专利名称：抗人scgn的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人促泌素(secretagogin，筒称SCGN)的单克隆抗 体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(二) 背景技术恶性肿瘤是严重危害我国人民群众身体健康的最常见疾病之一，每年 约有130万人死于恶性肿瘤，是我国第二大死因。由于对胂瘤发生、发展 认识的局限性，目前临床上理想的肺瘤标志物仍很少。促泌素是我们运用 双向凝胶电泳的方法首次筛选到的一个在结直肠癌中表达下调的蛋白，并 经免疫印迹及免疫组织化学反馈性验证。促泌素是2000年由Wagner等 利用免疫筛选技术从人胰腺P细胞cDNA文库中筛选出来的一个新的基 因，该基因定位于染色体6p22.1-22.3,其转录产物经翻译后形成一种含 276个氨基酸，分子量为32KDa的蛋白质。对该蛋白的氨基酸序列分析 发现，该蛋白含有6个EF-手型Ca^结合环，属S100家族蛋白。人体内 促泌素基因在胰腺及垂体中表达最高，在其他组织中也有表达，如脑、肾 上腺、曱状腺及胃肠道等。目前该蛋白的性质和功能还不是十分清楚。有 研究表明促泌素蛋白有控制细胞生长和分化的作用。我们的免疫组织化学 结果表明，促泌素主要表达于正常结直肠粘膜隐窝的基底层，细胞形态呈 锥形，与肠道神经内分泌细胞极为相似，初步提示促泌素可能是一个新的 神经内分泌的标记物。在此基础上，我们利用多克隆抗体以免疫组织化学 的方法检测了 54例神经内分泌肿瘤，并与CgA、 NSE和Syn等三个常用 的神经内分泌标记物比较，结果发现促泌素对神经内分泌肿瘤有4艮好的特异性，检测的敏感性要高于其它三个指标。尤其是对于小细胞肺癌，促泌素有很好的敏感性，在检测的31例小细胞肺癌中，有26例呈阳性表达， 其中有17例呈弥漫性强阳性表达，敏感性要高于CgA、 NSE和Syn三个 标记物。以往的研究报道，尽管联合应用多种神经内分泌的标记物进行检 测，但至少有10%的小细胞肺癌呈阴性。因此，促泌素有可能成为小细 胞肺癌新的诊断标记物。众所周知，随着工业化的进程加快和吸烟的增多，肺癌已成为目前人 类因癌症死亡的主要原因，其发病率与病死率均呈逐年上升趋势。在我省， 近20年来，肺癌病死率上升了 148.38%,居恶性肺瘤死因之首。虽然治 疗方法不断改进，但治疗效果仍未根本改观，主要是缺乏早期诊断和治疗 的有效方法。尤其是小细胞肺癌，作为肺癌最基本类型之一，具有发病年 龄较轻，恶性程度高，易转移、复发，预后差等特点。寻找与肺癌早期诊 断、治疗和评估预后相关的肿瘤分子标记物已成为迫在眉睫的研究^果题。 而且，与其它类型肺癌不同，该类肺癌一般不主张手术，化疗是常规治疗 手段。所以，气管镜或经皮肺穿刺活检获取病理诊断是治疗关键。然而， 由于活检组织的数量、取材挤压等因素影响，诊断困难，常要借助免疫标 记。但如前面提及，至少有10%的小细胞肺癌不表达现有各类神经内分 泌标记，从而使诊断困难，甚至导致不必要的外科手术治疗。因此， 一个 敏感、特异的标记将是小细胞肺癌诊断的有力工具。为此，我们在已有的工作基础上，制备抗人促泌素单克隆抗体并验证， 建立灵敏、可靠的外周血检测方法，检测神经内分泌肿瘤，尤其是小细胞 肺癌的外周血，以评估其对于诊断、预后及临床治疗效果检测等的应用价 值。
发明内容本发明目的是提供一种抗人促泌素的单克隆抗体及其制备与应用，以 及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞林。本发明采用的技术方案是一种抗人促泌素的单克隆抗体，所述单克隆抗体对SEQIDNo.l所示 核苷酸序列的第204 1034位核苦酸(即SEQIDNo.3所示核苦酸序列) 编码的多肽具有特异性，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC No: C200729的细胞抹分泌产生。本发明关键在于免疫抗原的确定，选择SEQ ID No.l所示核香酸序列的第204-1034位核苷酸编码的多肽作为抗原， 在已知抗原前提下，抗体可通过本领域熟知的技术方便的获得。所述单克隆抗体对SCGN重组蛋白(分子量为32KD)具有反应性， 所述SCGN重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述单克隆抗体为IgGl亚型，命名为SCGN-F9。一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞抹,保藏于中国典型培养物保 藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2007年10月1日，保藏 编号CCTCCNo: C200729。