQFYEQVKSNPSAQQVLLNMTIQKVFEKQYGSELDDKEVDDTIAEEKKQYGENYQRVLSQAGMTLETRKAQIRTSKLVELAVKKVAEAELTDEAYKKAFDEYTPDVTAQHRLNNEDKAKEVLEKAKAEGADFAQLAKDNSTDEKTKENGGEITFDSASTEVPEQVKKAAFALDVDGVSDVITATCTQAYSSQYYIVKLTKKTEKSSNIDDYKEKAKTVILTQKQNDSTFVQSHGKELQAANKVKDQAFQNTFTQYIGGGDSSSSSSTSNE
SlrA通过PCR由肺炎链球菌D39用下述引物扩增活性肽SlrA的基因5′TTTACTGCATATGCACCATCACCATCACCATAGCAGCGTCCAACGCAGT3′和5′CATTAGGATCCAATCGCTGGGGAAGTG3′，其插入侧接的NheI和BamHI限制性位点，和N-末端His6标记。扩增的DNA被克隆到pETlla表达载体(Stratagene，LaJolla，CA)中并电转染到大肠杆菌BL21(DE3)中。通过用HisTrap试剂盒(Amersham Pharmacia)根据生产商的建议进行Ni+亲和层析来纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白质用抗10mM HEPES缓冲液，pH7.5，渗折，冻干并储藏在-20℃。
SlrA肺炎链球菌D39的slrA核苷酸序列ATGAAAAAACTAGCAACCCTTCTTTTACTGTCTACTGTAGCCCTAGCTGGGTGTAGCAGCGTCCAACGCAGTCTGCGTGGTGATGATTATGTTGATTCCAGTCTTGCTGCTGAAGAAAGTTCCAAAGTAGCTGCCCAATCTGCCAAGGAGTTAAACGATGCTTTAACAAACGAAAACGCCAATTTCCCACAACTATCTAAGGAAGTTGCTGAAGATGAAGCCGAAGTGATTTTCCACACAAGCCAAGGTGATATTCGCATTAAACTCTTCCCTAAACTCGCTCCTCTAGCGGTTGAAAATTTCCTCACTCACGCCAAAGAAGGCTACTATAACGGTATTACCTTCCACCGTGTCATCGATGGCTTTATGGTCCAAACTGGAGATCCAAAAGGGGACGGTACAGGTGGTCAGTCCATCTGGCATGACAAGGATAAGACTAAAGACAAAGGAACTGGTTTCAAGAACGAGATTACTCCTTATTTGTATAACATCCGTGGTGCTCTTGCTATGGCTAATACTGGTCAACCAAACACCAATGGCAGCCAGTTCTTCATCAACCAAAACTCTACAGATACCTCTTCTAAACTCCCTACAAGCAAGTATCCACAGAAAATTATTGAAGCCTACAAAGAAGGTGGAAACCCTAGTCTAGATGGCAAACACCCAGTCTTTGGTCAAGTGATTGACGGTATGGATGTTGTGGATAAGATTGCTAAGGCCGAAAAAGATGAAAAAGACAAGCCAACTACTGCTATCACAATCGACAGCATCGAAGTGGTGAAAGACTACGATTTTAAATCTTAASlrA氨基酸序列MKKLATLLLLSTVALAGCSSVQRSLRGDDYVDSSLAAEESSKVAAQSAKELNDALTNENANFPQLSKEVAEDEAEⅥFHTSQGDIRIKLFPKLAPLAVENFLTHAKEGYYNGITFHRVIDGFMVQTGDPKGDGTGGQSIWHDKDKTKDKGTGFKNEITPYLYNIRGALAMANTGQPNTNGSQFFINQNSTDTSSKLPTSKYPQKIIEAYKEGGNPSLDGKHPVFGQVIDGMDVVDKIAKAEKDEKDKPTTAITIDSIEVVKDYDFKS重组His标记的SlrA
MAIIHHHHHSSVQRSLRGDDYVDSSLAAEESSKVAAQSAKELNDALTNENANFPQLSKEVAEDEAEVIFHTSQGDIRIKLFPKLAPLAVENFLTHAKEGYYNGITFHRVIDGFMVQTGDPKGDGTGGQSIWHDKDKTKDKGTGFKNEITPYLYNIRGALAMANTGQPNTNGSQFFINQNSTDTSSKLPTSKYPQKHEAYKEGGNPSLDGKHPVFGQVIDGMDVVDKIAKAEKDEKDKPTTAITIDSIEVVKDYDFKSHis6rIgA1蛋白酶的表达和纯化用下述引物引物由链球菌肺炎链球菌TIGR4通过PCR扩增编码IgA1蛋白酶的氨基酸671-1987的3948bp基因片段5′CAACATCACATATGGGACAAACAGAACCAGAG3′和5′ACTTAGATCTTAATGATGGTGGTGATGATGGGCTTTAAAGATTGCTCTC3′，其插入侧接的NdeI和BglII限制性位点，和C-末端His6标记。扩增的DNA被克隆到pETlla表达载体(Stratagene，LaJolla，CA)中并电转染到大肠杆菌BL21(DE3)中。
接种200ml具有50μl/ml氨苄青霉素的LB肉汤培养基并在37℃培养过夜。
将每升20-30ml的过夜培养物转移至预热的具有50μl/ml氨苄青霉素的LB中并且培养至OD600为0.6～1.0(2-3小时)。
通过添加1mM IPTG(10ml的100mM原种/升)诱导表达，且细胞进一步培养2-3小时。收集细胞(10min@3000rpm)并再悬浮在具有8M脲的冰冷20mM磷酸钠缓冲液pH7.4(15ml的缓冲液/升培养物)中。
通过在冰上超声处理3×30秒溶解细胞(1分钟间隔来进行冷却)。
将溶解产物在4℃置于旋转振荡器上20分钟(来溶解内含体)。
通过离心澄清粗溶解产物(在JA20旋转器中15,000rpm 30min)。
将澄清的上清液置于预沸腾的透析袋中，并渗析过夜抗具有1mM DTT的2L冰冷的20mM磷酸钠缓冲液pH7.4。
添加硫酸铵至透渗析上清液中至20％饱和度(0.123g/ml)，并在4℃搅拌20min。
在JA20旋转器中4℃10,000rpm旋转沉淀。(由蛋白小球回收IgA1蛋白酶)。
将蛋白小球(5ml/升培养物)再溶解于起始缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，0.5M NaCl，10mM咪唑8M脲)中。
通过45μm过滤器过滤。
装载具有Ni+的1ml柱并用具有脲的起始缓冲液平衡。
