专利名称：下调ccr5表达的组合物及其应用方法
背景技术：
发明领域本发明涉及CCR5表达的下调，尤其是涉及包括至少一种显示出下调表面受体CCR5表达的G1期停滞剂的组合物由此治疗CCR5受体起有害作用的人的疾病。
相关技术的背景人类免疫缺陷性病毒(HIV)已经被认为是称作获得性免疫缺损综合症(AIDS)的慢性退行性免疫系统疾病的主要病因。至少有截然不同的两类HIVHIV-1以及HIV-2。人类HIV复制只要发生在CD4 T淋巴细胞群，并且HIV感染引起这种细胞型的衰竭并最终导致免疫功能不全，机会感染，神经功能障碍，肿瘤生长并且最终死亡。
HIV是逆转录病毒的慢病毒家族的成员。逆转录病毒是包含单链RNA基因组，并且通过由病毒编码的逆转录酶即依赖RNA的DNA聚合酶产生的DNA中间体复制的小-包膜病毒。
HIV病毒粒子包括部分由衣壳蛋白连同病毒RNA基因组以及早期复制事件所需的酶组成的病毒核心。十四烷基化的gag蛋白形成了围绕病毒核心的外壳，其反过来由来源于受感染细胞膜的脂膜包膜包围。HIV包膜表面糖蛋白被合成为单个的160千道尔顿前体蛋白，其由细胞蛋白酶在病毒出芽期间裂解成两个糖蛋白gp41以及gp120。gp41是跨膜糖蛋白并且gp120是细胞外糖蛋白，其与gp41保持可能是三聚体或者多聚体形式的非共价连接。
HIV靶向CD4细胞，因为CD4细胞表面蛋白(CD4)作为HIV-1病毒的细胞受体。病毒进入细胞依赖于结合细胞CD4受体分子的gp120，解释了HIV对CD4细胞的趋向性，而gp41锚定病毒膜中的包膜糖蛋白复合物。CCR5作为由HIV-1的非合胞体-诱导(NSI)株感染CD4细胞的共受体。
CCR5受体在T细胞上的表达依赖于细胞的激活状态。静息淋巴细胞不表达CCR5，然而在活化后表达CCR5。CCR5对于HIV-1最初传播的重要性由缺乏CCR5(CCR5-Δ32纯合遗传型)表达的个体通常抗感染的事实得以强调(Liu等人，1996)。此外，近代研究指出CCR5细胞表面密度与感染个体的疾病进程有关(Lin，等，2002)。
其它失调以及影响的进展已经被认为是与CCR5受体的表达相关。例如，同种异体移植排斥的发生是由于受体单核细胞进入异体移植物之内外渗的结果，该过程由CCR5在浸润单核细胞上的表达介导。利用过敏性气道疾病的鼠模型进行的哮喘研究已经显示CCR5可能在气道炎症中起重要作用。此外，类风湿性关节炎的特征为滑膜被单核细胞的浸润并且CCR5似乎由于浸润的淋巴细胞中发现CCR5高水平表达起到一定的作用。有趣的是，存在于患多发性硬化的受试者的特征性的活性脱髓鞘血小板中的单核细胞也显示CCR5的高水平表达。
由此，降低或者抑制CCR5表面受体在单核细胞上表达的化合物的鉴定并且施用这种化合物从而有效治疗与CCR5表面受体的表达相关的失调将是非常有益的。
发明概述本发明涉及通过施用停滞细胞周期G1期的组合物操纵活化的淋巴细胞的细胞周期从而下调表面受体CCR5的表达，由此破坏淋巴细胞对IL-2(通过IL-2R)的应答，支配从G1到S期的过渡，而且通过S期的进度。CCR5表达的下降减少了HIV进入T细胞的受体部位并且由此影响HIV的进展。
一个方面，本发明涉及抑制CCR5的转录从而减少CCR5表面受体的表达由此引起趋化因子在细胞水平的聚集。这种趋化因子的聚集应归于用于趋化因子/配体吸收的表面CCR5受体数目的减少。
在另一方面，本发明涉及抑制CCR5的转录，减少CCR5表面受体的表达由此引起用于HIV gp120结合的表面受体数目的降低，其进而预防或者减少HIV的复制。
在另一方面，本发明涉及通过减少单核细胞上表达的CCR5表面受体的数目抑制CCR5-介导的HIV病毒进入的组合物，所述单核细胞包括但不限于T细胞，活化的T细胞以及巨噬细胞。
在另一方面，本发明涉及包含延缓单核细胞周期进入S-期的G1期停滞剂的组合物，其中G1期停滞剂破坏IL-2结合到细胞表面上IL-2受体(IL-2R)后发生的信号传导以及由此抑制取决于通过IL-2受体进行信号传导的CCR5的表达。
本发明的另一方面涉及抑制CCR5-介导的病毒进入，也就是通过免疫调节药物雷帕霉素(RAPA)下调CCR5蛋白表达的方法。RAPA是一种细菌的大环内酯，目前已被批准用于肾移植排斥的治疗，通过破坏源于IL-2与IL-2受体结合的分子事件在T细胞中发挥细胞抑制的活性(Sehgal，S.N.，1998)。
G1细胞周期调节剂可以包括停滞或者延长单核细胞的细胞周期中G1期的任何化合物，例如包括而不限于丁酸钠，阿非迪霉素(aphidicolin)，羟基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，包括α-生育酚，β-生育酚，D-α-生育酚，Δ-生育酚，γ-生育酚，生育三烯酚，雷帕霉素(RAPA)及其功能类似物或者衍生物。
本发明的组合物可以更进一步包括至少一种抗病毒剂。该抗病毒剂可以包括抑制感染性病毒，具体地逆转录病毒诸如HIV病毒进入细胞或者在其中复制的任何药剂。抗病毒剂包括但不限于核苷RT抑制剂，CCR5抑制剂/拮抗剂，病毒进入抑制剂及其功能类似物。
由此，在一个方面，本发明的组合物以及方法更进一步包括治疗有效量的至少一种抗病毒剂，包括但不限于核苷RT抑制剂，诸如叠氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(lamivudine)(3TC)，双脱氧胸苷(d4T)，2′，3′-双脱氧肌苷(ddl)，2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)，阿巴卡韦(Abacavir)(ABC)，Emirivine(FTC)，替诺福韦(Tenofovir)(TDF)，德拉维拉丁(Delaviradine)(DLV)，依法韦伦(Efavirenz)(EFV)，奈韦拉平(Nevirapine)(NVP)，沙奎那维(Saquinavir)(SQV)，利托那韦(Ritonavir)(RTV)，茚地那韦(Indinavir)(IDV)，奈非那韦(Nelfinavir)(NFV)，安普那韦(Amprenavir)(APV)，洛匹那韦(Lopinavir)(LPV)，阿扎那韦(Atazanavir)，双汰芝(Combivir)(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三协唯(Trizivir)(ZDV/3TC/ABC)；CCR5抑制剂/拮抗剂，诸如SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857，单克隆抗体；病毒进入抑制剂，诸如Fuzeon(T-20)，NB-2，NB-64，T-649，T-1249，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857；及其功能类似物或等效物。
本发明的另一方面涉及加强TAK-779的效力以及减少活化T细胞上CCR5表面受体数目的方法，该方法包括施用包括如下成分的组合物a)被认为是拮抗CCR5受体无效量的TAK-779以及b)有效减少CCR5的表达量的G1期停滞剂，借此组合物中包含的G1期停滞剂增强了TAK-779的效力。优选地G1期停滞剂是RAPA或者HU并且效力被协同提高。
在另一方面，本发明涉及抗病毒感染的方法，其中CCR5表面受体起到有害的作用，包括给患者施用包括有效量G1期停滞化合物以减少CCR5表面受体表达的组合物。
在另一方面，本发明涉及对HIV保持持久病毒控制的方法，该方法包括施用至少一种抗病毒剂以及治疗有效量的G1停滞化合物减少CCR5受体的表达由此降低HIV gp120的结合。
抗病毒剂可以是任何HIV进入抑制剂，诸如TAK 799或者SCH-C，二者都可阻断病毒与CCR5受体的结合。已经显示出对这些CCR5拮抗剂分子的病毒抗性源于病毒更有效利用CCR5(Trkola等人，2002)。HIV-1病毒抗CCR5阻断剂但仍然依赖于CCR5受体感染的事实表明CCR5的减少将干扰病毒抗性突变体的生长以及出现由此提高进入抑制剂治疗的抗病毒持久性。
本发明的另一方面涉及减少HIV感染受试者体内HIV的影响以及复制的方法，所述方法包括与CCR5拮抗剂TAK 779组合施用G1期停滞剂以加强TAK-779的效力以及减少CCR5的表达。
在更进一步的方面，本发明涉及可能暴露于HIV的受试者预防HIV的方法，所述方法包括给受试者施用至少一种有效量的G1期停滞化合物减少CCR5表面受体的转录由此抑制HIV病毒进入受试者体内。
本发明的其它特征以及优点将根据下列详细说明，附图以及权利要求而更加显而易见。