所述杂交瘤细胞抹由免疫的BALB/c小鼠脾 细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复 苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体SCGN-F9。一种所述单克隆抗体的制备方法，所述方法包括用SEQ ID No.2 所示SCGN重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛 选出能够分泌对SEQ ID No.l所示核苷酸序列的第204 1034位核苷酸编 码的多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞,从杂交瘤细胞上清液中 或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。所述SCGN重组蛋白由以下方法获得将含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的质粒载体转化大肠杆菌，IPTG诱导下获得GST-SCGN包涵体，对GST-SCGN包涵体进行纯化，经凝血酶酶切GST后得到所述的SCGN重组蛋白，本发明所指的IPTG(Isopropyl-卩-D-thiogalactopyranoside,异丙基-(3-D硫代半乳糖苷),可以诱导蛋白表达，能对乳糖操纵子产生极强的诱导效应,是强诱导物。具体的，所述单克隆抗体由如下方法制备得到 (1 ) GST-SCGN融合蛋白的诱导表达挑取含SEQ ID No.3所示核香酸序列的pGEX-4T-l/SCGN质粒的菌体单斑至LB培养液(含Amp50吗/ml)中37。C过夜培养。次日按l : 100比例稀释过夜菌，37。C震荡培养至至菌液的0D600达到0.4~1.0。加入IPTG诱导剂至终浓度1 mM, 30。C诱导4h。 4500rpm离心5min，收集菌体悬浮于预冷的PBS中，加入PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride,苯甲基磺酰氟)至终浓度为2mmol/L。冰浴下超声破碎菌体(每次5 s，间歇5s，共30min)。 12000rpm离心30min，收集上清。进行SDS聚丙烯酰胺凝"交电泳分析。(2 ) SCGN蛋白的纯化参照Pharmacia公司提供的GST亲和柱纯化操 作步骤获得纯化的GST-SCGN融合蛋白，然后将凝血酶加入到纯化 后的GST-SCGN融合蛋白中(按每IOO吗GST-SCGN融合蛋白加 1U凝血酶的比例)，22。C酶切16h,并取少量酶切产物进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析酶切结果。最后通过GST亲和柱纯化操作 获得纯化的SCGN重组蛋白。(3)动物免疫用上述纯化过的SCGN重组蛋白免疫BALB/c小鼠，以 期产生针对SCGN蛋白的特异性单克隆抗体。每只小鼠以lOOug的 量进行背部皮下注射，每周一次共三次，第四次冲击免疫一次，3天后待融合，获得免疫小鼠。(4) 杂交瘤细胞系的建立取免疫小鼠的脾脏细胞作为能够产生抗体的 浆细胞，与同系动物的骨髓瘤细胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG1500) 为介导进行融合。融合后细胞经HAT培养基选择性培养，以间接 酶联免疫吸附反应(ELISA)筛选阳性克隆。用有限稀释法对阳性 孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养直至克隆化细胞抗体阳性率为 100%。将杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复 苏，直到细胞系能稳定分泌单克隆抗体。(5) 单克隆抗体的制备与纯化将建系的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预 处理的小鼠腹腔，诱生腹水。诱生的腹水用亲和层析法获得纯化的 单克隆抗体。本发明还涉及所述的单克隆抗体在检测SCGN及其编码蛋白在人组 织中分布及表达的应用。例如通过免疫组化，免疫印迹，酶联免疫吸附 反应检测SCGN蛋白；用抗人促泌素单克隆抗体SCGN-F9，采用免疫组 织化学染色法检测人全身各组织SCGN蛋白的表达及定位情况；用抗人 促泌素单克隆抗体SCGN-F9，采用免疫组织化学染色法检测单克隆抗体 相应抗原在神经内分泌肿瘤组织中的表达。