专利名称：兔抗人marveld1多肽多克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生命科学，具体说就是一种兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体及其制 备方法。
(二)
背景技术：
MARVELD1基因最初从人肺上皮细胞中分离得到的，研究发现其参与了细胞微丝 的组装调控，而且在多种组织中表达。该基因曾被命名为P18基因，且根据其参与了微丝 组装和细胞粘附的特性申请了专利(专利号ZL200610009776.5)。进一步的研究发现 MARVELD1在多种肿瘤中表达下调，且参与了细胞对紫外线辐射耐受的响应性表达。目前关 于MARVELD1蛋白的抗体尚无商业化产品，限制了对MARVELD1蛋白生物学功能的深入分析。
(三)
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与细胞内源性的MARVELD1蛋白
发生特异性结合反应的兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体及其制备方法。 本发明的目的是这样实现的所述的MARVELD1多肽的氨基酸序列为ProProProArgGlnProProProGlnAlaArgAlaAlaArgCys 。 所述的兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体的制备方法，步骤如下 步骤一 经DNAStar软件分析后，确定MARVELD1蛋白N末端4-17位14个氨基酸
作为其抗原表位，氨基酸序列为权利要求1所述； 步骤二 用多肽自动合成仪合成MARVELD1多肽，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成 MARVELD1多肽-KLH复合蛋白； 步骤三将乳化后的MARVELD1多肽-KLH在兔背部皮下注射，共进行四次免疫； 步骤四收集、分离得到含有兔抗人MARVELD1多肽抗体的血清； 步骤五将MARVELD1多肽与溴化氰活化的S印harose 4B偶联，制备多肽亲和层析
柱； 步骤六将含有兔抗人MARVELD1多肽抗体的血清加入到步骤五制备的层析柱中， 放置于4。C孵育过夜后，洗脱抗体，即得到抗人MARVELD1多肽抗体。
本发明还有以下技术特征 (1)所述的MARVELD1多肽的纯化，采用HPLC对其进行纯化，使MARVELD1多肽的纯 度达到95%以上。 (2)所述的免疫次数为四次。 (3)采用免疫亲和纯化的方式对兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体进行纯化。
(4)所述的兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体，效价在1 : 50000以上。
本发明制备的抗MARVELD1多克隆抗体具有特异性好、纯度高的特点，可与细胞 内源性的MARVELD1蛋白发生特异性结合反应，可用于免疫组化、免疫印迹等实验的要求， 用于建立体外免疫分析。本发明兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体的制备，为深入研究MARVELDl蛋白的生物学功能和肿瘤诊断提供了一个重要的工具，具有重要的理论意义和临 床价值。
(四)
图1为本发明采用DNAStar 7. 0软件对MARVELDl蛋白序列的分析结果图；包括抗 原指数分析和表面可能区； 图2为本发明的HPLC分析MARVELD1抗原肽的纯度图；图中各峰面积计算得出目 标多肽的纯度为95.6% ; 图3为本发明的兔抗人MARVELDl抗体效价测定的结果图；设定样品0D450值为空 白对照0D450值的2倍以上为有效稀释度，据此测得兔抗MARVELDl多肽多克隆抗体的最大 效价为1 : 512000 ; 图4为本发明的免疫杂交检测兔抗MARVELD1多肽多克隆抗体的特异性结果图；图 中1道为转染对照空载体的细胞裂解液，2道为转染pcDNA3. l/V5-His-T0P0-MARVELDl重 组体的细胞裂解液，箭头所示为MARVELD1-V5融合蛋白条带。
(五)
具体实施例方式
下面结合附图举例对本发明作进一步说明。 实施例1 :结合图1-图4，本发明一种兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体及其制备 方法，所述的MARVELDl多肽的氨基酸序列为ProProProArgGlnProProProGlnAlaArgAlaAl aArgCys。 所述的兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体的制备方法，步骤如下 步骤一 经DNAStar软件分析后，确定MARVELDl蛋白N末端4-17位14个氨基酸
