专利名称：：黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖的提取工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖提取工艺。
背景技术：
：黄伞(p力oh'Waa&'posa(Fr.)Qu61.)是野生于泰山上的一种珍贵药、食两用真菌，脆嫩可口、营养丰富。从黄伞中提取的多糖物质具有抑制肿瘤生长，预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌感染等作用。硒元素是人体必需的微量元素之一，具有降低癌症发生率和死亡率，防治脑血管疾病、糖尿病，抗衰老等作用，并且能够解除重金属的致癌性与毒害。而硒制剂中以有机硒为佳，与无机硒相比有机硒具有吸收率高、无毒性等优点。近年来的研究表明，有机硒对铅具有一定的拮抗作用。多糖类等大分子物质，其糖链上丰富的游离-OH和-COOH基团可与铅络合，形成难以吸收的凝胶，有效地阻止铅在胃肠道的吸收，起到促进排铅的作用，说明硒多糖具有复合排铅的功能。本发明通过黄伞菌丝体的富硒培育，提取黄伞硒多糖，通过动物实验，具有较好的排铅效果，为黄伞硒多糖的开发利用奠定了基础。
发明内容本发明的目的是通过黄伞菌丝体的富硒培育，提取黄伞硒多糖，为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括以下方法步骤(1)黄伞菌种的活化将由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg和蒸馏水1000ml组成的培养基装入试管，灭菌摆斜面后冷却，在无菌条件下，将冷藏保存的黄伞菌母种转接活化后，接种到配置好的培养基上，在25t恒温培养箱进行菌种的扩大培养；(2)液体培养种子的制备将由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg和蒸馏水1000ml组成的液体培养基装入培养瓶封口后，进行高压灭菌，在0.15Mpr/cm2，125°C条件下灭菌20h;待液体培养基温度降至30QC以下时，按无菌操作规程选取经步骤(1)扩大培养后菌丝浓密、生长优良的菌种，接入液体培养基中，每支试管菌种扩接6瓶三角烧瓶；将接种后的三角烧瓶置于摇床中进行避光培养，温度为24t，转速为145r/min，培养96h，待菌丝球呈米粒状并布满培养液时，停止培养，用作液体培养的种子；(3)种子的扩大培养在由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg和蒸馏水1000ml组成的液体培养基中添加亚硒酸钠母液，调整培养基中硒离子浓度为20-50ppm;调整后的培养基装入50—200L液体发酵罐中，装入培养基的体积量为发酵罐容量的70%，经灭菌冷却待培养液温度降到25。C左右时，按无菌操作规程将步骤(2)制备的液体培养种子接种到培养基中，接种量为培养液体积的10%;控制培养温度24t，罐压0.02MPa/cm2，通气量0.03m7min，培养96h，待菌丝球布满培养基时停止培养；(4)黄伞硒多糖的提取将扩大培养的获得的菌丝球用蒸馏水清洗3-5次后，加入10倍于菌丝球重量的蒸馏水进行热水浸提，提取温度为95。C，提取时间2h;将压滤后的滤液导入浓縮罐中，在0.09MPa的真空度下，浓縮至原体积的l/4;浓縮液取出后按l:2比例加入95%乙醇，静置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下离心10min，60'C烘干，即得粗黄伞硒多糖。通过该培育工艺提取的黄伞硒多糖经称量测定得率为0.08g/100ml、硒多糖中硒浓度为2120ppm，因此本发明工艺合理，硒多糖的得率高，硒多糖中的硒浓度冷县*3里冋。具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步描述本发明的黄伞菌丝体富硒培育工艺包括以下方法步骤(1)黄伞菌种的活化将由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg和蒸馏水1000ml组成的培养基装入试管，灭菌摆斜面后冷却，在无菌条件下，将冷藏保存的黄伞菌母种转接活化后，接种到配置好的培养基上，在25t恒温培养箱进行菌种的扩大培养；(2)液体培养种子的制备将由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg和蒸馏水1000ml组成的液体培养基装入培养瓶封口后，进行高压灭菌，在0.15MPr/cm2，125°C条件下灭菌20min;待液体培养基温度降至30°C以下时，按无菌操作规程选取经步骤(1)扩大培养后菌丝浓密、生长优良的菌种，接入液体培养基中，每支试管菌种扩接6瓶三角烧瓶；将接种后的三角烧瓶置于摇床中进行避光培养，温度为24。C，转速为145r/min，培养96h，待菌丝球呈米粒状并布满培养液时，停止培养，用作液体培养的种子；(3)种子的扩大培养在由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg和蒸馏水1000ml组成的液体培养基中添加亚硒酸钠母液，调整培养基中硒离子浓度为20-50ppm;调整后的培养基装入50—200L液体发酵罐中，装入培养基的体积量为发酵罐容量的70%，经灭菌冷却待培养液温度降到25。