本发明还涉及所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用，所述检 测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、放 射性标记物或酶标记物。所述检测试剂盒为小细胞肺癌检测试剂盒。例如， 用抗人促泌素克隆抗体SCGN-F9，结合该蛋白的多克隆抗体，采用酶联免疫吸附反应检测小细胞肺癌患者外周血中SCGN的水平。本发明的有益效果主要体现在提供了及一种抗人促泌素 (secretagogin, SCGN)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞林，在本发明基础上可建立灵壽文、可靠的外周血检测 方法，检测神经内分泌肺瘤、尤其是小细胞肺癌的外周血，为评估其对于 诊断、预后及临床治疗效果检测提供了理论基础，具有重大应用前景。(四)
图1为GST-SCGN融合蛋白在大肠杆菌BL21中的表达；1为蛋白marker; 2为未诱导细菌；3 6依次为IPTG 1 mM、 37。C时诱导lh, 2h， 3h， 4h; 7 10依次为IPTG 1 mM 、 30。C时诱导lh, 2h， 3h, 4h; 图2为纯化的GST-SCGN融合蛋白的凝血酶酶切结果；1为蛋白Marker; 2为凝血酶；3为纯化后GST-SCGN融合蛋白；4~9依次为22。C时酶切 13h, 14h, 15h, 16h， 18h， 20h;图3为GST-SCGN融合蛋白的酶切产物纯化结果；1为蛋白Marker; 2为酶切前的GST-SCGN融合蛋白；3、 4为GST-SCGN融合蛋白的酶切产物；5 、 6为纯化后的SCGN重组蛋白；图4为纯化后的SCGN-F9单克隆抗体SDS-PAGE结果；图5为纯化后的SCGN-F9单克隆抗体ELISA方法检测效价结果。图6为SCGN-F9单克隆抗体经流式细胞术进行亚型鉴定后的结果。图7为免疫印迹杂交;f企测SCGN-F9单克隆抗体特异性的结果；图8为免疫组化法检测神经内分泌肿瘤组织中促泌素的表达情况；A为垂体腺瘤；B为小细胞肺癌；C为阑尾类癌；D为曱状腺髓样癌；具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一 步描述,但本发明的保护范围 并不仅限于此实施例1:GST-SCGN融合蛋白的表达及纯化1. GST-SCGN融合蛋白的诱导表达A. 挑取含SEQIDNo.3所示核苷酸序列的pGEX-4T-l/SCGN质粒(由 上海玉华生命科技发展有限公司构建)的菌体单斑至LB培养液(含Amp50吗/ml)中37。C过夜培养。B. 按1 : 100比例稀释过夜菌，37。C震荡培养至菌液的0D600达到 0.4~1.0。C. 加入IPTG诱导剂至终浓度1 mM, 30。Ci秀导4h。D. 4500rpm离心5min,收集菌体悬浮于预冷的PBS( Phosphate Buffer Solution)磷酸緩冲液中，加入苯曱基石黄酰胺氟(PMSF)至终浓 度为2mmol/L。E. 冰浴下超声破碎菌体(每次5s,间歇5s,共30min)。F. 12000rpm离心30min,收集上清。G. 进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果见图1,可见经IPTG 诱导后在55KD上方产生了 一条很明显的蛋白条带，而GST-SCGN 分子量为57KD。2. SCGN蛋白的纯化A. GST-SCGN融合蛋白的纯化参照Pharmacia公司提供的GST亲 和柱纯化操作步骤对所收集的上清进行纯化，得到纯化的融合蛋 白。B. GST-SCGN融合蛋白的酶切将凝血酶加入到纯化后的融合蛋白 中(按每IOO吗融合蛋白加1U凝血酶的比例)，22。C酶切16h， 并取少量酶切产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析酶切结果， 结果见图2。经凝血酶酶切后，产生了两条分子量约为25和32KD 的蛋白条带，分别为GST(glutathione S-transferase，谷胱甘肽S转移酶)和SCGN蛋白(图2)。 C. SCGN蛋白的纯化参照Pharmacia公司提供的GST亲和柱纯化 操作步骤进行结果见图3。与纯化前相比，获得了纯度很高的 SCGN重组蛋白(图3 )。 Western印迹检测纯化后的SCGN蛋白A. 取6吗化后的目的蛋白，加入4xSDS凝胶加样緩冲液；B. 电泳电压100V,待溴酚蓝达到底部边》彖，停止电泳；C. 将PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(先在曱醇中浸泡30 sec), SDS-PAGE 胶(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶)及滤纸 在转膜缓沖液中平衡10min;按从阴极到阳极的顺序放入纤维垫-滤纸-凝力交-膜-滤纸-纤维垫。