泵上清液(15ml)使其通过装载Ni+的1ml HisTrap柱(AmershamPharmacia)。
用10ml冲洗缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，0.5M NaCl，20mM咪唑8M脲)冲洗。
用洗脱液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4；0.5M NaCl；400mM咪唑；8M脲)洗脱1ml级分。
第二组分应含有IgA1蛋白酶。
然后抗2L 10mM Hepes缓冲液pH7.4渗析第二组分过夜。
没有脲，蛋白将再沉淀。通过离心回收蛋白，冻干并储藏在-20℃。
蛋白可再溶解于8M脲中然后稀释在PBS等中。其在4M脲中将保持高浓度的可溶性。
免疫球蛋白A1蛋白酶(iga)核苷酸序列[肺炎链球菌TIGR4]
AATAGATTTTCAAGAAGAAATTCAAGAAAATCCTGATTTAGCTGAAGGAACTGTAAGAGTAAAACAAGAAGGTAAATTAGGTAAGAAAGTTGAAATCGTCAGAATATTCTCTGTAAACAAGGAAGAAGTTTCGCGAGAAATTGTTTCAACTTCAACGACTGCGCCTAGTCCAAGAATAGTCGAAAAAGGTACTAAAAAAACTCAAGTTATAAAGGAACAACCTGAGACTGGTGTAGAACATAAGGACGTACAGTCTGGAGCTATTGTTGAACCCGCAATTCAGCCTGAGTTGCCCGAAGCTGTAGTAAGTGACAAAGGCGAACCAGAAGTTCAACCTACATTACCCGAAGCAGTTGTGACCGACAAAGGTGAGACTGAGGTTCAACCAGAGTCGCCAGATACTGTGGTAAGTGATAAAGGTGAACCAGAGCAGGTAGCACCGCTTCCAGAATATAAGGGTAATATTGAGCAAGTAAAACCTGAAACTCCGGTTGAGAAGACCAAAGAACAAGGTCCAGAAAAAACTGAAGAAGTTCCAGTAAAACCAACAGAAGAAACACCAGTAAATCCAAATGAAGGTACTACAGAAGGAACCTCAATTCAAGAAGCAGAAAATCCAGTTCAACCTGCAGAAGAATCAACAACGAATTCAGACAAAGTATCACCAGATACATCTAGCAAAAATACTGGGGAAGTGTCCAGTAATCCTAGTGATTCGACAACCTCAGTTGGAGAATCAAATAAACCAGAACATAATGACTCTAAAAATGAAAATTCAGAAAAAACTGTAGAAGAAGTTCCAGTAAATCCAAATGAAGGCACAGTAGAAGGTACCTCAAATCAAGAAACAGAAAAACCAGTTCAACCTGCACAAGAAACACAAACAAACTCTGGGAAAATAGCTAACGAAAATACTGGAGAAGTATCCAATAAACCTAGTGATTCAAAACCACCAGTTGAAGAATCAAATCAACCAGAAAAAAACGGAACTGCAACAAAACCAGAAAATTCAGGTAATACAACATCAGAGAATGGACAAACAGAACCAGAACCATCAAACGGAAATTCAACTGAGCATGTTTCAACCGAATCAAACACATCCAATTCAAATGGAAACGAAGAAATTAAACAAGAAAATGAACTAGACCCTGATAAAAAGGTAGAAGAACCAGAGAAAACACTTGAATTAAGAAATGTTTCCGACCTAGAGTTATACAGTTTGTCAAATGGTACTTATAAACAACACATTTCGTTAGAGCAAGTTCCAAGCAATCCAAATAGCTACTTTGTTAAAGTGAAATCTTCTTCATTCAAAGATGTATACCTACCAGTAGCATCAATATCAGAGGAAAGAAAAAATGATAAAATCCTTTATAAAATCACACCAAAAGTAGAAGGGCTTCAGCAGGAAGATAGGGCAGATATAAAGATAATTTTACCTTCTATCTAGCTAAGAAGGGAAACAGAAGAAACAACAAACTTTACTTCCTTTAGTAATCTGGTCAAAGCTATAAACCAAAATCCCTCTGGAACCTATCATTTAGCGGCCAGCCTGAATGCTAACGAAGTGGAGCTTGGTCCTGATGAAAGATCCTATATCAAGGACACCTTTACTGGTCGTTTAATCGGTGAAAAAGATGGCAAGAATTATGCTATCTATAATTTGAAAAAACCTCTGTTTGAAAACTTGAGTGGTGCTACAGTAGAAAAACTGAGTCTAAAAAATGTTGCTATTTCAGGGAAAGATGATATCGGTTCACTGGCAAATGAAGCTCAGAATAACACAAAAATTAAGCAAGTTCACGTCGATGGTGTTCTGGCTGGTGAACGTGGTATCGGTGGTTTGCTGGCTAAGGCTGAGCAATCAAGCATCACAGAGAGCAGTTTCAAGGGAAGAATTATCAACACTTATGAAACGACTGCTGCCTACAATATCGGTGGTATGGTCGGTCATTTGACAGGTGACAAGGCTTTACTTACTAAGTCAAAAGCGACAGTAGCCATTTCATCTAACACAAATACTTCAGATCAGACTGTGGGTCGACTTGCAGGCCTAGTAGACCGAGATGCACAGATCCAAGATAGCTATGCTGAAGGTGATATCAACAATGTCAAGCACTTTGGTAGAGTCGCTGGAGTGGCAGGCAATTTGTGGGATCGAACTTCTGGTGATGTTAGGCATGCTGGAAGTTTGACCAATGTTCTCAGCGATGTTAATGTAACCAACGGAAATGCCATCACTGGTTACCACTATAACGAAATGAAGGTAAAGGACACATTCAGCAGCAAGGCCAACAGAGTCTACAATGTCACCTTGGTCAAGGATGAGGTCGTCAGCAAGGAATCCTTTGAAGAAAGAGGAACAATGCTAGATGCTTCTCAAATTGCAAGCAAAAAACAAGAAATCAATCCTCTCATTTTACCAACAGTGGAGCCACTTTCAACAAGTGGCAAAAAACACAGTGATTTTTCTAAGGTGGCCTATTATCAAGCTAAGCGCAACTTGACTTATAAAAACATTGAAAAATTGCTACCTTTCTACAACAAGGCAACCATCGTCAAATACGGAAACCTGGTCAATGAGAACAGTCTTTTATATCAAAAAGAACTCTTGTCAGCAGTCATGATGAAGGACAACCAAGTCATCACAGACATTGTTTCTAACAAACAGACTGCAAACAAACTCTTGCTTCACTACAAGGATGATTTATCTGAGAAGCTGGATCTCAAATACCAGAATGATTTCGCCAAATTAGCAGAATATAGTCTGGGCAATACTGGACTTCTCTATACGCCAAACCAATTCCTGTATCACCAAACCTCTATCATCAAGCAAGTCTTACCTGACTTACAAAAGGTTGACTATCATTCAGAAGCCATCAGAAAGACGCTGGGTATTTCTCCAAACGTCAAGCAAACTGAGCTCTATCTAGAAGACCACTTCGCCAAAACAAAACAACAACTGGAAGACAGTTTGAAAAAACTCTTGTCAGCGGATGCTGGACTGGCT
AGTGCTAACCCCGTCACTGAAGGTTATCTTGTAGATAAAATCAAACGCAACAAGGAAGCCTTGCTACTTGGCTTGACCTATCTGGAACGGTGGTATAACTTTAGCTATCGTCAGGTGAATGTCAAAGACCTAGTTCTGTACCATTTGCACTTCTTTCGTAAGGGGAATGCTTCACCATTACATACTCTGATTGAGTTGGGTAAATCTGGCTTTAACAATCTTCTAGCTAAGAATAATGTCGATACTTATGGTATCAGTCTTGCCAGTCAACATGGAACGACAGATTTGTTTAGCACGCTGGAACATTACCGAAAAGTCTTTTTACCAAATACAAGCAATAATGAGTGGTTTAAATCAGAGACTAAGGCTTACATTGTCGAAGAAAAATCCACTATCGAAGACGTGAAAACGAAGCAAGGGTTAGCTGGCACCAAGTATTCTATCGGTGTTTATGATCGTATCACGAGTGCCACATGGAAATACCGCAATATCGTCTTGCCTCTCCTGACCTTGCCAGAGAGATCCGTATTTGTCATCTCGACCATGTCTAGTCTAGGATTTGGACCTTATGATCGCTACCGCACTAGTGACCATAAAGCGGGCAAGGCTCTCAATGATTTTGTTGAAGAAAATGCGCGTGAAACAGCCAAACGTCAGCGAGATCACTACGATTATTGGTATCGTATTTTAGACGACAATGCACGTGAAAAACTTTATAGAAATATTTTGCTTTACGATGCTTATAAATTTGGCGATGATAATACCGTAGGGAAAGCTACAGAAGTGGCAGATTTTGATAATCCAAATCCTGCAATGCAACATTTCTTTGGACCTGTTGGAAATAAAGTTGGGCATAATCAACACGGTGCTTATGCTACACGTGATGCAGTTTATTATATGGGTTATCGAATCTTGGATAAGGATGGAGCTATTACTTATACGCATGAGATGACACATGACTCAGATCAGGACATTTATCTTGGAGGATATGGTCGAAGAAGTGCCTTGGCACCACAGTTCTTTGCTAAACGATTATTACAAGCACCAGACCATCCAGATGATGCAACCATTCCATCAACTCCATGTTGAAACATTCAAAATCTGATACGAACAGAAAGTCCACGATTACAAGTACTTGATCCAACTACAAGATTTAATAATGCAGATGATTTGAAGCAATATGTCCACAACATGTTTGACGTTGTTTATATGTTGGAATATCTCGAAGGAAATTCAATTCTTAAATTGGATACGAATCAAAAACAACAACTTCTTAGAAAAGTTACAAATGAGTACCATCCTGATCCTGATGGAAATAAGCTCTATGCAACAAATGTTGTGAGAAATCTAACAGTAGAAGAAGTTGAAAGACTACGTTCATTCAATGATTTGATTGATAATAATATTCTTTCGTCTAGGGAATATGCCTCAGGTAAATACGAAAGAAATGGCTACTTCACTATTAAGTTATTTGCACCGATTTATGCTGCATTAAGTAATCATATAGGAACACCAGGTGACCTGATGGGACGTCGTATAGCCTATGAACTACTAGCTGCTAAAGGCTTTAAACATGGTATGGTACCATATATCTCAAACCAATACGAAGAAGAAGCCAAACAAAAGGGCAAGACAATCAATCTCTACGGTAAAACAAGAGGTTTGGTTACAGATGACTTGGTTTTGGAAAAGGTATTTAATAACCAATATCATACTTGGAGTCAGTTTAAGAAAGCTATGTATCAAGAACGACAAGATCACTTTGATAGATTGAACAAAGTTACTTTTAATGATACAACACAGCCTTGGCAAACATTTGCCAAGAAAACTACAAGCAGTGTAGATGAATTACAGAAATTAATGGACGTTGCTGTTCGTAAGGATGCAGAAGACAATTACTACCATTGGAATAACTACAATCCAGACATAGATAGTGAAGTCCACAAGCTCAAGAGAGCAATCTTTAAACCCTATCTTGACCAAACAATGATTTTAGAAGTTCAATTTTTGAGAATAAAAAAATAG氨基酸序列IgaMEKYFGEKQERFSFRKLSVGLVSATISSLFFMSAVLASSSVDAQETAGVHYKYVADSELSSEEKKQLVYDIPFYVENDDETYYLVYKLNSQNQLAELPNTGSKNERQALVAGASLAAMGILIFAVSKKKVKNKTVLHLVLVAGIGNGVLVSVHALENHLLLNYNTDYELTSGEKLPLPKEISGYTYIGYIKEGKTTSESEVSNQKSSVATPTKQQKVDYNVTPNFVDHPSTVQAIQEQTPVSSTKPTEVQVVEKPFSTELINTRKEEKQSSDSQEQLAEHKNLETKKEEKISPKEKTGVNTLNPQDEVLSGQLNKPELLYREETMETKIDFQEEIQENPDLAEGTVRVKQEGKLGKKVEIVRIFSVNKEEVSHEIVSTSTTAPSPRIVEKGTKKTQVTKEQPETGVEHKDVQSGAIVEPAIQPELPEAVVSDKGEPEVQPTLPEAVVTDKGETEVQPESPDTVVSDKGEPEQVAPLPEYKGNIEQVK