图1显示了RAPA对PBMCs增殖以及减少增殖的影响在高于1nM RAPA的水平是显著的。
图2A-D显示了RAPA对下调T细胞以及单核细胞上CCR5表达的有效性；2A显示了特异性检测到CCR5在正常供体的CD4+T细胞上的表面表达，而非CCR5基因Δ32突变的同型接合个体CD4+T细胞上的CCR5表面表达；2B显示了由PBMCs中RAPA下调CD4+T细胞上CCR5的表面表达，所述PBMCs在IL-2以及RAPA存在下培养7天然后分析CCR5的水平，其中CCR5在CD4+T淋巴细胞上的表达显示为实线，并且IgG同种型对照的荧光强度显示为虚线；2C显示了由RAPA抑制CCR5 mRNA在PBMCs中的转录。总RNA分离自在IL-2以及RAPA存在下已经培养7天的PBMCs(来自与图2B所示相同实验的细胞)。利用特异于CCR5mRNA(上游)以及18S核糖体RNA(下游)扩增的引物对将同等量的RNA进行RT-PCR；2D显示了RAPA下调在RPMI 20/10％ABHS以及RAPA存在下培养5天的成熟单核细胞上CCR5的细胞表面表达，所述成熟单核细胞双重免疫染色CD14以及CCR5。在CD14-门控的细胞中检测CCR5表面表达的改变。将用抗-CCR5mAb 182获得的免疫荧光分布图(实线)与IgG2b同种型对照的免疫荧光相比较(虚线)。2B以及2C的结果为来自5个不同供体获得的PBMCs中的代表性数据。2D的结果为3个不同供体获得的代表性类似分布图。
图3A以及3B显示了RAPA提高PBMC培养物中细胞外β-趋化因子的水平。3A显示了在IL-2以及RAPA存在下培养10天的供体PBMCs的结果，在培养10天时由ELISA评价上清液β-趋化因子的含量并且对细胞进行染色检测CCR5的表达。显示了在每一浓度的RAPA表达CCR5的CD4淋巴细胞的百分比。2个供体中显示的结果代表利用4个不同供体的4个实验。由斯氏t检验法与未经治疗的对照相比*，P＜0.01；#，P＜0.05，；3B显示了RAPA对CCR5-无效PBMCs培养物中MIP-1β细胞外水平的影响。测定正常供体以及CCR5基因Δ32突变同型接合的供体的IL-2-刺激的PBMCs的上清液中在RAPA存在以及不存在条件下MIP-1β蛋白的水平。获得培养10天的值以及一式两份微孔的平均值±SD。
图4显示了RAPA抑制PBMCs中HIV-1的复制而且R5 HIV-1中的抗病毒活性大于在X4 HIV-1中的抗病毒活性。4A显示了7天试验期间的复制结果，其中RAPA-处理的PBMCs感染了HIV-1 IIIb或者HIV-1 ADA。感染细胞在药物RAPA存在下培养7天，并且在该时间由p24测定病毒复制并且由MTT分析测定细胞存活力。结果(一式三份微孔的平均值±SD)表示7个独立实验，每一为来自不同供体的细胞上；4B显示了当用100nM RAPA处理时对HIV-1 IIIb以及HIV-1 ADA感染的DNase-处理的PBMCs母株的作用。HIV-1 DNA序列由PCR在感染后24小时制备的细胞裂解物中进行扩增。扩增的PCR产物用放射性探针进行检测。“+”表示感染前后PBMC培养物中RAPA的存在；“-”表示无RAPA处理。β-肌动蛋白序列的扩增显示了在不同细胞裂解物中细胞DNA的相同量(数据未显示)。NC表示PCR阴性对照；4C显示了当在HIV-1的R5株试验组中研究时低浓度RAPA的抗病毒活性。在相同条件下培养的相同供体的未感染细胞上分析细胞增殖。结果(一式三份微孔的平均值±SD)表示3个独立实验，每一在不同的供体细胞上进行。
图5表示RAPA抑制MDMs中HIV-1的复制。在RAPA的存在下培养纯化的单核细胞5天。在第5天，细胞感染HIV-1 ADA并且在RAPA存在下另外培养14天。在感染后7，10以及14天，通过RT分析测定病毒生长。在第14天，由MTT测定细胞存活力。结果(平均值±SD)表示3个独立实验中获得的数据，每一利用来自不同供体的细胞。
图6表示RAPA增强CCR5拮抗剂TAK-779的抗病毒活性。已经在不存在或者存在RAPA(1，10以及100nM)下培养7天的PBMCs在0.1nM TAK-779存在下感染HIV-1 ADA。受感染细胞在RAPA以及0.1nM TAK-779存在下培养。在感染后7天，通过p24分析测定培养上清液中病毒的产量。记录Y轴中的对数刻度。数据表示一式三份微孔的平均值±SD。显示了3个独立实验之一获得的代表性结果。
图7显示HU增强了CCR5拮抗剂TAK-779的抗病毒活性。已经在不存在或者存在HU下培养7天的PBMCs在TAK-779存在或者不存在下感染HIV-1 ADA。在感染后7天，通过p24分析测定培养上清液中病毒的产量。
图8A-B显示了HU下调T细胞以及单核细胞上CCR5表达的有效性；8A显示了由HU下调在IL-2以及HU存在下培养7天的PBMCs中CD4+T细胞上的CCR5表面表达然后分析CCR5的水平，其中CCR5在CD4+T淋巴细胞上的表达显示为实线，来自于IgG同种型对照的荧光强度显示为虚线；8B显示了由HU抑制PBMCs中CCR5 mRNA的转录。总RNA分离自在IL-2以及HU存在下已经培养7天的PBMCs(来自与图8A所示相同实验的细胞)。利用CCR5 mRNA(上游)以及18S核糖体RNA(下游)扩增的特异性引物对将等量的RNA进行RT-PCR；图9显示了CCR5表达测定的CCR5m RNA从基线的变化。将值标准化到细胞管家基因β肌动蛋白的值。与基线(第0天)的差异倍数显示为对数标度。检验的时间点包括在RAPA施用的7，14和28天以及中止RAPA施用后2周的42天。
优选实施方案的详细说明本发明的治疗病毒感染的方法包括“预防性”治疗或者“治疗性”治疗。“预防性”治疗是针对不显示出疾病病征或者显示出早期的疾病病征的受试者进行治疗，目的在于减少形成与疾病相关的病理特征的危险。
本发明使用的术语“治疗性”是指针对显示出病理病征的受试者的治疗，目的在于减轻或者消除那些病征。
本发明使用的术语“治疗有效量”是指给受试者足以提供所施用的化合物有益效果的量的化合物。有益效果是指例如使得病毒不能复制，抑制病毒复制，抑制其它寄主细胞的感染或者提高CD4T细胞的量。
本发明使用的术语“病毒靶向细胞”是指其中存在病毒以及感染病毒或者可能感染病毒的细胞并且包括上皮细胞，神经系统细胞，T-淋巴细胞(活化或者静息)，巨噬细胞，单核细胞，组织树突状细胞等等。
本发明使用的术语“功能等效”是指药剂保持相应的化合物一些或者所有的生物活性。
本发明使用的术语“功能类似物”是指由基本上不引起母体化合物生物活性损失(即超过100×)的直接取代衍生自特定母体化合物的化合物，其中这种取代是本领域技术人员公知的修饰，例如酯化作用，由卤素取代氢，由烷基取代烷氧基，由烷氧基取代烷基等等。
发明G1期停滞化合物本发明的组合物可以包括停滞，延缓或者延长单核细胞的G1期和/或G1-S过渡期的细胞-周期活性以及减少CCR5表达的任何G1期停滞剂。优选地，G1期停滞剂破坏淋巴细胞对IL-2(通过IL-2R)的应答，所述应答支配从G1到S期的过渡以及通过S期的进度。
G1期停滞剂可以包括但是不局限于丁酸钠，阿非迪霉素(aphidicolin)，羟基脲(HU)，olomoucme，roscovitine，生育酚，生育三烯酚，雷帕霉素(RAPA)和/或其功能类似物。优选地，组合物包括抑制T细胞针对IL-2应答的雷帕霉素，所述物质引发已经由TCR活化的T细胞进展通过G1。因此雷帕霉素将细胞停止在G1-S过渡期。更优选地，组合物包括破坏淋巴细胞针对IL-2应答(通过IL-2R)的有效量的RAPA，其支配从G1到S期的过渡由此引起CCR5表达的减少并且附随减少HIV进入的受体位点。
本发明采用上述鉴定的G1期停滞化合物的一种施用于患病毒感染的受试者，其中该化合物延长活化的淋巴细胞的细胞周期的G1期由此抑制CCR5受体的表达并且减少HIV gp120配体的结合位点。
药物组合物本发明提供了包括至少一种G1期停滞化合物以及任选地至少一种抗病毒剂的组合物，以及预防，治疗和/或减少HIV的作用的方法。该方法包括施用所述包括G1期停滞化合物以及任选抗病毒药的组合物，其中这两种化合物可以单独，同时，并行或者顺序施用。
药用衍生物以及盐本发明使用的术语“药用衍生物”表示本发明的化合物的药物或者药理学可以接受的盐，酯或者这种酯的酯或者盐，或者在施用到受体后能够提供(直接或者间接)一种或者多种本发明化合物的任何化合物，或者其抗病毒活性代谢物或者残余物。