作为其抗原表位，氨基酸序列为权利要求1所述； 步骤二 用多肽自动合成仪合成MARVELDl多肽，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成 MARVELDl多肽-KLH复合蛋白； 步骤三将乳化后的MARVELDl多肽_KLH在兔背部皮下注射，共进行四次免疫； 步骤四收集、分离得到含有兔抗人MARVELDl多肽抗体的血清； 步骤五将MARVELDl多肽与溴化氰活化的S印harose 4B偶联，制备多肽亲和层析
柱； 步骤六将含有兔抗人MARVELDl多肽抗体的血清加入到步骤五制备的层析柱中， 放置于4。C孵育过夜后，洗脱抗体，即得到抗人MARVELDl多肽抗体。
本发明还有以下技术特征 (1)所述的MARVELDl多肽的纯化，采用HPLC对其进行纯化，使MARVELDl多肽的纯 度达到95%以上。 (2)所述的免疫次数为四次。 (3)采用免疫亲和纯化的方式对兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体进行纯化。
(4)所述的兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体，效价在1 : 50000以上。
实施例2 :结合图1-图4，本发明一种兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体及其制备 方法，具体实施方案如下
实施方案一 MARVELD 1抗原肽序列的确定。用DNAStar 7. 0蛋白分析软件对 MARVELDl蛋白氨基酸序列进行抗原指数(Antigeniclndex)和表面可能行区(Surface Probability Plot)进行分析，确定第4到第17位氨基酸为靶位序列。同时为便于将多肽 与载体蛋白进行交联，在多肽羧基末端附加一半胱氨酸，最终确定多肽的氨基酸序列为Pro ProProArgGlnProProProGlnAlaArgAlaAlaArgCys。
实施方案二 抗原肽的合成、纯度鉴定及与载体蛋白的交联。 在全自动多肽合成仪上合成多肽。对粗品采用高效液相色谱法和Kromasil 公司的C18柱进行纯化及纯度分析。载体蛋白选择钥孔慽血兰蛋白(keyhole limpet hemocyanin， KLH)，将纯化多肽与KLH用间-马来酰亚胺苯甲酸_N_羟基琥珀酰亚胺酯 (MBS)进行交联。用5mg KLH和5mg多肽进行反应，室温反应3小时，然后将反应混合物对 1 XPBS (磷酸盐缓冲液)在4。C条件下透析过夜，既得MARVELDl多肽-KLH复合物。
实施方案三实验动物的免疫。 将400 ii g的KLH-多肽复合物溶于500 y 1的PBS溶液中，与等体积的完全福氏佐 剂混合均匀。免疫动物选取适龄新西兰白兔，背部皮内进行多点注射。其后每隔两周进行 加强免疫，加强免疫所用的KLH-多肽复合物的量为200 g，并改用不完全福式佐剂乳化抗 原，共进行三次加强免疫。然后采用颈动脉放血的方式收集动物血液，并制备血清。
实施方案四MARVELD1多肽亲和层析柱的制备。 取lg CNBr活化的S印harose 4B琼脂糖凝胶珠，用lmmol/L HC1进行预处理后， 再用偶联缓冲液(0. lmol/L NaHC03，0. 5mol/L NaCl，pH 8. 3)洗2次，并与溶于10ml偶联缓 冲液的700 g MARVELDl多肽进行混合，于4"C条件下旋转混合过夜。用乙醇胺封闭多余的 活性基团后，用不同pH值的缓冲液轮换清洗5次，每轮先用含有0. 5mol/LNaCl的0. lmol/L acetic acid/sodium acetate,pH4. 0溶液进行清洗，然后用含有0. 5mol/L NaCl的O. lmol/ L Tris-HCl， pH8.0溶液清洗。最后用1 XPBS清洗凝胶，制备好的凝胶保存于1 XPBS中， 并加入终浓度为0. 02%的叠氮钠，41:保存。
实施方案五免疫亲和层析纯化抗MARVELDl多肽抗体。 将10ml由实施方案三制备的兔血清与1ml偶联多肽的凝胶混合，在4。C条件下旋 转混合。混合4小时后，将凝胶加入层析柱，弃去流出液，用10ml 1XPBS反复冲洗凝胶3 次。冲洗完毕后向层析柱中加入1ml的甘氨酸缓冲液(0. lmol/L，pH2. 8)洗脱结合的抗体， 共进行5次洗脱。向洗脱液中加入100 ill的2mol/L Tris-HCl， pH7. 5缓冲液调整溶液的pH 值。分离结束后，用3倍柱体积的高pH值的缓冲液(0. lmol/L Tris-HCl，O. 5mol/L NaCl， pH8. 5)和低pH值的缓冲液(0. lmol/LNaAc，0. 5mol/L NaCl， pH4. 5)再生柱，至少洗3轮， 然后用含有0.02%叠氮钠的水清洗。再生后的亲和柱可重复使用。
实施方案六间接ELISA法测定抗体的效价。 将KLH-MARVELD1多肽复合物包被ELISA板，4t:条件下包被过夜。然后用10% 的山羊血清室温封闭2小时，接着用不同稀释浓度的由实施方案五制备的抗体，稀释