PETPVEKTKEQGPEKTEEVPVKPTEETPVNPNEGTTEGTSIQEAENPVQPAEESTTNSEKVSPDTSSKNTGEVSSNPSDSTTSVGESNKPEHNDSKNENSEKTVEEVPVNPNEGTVEGTSNQETEKPVQPAEETQTNSGKIANENTGEVSNKPSDSKPPVEESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEPSNGNSTEDVSTESNTSNSNGNEEIKQENELDPDKKVEEPEKTLELRNVSDLELYSLSNGTYKQHISLEQVPSNPNSYFVKVKSSSFKDVYLPVASISEERKNDKILYKITAKVEKLQQEIESRYKDNFTFYLAKKCTEETTNFTSFSNLVKAINQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATVEKLSLKNVAISGKDDIGSLANEAQNNTKIKQVHVDGVLAGERGIGGLLAKAEQSSITESSFKGRHNTYETTAAYNIGGMVGHLTGDKALLTKSKATVAISSNTNTSDQTVGGLAGLVDRDAQIQDSYAEGDINNVKHFGRVAGVAGNLWDRTSGDVRHAGSLTNVLSDVNVTNGNAITGYHYNEMKVKDTFSSKANRVYNVTLVKDEVVSKESFEERGTMLDASQIASKKAEINPLILPTVEPLSTSGKKDSDFSKVAYYQAKRNLTYKNIEKLLPFYNKGATIVKYGNLVNENSLLYQKELLSAVMMKDNQVITDIVSNKQTANKLLLHYKDDLSEKLDLKYQNDFAKLAEYSLGNTGLLYTPNQFLYDQTSHKQVLPDLQKVDYHSEAIRKTLGISPNVKQTELYLEDQFAKTKQQLEDSLKKLLSADAGLASANPVTEGYLVDKIKRNKEALLLGLTYLERWYNFSYGQVNVKDLVLYHLDFFGKGNASPLDTLIELGKSGFNNLLAKNNVDTYGISLASQHGTTDLFSTLEHYRKVFLPNTSNNDWFKSETKAYIVEEKSTIEEVKTKQGLAGTKYSIGVYDRITSATWKYRNMVLPLLTLPERSVFVISTMSSLGFGAYDRYRSSDHKAGKALNDFVEENARETAKRQRDHYDYWYRILDDNAREKLYRNILLYDAYKFGDDNTVGKATEVADFDNPNPAMQHFFCPVGNKVGHNQHGAYATGDAVYYMGYRMLDKDGAITYTHEMTHDSDQDIYLGGYGRRSGLGPEFFAKGLLQAPDHPDDATITINSILKHSKSDSTESRRLQVLDPTTRFNNADDLKQYVHNMFDVVYMLEYLEGNSILKLDTNQKQQLLRKVTNEYHPDPDGNKVYATNVVRNLTVEEVERLRSFNDLIDNNILSSREYASGKYERNGYFTIKLFAPIYAALSNDIGTPGDLMGRRIAYELLAAKGFKDCMVPYISNQYEEEAKQKGKTINLYGKTRGLVTDDLVLEKVFNNQYHTWSEFKKAMYQERQDQFDRLNKVTFNDTTQPWQTFAKKTTSSVDELQKLMDVAVRKDAEHNYYHWNNYNPDIDSEVHKLKRAIFKAYLDQTNDFRSSIFENKK重组His标记的IgaMGQTEPEPSNGNSTEDVSTESNTSNSNGNEEIKQENELDPDKKVEEPEKTLELRNVSDLELYSLSNGTYKQHISLEQVPSNPNSYFVKVKSSSFKDVYLPVASISEERKNDKILYKITAKVEKLQQEIESRYKDNFTFYLAKKGTEETTNFTSFSNLVKAINQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATVEKLSLKNVAISGKDDIGSLANEAQNNTKIKQVHVDCVLAGERGIGGLLAKAEQSSITESSFKGRIINTYETTAAYNIGGMVGHLTGDKALLTKSKATVAISSNTNTSDQTVGGLAGLVDRDAQIQDSYAEGDINNVKHFGRVAGVAGNLWDRTSGDVRHAGSLTNVLSDVNVTNGNAITGYHYNEMKVKDTFSSKANRVYNVTLVKDEVVSKESFEERGTMLDASQIASKKAEINPLILPTVEPLSTSGKKDSDFSKVAYYQAKRNLTYKNIEKLLPFYNKATIVKYGNLVNENSLLYQKELLSAVMMKDNQVITDIVSNK
QTANKLLLHYKDDLSEKLDLKYQNDFAKLAEYSLGNTGLLYTPNQFLYDQTSIIKQVLPDLQKVDYHSEAIRKTLGISPNVKQTELYLEDQFAKTKQQLEDSLKKLLSADAGLASANPVTEGYLVDKIKRNKEALLLGLTYLERWYNFSYGQVNVKDLVLYHLDFFGKGNASPLDTLIELGKSGFNNLLAKNNVDTYGISLASQHGTTDLFSTLEHYRKVFLPNTSNNDWFKSETKCAYIVEEKSTIEEVKTKQGLAGTKYSIGVYDRITSATWKYRNMVLPLLTLPERSVFVISTMSSLGFGAYDRYRSSDHKAGKCALNDFVEENARETAKRQRDHYDYWYRILDDNAREKLYRNTLLYDAYKFGDDNTVGKATEVADFDNPNPAMQHFFGPVGNKVGHNQHGAYATGDAVYYMGYRMLDKDGAITYTHEMTHDSDQDIYLGGYGRRSGLGPEFFAKGLLQAPDHPDDATITINSILKHSKSDSTESRRLQVLDPTTRFNNADDLKQYVHNMFDVVYMLEYLEGNSILKLDTNQKQQLLRKVTNEYHPDPDGNKVYATNVVRNLTVEEVERLRSFNDLIDNNILSSREYASGKYERNGYFTIKLFAPIYAALSNDIGTPGDLMGRRIAYELLAAKGFKDGMVPYISNQYEEEAKQKGKTINLYGKCTRGLVTDDLVLEKVFNNQYHTWSEFKKAMYQERQDQFDRLNKVTFNDTTQPWQTFAKKTTSSVDELQKLMDVAVRKDAEHNYYHWNNYNPDIDSEVHKLKRAIFKAHHHHHHPsaA用下述引物通过PCR由肺炎链球菌D39扩增PsaA的基因5′CCATGGCTAGCCACCATCACCATCACCATgctacaaactcaatcatcgc 3′和5′TTTCGGATCCTTATTTTGCCAATCCTTCAGC3′，其插入侧接的NheI和BamHI限制性位点，和N-末端His6标记。扩增的DNA被克隆到pETlla表达载体(Stratagene，LaJolla，CA)中并电转染到大肠杆菌BL21(DE3)中。通过用HisTrap试剂盒(Amersham Pharmacia)根据生产商的建议进行Ni+亲和层析来纯化重组蛋白。为防止内含体形成，纯化过程的自始至终将8M脲添加给所有的缓冲液。纯化的重组蛋白质用抗10mM HEPES缓冲液，pH7.5渗折，冻干，并储藏在-20℃。