本发明的G1期停滞化合物的优选酯包括羧酸酯，其中酯基的非羰基部分选自直或者支链烷基，例如正-丙基，叔丁基，正丁基，烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)，芳烷基(例如苯甲基)，芳氧烷基(例如苯氧甲基)，芳基(例如，由卤素，C1-4烷基或者C1-4烷氧基或者氨基任选取代的苯基)；磺酸酯诸如烷基-或者芳烷基磺酰基(例如甲基磺酰基)；氨基加成酯(例如L-缬氨酰基或者L-异亮氨酰基)；以及单，二或者三磷酸酯。磷酸酯可以进一步由例如，C1-20醇或者其活性衍生物或者由2，3-二C2-4酰基甘油酯化。
药用盐包括但不限于有机羧酸诸如乙酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，羟乙磺酸，乳糖酸，p-氨基苯甲酸以及琥珀酸的盐；有机磺酸诸如甲基磺酸，乙基磺酸，苯甲基磺酸以及p-甲苯磺酸以及无机酸诸如盐酸，硫酸，磷酸以及氨基磺酸的盐。
抗病毒化合物在一个方面，本发明的组合物以及方法更进一步包括治疗地有效量的至少一种抗病毒剂，包括但不限于核苷RT抑制剂，CCR5抑制剂/拮抗剂，病毒进入抑制剂及其功能类似物。
优选地，抗病毒剂包括核苷RT抑制剂，诸如叠氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(lamivudine)(3TC)，双脱氧胸苷(d4T)，2′，3′-双脱氧肌苷(ddl)，2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)，阿巴卡韦(Abacavir)(ABC)，Emirivine(FTC)，替诺福韦(Tenofovir)(TDF)，德拉维拉丁(Delaviradine)(DLV)，依法韦伦(Efavirenz)(EFV)，奈韦拉平(Nevirapine)(NVP)，沙奎那维(Saquinavir)(SQV)，利托那韦(Ritonavir)(RTV)，茚地那韦(Indinavir)(IDV)，奈非那韦(Nelfinavir)(NFV)，安普那韦(Amprenavir)(APV)，洛匹那韦(Lopinavir)(LPV)，阿扎那韦(Atazanavir)，双汰芝(Combivir)(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三协唯(Trizivir)(ZDV/3TC/ABC)；CCR5抑制剂/拮抗剂，诸如SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857，单克隆抗体；病毒进入抑制剂，诸如Fuzeon(T-20)，NB-2，NB-64，T-649，T-1249，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857；及其功能类似物。
抗病毒治疗虽然当前用抗逆转录病毒(ARV)治疗引起HIV复制的抑制并且引起免疫功能的改进，但是当前的治疗受限于高成本，毒性以及坚持的困难。而且，单独用抗逆转录病毒治疗实现长期HIV感染的控制似乎不太可能。迄今为止，目前的抗逆转录病毒治疗已经显示出不足以从感染个体完全根除HIV并且在典型抗逆转录病毒治疗时没有实际资料显示残留的病毒量随时间减少。此外，停止抗逆转录病毒治疗后，病毒载量可以回弹到比处理前病毒载量还高的水平(Davey，1999；Dybul等，2002和2001)。
抗逆转录病毒治疗需要严格的坚持复合给药方案。6-月期间的病毒衰退速率已经显示出高达60％的患者不能实现高于95％的坚持。与抗逆转录病毒治疗有关的多种不良副作用以及这种治疗对估计世界范围33百万感染者的每20人中只有1例有效的效果的组合已经促进我们重新考虑当前实现HIV治疗目标的策略。
而且，目前认为HIV治疗为延长生命的过程。因此，开发可成功施用用于长期抑制逆转录病毒，尤其是预防和/或抑制HIV的有效治疗是非常重要的。此外，希望清除，或者至少最小化与施用抗病毒药有关的细胞毒性换句话说确定有效。普遍认为抗病毒剂的毒性可以通过施用减少剂量的抗病毒剂避免或者至少最小化；然而同时承认抗病毒剂的效果通常随着剂量的减少而降低。
由此，本发明的一个实施方案提供了通过利用周期治疗以及将本发明的G1细胞周期剂引入HIV感染受试者的给药方案减少抗病毒药的剂量同时保持或者减少病毒载量。具体地，通过利用G1期停滞化合物连同抗病毒药已经有希望保持周期给药程序中的病毒抑制。通过利用少于50％的药物，已经证明与抗逆转录病毒应用相关的副作用减少并且坚持程度也已经提高。另一个明显的影响是药物的总成本，其将促进这些药物在所有发达国家的应用。
由此，在本发明的一个实施方案中，采用周期治疗作为设计用于提高抗病毒药活性，减少药物成本以及毒性的替代方法。此外，因为本发明组合物的一个组分靶向宿主的细胞机制而非病毒，因此本发明的发明人料想将基本上不会发生对这种药物组合物的抗性。
周期抗病毒治疗方案可以持续12周然后添加G1期停滞化合物或者被其所代替4周。如果病毒载量保持低水平或者基本上恒定，可以改变周期减少每一周期的时间。如果添加G1期停滞化合物，消耗抗病毒药物的时间可以减少。此外，可以引入不包括抗病毒药物以及只有G1期停滞化合物的时间。这种受试者不消耗抗病毒药的时间给受试者的生物系统提供了重组的时间修复或者补偿抗病毒化合物的有毒影响。
此外，本发明的组合物以及方法可用于通过减少病毒载量以及通过减少gp120配体的结合位点减少病毒复制治疗HIV病毒感染。
根据G1期停滞剂，抗病毒剂，治疗时间，施用频率，宿主以及感染的特性以及严重程度改变施用的剂量。剂量可以由本领域技术人员不经多余的实验就可以确定。
本发明的组合物以基本上无毒、足以保证足量剂量单位的本发明的组合物进入患者体内提供所需要的HIV病毒抑制的剂量浓度施用。实际的施用剂量可以根据身体以及生理因素诸如年龄，体重，疾病的严重程度和/或患者的病历进行确定。理论上所施用的活性抗病毒组分可以实现体内约0.01μM到约100μM的抗病毒剂的体内血浆浓度，更优选地约001到10μM，并且最优选地约1-5μM，以及约1μM-25μM，更优选地约2-20μM，最优选地约5-10μM的G1期停滞剂。
例如，在HIV-阳性以及AIDS患者的治疗中，本发明的方法可以使用组合物提供从约0.005-500mg/kg体重/天的抗病毒剂，更优选地从约0.1-200mg/kg/天，以及最优选地1-50mg/kg/天；以及从约0.01-1000mg/kg体重/天的G1期停滞剂，更优选地从约0.001-1000mg/kg/天或者最优选地从约0.5-50mg/kg/天。本发明的G1期停滞剂以及抗病毒剂的特定单位剂量包括例如单独配制，或者下文所述成分一起配制的50mg，100mg，200mg，500mg以及1000mg的量。
然而应该理解，偏离所提供范围的剂量水平也可以适于治疗所列举的病毒感染。
G1期停滞化合物的治疗效果可以由细胞培养或者实验动物中进行的标准药物程序进行确定，例如用于确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(50％种群有效的治疗剂量)。毒性以及治疗作用之间的剂量比率是治疗指数并且可以表示为LD50/ED50的比率。优选显示出高治疗指数的化合物。细胞培养分析以及动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。这种化合物的剂量优选处于包括没有毒性的ED 50的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型以及所使用的给药途径在这个范围内改变。对于本发明方法中使用的化合物治疗有效剂量可以从最初的细胞培养分析进行估计。可以根据动物模型配制剂量以便获得包括在细胞培养中确定的IC50(即实现症状的半最大抑制的检验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可用于更精确地确定用于人的剂量。例如通过高效液相色谱法测定血浆中的水平。
期望的剂量优选为整天中合适间隔施用2，3，4，5，6或更多的亚剂量。这种亚剂量根据每单位剂型G1期停滞化合物的亚剂量数目以例如包含0.01到1000mg，优选地1mg到50mg的单位剂型施用。
虽然有可能连续或者同时分别施用特异性G1期停滞化合物以及抗病毒剂，优选组合在药物组合物中一起施用。
本发明的组合物可以包括两种上述的成分，连同一或者多种其可以接受的载体以及任选的其它治疗剂。每一载体必须是“药用的”是指与制剂的其它成分相容合并且对受试者无害。
本发明提供了治疗或者预防可以根据本发明治疗或者预防的病毒感染诸如逆转录病毒感染包括人类逆转录病毒感染诸如人类免疫缺陷性病毒的方法。本发明的特异性G1期停滞化合物，组合物以及方法尤其可用于治疗AIDS以及相关的HIV-阳性病征。本发明的化合物也可用于治疗由人逆转录病毒引起的或者与其有关的无征状感染或者疾病。