C左右时，按无菌操作规程将步骤(2)制备的液体培养种子接种到培养基中，接种量为培养液体积的10%;控制培养温度24。C，罐压0.02MPa/cm2,通气量0.03m7min，培养96h，待菌丝球布满培养基时停止培养；(4)黄伞硒多糖的提取将扩大培养的获得的菌丝球用蒸馏水清洗3-5次后，加入10倍于菌丝球重量的蒸馏水进行热水浸提，提取温度为95。C，提取时间2h;将压滤后的滤液导入浓縮罐中，在0.09MPa的真空度下，浓縮至原体积的1/4;浓縮液取出后按1:2比例加入95%乙醇，静置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下离心10min，60'C烘干，即得粗黄伞硒多糖。黄伞硒多糖抗铅作用试验如下试验动物采用体重为20(±2)g小白鼠30只，随机分成3组，每组l0只，分别饲以普通饲料(硒含量为0.1497mg/kg)，添加硒多糖饲料(硒含量为0.4387mg/kg)，饲料组成为玉米70%，大豆29%，食盐1%，自由进食进水。给药方式采用腹腔注射方法。给药量为铅2Omg/kg，(药量/体重)。前两次隔日给药，第3次3d给药，第4次，5次隔4d给药。第5次给药后饲养9d后断脊处死取样。黄伞硒多糖对小鼠组织中硒、铅含量的影响试验结果见下表小鼠组织中硒、铅的含量(X士S,湿组织)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由上表可见，在本试验浓度下硒多糖可使小鼠各组织硒含量增加，使心、肾硒含量明显增加(P〈0.05)，使血、肝硒含量极显著增加(P〈0.01);使血、心、肝、肾硒含量极显著增加(P〈0.01)硒多糖的补硒效果显著。可降低小鼠各组织中铅含量，减少铅在体内的蓄积，但硒多糖的排铅效果对心、肾等组织可达极显著水平，对肝等组织可达显著水平。上述实验表明，硒多糖具有较好抗铅作用，可不同程度减低小鼠各组织中铅含量，迅速增加各组织中的硒含量，表明硒多糖具有对抗铅毒性作用。为寻求解决目前由于铅污染对人体危害的预防提供了一条新途径。权利要求1、一种黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖提取工艺，其特征在于包括以下方法步骤(1)黄伞菌种的活化制备PDA培养基，装入规格为180×80的试管内，封口、灭菌、摆斜面，培养基冷却后，在无菌条件下，将冷藏保存的黄伞菌母种转接活化，在25℃下进行菌种的扩大培养；(2)液体培养种子的制备按马铃薯100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml的配比制备液体培养基，分装于500ml的三角瓶封口后，进行高压灭菌，在0.15Mpr/cm2、125℃条件下灭菌20min；取出待液体培养基温度降至30℃以下时，按无菌操作规程选取经步骤(1)活化培养后的菌种，接入液体培养基中；每支试管菌种扩接6-8瓶三角烧瓶；将接种后的三角烧瓶置于摇床中进行避光培养，温度为22-26℃，转速为120-160r/min，培养时间为90-120h，待菌丝球呈米粒状并布满培养液时，停止培养，用作液体培养的种子；(3)种子的扩大培养在由(2)组成的液体培养基中添加配制成一定浓度的亚硒酸钠母液，调整培养基中硒离子浓度为20-50ppm；将上述培养液装入50-200L液体发酵罐中，装入培养基的体积量为发酵罐容量的70％；经灭菌冷却待培养液温度降到20-30℃时，按无菌操作规程将步骤(2)制备的液体培养种子接种到发酵罐中，接种量为培养液体积的3％-10％；控制培养温度22-26℃，罐压0.01-0.03MPa/cm2，通气量0.02-0.04m3/min，培养时间为80-120h，待菌丝球布满培养基时停止培养；(4)黄伞硒多糖的提取将扩大培养的获得的菌丝球用蒸馏水清洗3-5次后，加入10倍于菌丝球湿重的蒸馏水进行热水浸提，提取温度为85-100℃，提取时间2-4h；将压滤后的滤液导入浓缩罐中，在0.085-0.095MPa的真空度下，浓缩至原体积的1/3-1/5；浓缩液取出后按1∶2-1∶4比例加入60-95％乙醇，静置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下离心10h，60℃烘干，即得粗黄伞硒多糖。全文摘要本发明公开了一种黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖的提取工艺，包括黄伞菌种的活化、液体培养种子的制备、种子的扩大培养和黄伞硒多糖的提取等方法步骤，本发明通过黄伞菌丝体的富硒培育，提取黄伞硒多糖，具有工艺合理，硒多糖的得率高，硒多糖中的硒浓度含量高的特点。文档编号C12R1/645GK101525646SQ20091001455公开日2009年9月9日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者王临哲,苏延友申请人:王临哲