肺炎链球菌D39的psaA核苷酸序列ATGAAAAAATTAGGTACATTACTCGTTCTCTTTCTTTCTGCAATCATTCTTGTAGCATGTGCTAGCGGAAAAAAAGATACAACTTCTGGTCAAAAACTAAAAGTTGTTGCTACAAACTCAATCATCGCTGATATTACTAA
AAATATTGCTGGTGACAAAATTGACCTTCATAGTATCGTTCCGATTGGGCAAGACCCACACGAATACGAACCACTTCCTGAAGACGTTAAGAAAACTTCTGAGGCTGATTTGATTTTCTATAACGGTATCAACCTTGAAACAGGTGGCAATGCTTGGTTTACAAAATTGGTAGAAAATGCCAAGAAAACTGAAAACAAAGACTACTTCGCAGTCAGCGACGGCGTTGATGTTATCTACCTTGAAGGTCAAAATGAAAAAGGAAAAGAAGACCCACACGCTTGGCTTAACCTTGAAAACGGTATTATTTTTGCTAAAAATATCGCCAAACAATTGAGCGCCAAAGACCCTAACAATAAAGAATTCTATGAAAAAAAATCTCAAAGATATACTGATAAGTTAGACAAACTTGATAAAGAAAGTAAGGATAAATTTAATAAGATCCCTGCTGAAAAGAAACTCATTGTAACCAGCGAAGGAGCATTCAAATACTTCTCTAAAGCCTATGGTGTTCCAAGTGCCTACATCTGGGAAATCAATACTGAAGAAGAAGGAACTCCTCAACAAATCAAGACCTTGGTTGAAAAACTTCGCCAAACAAAAGTTCCATCACTCTTTGTAGAATCAAGTGTGGATGACCGTCCAATGAAAACTGTTTCTCAAGACACAAACATCCCAATCTACGCACAAATCTTTACTGACTCTATCGCAGAACAAGGTAAAGAAGGCGACAGCTACTACAGCATGATGAAATACAACCTTGACAAGATTGCTGAAGGATTGGCAAAATAAPsaA氨基酸序列MKKLGTLLVLFLSAHLVACASGKKDTTSGQKLKVVATNSHADITKNIAGDKIDLHSIVPIGQDPHEYEPLPEDVKKTSEADLIFYNGINLETGGNAWFTKLVENAKKTENKDYFAVSDGVDVIYLEGQNEKCKEDPHAWLNLENGHFAKNIAKQLSAKDPNNKEFYEKNLKEYTDKLDKLDKESKDEFNKIPAEKKLIVTSEGAFKYFSKAYGVPSAYIWEINTEEEGTPEQIKTLVEKLRQTKVPSLFVESSVDDRPMKTVSQDTNIPIYAQIFTDSLAEQGKEGDSYYSMMKYNLDKIAEGLAK重组His标记的PsaAMAHHHHHHTNSHADITKNAGDKIDLHSIVPIGQDPHEYEPLPEDVKKTSEADLIFYNGINLETGGNAWFTKLVENAKKTENKDYFAVSDGVDVIYLEGQNEKGKEDPHAWLNLENGHFAKNIAKQLSAKDPNNKEFYEKNLKEYTDKLDKLDKESKDKFNKIPAEKKLIVTSEGAFKYFSKAYGVPSAYIWEINTEEEGTPEQIKTLVEKLRQTKVPSLFVESSVDDRPMKTVSQDTNIPIYAQIFTDSIAEQGKEGDSYYSMMKYNLDKLAEGLAK抗体的ELISA试验通过EIA测定遭受肺炎球菌感染的人的血清中Eno，Iga，PpmA和SlrA的IgG抗体。微滴定板(Maxisorp；Nunc，Roskilde，丹麦)用100μl/孔，具有5μg/ml抗原浓度的PBS溶液包被并且在37℃温育过夜。平皿用1％牛血清蛋白以及0.05％吐温20的PBS溶液在37℃封闭1小时。样品在稀释缓冲液(1％BSA，0.05％吐温20的PBS溶液)连续地稀释(起始于1∶100)。一式两份(100μl/孔)37℃温育2小时。人IgG(Sigma Chemicals，St.Louis)的多克隆碱性磷酸酶-共轭的抗血清在稀释缓冲液中1∶3000稀释，以100μl/孔吸取，并且在37℃温育2小时。最后，添加100μl/孔的MUP(Sigma，CAT#M8883)底物溶液(0.2mM 4-甲基伞形酮磷酸酯，0.05M NaCO3，0.05mM MgCl2)，并于37℃温育平皿1小时。通过Molecular Devices SpectraMAX(Sunnyvale，美国)微孔板读数器用365nm的激发波长以及450nm的发射波长测定荧光。以背景荧光加4倍标准偏差由吸光率对比-血清稀释曲线的交叉点内推血清的终点抗体滴度。
通过和包含由健康的成年志愿者收集的标准血清比较将终点滴度然后转变为抗体浓度(每毫升免疫球蛋白的EIA单位)，并且终点滴度被认为含有100U/mL的抗-α-烯醇酶，Iga，PpmA或SlrA。具有检测极限(对于Eno而言为30U/mL，对于Iga而言为4U/mL，对于SlrA而言为4U/mL，且对PpmA而言为5U/mL)以下抗体浓度的样品被赋予具有相当于检测极限一半的值。结果显示于表9。
统计方法我们利用SPSS软件(SPSS，USA)分析log-转换数据。儿童组的抗体浓度报道为具有95％置信区间(95％CI)的几何平均浓度(GMC，单位/ml)并且通过单程ANOVA比较然后通过LSD事后检验(post hoc test)。利用配对斯氏t检验法(paired Student′s t test)进行急性的和恢复期阶段血清的抗体水平之间的统计比较。当比较变化的比例时利用Fisher′s精确检验。