本发明的治疗组合物可以与其它治疗病毒感染或者病征的其它治疗剂组合施用。这种其它治疗剂的实例包括有效治疗病毒感染或者相关病征诸如免疫调节剂诸如胸腺素，核糖核苷酸还原酶抑制剂诸如2-乙酰吡啶5-[(2-氯苯氨基)硫代羰基)硫羰腙，干扰素诸如α-干扰素，1-β-D-阿糖呋喃-5-(1-丙炔基)尿嘧啶，3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷，病毒唑以及膦酰甲酸。
施用途径本发明的组合物可以通过任何适合的途径施用进行治疗，包括口服，直肠，鼻，局部(包括透皮，口腔以及舌下)，阴道以及肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内以及皮内)。应该认识到优选的途径将根据受体的病征以及年龄，感染的性质以及所选择的活性成分的变化而改变。
本发明的药物制剂包括那些适合于口服，直肠，鼻，局部(包括透皮，口腔或者舌下)，阴道或者肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内以及皮内)施用的制剂。
制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以由药学领域已知的方法进行制备。这种方法包括结合G1期停滞化合物以及任选地抗病毒剂连同载体的步骤。载体任选地包括一或者多种助剂。通常，制剂通过均匀以及紧密地将单独的成分与液体载体或者细分散的固体载体或者二者组合然后如有必要将产物成形进行制备。
适合于透皮施用的组合物可以适于与受体的表皮保持延长时间密切接触的离散贴片的形式存在。这种贴片合适地包含G1期停滞化合物以及任选地包括抗病毒剂诸如CCR5拮抗剂1)在任选的缓冲液，水溶液中；或者2)溶解和/或分散在粘合剂中；或者3)分散在聚合物中。
本发明适合于口服的制剂可以离散单位诸如胶囊，caches或者片剂，每一包含预定量的成分；粉末或者颗粒；水或者非水液体的溶液或者悬浮液；或者水包油液体乳剂或者油包水液体乳剂的形式存在。
片剂可以压缩或者模制，任选地与一或者多种助剂的方式制备。压缩片剂可以在适合的机器中通过压缩自由流动形式诸如粉末或者颗粒的G1期停滞化合物以及抗病毒剂，任选地与粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮，凝胶，羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠，交联的聚乙烯基吡咯烷酮，交联的羧甲基纤维素钠)表面活性或者分散剂混合进行制备。模制的片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物进行制备。可以任选地对片剂包衣或者刻痕并且利用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素进行配制以便提供其中一种或者多种成分的缓释或者控释从而提供期望的释放分布图。片剂可以任选地提供有肠溶衣提供除了胃以外在部分消化道中的释放。
适合于局部施用于口腔的制剂包括在加香母基中通常为蔗糖或者阿拉伯胶中含有一种或者多种G1期停滞化合物以及任选抗病毒剂的锭剂；在诸如凝胶以及甘油或者蔗糖并且阿拉伯胶的惰性母基中包括一种或者多种成分的软锭剂；以及在适合的液体载体中包含一种或者多种成分的嗽口水。
用于直肠施用的制剂可以连同适合的母基包括例如可可脂或者水杨酸酯的栓剂形式存在。
适合于阴道施用的制剂可以除了包含本发明的一种或者多种化合物外包含本领域已知的合适的载体的阴道栓，棉塞，乳油，凝胶剂，糊剂，泡沫或者喷雾剂形式存在。
适合于肠胃外施用的制剂包括水以及无水等渗无菌注射溶液，其可以包含可赋予所述制剂与目的受体的血液等渗的抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂以及溶质；以及可以包括悬浮剂以及增稠剂的水以及无水无菌悬浮液。制剂可以存在于单位剂量或者多剂量的密封容器中，例如安瓿以及小瓶中，并且可以只需在使用之前添加无菌液体载体，例如注射用水的冷冻干燥(冻干)形式保藏。现配的注射溶液以及悬浮液可以从先前描述的无菌粉末，颗粒以及片剂制备而来。
对于怀孕的受试者，本发明的药物组合物例如可以在怀孕36周后口服施用并且持续到分娩。妊娠晚期以及分娩(发生大多数传播的时间)前后的时间进行干预是最有效的。
除了先前描述的组合物，所述化合物也可配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或者肌内)或者通过肌肉注射施用。由此，例如化合物可以与适合的聚合或者疏水材料(例如作为可以接受油形式的乳剂)或者离子交换树脂，或者作为微溶衍生物，例如作为微溶盐一起配制。其它适合的递送系统包括提供局部延长时间非扩散递送药物可能性的微球体。所施用的治疗剂缓慢地从这些微球体释放并且由周围的组织细胞(例如内皮细胞)吸收。
如果期望组合物可以存在于包装或者分配装置中，所述装置可以包括含有活性成分的一或者多种单位剂型。包装可以例如包括金属或者塑料薄膜，诸如薄膜包装。包装或者分配装置可以附有施用的说明书。
适合的G1细胞周期剂可被用于允许持续病毒抑制从而保持较少组合抗逆转录病毒(ARV)治疗依赖的HIV治疗策略。ARV的当前目标是获得尽可能低尽可能长的病毒抑制。需要低频率给药或者减少量ARV控制病毒抑制直接引起下述的与实现抗逆转录病毒治疗的当前目标相关的问题，包括1.当前的HAART方案麻烦又复杂并且需要持续的耐受以及严格坚持3或更多的药物。
2.长期严格坚持对于大多数患者而言是不可能的。
3.对于累积药物毒性的长期耐受对于大多数患者而言是不可能的。
4.HIV感染的当前治疗原则推荐相对晚开始HAART因为单独的HARRT不能根除感染以及包括严重代谢综合症的药物相关副作用的危险。
5.一些没有治疗直到疾病晚期阶段的患者将具有高水平的病毒载量，其可以提高传播的危险性以及引起公共卫生问题。
6.最后，全世界的大多数HIV感染人群大多数由于费用并不采用抗逆转录病毒药物。
通过将G1细胞期停滞剂引入焦点治疗方法，将转向用较低复杂性，较少毒性以及更可承受的可应用于世界范围的方案保持长期的病毒控制。靶向G1细胞周期减少活化T细胞的CCR5受体表达的本发明可以成功用于无需多种抗逆转录病毒药物的持续治疗就可保持慢性HIV-1感染的病毒抑制。这些结果对于费用，副作用以及HIV治疗的有效性具有正面的影响。
本发明通过下列实施例进一步进行描述，并且所述实施例不应被认为是以任何方式对本发明进行限制。
本发明的应用除非另有陈述将使用本领域技术人员所掌握范畴内的细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA以及免疫学的传统方法。这种技术全部解释在文献中。例如参见，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd，Sambrook，Fritsch以及Maniatis编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press；1989)；DNA Cloning，I以及II卷(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
实施例方法和材料细胞培养以及流式细胞术如(Poli，1993；Perno，1993)所述在正常供体上进行外周血单核细胞(PBMCs)以及单核细胞-衍生的巨噬细胞(MDMs)的培养。在存在100单位/ml rhIL-2(Roche MolecularBiochemicals)条件下培养PBMCs。通过台盼蓝染色或者通过MTT分析(Roche Molecular Biochemicals)确定细胞的存活力。
RAPA购自Calbiochem。CCR5拮抗剂，TAK-779获自NationalInstitutes of Health AIDS Research以及Reference Reagent Program(Rockville，MD)。
在IL-2存在下培养7-10天的PBMCs上测定CCR5的表面表达。如前所述(Lane，1999)进行染色但是利用CCR5mAb 182(R&D系统)。通过添加同种型-匹配的对照(IgG2b，R&DSystems)代替抗CCR5 mAb确定背景染色。通过利用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)以及通过利用FLOWJO(Tree Star，San Carlos，CA)的分析获得数据。