100V转移90 min;D. 取出PVDF膜，在TBST緩沖液中短暂漂洗；TBST緩冲液配方(1 Ommol/L Tris HC1, pH8.0, 150mmol/L NaCl, 0.05 % Tween20 )E. 立春红染色3min,然后用去离子水—逸色；F. 放入封闭液中(5%脱脂奶粉)，温和振荡lh;G. 把膜放入一抗(兔抗人促泌素抗体，由奥地利维也纳大学Wagner 教授提供，稀释浓度为1: 4000)室温温和振荡30min后，放入 4匸冰箱过夜；H. 自4。C冰箱取出膜，室温温和4展荡30min;I. TBST洗膜20minx3次；J.把膜放入第二抗体中(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，购 自北京中杉金桥生物技术有限公司，稀释度为1:10 000)，室温温 和4展荡1 h;K. TBST洗膜30minx4次；L.根据膜的大小取适当的ECL溶液(免疫印迹化学发光溶液)，(本发明所用的ECL购自Pierce 7>司)将膜在溶液中孵育1-3 min; M.沥干膜，用保鲜膜包好后，至于暗盒中，曝光2 sec-60 min。 N.胶片由GS-800扫描仪扫描。结果见图4。用SCGN多克隆抗体与纯化后的重组蛋白免疫印迹反应 后可见一特异性的目的条带。实施例2:抗血清的制备用含纯化的50昭SCGN蛋白与等体积完全弗氏佐剂充分混匀，使其乳 化，以形成油包水状为混合成功的标志。取雌性6~8周龄的BALB/c小鼠， 于背部皮下多点注射，进行初次免疫。两周后以等体积的不完全代替弗氏 佐剂与50mgSCGN蛋白进行乳化，加强免疫BALB/c小鼠，此后每隔两 周加强免疫一次。加强免疫3次后，小鼠眼眶釆血并分离血清，以间接 ELISA法测定效价，当达到10 —4后准备融合。融合前三天加强免疫一次， 获得免疫后小鼠。实施例3:单克隆抗体的制备1、 饲养细胞铺板取一只16周龄的BALB/c免疫后小鼠，将其拉颈处死后，75%酒精浸 泡消毒。打开其腹腔，取饲养细胞，铺板，37。C孵箱培养，备用次日。2、 免疫后的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 无菌条件下取免疫后的BALB/c小鼠脾脏，剥离包膜使细胞游离，过 100目钢丝网，收集滤过的脾细胞。将生长状态好，处于对数生长期 的SP2/0细胞与脾细胞混合，比例为1: 10,以50%的PEG为介导进行融合，离心后用HAT培养基重悬细胞，并用该含有细胞的HAT培 养液铺96孔板，每孔2滴。置于37度，5%(302培养箱中培养。融合 后第3天用HAT培养基半量换液，第五天、第七天分别半量换液一次。 两周后换HT培养基。HT培养基的配制方法将100倍浓缩的HT液体(lmL )及100倍浓 缩的谷氨酰胺(lmL )稀释入1640培养基(98mL,购自美国GBICO 公司)。HAT培养基的配制方法将100倍浓缩的HT液体(lmL )、 100倍浓 缩A液体(lmL )及100倍浓缩的谷氨酰胺(lmL )稀释入1640培养 基(97mL )。100倍浓缩的HT液配制方法称取136.1mg次黄噪p令(hypoxanthine, H)， 38.8mg胸腺嘧，定核苷 (thymidine, T),逐次溶解在100ml双蒸 水中。过滤除菌，分装，储存于-2(TC。100倍浓缩的A液配制方法称耳又1.76mg氨基喋呤(aminopterin， A)， 加入90ml双蒸水，滴加Imol/LNaOH溶液，不断摇动直至氨基喋呤完 全溶解，再滴加等量lmol/L盐酸溶液，恢复PH值至7.0左右，双蒸水 补足溶液至100ml,过滤除菌，分装，^诸存于-2(TC。 100倍浓缩的谷氨酰胺的配制方法称取2.92gL-谷氨酰胺溶于100ml 双蒸水中，过滤除菌，分装，储存于-20°C。所用的次黄。票呤、氨曱蝶呤、胸腺嘧咬核苷和L-谷氨酰胺均来自sigma公司。 3、杂交瘤细胞筛选观察杂交瘤细胞的生长情况，当克隆生长至孔底面积的1/3-1/2时，取 上清lOOul,用间接ELISA方法进行4企测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养，四次后克隆化细胞抗体 阳性率为100%。将阳性克隆细胞进行进一步扩大培养。杂交瘤细胞经体外连续传代3个月以上，反复冻存，复苏，定期收集上清，用筛 选抗体的方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。实施例4:单克隆抗体的大量生产及纯化1、 选用12周龄以上的BALB/c小鼠，腹腔注射lml液体石蜡， 一周 后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤细胞，每只小鼠腹腔注射 1><106个杂交瘤细胞。