逻辑回归用于评价急性期抗体浓度、年龄和肺炎球菌接触的特性对抗体反应的作用以及用于评价抗体浓度(抗体浓度的log e对数)作为肺炎球菌参与的危险度以及作为AOM发展的危险度。根据年龄将采集急性血清的儿童分组到八个3月的组。为测定是否有和年龄有关的显著差异，通过单程ANOVA然后通过Tukey′s HSD检验分析各组表9.ELISA检验的结果
实施例2粘膜接种与AcmA细胞-壁-结合结构域(蛋白锚)结合的乳酸球菌血影细胞可用作抗原的粘膜以及全身递送的载体/佐剂系统(WO 99/25836和WO02/101026)。
在本研究中，检验三价血影细胞-蛋白疫苗(SlrA，Igalprt，PpmA)的免疫原性和保护活性以及疫苗鼻施用和用强毒肺炎链球菌鼻攻击后每一单价血影细胞-蛋白疫苗的免疫原性和保护活性。实验的目的是●评价鼻内施用乳酸球菌血影细胞-蛋白锚三价(SlrA，PpmA，Igalprt)疫苗的以及血影细胞-蛋白锚单价的(SlrA)，血影细胞-蛋白锚单价的(PpmA)和血影细胞-蛋白锚单价的(Igalprt)疫苗的保护活性。
●评价鼻内施用结合于血影细胞乳酸菌的抗原的免疫应答并比较同时或分别抗原施用的免疫应答。
●评价肺、血液和鼻咽中细菌量与接种后保护和免疫应答的相互关系。
材料和方法载体的构建。表10概括了基于血影细胞蛋白的肺炎链球菌疫苗中所用抗原的特性。
PpmA::PA融合。质粒pPA32，说明肺炎链球菌PpmA蛋白和蛋白锚之间的融合(图12)，被通过连接NcoI-和EcoRI-裂解的PCR-扩增的CbpA片段到pPA3的NcoI和EcoRI位点中来进行构建(Steen等2003.J.Biol.Chem.27823874-23881)。PpmA-特异性片段用引物PpmA.1(cggtctcacatgtcgaaagggtcagaaggtgcagacc)和PpmA.2(cggtctcgaattgcttcgtttgatgtactactgcttgag)利用肺炎链球菌菌株D39染色体DNA作为模板进行扩增。在用于乳酸球菌PA1001电穿孔之前，将连接混合物用EcoRI和NheI切割(Kuipers等，J.Biol.Chem.2004 Mar24[Epub ahead of print])。最终的构建体命名为pPA32。
Igalprt::PA融合。质粒pPA152，说明肺炎链球菌Igalprt蛋白(残基672至1330)的片段和蛋白锚(附图13)之间的融合。通过连接Igalprt的NcoI-和EcoRI-裂解的PCR-扩增片段到pPA3的相应位点中来构建质粒pPA152。Igalprt-特异性片段用引物Igal.fw2(cgtctcccatgggacaaacagaaccagagccatcaaacgg)和Igaltrunc2.rev(ccgtctcgaattctagccagtccagcatc)利用肺炎链球菌菌株TIGR4染色体DNA作为模板进行扩增。在用于乳酸球菌PA1001电穿孔之前，连接混合物用NheI切割。最终的构建体命名为pPA152。
SIrA::PA融合。质粒pPA162，说明肺炎链球菌SlrA蛋白和蛋白锚之间的融合(附图14)，被通过连接Esp3I-裂解的PCR-扩增的S1rA片段到质粒pPA3的NcoI和EcoRI位点中来构建。SlrA-特异性片段用引物SlrA.fw(ccgtctcccatggtccaacgcagtctgcgt)和SlrA.rev(ccgtctcgaattccagatttaaaatcgtagtctttcacca)利用肺炎链球菌菌株D39染色体DNA作为模板进行扩增。在用于乳酸球菌PA1001电穿孔之前，连接混合物用SphI切割。最终的构建体命名为pPA162。
血影细胞的制备。如WO 02/101026所述制备乳酸球菌血影细胞。每一剂量表示一种小鼠鼻施用的量，含有大约2.5×109个血影细胞。
抗原制备。基于酵母的GLS培养基用于疫苗的制备。GLS含有2％gistex(GistexLS Ferra粉末AGGL-1027180，Strik Special Additives，荷兰)，3％β-甘油磷酸盐和2％葡萄糖。当菌株接种时，葡萄糖被灭菌作为一种分离溶液并添加至肉汤培养基中。含有质粒pPA152，pPA32或pPA162的乳酸球菌PA1001培养在补充5μg/ml氯霉素的GLS中。在约0.5和1.0的OD600水平，通过每升培养基添加1ml的乳链菌肽的无细胞上清液产生乳酸球菌培养物来诱导培养物(1∶1000；Kuipers等1997.Tibtech.15135-140)。培养物30℃过夜，随后培养物上清液用VivaFlow切向流动模块(Vivascience VivaFlow 200；10,000Da cut-off)浓缩。浓缩物通过0.45μm过滤除菌并储藏在4℃直至结合。
疫苗的制备。疫苗制备如下血影细胞-SlrA::PA单价疫苗27.5ml的产生乳酸球菌培养物的SlrA::PA的10x浓缩上清液在血液悬浮混合器上室温下30分钟结合于4.6ml血影细胞(46单位)。冲洗后，小球再悬浮在920μl PBS中且将880μl分成4瓶(每个220μl)。3瓶用于单价疫苗以及1瓶用于三价疫苗。
血影细胞-PpmA::PA单价疫苗170ml的产生乳酸球菌培养物的PpmA::PA的10x浓缩上清液在血液悬浮混合器上室温下30分钟结合于4.6ml的血影细胞(46单位)。冲洗后，小球再悬浮在920μl PBS中且880μl分成4瓶(每个220μl)。3瓶用于单价疫苗以及1瓶用于三价疫苗。
血影细胞-Igalprt::PA单价疫苗所有产生乳酸球菌培养物的Igalprt::PA的浓缩上清液(25-41x)在血液悬浮混合器上室温下30分钟结合于4.6ml的血影细胞(46单位)。冲洗后，小球再悬浮在920μlPBS中且880μl分成4瓶(每个220μl)。3瓶用于单价疫苗和1瓶用于三价疫苗。
三价疫苗混合三瓶单价疫苗并分成3瓶(每个220μl)。
所有的疫苗保持在-80℃直至开始免疫。
一剂量(20μl)的鼻疫苗含有2.5×109个血影细胞。
小鼠.雌性的杂交CD-1小鼠购自Harlan France。
在开始研究的时候小鼠为6周龄。
肺炎球菌攻击的菌株.肺炎链球菌D39，血清型2，获自国家典型培养物中心(NCTC 7466；中央公共卫生实验室，伦敦)。
免疫和试验组.小鼠在光吸入麻醉(异氟烷/O2/N2O)下通过吸取20μl的疫苗或对照到鼻孔上进行鼻内免疫。完全免疫包含以10天间隔提供3剂量。
接受PBS的小鼠(每组10只)作为对照。对于单价疫苗而言，每剂量疫苗包括2.5×109血影细胞和含有5μg Igalprt，10μgPpmA和50μg SlrA，对于三价疫苗而言，含有2.5×109血影细胞与三分之一单价剂量的各抗原。
使用下列组1. 20μl PBS.