通过利用ELISA试剂盒(R&D系统)在培养上清液中测定β-趋化因子MIP-1α，MIP-1β以及RANTES的水平。
传染性分析下列病毒用于感染试验HIV-1 IIIb，HIV-1 ADA，HIV-1 BaL，HIV-1 JRFL，HIV-1 JRCSF以及HIV-1 SF162。HIV-1 IIIb是T细胞系适应的实验室株，其利用CXCR4进入细胞而其余的使用CCR5进行分离。病毒获自National Institutes of Health AIDS Research以及Reference Reagent Program。
对于PBMCs感染，将新鲜的供体PBMCs培养在含IL-2的培养基中7天。在第7天将细胞暴露于病毒3小时。通过用PBS洗涤细胞3次除去未吸附的病毒。将受感染细胞培养在IL-2培养基中。如前所述(Perno，1993)进行MDMs的感染。除非另有陈述，通过利用0.001的moi(感染多重度)感染PBMCs，并通过利用0.002的moi感染MDM。通过ELISA(NEN)或者通过测定RT分析中(Willey，1988)病毒RT的活性测定p24抗原水平监控培养上清液中的病毒生长。
PCR法通过所述的RT-PCR(Baba，1996；Levine，1996)进行CCR5以及β-趋化因子RNA序列的扩增。在一些实验中，RAPA治疗对病毒进入PBMCs的效果通过DNA PCR进行研究。简而言之，已经用IL-2以及RAPA处理7天的PBMCs在0.05的moi用HIV-1 IIIb或者HIV-1 ADA感染3小时。病毒接种体经由0.22-μm过滤器粗滤器然后用DNase(10μg/ml)在37℃处理30分钟净化HIV-1 DNA的接种物。彻底洗涤受感染细胞除去残留的病毒。感染后24小时，制备细胞裂解物，并且利用引物对M661/M667(Zack，1990)通过DNA PCR扩增等分试样。通过液相杂交利用32P标记的探针检测扩增产物(Spina，1995)。在磷光影像分析仪中测定杂交信号的强度。β-肌动蛋白引物用来控制样品中DNA的输入量。
实施例1RAPA对PBMC增殖以及存活力的影响来自正常供体的纯化PBMCs在IL-2以及RAPA存在下培养(10倍系列稀释，从104到0.01nM)。在第7天，通过MTT分析测定细胞增殖的程度。显示了每一利用来自4个供体的细胞的2个独立实验之一获得的代表性结果。对于每一供体而言，数据值为3个独立微孔的平均值±SD。如图1所示在≥1nM药物浓度检测在第7天通过MTT分析测定的增殖的降低。在高于103nM的药物浓度观察到药物毒性(数据未显示)。
实施例2RAPA下调CCR5在T淋巴细胞以及单核细胞上的表达利用通过测定正常供体以及先前表征为CCR5基因Δ32突变同型接合的供体的淋巴细胞上CCR5的表达的表面染色方案测定CCR5的特异性。染色之前，来自两种供体的PBMCs在IL-2存在下培养7天因为这些培养条件上调了CCR5的表面表达(Bleul，1997)。描述门控CD4T细胞上CCR5表达的结果显示在图2A中。结果显示了特异性检测了CCR5在来自正常供体的CD4+T细胞上的表面表达而非在来自CCR5基因Δ32突变同型接合的个体的CD4+T细胞上的表面表达。结果显示，用于本实施例的方法可以特异性检测CCR5的表面表达。
为了确定RAPA对正常供体淋巴细胞上CCR5表面表达的影响，将新鲜的供体PBMCs培养在逐渐提高浓度的RAPA(0.1，1，10以及100nM)的IL-2培养基中10天。在第7以及10天，通过抗CD4以及抗CD8抗体连同抗CCR5 mAb 182的双重染色法以及FACS上的分析测定CD4以及CD8T淋巴细胞上的CCR5表面表达。第7天以及第10天的结果显示≥1nM浓度的RAPA下调所试验的5个供体中CD4淋巴细胞上CCR5的表面表达。0.1nM的RAPA下调来自一些而不是所有供体的CD4淋巴细胞上CCR5蛋白的表达。显示有效下调所有供体中CCR5的RAPA的浓度的第7天的代表性结果描述在图2B中。CD8淋巴细胞亚型上CCR5表达的类似减少是明显的，并且在第10天也观察到CCR5对CD4以及CD8淋巴细胞亚型的下调(数据未显示)。
在转录水平，分离自RAPA-处理的PBMC培养物的RNA的半定量RT-PCR分析显示药物存在下减少量的CCR5转录本(图2C的上图)。核糖体18S RNA的RT-PCR分析显示了在产生减少水平的CCR5转录本样本间类似的RNA含量(图2C的下图)。此外，无RT步骤时RNA样品的扩增不会显示扩增信号，由此排除了RNA制剂中细胞DNA污染的可能性(数据未显示)。
类似地，RAPA下调成熟单核细胞上CCR5的细胞表面表达。对在RPMI 20/10％ABHS以及RAPA存在下培养5天的单核细胞双重免疫染色CD14以及CCR5。在CD14-门控细胞中检验CCR5表面表达的改变。如图2D所示将由抗-CCR5mAb 182获得的免疫荧光分布图(实线)与IgG2b同种型对照的免疫荧光相比较(虚线)。在RAPA的存在下培养5天的单核细胞与未经药物处理的培养物相比显示减少水平的CCR5表面表达。利用来自3个不同供体的单核细胞的实验显示低达0.01nM的RAPA浓度时一致的CCR5表面表达的下调。这些结果显示RAPA减少CCR5在培养的T淋巴细胞(CD4以及CD8)以及单核细胞上的表面表达。连同PBMCs中的RT-PCR结果，这些结果显示RAPA通过降低基因转录干扰CCR5的表达。
实施例3RAPA提高PBMC培养物中MIP-1α以及MIP-1β的细胞外水平因为RAPA存在下培养的淋巴细胞以及单核细胞呈递减少水平的CCR5RNA以及蛋白，因此在RAPA-处理的PBMC培养物中测定CCR5配体MIP-1α，MIP-1β以及RANTES的水平。来自4个供体的PBMCs培养在IL-2以及RAPA存在下10天。在第10天，对每一供体测定表达CCR5的细胞的百分比以及上清液趋化因子的含量。如前述的实验，RAPA治疗引起CCR5蛋白表达水平的降低。当测定培养物上清液中的趋化因子含量时，人们发现所有4个供体中RAPA存在下MIP-1α以及MIP-1β的水平比不存在RAPA时高。在不同的供体之中，RAPA-处理的培养物包含比未处理的培养物高6-39倍的MIP-1α。类似地，在RAPA存在下与未处理的对照相比MIP-1β的水平提高17-47倍。相比之下，RAPA存在下RANTES的水平在2个供体中增加而在其他供体中保持不变乃至减少。图3A中图示了RAPA存在下显示不一致RANTES水平的供体中2个获得的趋化因子的结果。
为了确定RAPA-处理的细胞的上清液中检测的MIP-1α以及MIP-1β蛋白水平的提高是否是转录活性提高的结果，通过半定量RT-PCR对来自RAPA处理的以及未处理的培养物的总RNA进行扩增。用MIP-1α以及MIP-1β特异性引物对扩增在第3，7以及10天的培养物分离的RNA显示RAPA-处理的以及未处理的培养物之间趋化因子的转录本量没有差异(数据未显示)。这些数据暗示RAPA不通过增强趋化因子转录本的产量增加细胞外MIP-1α/β的水平。
上述显示RAPA处理细胞引起CCR5转录本(以及蛋白水平)量的减少不增强趋化因子转录本产量的结果暗示所观察到的MIP-1α/β蛋白的提高应归于RAPA处理的细胞上趋化因子吸收的缺乏。上述结果由RAPA对MIP-1β在来源于CCR5基因Δ32突变同型接合的供体的PBMCs培养物中分泌的影响的评价得以证实，所述MIP-1β是一种运用CCR5作为其唯一受体的趋化因子。在该MIP-1β不能被CCR5胞吞的实验组中，RAPA对MIP-1β蛋白水平的影响提供了关于RAPA提高β-趋化因子水平的机制的信息。为此，如前所述实验在RAPA存在下培养来自2个正常供体以及来自CCR5-无效供体的刺激的PBMCs。在第10天评价上清液中MIP-1β的水平。正常供体之一获得的代表性结果显示在图3B中紧接于CCR5-无效供体上获得的结果。在正常供体中，如前述实验所料RAPA处理引起MIP-1β蛋白水平的提高(与RAPA-未处理的对照相比提高9.3倍)。然而，在RAPA存在下CCR5-无效供体中MIP-1β水平只增加1.2倍。合起来，这些结果显示了RAPA存在下MIP-1β蛋白以及另外的MIP-1α水平的提高反映了由于呈递减少了CCR5共受体细胞的吸收水平的减低引起的趋化因子的累积。