7~10天后小鼠腹部可见明显膨隆，收集腹 水。3000rpm离心5分钟，取上清，分装，-20。C保存。用饱和硫 酸铵沉淀法将腹水进行初步提纯，之后用ProteinA亲和层析法将其 进一步纯化，纯化后的SCGN-F9单克隆抗体SDS-PAGE结果见图 5。 SDS-PAGE结果显示了 SCGN-F9单克隆抗体的重链及轻链。2、 抗人促泌素单克隆抗体SCGN-F9腹水效价及亚型鉴定用间接ELISA方法，检测纯化后单克隆抗体的效价，纯化后的 SCGN-F9单克隆抗体Elisa方法检测效价结果见图6,为1: 10—4。收 集杂交瘤细胞，用流式细胞术检测抗体的亚型(所用试剂盒购买自 Southembiotech公司，货号为Cat5500-01 ), SCGN-F9单克隆抗体经 流式细胞术进行亚型鉴定后的结果见图7,经检测SCGN-F9单克隆抗 体亚型为IgGl型，轻链为K型。实施例5:促泌素蛋白在人体组织中的分布及表达 Envision加强法免疫组织化学染色(l)脱蜡水化将烘干的切片依次置于二曱苯三道 每道15分钟100 %酒精 5分钟卯％酒精 5分钟75%酒精 5分钟50%酒精 5分钟 取出切片，用0.01M, pH7.4PBS洗涤3次，每次10分钟。 (2 )阻断内源性过氧化物酶将脱蜡水化后的切片置于3 %的过氧化 氢甲醇中15分钟。(3 ) PBS液(磷酸盐緩冲液)洗涤3次，每次5分钟。(4) 抗原修复将切片置于盛有0.01M， pH6.0的柠檬酸盐緩沖液的 容器中，进行微波修复(80火力8分钟，60火力6分钟两次)。(5) 取出后室温自然冷却，PBS洗涤3次，每次5分钟。 (6 )根据抗体需要以血清对组织进行封闭。(7) 滴加SCGN蛋白(1: 800稀释)，置4。C冰箱中过夜。(8) 第二日取出玻片以PBS液洗涤3次，每次5分钟。(9) 滴加抗鼠二抗，室温下孵育40分钟。 (10 ) PBS液洗涤3次，每次5分钟。(11 )每张切片滴加新配制的DAB ( 3，3，-diaminobenzidine, 二氨基联 苯胺)显色液，光学显微镜下观察3 5分钟，以出现特异性的细胞着色 为显色成功。(12 )流水冲洗30分钟终止显色。(13)苏木素复染胞核将上述冲洗干净的玻片置于苏木素液中20 30 秒，取出后自来水冲洗蓝化。(14) 切片脱水依次经梯度酒精脱水干燥(15) 二甲苯透明5分钟。(16) 封片每片滴加中性树胶，覆盖以盖玻片，光学显微镜下观察结果。(17 )阴性对照以PBS代替一抗。 免疫组化法检测神经内分泌肿瘤组织中促泌素的表达情况见图8,结 论SCGN蛋白在神经内分泌肺瘤中表达显著增高，为其成为一个神经内 分泌肺瘤的标志物提供了强有力的证据。实施例7:双抗夹心法检测小细胞肺癌与正常人群外周血中SCGN蛋白水 平方法如下1. 用稀释后SCGN多克隆抗体包被酶标板，4。C过夜；2. 弃去孔内液体，PBS洗涤3次，每次3分钟；3. 加入待测血清，37°C,湿盒，孵育2小时；3. 弃去孔内液体，PBS洗涤3次，每次3分钟；4. 加入10 %小牛血清37。C封闭30分钟；5. 弃去孔内液体，PBS洗涤3次，每次3分钟；6. 加入稀释后的SCGN-F9单克隆抗体，37°C,湿盒，孵育2小时；7. 弃去孔内液体，PBS洗涤3次，每次3分钟；8. 加入l^f艮过氧化物酶酶标过的抗鼠二抗，37°C，湿盒，赙育l小时；9. 加入TMB (四曱基联苯胺)底物緩冲液及显色液；10. 避光显色3 5分钟后，加入终止液；11. 用酶标仪读取吸光度值。建立了标准曲线，检测了 50例健康人群及20例小细胞肺癌患者外周 血中的SCGN蛋白，初步结果显示，SCGN蛋白在20例小细胞肺癌患者 的外周血中有11例为阳性，而在50例健康人群外周血中，仅有2例为阳 性，SCGN蛋白在小细胞肺癌患者中的水平明显增高，因此结合其他临床 病例资料，以SCGN作为小细胞肺癌早期诊断指标具有很大的潜力。序列表SEQUENCE LISTING<110〉浙江大学<120>抗人SCGN的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株<130>〈160〉 3<170> Patentln version 3. 