2. 2.5×109乳酸菌血影细胞-蛋白锚-SlrA融合(50μgSlrA::PA)的20μl PBS溶液。
3. 2.5×109乳酸菌血影细胞-蛋白锚-PpmA融合(10μg PpmA::PA)的20μl PBS溶液。
4. 2.5×109乳酸菌血影细胞-蛋白锚-IgAprt融合(IgAprt::PA)的20μl PBS溶液。
5. 2.5×109乳酸菌血影细胞与结合的蛋白锚-SlrA/PpmA/Igalprt融合(抗原分别地结合作为组2，3和4以及以比例1∶1∶1混合)的20μlPBS溶液。
攻击。最后免疫后4周进行鼻内攻击。快速解冻接种物的等分样品并将细菌在无菌PBS中稀释至1×106CFU/50μ1。攻击在光麻醉下通过吸取50μl的接种物到小鼠的鼻孔上来进行。接种后将其仰卧直至回收。攻击之前以及在t＝44-小时时对小鼠称重。经常地监控小鼠的病症(至少一天三次)并且利用下述原则进行记分有瘤，星形皮毛(starry coat)，昏睡，垂死。44-小时后，在麻醉条件下收集小鼠血液并且通过颈部脱臼处死小鼠。收集鼻冲洗物和肺用于定量微生物培养。
健康状况记分。根据表11所示的原则对感染后44小时的各动物记分。每组10个动物的满分为40(所有动物均死亡)。所有动物均健康则结果为0分。发病指数为满分的百分比。
细菌负载的测定。血样、肺匀浆和鼻子冲积物被连续地稀释并铺板在具有5％羊血液的琼脂上。菌落计数之前将平板37℃温育过夜。利用GraphPad Instat进行统计分析。通过未配对student t检验用细菌的对数值评价组之间的差异。通过配对t-检验评价体重的下降。通过Mann-Whitney分析进行发病指数的比较。P-值＜0.05被认为是显著的。
ELISA.抗原(SlrA，PpmA和Iga1蛋白酶)，利用his-标记纯化作用进行纯化，以涂布缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6)涂布在96孔平板(2μg/ml)中。仅Iga1蛋白酶以10μg/ml的涂布缓冲液浓度进行涂布。为制作校准曲线，以在涂布缓冲液中1/500的稀释度涂布大鼠抗-小鼠κ链(BD Biosciences 559749，0.5mg/ml)。在4℃温育过夜后，平板用冲洗缓冲液(0.02％吐温20的PBS溶液)冲洗3次。通过向各孔中添加100μl封闭缓冲液(1％BSA，0.02％吐温20的PBS溶液)来封闭平板。平板在室温下温育1小时。所有血样用封闭缓冲液稀释1/100并且在100μl封闭缓冲液中进行这些样品的系列稀释(1/3)。为制作校准曲线，从μg/ml开始制备小鼠IgG1κ轻链(Sigma M7894)的连续稀释。所有样品一式两份进行检验。在室温下温育2小时后，平板用冲洗缓冲液冲洗3次。通过利用在封闭缓冲液中稀释1/5000的山羊抗-小鼠IgG(Fc)-碱性磷酸酶共轭物(Sigma A7434)检测抗原特异性抗体。平板用冲洗缓冲液冲洗两次并用重馏水冲洗两次以及用pNPP(Sigma N2765，1mg/ml的50mM碳酸钠，1mM MgCl2的溶液，pH9.6)展开。用pNPP温育30分钟后，通过添加50μl NaOH(2M)终止反应。记录405纳米处的吸光率并通过和校准曲线比较测定血样中的IgG浓度。
结果疫苗的组成.利用含有不同血影细胞-抗原组和BSA蛋白标准的样品的CBB-染色的SDS-PAGE凝胶(附图15中的实例)测定不同疫苗中抗原-PA融合的量。确定的单价疫苗的量为血影细胞-SlrA::PA 50μg/剂量血影细胞-PpmA::PA 10μg/剂量血影细胞-Igalprt::PA5μg/剂量通过以与在单价疫苗(2.5×109)相同的血影细胞量按1∶1∶1的比例混合单价疫苗构成的三价疫苗产生如下述量的抗原血影细胞-SlrA::PA 17μg/剂量血影细胞-PpmA::∷PA 3.3μg/剂量血影细胞-Igalprt::PA1.7μg/剂量疫苗在PBS中配制，没有其它的佐剂。
疫苗效力.
健康状况.用三价血影细胞疫苗鼻内接种产生抗用强毒肺炎链球菌鼻攻击的保护。
当与接受PBS的小鼠相比时，接种小鼠通过发病指数反映的健康显著地降低(附图16)。
在这些组中没有显著的体重下降(附图17)，表明健康的显著改善。单价疫苗中，SlrA和PpmA显示出次要的保护作用(附图16)。PpmA单价疫苗组也显示没有显著的体重下降(附图17)，表明比在PBS对照组中更好的总体健康。然而，所有三价疫苗组中的动物在攻击后清楚地显示出最好的健康状况。
细菌计数(参见图18和表12)。在用三价疫苗接种的小鼠中，肺和鼻子中细菌的数量与PBS对照组的相比显著地降低(P-值＜0.05)。
当小鼠用各单价疫苗免疫时，情况则不是这样。同样，三价疫苗组和单价疫苗组之间的比较显示出鼻，肺和血液中的细菌数具有显著的差异。同样，清楚地表明三价疫苗组是实施最好的。
免疫应答。在预攻击血液中免疫3次后通过ELISA测定血清IgG应答。图19显示在不同疫苗组中产生血清IgG抗原特异性应答。单价疫苗中的抗SlrA，PpmA和Igalprt的应答类似于三价疫苗中的对这些抗原的应答，表明三疫苗中抗原的量足以激发对于这些抗原的血清抗体应答。对三价疫苗中三种抗原的组合应答是获得保护作用所需要的，因为单价疫苗组中的各自单独的应答不能提供充分的保护。
结论●鼻(粘膜的)接种三价SlrA，PpmA，Igalprt疫苗对用肺炎链球菌攻击后的小鼠提供了保护的增加。
●用三价疫苗鼻内接种导致肺和鼻中细菌数量显著减少。。
●用单-和三价疫苗鼻免疫在血清中产生显著的抗原特异性IgG水平。
●当用肺炎链球菌攻击时用单价疫苗鼻接种没有保护作用。
表10.肺炎链球菌抗原特性的概括。用于实际的蛋白锚融合的片段被显示。
表11.健康状况记分的概括。
表12.各种疫苗之间的统计比较。P值＜0.05被认为是显著的(用粗体表示)。
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图1.儿童和成人中抗PpmA的抗-肺炎球菌IgG的滴度。
图2.儿童和成人中抗-肺炎球菌溶血素的抗-肺炎球菌IgG的滴度。
图3.儿童和成人中抗-IgA1蛋白酶的抗-肺炎球菌IgG的滴度。
图4.儿童和成人中抗-α-烯醇酶的抗-肺炎球菌IgG的滴度。
图5.儿童和成人中抗-SlrA的抗-肺炎球菌IgG的滴度。
图6.肺炎链球菌D39鼻内感染的SlrA-接种的CD-1小鼠的存活时间。
图7.肺炎链球菌D39鼻内感染的IgA1蛋白酶-接种的CD-1小鼠的存活时间。
图8.肺炎链球菌D39鼻内感染的PsaA-接种的CD-1小鼠的存活时间。
图9.肺炎链球菌D39鼻内感染的PpmA-接种的CD-1小鼠的存活时间。
图10.CD-1小鼠用预-免疫血清(PIS)，抗-PpmA血清(APS)被动免疫并用肺炎链球菌D39或肺炎链球菌的PpmA阴性敲除菌株进行鼻内攻击。
