专利名称：：结核分枝杆菌抗原限制性表位肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有抗结核的治疗性活性肽，尤其是涉及一种结核分枝杆菌抗原限制性表位肽。
背景技术：
：结核病治疗性多肽疫苗发展的前提基础是结核杆菌抗原的发现及其细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的鉴定。结核抗原表位的鉴定，是设计基于CTL表位的结核多肽疫苗的重要途径。Rvl410c为结核杆菌的耐药相关蛋白，含有518个氨基酸，其基因在P25位点。已有报道指出，Rvl410c蛋白的功能可能为耐药泵，存在于细胞膜上，其对氨基糖类抗生素与四环素有抗性作用，并证明其对利血平耐药性与对溴化乙锭敏感性都有一定作用。近年来研究发现，CD8+CTL在抗结核感染保护性应答中起着重要和独特的作用，CD8+CTL对靶细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-I类分子结合的特异性抗原表位，即细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)表位。由一个或数个不同保护性抗原组成的融合蛋白亚单位疫苗以及抗原肽多表位疫苗占了目前全世界正在研究的170多种结核疫苗的大部分。保护效果优于卡介苗且副作用小的亚单位疫苗将可能成为卡介苗的理想替代品。研究表明细胞免疫对结核杆菌感染具有保护性作用。在大多数感染中，细胞免疫反应是由识别并结合的肽或非肽抗原决定的，最终在机体内出现相对有限的数个病原特异性细胞免疫应答，即免疫优势反应，因此鉴定这些具有保护性作用的抗原优势表位是设计有效疫苗的重要步骤。由于CD8+T细胞识别抗原受等位基因MHC-I(HLA)的限制，筛选潜在的疫苗候选表位需要考虑到HLA限制性，以确保绝大多数人群中的抗原识别。由于个体内仅存在少数几个型别的MHC-I类分子，而每个MHC-I类分子可与一系列同种类的抗原肽结合进而形成多种多样的MHC-肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。因此，筛选具有一定亲和力与MHC-I类分子有效结合的表位肽，是诱导特异性细胞免疫应答的一个重要环节。
发明内容本发明的目的在于提供一种具有一定亲和力与MHC-I类分子有效结合的结核分枝杆菌抗原限制性表位肽。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案本发明所述的结核分枝杆菌抗原限制性表位肽，它包括候选肽P510、P452和P470，所述候选肽P510的氨基酸序列为TLAPQVEPL，分子量为967;所述候选肽P452的氨基酸序列为SLLDRAAAI，分子量为043;所述候选肽P470的氨基酸序列为LMYGEIFTI，分子量为1108。本发明的优点在于利用结核杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核的治疗性活性肽，鉴定的上述候选肽均未见文献报道，不仅为研制基于Rvl410c抗原的结核疫苗提供了理论基础，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息，为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定了基础。本发明运用Pubmed提供的结核杆菌的蛋白质组数据库，筛选结核杆菌耐药蛋白，选取免疫原性强的保护性抗原进行BLAST同源性分析，其中与人类的蛋白质同源性差异大于50%的蛋白质作为候选的抗原。最终确定结核杆菌耐药蛋白Rvl410c作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL1.2数据库对此蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位进行了预测分析，见表1。表1Rvl410c抗原HLA-A2以及HLA-A3限制性CTL表位预测蛋白位置序列SYFPEITHIBIMASNetCTL<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>从表1中可以看出在预测中，当A2的结合力在25分以上时，这些表位肽都将会成为我们将来所要研究的潜在的结核抗原表位疫苗。图l-a，图l-b是本发明候选肽的合成流程图。图2-a，图2-b，图2-c分别是候选肽P510、P452和P470的质谱鉴定图。图3-a，图3-b，图3-c分别是候选肽P510、P452和P470的细胞流式图。具体实施例方式本发明所述的结核分枝杆菌抗原限制性表位肽，它包括候选肽P510、P452和P470，所述候选肽P510的氨基酸序列为TLAPQVEPL(Thr-Leu-Ala-Pro-Qln-Val-Elu-Pro-Leu)，分子量为967;所述候选肽P452的氨基酸序列为SLLERAAAI(Ser-Leu-Leu-Elu-Arg-Ala-Ala-Ala-Ile)，分子量为943;所述候选肽P470的氨基酸序列为LMYGEIFTI(Leu-Met-Tyr-Gly-Glu-Ile-Phe-Thr-Ile)，分子量为1108。本发明表位肽采用标准Fmoc方案进行合成，如图l-a，图l_b所示，首先通过树脂与目的多肽的第一位带保护基的氨基酸在一定条件下进行縮合，随后脱掉保护基，加入第二个氨基酸进行縮合。重复以上步骤，直到加入第九个氨基酸，脱掉其保护基后，利用切割试剂把九肽从树脂上切下得到粗肽。经HPLC纯化后，其纯度大于95%，得到精肽。质谱分析并证实其分子量符合理论值。肽质谱鉴定图见图2-a，图2-b，图2-c。肽/MHC结合力分析利用流式细胞术检测待测肽与T2A2细胞的结合力，见图3-a，图3-b，图3-c。候选肽与HLA-A*0201结合活性见表2。表2候选肽与HLA_A*0201结合力及稳定性试验结果FIa_1.980.40.38P510P452P470FIa=(表位肽平均荧光强度_背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度，如果FI>1.5:候选肽与HLA-A*0201/03具有强结合力；1.5>FI>1.0:中等结合力；FI<0.5:弱结合力从表2中可以看出，候选肽P510与T2A2细胞的结合力较高，候选肽P452、P470与T2A2细胞的结合力较低一些。附氨基酸縮写表5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种结核分枝杆菌抗原限制性表位肽，其特征在于它包括候选肽P510、P452和P470，所述候选肽P510的氨基酸序列为TLAPQVEPL，分子量为967；所述候选肽P452的氨基酸序列为SLLERAAAI，分子量为943；所述候选肽P470的氨基酸序列为LMYGEIFTI，分子量为1108。全文摘要本发明公开了一种结核分枝杆菌抗原限制性表位肽，它包括候选肽P510、P452和P470，所述候选肽P510的氨基酸序列为TLAPQVEPL，分子量为967；所述候选肽P452的氨基酸序列为SLLERAAAI，分子量为943；所述候选肽P470的氨基酸序列为LMYGEIFTI，分子量为1108。本发明的优点在于利用结核杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核的治疗性活性肽，鉴定的上述候选肽均未见文献报道，不仅为研制基于Rv1410c抗原的结核疫苗提供了理论基础，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息，为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定了基础。文档编号C07K7/00GK101724023SQ20101003022公开日2010年6月9日申请日期2010年1月21日优先权日2010年1月21日发明者吕虹,朱宇皇,祁元明,翟明霞,陈飞,高艳锋申请人:郑州大学