4<210〉 1<211> 1492〈212> 瞧<213> Human astrovirus<■〉 1cagccgctggttttgctgagggctgagggacggctcagcgacgccacggccagcagcgct60cgcgtcctccccagcaacagttactcaaagctaatcagatgcaggagagc120aagtcaagaaatacggtgaaggagtccttcccaasgttgtctaggtccttccgcgccggt180gcctggtcttcgtcgtcaacaccatggacagctcccgggaaccgactctggggcgcttgg240acgccgctggcttctggcaggtctggcagcgctttgatgcggetgaaa犯ggttacatag300a卿g卿gaactcgatgctttctt"tc"tccacatgttgatga犯ctgggtactgatgaca360cggtcatgaaa_gcaaatttgcacaaggtgaaacagcagtttatgactacccaagatgcct420ctaaagatggtcgcattcgg3tga犯gagcttgctggtatgttcttatct480actttcttctgctct"t"tcgccgggaa幼cccactggacagcagcgtggagtttatgcaga540tttggcgcaaatatgacgctgacagcagtggctttatatcagctgctgagctccgcaact600tcctccgagacctctttcttaggccatttctgaggctaaactggaagaat660acactggcaccatgatgaagatttttgacagaaataaagatggtcggUggatctaaatg720acttagcaaggattctggctcttcaggaaaacttccttctcc犯tttaaaatggatgctt780gttctactgaag犯agga^agggactttgag33肌tctttgcctactatgatgtt已gt3840aaacaggagccctggaaggccc卿agtggca犯gacatgELtggagCttg900tccagcccagC3tC3gCggggtggaccUgataagttccgcgagattctcctgcgtcact960gcgacgtgaacaaggatggaaaaattcagaagtctgagctggctttgtgtcttgggctga10203^tC￡L￡lCCCeit犯"tCCCELgactgctttgccttttgc1xtctgtgatctt1080gctggt卿attgtatctgtgcattgatgttggg犯cacagtgggcaaactcacaaatgg1140tgtgctattcttgggcaagaacagggacgctagggccttccttccaccggcgtgatctat1200ccctgtctcactgaaagcccctgtgtagtgtctgtgttgttttcccttgaccctgggctt1260tcctatcctcccaaagactcagctcccctgttagatggctctgcctgtccttccccagtc1320accagggtgggggggacaggggcagctgagtgcattcattttgtgcttttcttgtgggct1380ttctgcttagtctgaaaggtgtgtggcattcatggcaatcctgtaacttcaacatagatt1440tttttgtgtgtgtgg肌3tatggaaacaaaaaaaaaaaaa1492<210〉 2 <211〉 276 <212〉 PRT〈213〉 Human astrovirus <400> 2Met Asp Ser Ser Arg Glu Pro Thr Leu Gly Arg Leu Asp Ala Ala Gly1015Phe Trp Gin Val Trp Gin Arg Phe Asp Ala Asp Glu Lys Gly Tyr lie 20 25 30Glu Glu Lys Glu Leu Asp Ala Phe Phe Leu His Met Leu Met Lys Leu 35 40 45Gly Thr Asp Asp Thr Val Met Lys Ala Asn Leu His Lys Val Lys Gin 50 55 60Gin Phe Met Thr Thr Gin Asp Ala Ser Lys Asp Gly Arg lie Arg Met 65 70 75 80Lys Glu Leu Ala Gly Met Phe Leu Ser Glu Asp Glu Asn Phe Leu Leu 85 90 95Leu Phe Arg Arg Glu Asn Pro Leu Asp Ser Ser Val Glu Phe Met Gin 100 105 110lie Trp Arg Lys Tyr Asp Ala Asp Ser Ser Gly Phe lie Ser Ala Ala 115 120 125Glu Leu Arg Asn Phe Leu Arg Asp Leu Phe Leu His