比例为i : iooo、 i : 2000、 i : 40oo、i : sooo、i : 16000、1 : 32000、 i : 64000、
1 : 128000、1 : 256000和1 : 512000，再加入辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗兔二抗，用PBS洗去未结合的二抗后，加入四甲基联苯胺(3， 3'，5， 5， -Tetramethylbenzidine， TMB)进行显色反应，硫酸终止反应后测定450nm波长的吸光
5值。
实施方案七免疫印迹实验确定抗体的特异性。 将全长MARVELD1基因编码区克隆至pcDNA3. l/V5-His_T0P0载体，并将重组体转 入HEK293细胞。用细胞裂解液进行抗体的免疫印迹分析，同时以转入空pcDNA3. 1载体的 细胞裂解液作为对照。细胞裂解液经电泳、转膜和封闭后，向5%脱脂奶粉的封闭液中加入 制备的兔抗MARVELD1多克隆抗体，终浓度为1 y g/ml。室温孵育2小时，用PBST摇洗3次 后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗进行室温孵育1小时。清洗后用化学发光底 物进行显色并用X-光片进行显影。
序列表
〈110〉哈尔滨工业大学 〈120〉兔抗人MARVELD1多克隆抗体的制备与应用 〈160>1 〈210>1 〈211〉 15 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈400〉 1Pro Pro Pro Arg Gin Pro Pro Pro Gin Ala Arg Ala Ala Arg Cys
15 10 1权利要求
一种MARVELD1多肽，其特征在于MARVELD1多肽的氨基酸序列为ProProProArgGlnProProProGlnAlaArgAlaAlaArgCys。
2. —种兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤如下 步骤一 经DNAStar软件分析后，确定MARVELDl蛋白N末端4_17位14个氨基酸作为其抗原表位，氨基酸序列为权利要求1所述；步骤二 用多肽自动合成仪合成MARVELDl多肽，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成 MARVELDl多肽-KLH复合蛋白；步骤三将乳化后的MARVELDl多肽-KLH在兔背部皮下注射，共进行四次免疫； 步骤四收集、分离得到含有兔抗人MARVELDl多肽抗体的血清；步骤五将MARVELDl多肽与溴化氰活化的S印harose 4B偶联，制备多肽亲和层析柱； 步骤六将含有兔抗人MARVELDl多肽抗体的血清加入到步骤五制备的层析柱中，放置 于4。C孵育过夜后，洗脱抗体，即得到抗人MARVELDl多肽抗体。
3. 根据权利要求2所述的兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的MARVELDl多肽的纯化，采用HPLC对其进行纯化，使MARVELDl多肽的纯度达到95% 以上。
4. 根据权利要求2所述的兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的免疫次数为四次。
5. 根据权利要求2所述的兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于 步骤六采用免疫亲和纯化的方式对兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体进行纯化。
6. —种兔抗人MARVELDl多肽多克隆抗体，其特征在于该抗体效价在1 : 50000以上。
全文摘要
本发明提供一种特异性好、纯度高、可与细胞内源性的MARVELD1蛋白发生特异性结合反应的兔抗人MARVELD1多肽多克隆抗体及其制备方法。所述的MARVELD1多肽的氨基酸序列为ProProProArgGlnProProProGlnAlaArgAlaAlaArgCys。步骤如下经DNAStar软件分析后，确定MARVELD1蛋白N末端4-17位14个氨基酸作为其抗原表位，将含有兔抗人MARVELD1多肽抗体的血清加入到层析柱中，放置于4℃孵育过夜后，洗脱抗体，即得到抗人MARVELD1多肽抗体。本发明具有特异性好、纯度高的特点，可与细胞内源性的MARVELD1蛋白发生特异性结合反应，可用于免疫组化、免疫印迹等实验的要求，用于建立体外免疫分析。
文档编号C07K7/08GK101747415SQ20101003246
公开日2010年6月23日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日
发明者史明, 李钰, 王山, 胡建燃, 韩放 申请人:哈尔滨工业大学