图11.用抗-PpmA抗血清被动接种并用肺炎链球菌D39鼻内感染的MF-1小鼠的存活率。
图12.分泌的PpmA::PA融合蛋白的序列。Igalprt的氨基酸加下划线。蛋白锚(PA)氨基酸为斜体。
图13.分泌的Igalprt::PA融合蛋白的序列。Igalprt的氨基酸加下划线。蛋白锚(PA)氨基酸为斜体。
图14.分泌的SlrA::PA融合蛋白的序列。Igalprt的氨基酸加下划线。蛋白锚(PA)氨基酸为斜体。
图15.CBB染色的具有血影细胞-抗原疫苗和BSA参照的SDS-PAGE凝胶。SlrA，PpmA和Igal为来自疫苗组的样品。各样品表示一剂量(20μl)。在右边的五个泳道中，数字表示BSA的微克量。估计结合的抗原量并显示于附图的右下部。
图16.结束实验时的小鼠健康状况(t＝感染后44-小时)。根据材料和方法部分描述的参数对各小鼠赋予从0-4的记分。疾病指数计算为最大记分的百分比且表示为各组的平均值+SEM。高分表示大多数动物患病。低分表示大多数动物为健康的。
图17.攻击后体重损失。小鼠在感染前和攻击后44-小时进行称重。体重损失计算为最初体重的百分比且表示为各组的平均值+SEM。体重损失表示动物患病。
图18.对攻击后44-小时的肺(A)，鼻(B)和血液(C)中的细菌计数。图表显示个体数据(◇)和各组的平均值(-)。高的细菌计数表明动物没有受到保护。
图19.3次免疫后但在攻击之前的血清中的抗原特异性IgG。该值表示为各组的平均值+SEM。
权利要求
1.鉴定调理吞噬作用诱导抗原作为疫苗组分用于抗微生物免疫处理的方法，包括a.在硅片上通过膜锚定基序和/或细胞壁结合结构域选择编码细菌蛋白的至少一部分的核苷酸序列，和b.产生至少一部分的所述蛋白，和c.将抗体的集合与所述蛋白接触并测定至少一种抗体和至少一种抗原之间的结合，和d.测定具有此抗原的微生物的所述结合抗体体外和/或体内的调理作用的能力。
2.根据权利要求1的方法，其中所述抗体的集合是通过用所述微生物的至少一部分的所述蛋白免疫动物获得的。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述微生物是肺炎链球菌的成员。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述微生物是粘膜炎莫拉氏菌的成员。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述微生物是链球菌属的成员，或葡萄球菌属的成员，或粘膜炎莫拉氏菌，和/或脑膜炎奈瑟氏球菌，和/或Neisseria ghonorrhoeae，和/或幽门螺旋杆菌，和/或流感嗜血杆菌和/或空肠弯杆菌的成员，和/或假单胞菌属的成员，和/或芽孢杆菌属的成员。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中的基序选自PBD[YV]-X(1-4)-G-D-[ST]-[VLIA]-X(0，2)-[VLIA]CBDG-X(0-5)-G-X-[WYI]-[WYT]-[YVL]-[FV]Lipobox(+信号肽)＜M-X(1-10)-[RK]-X-{DERRK}(7-17)-[LVFTIMG]-[ASTIVGMLCPFL]-[AGLISVTFP]-CLPxTGL-P-X-T-G其中X表示任意天然存在的氨基酸，且其中方括号表示可以用方括号间表示的任意氨基酸填充的一个位置；并且其中下标的数字表示相应的氨基酸重复下标值的次数。
7.至少编码蛋白的抗原部分的核苷酸序列，所述蛋白诱导具有此类蛋白的微生物的调理吞噬作用。
8.根据权利要求7的核苷酸序列，其中所述蛋白与根据权利要求1或2的方法选择的蛋白部分同源。
9.包含权利要求7或8的核苷酸序列的重组载体。
10.表达至少部分权利要求8的核苷酸序列的重组细胞。
11.纯化蛋白，通过权利要求10的重组细胞产生。
12.用于抗可通过调理吞噬作用细胞杀死的微生物的免疫处理的疫苗组分，所述疫苗组分包含权利要求11的蛋白，和/或可通过权利要求1或2的方法获得的抗原。
13.根据权利要求12的疫苗组分，至少包括肺炎链球菌的链球菌性脂蛋白旋转异构酶A(SlrA)的功能部分。
14.根据权利要求12的疫苗组分，至少包括肺炎链球菌的肺炎球菌IgAl蛋白酶(IgAl)的功能部分。
15.根据权利要求12的疫苗组分，至少包含肺炎链球菌的肺炎球菌表面粘附蛋白A(PsaA)的功能部分。
16.根据权利要求12-15任一项的疫苗组分，同样也至少包含肺炎链球菌的肺炎球菌成熟蛋白A(PpmA)的功能部分。
17.疫苗，至少包含肺炎球菌成熟蛋白A(PpmA)或与所述蛋白PpmA具有超过50％的序列相似性的蛋白的至少功能部分以及肺炎球菌的表面粘附蛋白A(PsaA)或与所述蛋白PsaA具有超过50％序列相似性的蛋白的至少功能部分的组合。
18.疫苗，至少包括权利要求12至16任一项的一种疫苗组分，和/或其同源的和/或功能同源蛋白或其蛋白片段，用于治疗可通过调理吞噬作用细胞杀死的微生物的感染。
19.根据权利要求17或18的疫苗，也包括药用载体和/或佐剂。
20.根据权利要求19的疫苗，其中所述佐剂获自细菌细胞壁物质，更优选地其中所述佐剂是血影细胞，更优选地血影细胞来自乳酸球菌。
21.根据权利要求20的疫苗，其中权利要求12至16任一项的疫苗组分与血影细胞结合，优选地其中的结合受蛋白锚的影响，更优选地其中所述蛋白锚为AcmA。
22.产生抗体的方法，包括将免疫细胞与至少一种权利要求12-18任一项的疫苗组分接触。
23.分离的抗体或其功能部分或衍生物，其可通过权利要求22的方法获得。
24.权利要求23的抗体在药物制备中的应用。
25.包含抗权利要求23的疫苗组分的抗体的药剂。
26.权利要求17至21任一项的疫苗和/或权利要求26的药剂在治疗可通过调理吞噬作用细胞杀死的微生物感染中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物学领域，更具体地说涉及免疫学和微生物学领域。本发明进一步涉及抗微生物感染疫苗的领域且尤其是细菌疫苗，尤其是涉及肺炎球菌疫苗。更具体地，本发明涉及鉴定、选择和分离用于被动和/或主动免疫抗可被调理吞噬作用细胞杀死的微生物的疫苗组分的方式和方法。本发明涉及一种鉴定调理吞噬作用诱导的抗原作为抗微生物免疫处理的疫苗组分的方法。本发明描述了三种肺炎球菌蛋白SlrA，IgA1蛋白酶和PsaA，以及它们作为有或者没有PpmA的疫苗组分的应用。本发明也公开了抗所述蛋白的抗体用于被动免疫以及诊断的应用。
文档编号A61K39/02GK1806172SQ200480016839
公开日2006年7月19日 申请日期2004年5月17日 优先权日2003年5月16日
发明者科内利斯·约翰尼斯·利恩霍特斯, 罗纳德·德格罗特, 彼得·威廉默斯·玛丽亚·赫尔曼斯 申请人:伊拉斯姆斯大学医学中心