His Lys Lys Ala 130 135 140lie Ser Glu Ma Lys Leu Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Met Met Lys lie 145 150 155 160Phe Asp Arg Asn Lys Asp Gly Arg Leu Asp Leu Asn Asp Leu Ala Arg 165 170 175lie Leu Ala Leu Gin Glu Asn Phe Leu Leu Gin Phe Lys Met Asp Ala 180 185 190Cys Ser Thr Glu Glu Arg Lys Arg Asp Phe Glu Lys lie Phe Ala Tyr 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1.一种抗人促泌素的单克隆抗体，所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第204～1034位核苷酸编码的多肽具有特异性，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NoC200729的细胞株分泌产生。
2. 如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体对SCGN 重组蛋白具有反应性，所述SCGN重组蛋白氨基酸序列如SEQ IDNo.2 所示。
3. 如权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体为 IgGl亚型。
4. 一种产生如权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞林，保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2007年 IO月1日，保藏编号CCTCC No: C200729。
5. 如权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，所述方法包括用SEQ ID No.2所示SCGN重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融 合，筛选出能够分泌对SEQ ID No.l所示核苷酸序列的第204~1034位 核普酸编码的多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤 细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗 体。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述SCGN重组蛋白由以下方 法获得将含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的质粒载体转化大肠杆 菌，IPTG诱导下获得GST-SCGN包涵体，对GST-SCGN包涵体进行 纯化，经凝血酶酶切得到所述的SCGN重组蛋白。
7. 如权利要求1所述的单克隆抗体在检测SCGN基因及其编码蛋白在人 组织中分布及表达的应用。
8. 如权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用，所述检 测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、 》丈射性标记物或酶标记物。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述检测试剂盒为小细胞肺癌 才企测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种抗人促泌素(secretagogin，SCGN)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第204～1034位核苷酸编码的多肽具有特异性，由保藏编号为CCTCC NoC200729的细胞株分泌产生。在本发明基础上可建立灵敏、可靠的外周血检测方法，检测神经内分泌肿瘤、尤其是小细胞肺癌的外周血，为评估其对于诊断、预后及临床治疗效果检测提供了理论基础，具有重大应用前景。
文档编号C07K16/26GK101270162SQ20081006011
公开日2008年9月24日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者徐恩萍, 李风英, 来茂德, 裕 马 申请人:浙江大学