实施例4PBMCs中RAPA的抗病毒活性分析感染之前在RAPA存在下培养7天的PBMCs中RAPA的抗病毒活性。细胞感染X4 HIV-1 IIIb以及R5 HIV-1 ADA株。受感染细胞在RAPA(与预处理期间相同的浓度)存在下另外培养7天，在该期间内测定病毒复制以及细胞存活力。在利用不同供体细胞的总共7个不同实验中，RAPA的抗病毒效果抗HIV-1 ADA比抗HIV-1 IIIb更有效。图4A所示的一个供体的结果显示10nM RAPA时7个实验中HIV-1 ADA抑制的平均值是91％(88-97％的)，而在100nM RAPA，HIV-1 ADA被抑制94％(92-99％的范围)。相比之下，10nM RAPA抑制13.5％(5-25％的范围)的HIV-1 IIIb，并且100nM RAPA抑制32％(29-60％的范围)的HIV-1 IIIb。
为了更进一步显示RAPA对R5比较X4 HIV-1株的不成比例的抗病毒效果，药物的抗病毒效果通过测定感染之后不久细胞中病毒DNA进行评价。已经在药物不存在或者存在(100nM RAPA)下培养1周的供体PBMCs感染DNase处理的R5 HIV-1ADA或者X4 HIV-1 IIIb母株。感染后24小时，制备细胞裂解物并且通过PCR扩增HIV-1的DNA序列。通过利用放射性标记探针检测扩增的PCR产物。如图4B所示，放射性信号的磷光影像分析仪分析显示HIV-1 IIIb DNA的含量在RAPA-处理的以及未处理的细胞中是相同的。相比之下，RAPA-处理的细胞中HIV-1 ADA DNA的含量比未处理的细胞中低3倍。β-肌动蛋白基因的特异性引物对显示样本间相同的DNA输入量(数据未显示)。
因为HIV-1 IIIb以及HIV-1 ADA获得的结果暗示RAPA在R5中比在X4 HIV-1中发挥更有效的抗病毒效果，然后评价低浓度RAPA(0.01，0.1以及1nM)抗5个HIV-1的R5株的试验组的抗病毒活性，结果显示在图4C中。RAPA在这些浓度下显示抗R5株的抗病毒活性但是不抗HIV-1 IIIb。0.01nM的RAPA根据毒株抑制10-64％的R5HIV-1，而0.1nM的RAPA抑制15-85％的病毒复制。1nM的RAPA抑制≥90％的所有R5病毒。合起来，这些结果显示RAPA降低了PBMCs对于由利用CCR5的HIV-1的毒株感染的敏感度而对利用CXCR4的毒株没有效果。
实施例5巨噬细胞中RAPA的抗病毒活性RAPA在MDMs中的抗病毒活性首先在显示下调CCR5表达的培养条件下进行分析(参见上述结果)。为此，在RAPA存在下培养供体单核细胞5天。在第5天，细胞感染了HIV-1 ADA。RAPA存在下培养受感染细胞另外的14天。感染后第7，10以及14天在培养上清液上测定病毒产量。在实验的最后通过MTT分析测定细胞存活力。实验期间，RAPA以剂量依赖的方式抑制病毒复制。在第14天，0.1-100nM浓度范围的RAPA抑制70-95％的病毒产生，如图5所示。实验最后的细胞存活力在RAPA浓度≥10nM时减少。在另外使用0.01nM RAPA的试验中，R5病毒HIV-1 ADA以及HIV-1 SF 162被分别抑制64％以及45％(数据未显示)。
上述实验中，在5-天分化期间已经用RAPA预先处理了单核细胞。为了控制RAPA对单核细胞分化过程的可能干扰，设计了新的感染试验其中在5-天单核细胞分化期间不存在RAPA。为此，在无RAPA时培养新鲜的单核细胞5天。在第5天，细胞感染HIV-1 ADA然后暴露于RAPA。在这些试验条件下，利用来自2个不同供体的单核细胞的2个独立试验显示在一个供体中1nM RAPA抑制～60％的病毒复制而在其它供体中抑制～80％的病毒复制(在感染后14天测定病毒产量；数据未显示)。
合起来，这些结果显示RAPA处理分化单核细胞干扰其成为HIV感染的易感目标的能力而且RAPA也干扰HIV在已经分化的巨噬细胞中复制的能力。
实施例6RAPA增强CCR5拮抗剂TAK-779的抗病毒活性进行检验确定RAPA存在下观察到的CCR5表面表达的下调是否提高CCR5拮抗剂药物的效力。为了检验这种假设，在RAPA不存在或者存在(1，10以及100nM)下将供体PBMCs培养在IL-2培养基中。7天后，在0.1nMTAK-779存在下将细胞感染HIV-1 ADA，0.1nM的TAK-779的药物浓度显示很低的抗病毒活性。RAPA存在下(与预处理期间相同的浓度)加0.1nM TAK-779培养受感染的细胞。感染后7天确定病毒产量。图6中显示的结果表明不存在RAPA时，0.1nM的TAK-779引起21％的病毒复制的抑制。然而，1nM RAPA存在下，TAK-779的抗病毒效果引起的病毒抑制从21％提高到74.5％。类似地，TAK-779的抗病毒活性在10以及100nM RAPA存在下病毒抑制分别增至89％以及96％。使用的TAK-779浓度不影响细胞存活力(数据未显示)。这些结果暗示CCR5拮抗剂药物的抗病毒特性通过RAPA得以增强。
图6中显示的结果图解了RAPA和TAK 779组合的协同效果。如上所述，0.1nM TAK-779显示较低的抗病毒活性并且图4所示的结果显示单独施用RAPA将P24的水平降低到毫微克/ml量。然而，两种化合物的组合将p24的水平降低到微微克/ml。由此，该组合物提供了HIV-1复制的协同降低。
实施例7RAPA以及TAK-779降低HIV-1复制的协同活性用HU以及TAK-779的组合得以进一步显示。图7图解了HU协同增强CCR5拮抗剂TAK-779的抗病毒活性。在HU不存在或者存在(0以及10μM)下将供体PBMCs培养在IL-2培养基中。7天后，细胞感染HIV-1ADA。HU存在下(与预处理相同的浓度)加0，2以及20nM范围的不同浓度的TAK-779培养受感染细胞。感染后7天确定病毒产量。TAK-779以及HU的组合显示无HU以及TAK-799时p24的值为大约5000微微克/ml。导入10μM的HU将p24的水平降低大约60％。引入2nM的TAK-779将p24的水平降低约20％。然而，10μM的HU以及2nM的TAK-779的组合引起大约90％p24的总下降，由此显示该组合物引起p24水平的协同减少并且提高了CCR5拮抗剂TAK-779的活性。因此，这些结果显示了CCR5拮抗剂活性的协同增加。
实施例8为了确定HU对正常供体淋巴细胞上CCR5表面表达的效果，将新鲜的供体PBMCs培养在逐渐提高浓度的HU(0，50，100以及200μM)的IL-2培养基中10天。在第7以及10天，通过抗-CD4以及抗-CD8抗体连同抗-CCR5 mAb 182的双重染色法以及FACS上的分析测定CD4以及CD8T淋巴细胞上的CCR5表面表达。第7天以及第10天的结果显示≥50μM的HU浓度下调5个实验供体中CD4淋巴细胞上的CCR5表面表达。在转录水平，分离自HU-处理的PBMC培养物的RNA的半定量RT-PCR分析显示药物存在下减少量的CCR5转录本(图8B的上图)。核糖体18S RNA的RT-PCR分析显示了在产生减少水平的CCR5转录本样本间类似的RNA含量(图8B的下图)。
实施例9对由于减低呈递减少表达水平的CCR5共受体吸收的慢性HIV感染HIV-1志愿者，雷帕霉素对趋化因子受体5(CCR5)的表达以及趋化因子MIP 1α，MIP-1β以及RANTES的积累的体内效果已经显示在大多数情况下利用趋化因子受体CCR5作为进入巨噬细胞以及CD4淋巴细胞的共受体。CCR5共受体的天然配体为称作β-趋化因子的蛋白。在如上所述的体外模型中，据证实雷帕霉素以及其他包括羟基脲的G1细胞周期剂如图2B-C以及8A-B所示显著降低CCR5表面受体的表达。
为了评价CCR5的表达活性及其对CCR5受体的体内作用水平，进行开放标记非随机化的概念验证(Proof of concept)试验，其中已经感染HIV的8名志愿者施用2mg/天的雷帕霉素，接着6mg的负荷剂量28天。在雷帕霉素施用的第7，14以及28天以及42天(在最后剂量的雷帕霉素后2个星期)的设盲访问时获得外周血确定CCR5的表达水平。8名受试者参加本研究并且迄今为止已经完成3名志愿者的实验并且雷帕霉素得以良好耐受。
图9图示了在这个试验期间感染HIV的志愿者体内观察到的CCR5表达的改变。所有3名志愿者显示与施用RAPA相关的最后28天CCR5表达的减少。显而易见，志愿者001以及006经历了CCR5表达几乎立即的减少而志愿者007经历了在处理后期的减少。因此，用G1-特异性试剂，雷帕霉素改变外周血单核细胞的细胞周期引起已经建立了HIV感染的HIV感染志愿者体内CCR5的RNA表达的减少；并且这种药剂可被良好耐受。
RAPA靶向诸如CCR5的细胞组分与靶向病毒本身相比提供了不可能引起病毒抗性的抗病毒策略，因为细胞组分不期望在药物迫使下突变。体外试验暗示了RAPA可能比控制HIV-1的X4株更有效控制HIV-1的R5株的复制。在这方面，治疗使用RAPA作为早期HIV-1疾病的治疗方案(出现X4株之前)非常有价值，尤其是考虑到当前提倡延缓抗逆转录病毒治疗开始的原则(Dybul，2002)。此外，RAPA的抗病毒特性尤其适于存在HIV-1 C亚型的地理区，因为这些病毒使用CCR5作为主要的共受体(Bjornal，1999)。过去的十年间HIV-1 C亚型感染已经开始流行，并且他们目前构成了世界范围内的主要亚型(Essex，M.(1999)。
而且，RAPA的抗病毒特性给经历实质器官移植的HIV感染受试者提供了抑制同种异体移植排斥的新的治疗机会。RAPA的抗病毒特性联合其抗血管生成特性(Guba，2002)暗示RAPA给经历器官移植的HIV患者提供了较好的选择。
总之，RAPA下调CCR5共受体表达以及增加β-趋化因子的细胞外水平的能力给HIV-1感染的治疗以及预防提供了具有重要意义的新策略。RAPA以及CCR5拮抗剂的组合可尤其有效控制患者体内的病毒复制。
参考文献本发明所有引用的参考文献都在此处引入作为通用的参考。
Andrieu，J.，Even，P.&Tourani，J.(1998)in Autoimmune Aspects ofHIV Infection，eds.Andrieu，J.-M.，Bach，J.-F.&Even，P.(R.Soc.Med.Services，London)，pp.191-194.
Baba，M.，Nishimura，O.，Kanzaki，N.，Okamoto，M.，Sawada，H.，Iizawa，Y.，Shiraishi，M.，Aramaki，Y.，Okonogi，K.，Ogawa，Y.，et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，5698-5703.
Baba，M.，Imai，T.，Yoshida，T.&Yoshie，O.(1996)Int.J.Cancer 66，124-129.
Bleul，C.，Wu，L.，Hoxie，J.，Springer，T.&Mackay，C.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，1925-1930.
Bjornal，A.，Sonnerborg，A.，Tscherning，C.，Albert，J.&Fenyo，E.(1999)AIDS Res.Hum.Retroviruses 15，647-653.
Calabrese，L.，Lederman，M.，Spritzler，J.，Coombs，R.，Fox，L.，Schock，B.，Yen-Lieberman，B.，Johnson，R.，Mildvan，D.&Parekh，N.(2002)J.Acquired Immune Defic.Syndr.29，356-362.
Cocchi，F.，DeVico，A.，Garzino-Demo，A.，Arya，S.，Gallo，R.&Lusso，P.(1995)Science 270，1811-1815.
Dybul，M.，Fauci，A.，Barlett，J.，Kaplan，J.&Pau，A.(2002)Ann.Intern.Med.137，381-433.
Essex，M.(1999)Adv.Virus Res.53，71-88.
Guba，M.，von Breitenbuch，P.，Steinbauer，M.，Koehl，G.，Flegel，S.，Hornung，M.，Bruns，C.J.，Zuelke，C.，Farkas，S.，Anthuber，M.，et al.(2002)Nat.Med.8，128-135.
Heredia，A；Amoroso，A；Davis，C.；Le，N.；Readon，E.；Klingebiel，E.；Gallo，R.C；and Redfield R.R.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(18)10411-10416..
Heredia，A.，Davis，C.，Amoroso，A.，Dominique，J.，Le，N.，Klingebiel，E.，Reardon，E.，Zella，D.&Redfield，R.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，4179-4184.
Kahan，B.&Camardo，J.(2001)Transplantation 72，1181-1193.
Kinter，A.，Poli，G.，Fox，L.，Hardy，E.&Fauci，A.(1995)J.Immunol.154，2448-2459.
Lane，B.，Markovitz，D.，Woodford，N.，Rochford，R.，Strieter，R.&Coffey，M.(1999)J.Immunol.163，3653-3661.
Levine，B.，Mosca，J.，Riley，J.，Carroll，R.G.，Vahey，M.T.，Jagodzinski，L.L.，Wagner，K.F.，Mayers，D.L.，Burke，D.S.，Weislow，O.S.，et al.(1996)Science 272，1939-1943.
Liu，R.，Paxton，W.，Choe，S.，Ceradini，D.，Martin，S.，Horuk，R.，MacDonald，M.，Stuhlmann，H.，Koup，R.&Landau，N.(1996)Cell 86，367-377.
Lin，Y.-L.，Mettling，C.，Portales，P.，Reynes，J.，Clot，J.&Corbeau，P.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，15590-15595.
Loetscher，P.，Seitz，M.，Baggiolini，M.&Moser，B.(1996)J.Exp.Med.184，569-577.
Lori，F.，Malykh，A.，Cara，A.，Sun，D.，Weinstein，J.N.，Lisziewicz，J.& Gallo，R.C.(1994)Science 266，801-805.
Perno，C.&Yarchoan，R.(1993)in Current Protocols in Immunology，eds.Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.&Strober，W.(Wiley，New York)，pp.12.4.1-12.4.11.
Poli，G.&Fauci，A.(1993)in Current Protocols in Immunology，eds.Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.&Strober，W.(Wiley，New York)，pp.12.3.1-12.3.7.
Poon，M.，Badimon，J.&Fuster，V.(2002)Lancet 359，619-622.
Rizzardi，G.，Harari，A.，Capiluppi，B.，Tambussi，G.，Ellefsen，K.，Ciuffreda，D.，Champagne，P.，Bart，P.，Chave，J.，Lazzarin，A.&Pantaleo，G.(2002)Clin.Invest.109，681-688.
Roy，J.，Sèbastien，J.，Fortin，J.&Tremblay，M.(2002)Antimicrob.Agents Chemother.46，3447-3455.
Sehgal，S.-N.(1998)Clin.Biochem.31，335-340.
Simmons，G.，Clapham，P.，Picard，L.，Offord，R.E.，Rosenkilde，M.M.，Schwartz，T.W.，Buser，R.，Wells，T.N.&Proudfoot，A.E.(1997)Science 276，276-279.
Spina，C.，Guatelli，J.&Richman，D.(1995)J.Virol.69，2977-2988.
Strizki，J.，Xu，S.，Wagner，N.，Wojcik，L.，Liu，J.，Hou，Y.，Endres，M.，Palani，A.，Shapiro，S.，Clader，J.W.，et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，12718-12723.
Trkola，A.，Kuhmann，S.，Strizki，J.，Maxwell，E.，Ketas，T.，Morgan，T.，Pugach，P.，Xu，S.，Wojcik，L.，Tagat，J.，et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，395-400.
Ullman，K.，Northrop，J.，Verweij，C.&Crabtree，G.(1990)Annu.Rev.Immunol.8，421-452.
Ward，S.，Bacon，K.&Westick，J.(1998)Immunity 9，1-11.
Weissman，D.，Dybul，M.，Daucher，M.，Davey，R.，Walker，R.& Kovacs，J.(2000)J.Infect.Dis.181，933-938.
Willey，R.，Smith，D.，Lasky，L.，Theodore，T.，Earl，P.，Moss，B.，Capon，D.&Martin，M.(1988)J.Virol.62，139-147.
Zack，J.，Arrigo，S.，Weitsman，S.，Go，A.，Haislip，A.&Chen，I.(1990)Cell 61，213-222.
Zella，D.，Riva，A.，Weichold，F.，Reitz，M.&Gerna，G.(1998)Immunol.Lett.62，45-49.
权利要求
1.用于降低CCR5表面受体在单核细胞上的表达的药物组合物，所述组合物包括治疗有效量的至少一种G1期停滞化合物。
2.权利要求1的药物组合物，更进一步包括至少一种抗病毒剂。
3.权利要求1的药物组合物，其中的G1期停滞化合物为选自如下组分的成员丁酸钠，阿非迪霉素，羟基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
4.权利要求2的药物组合物，其中的抗病毒剂为HIV抗病毒剂。
5.权利要求4的药物组合物，其中的HIV抗病毒剂为核苷RT抑制剂，CCR5抑制剂/拮抗剂，病毒进入抑制剂或者其功能等效物。
6.权利要求2的药物组合物，其中的抗病毒剂为至少一种选自如下的成分叠氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(3TC)，双脱氧胸苷(d4T)，2′，3′-双脱氧肌苷(ddl)，2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)，阿巴卡韦(ABC)，Emirivine(FTC)，替诺福韦(TDF)，德拉维拉丁(DLV)，依法韦伦(EFV)，奈韦拉平(NVP)，Fuzeon(T-20)，沙奎那维(SQV)，利托那韦(RTV)，茚地那韦(IDV)，奈非那韦(NFV)，安普那韦(APV)，洛匹那韦(LPV)，阿扎那韦，双汰芝(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三协唯(ZDV/3TC/ABC)，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857，单克隆抗体，NB-2，NB-64，T-649，T-1249及其功能类似物。
7.权利要求4的药物组合物，其中的化合物经口服，直肠，经鼻，局部，经阴道或者肠胃外施用。
8.权利要求1的药物组合物，其中的G1期停滞剂为RAPA或者HU。
9.用于通过减少CCR5表面受体在单核细胞上的表达降低人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染的作用的药物组合物，所述组合物包括治疗有效量的雷帕霉素。
10.权利要求9的药物组合物，其中雷帕霉素的治疗有效量为从约5mg/kg到约50mg/kg每天。
11.诱导活化淋巴细胞中抗-HIVβ-趋化因子的水平提高的方法，该方法包括施用包括至少一种有效量的G1期停滞剂以减少CCR5表面受体的表达的组合物，其中CCR5表面受体水平的减少降低HIV的病毒进入。
12.权利要求11的方法，其中的G1期停滞剂为选自如下组分的成员丁酸钠，阿非迪霉素，羟基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
13.权利要求11的方法，其中的G1期停滞剂为RAPA。
14.权利要求11的方法，更进一步包括至少一种HIV抗病毒剂。
15.权利要求14的方法，其中的HIV抗病毒剂为核苷RT抑制剂，CCR5抑制剂/拮抗剂，病毒进入抑制剂或者其功能等效物。
16.权利要求13的方法，其中的抗病毒剂为选自如下组分的成员叠氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(3TC)，双脱氧胸苷(d4T)，2′，3′-双脱氧肌苷(ddl)，2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)，阿巴卡韦(ABC)，Emirivine(FTC)，替诺福韦(TDF)，德拉维拉丁(DLV)，依法韦伦(EFV)，奈韦拉平(NVP)，Fuzeon(T-20)，沙奎那维(SQV)，利托那韦(RTV)，茚地那韦(IDV)，奈非那韦(NFV)，安普那韦(APV)，洛匹那韦(LPV)，阿扎那韦，双汰芝(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三协唯(ZDV/3TC/ABC)，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857，单克隆抗体，NB-2，NB-64，T-649，T-1249及其功能类似物。
17.权利要求13的方法，其中的化合物经口服，直肠，经鼻，局部，经阴道或者肠胃外施用。
18.抗依赖于CCR5表面受体水平的病毒感染的有效治疗的方法，该方法包括给受试者施用包括G1期停滞化合物的治疗有效量组合物以抑制CCR5表达由此降低CCR5的表面受体以及病毒感染的复制。
19.权利要求18的方法，其中的G1期停滞化合物为选自如下组分的成员丁酸钠，阿非迪霉素，羟基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
20.权利要求18的方法，更进一步包括施用有效量的至少一种HIV抗病毒剂。
21.权利要求20的方法，其中的抗病毒剂为核苷RT抑制剂，CCR5抑制剂/拮抗剂，病毒进入抑制剂或者其功能等效物。
22.权利要求21的方法，其中的抗病毒剂为至少一种选自如下的成分叠氮胸苷(ZDV，AZT)，拉夫米定(3TC)，双脱氧胸苷(d4T)，2′，3′-双脱氧肌苷(ddl)，2′，3′-双脱氧胞苷(ddC)，阿巴卡韦(ABC)，Emirivine(FTC)，替诺福韦(TDF)，德拉维拉丁(DLV)，依法韦伦(EFV)，奈韦拉平(NVP)，Fuzeon(T-20)，沙奎那维(SQV)，利托那韦(RTV)，茚地那韦(IDV)，奈非那韦(NFV)，安普那韦(APV)，洛匹那韦(LPV)，阿扎那韦，双汰芝(ZDV/3TC)，Kaletra(RTV/LPV)，三协唯(ZDV/3TC/ABC)，SCH-C，SCH-D，PRO 140，TAK 779，TAK-220，RANTES类似物，AK602，UK-427，857，单克隆抗体，NB-2，NB-64，T-649，T-1249及其功能类似物。
23.权利要求18的方法，更进一步包括施用有效量的HIV疫苗。
24.权利要求23的方法，其中的HIV疫苗以及G1期停滞剂同时施用。
25.保持HIV感染的病毒控制的方法，该方法包括施用至少一种有效量的G1期停滞化合物以使CCR5表面受体的表达以降低HIV gp120的结合位点的量降低。
26.权利要求25的方法，其中的G1期停滞化合物为选自如下组分的成员丁酸钠，阿非迪霉素，羟基脲(HU)，olomoucine，roscovitine，生育酚，生育三烯酚以及雷帕霉素(RAPA)。
27.权利要求25的方法，其中的G1期停滞剂为雷帕霉素。
28.包括G1期停滞剂以及CCR5拮抗剂化合物的药物组合物，其中的G1期停滞剂为雷帕霉素或者羟基脲。
29.权利要求28的药物组合物，其中的CCR5拮抗剂化合物为TAK-779。
30.权利要求29的药物组合物，其中雷帕霉素或者羟基脲的量足以协同增强TAK-779的活性。
31.协同增强CCR5拮抗剂化合物的活性的方法，该方法包括与G1期停滞剂组合施用CCR5拮抗剂化合物。
32.权利要求31的方法，其中的CCR5拮抗剂化合物为TAK-779并且G1期停滞剂为雷帕霉素或者羟基脲。
全文摘要
本发明涉及通过施用将细胞周期停滞在G1期的组合物操纵活化淋巴细胞中的细胞周期下调表面受体CCR5的表达，由此降低HIV进入T细胞的受体部位，并且因此降低HIV的作用。更进一步，本发明公开了组合物，所述组合物包括G1期停滞剂以及抗病毒剂，其中所述组合物协同增强抗病毒剂的活性。
文档编号A61K31/17GK1805740SQ200480016720
公开日2006年7月19日 申请日期2004年5月17日 优先权日2003年5月16日
发明者罗伯特·R·雷德菲尔德, 安东尼·阿莫罗索, 查尔斯·E·戴维斯, 阿隆萨·埃雷迪亚 申请人:马里兰大学生物技术研究所