采集并且转运阴道排出物用于检测传染性生物并且促进宫颈癌筛查的方法

专利名称：采集并且转运阴道排出物用于检测传染性生物并且促进宫颈癌筛查的方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及采集生物学液体或身体排出物的临床样品的方法，具体地讲，本发明涉及采集并且将阴道排出物保存和转运到简单器械上的方法，以便增加样本的数量和质量，并且能够通过核酸扩增或其他技术检测传染性疾病因子或宿主遗传标记的存在。
背景技术：
宫颈癌宫颈，或子宫颈是通向阴道上部的子宫下部。它还是精子进入子宫的通道和产道的一部分。暴露于阴道腔的宫颈部分通常覆盖有鳞状上皮，而宫颈的子宫腔的内表面是腺性的。这两种上皮细胞之间的结合部分(移行区)容易受HPV(人乳头瘤病毒)感染。该部位还容易发生恶性转化。在该部位的常见类型的癌症是鳞状上皮癌和腺癌。腺鳞状上皮癌，小细胞癌，淋巴瘤和肉瘤是罕见的。
由于宫颈比较隐蔽，很多癌症在被发现时已经到了晚期，通常是由于它们导致了异常出血才被发现的。George Nicolas博士在1920年代经巴氏试验发现，从宫颈癌中排出的细胞在载玻片上染色时，经过训练的人员用眼睛在显微镜下可以发现它们。这一发现导致了通过细胞学检查对早期宫颈癌的检测。正如现在所了解的，这些癌症中的大多数是由高风险的HPV引起(参见下文)。HPV的检测现在被认为能够提供甚至更早的报警，在细胞明显转化之前(外观恶化)。
美国癌症协会估计，在2003年有12,200个美国人被诊断患有宫颈癌，其中有1/3的人会因此而死亡。在某些社会群体中，例如，在哥斯达黎加的Guanacaste省的患宫颈癌的女性的比例更高。
巴氏涂片(PAP试验)从PAP试验推广开始的50年中宫颈癌的早期检测挽救了很多生命，PAP试验是基于对采集到载玻片上的染色宫颈细胞的显微镜检查。通过细胞技术学家和细胞病理学家的受过训练的眼睛，可以在转变成浸润性癌症之前识别很多早期宫颈新生瘤形成病例。
通常PAP试验具有缺陷，因为由于女性不能获得PAP试验，采样误差，制备的样本不好，在很多形态学解释性试验中固有的主观性和解释的误差。因此，常规Pap涂片的假阴性率为13-70％，假阳性率高达14％(参考文献4)。理想的筛查试验应当具有尽可能高的灵敏度(100％的灵敏度或0％的假阴性)。很显然Pap涂片作为癌症的筛查测试方法是很不理想的(参考文献25&26)。ThinPrepPAP试验通过将宫颈细胞采集到液体培养基中，然后在玻璃载玻片上进行单层制备使PAP试验更精确。清晰性的改进被解读成更精确的诊断。不过，没有获得PAP试验的女性仍然不能从这种形式的宫颈癌筛查中受益。
人乳头瘤病毒人体起着能导致疾病的微生物的宿主的作用。某些微生物通过女性下生殖道进入人体，感染有关组织，并且通过性接触或生育通过相同的入口感染其他个体。
上述传染性疾病因子之一是人乳头瘤病毒(HPV)。科学的进步业已揭示了这种病毒在导致人类宫颈癌方面的作用。超过99％的宫颈癌具有可检测的HPV遗传材料。具体地讲，高危HPV能产生大量蛋白，这些蛋白能使细胞周期异常，破坏宿主免疫防御机制，并有可能利用荷尔蒙周期，从而导致宫颈上皮细胞的恶性转化，逃脱被宿主的适应性免疫系统消除的命运，并且增强它向其他个体的传播。
所述病毒编码的蛋白的例子包括高危HPV E7蛋白，它被证实能使低磷酸化(hypophosphorylated)的宿主pRB失活，从而防止它螯合E2F，导致由E2F启动的转录机制的激活，以及使促进细胞分裂的蛋白表达。另外，E7能刺激S-期基因细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E，似乎能阻断细胞周期蛋白-依赖型激酶抑制剂WAF1(p21或CIP1)和KIP1(p27)的功能，并且扩增中心粒，诱导异倍性，所有这些现象导致了肿瘤发生高危HPVs还能产生E6，它能模拟细胞MDM-2，并且使p53穿梭到细胞质腔室，在这里它们被破坏掉。如果没有基因组的守护者p53，恶性转化是无法控制的。E6的其他转化特性包括或在前凋亡(pro-apoptotic)蛋白BAK破坏，导致转化的细胞的永生化，激活端粒末端转移酶，并有可能抑制SRC-家族激酶的降解。
高危HPVs的E6和E7蛋白协同驱动细胞进入不受限制的扩增，永生化，异倍性和基因组不稳定性，这些是良性细胞的恶性转化的必要的转折点。其他病毒因子，特别是能破坏适应性免疫系统的因子与诸如吸烟，诱变剂，其他感染，免疫抑制，遗传性易患病的体质和多个性伙伴的宿主因素相互作用，导致了临床恶变。
HPV检测作为巴氏涂片的辅助或与巴氏涂片组合使用由于已确立HPV，特别是高危型的HPV与宫颈癌的联系，并且细胞转化的分子机制和病毒逃脱宿主免疫系统被人们所了解，医生们已经认可将HPV检测用作PAP试验的辅助手段，或异常PAP试验的治疗类选法(食品和药品管理署[FDA]在2000年3月批准了对患有异常PAP试验的女性进行HPV检测)。
最近，在2000年3月，FDA批准了将HPV检测用于宫颈癌筛查，与PAP试验组合用于年龄超过30岁的妇女(http//www.fda.gov/bbs/topics/news/2003/new00890.html)。
采集用于HPV检测的样本样本采集方法包括活组织检查，医生直接的宫颈刮片(与获得PAP试验样本的方法类似)，子宫颈阴道灌洗液和采用子宫颈阴道灌洗液自己获得的样本，阴道拭子，阴门拭子，自己插入并且取出阴道棉塞和尿液收集装置。
上述获得临床样本的所有方法都存在严重的缺陷，无论是医生直接采集的或是自我采集的，均需要患者到诊所进行样本采集。不过，有很多女性仍然出现浸润性宫颈癌而又没有进行先期PAP试验的主要原因是否定的心里障碍，厌恶陌生环境和生人，没有时间和其他因素，如医学或筛查设施的无效，特别是在发展中国家。自我采集样本的其他建议包括考虑部分患者冒着被认出的危险购买物品或从诊所中获得一个。
2.相关技术的说明美国专利申请US2002/0007161披露了使用类似于卫生巾的特殊采集器械，这种器械经过改良，以便包括可拆除的采样条。这种器械尽管类似于普通未改良过的卫生巾，由于它的特殊性质，存在的缺陷是当患者在购买它时会感到耻辱(心理学上的)，因为购买或获得这种制品的行为与检测医学症状相关。一种例子是购买不通过交易所直接售给顾客的壮阳药物，如果FDA许可的话。按照现有技术所教导的保持液体样本，有利于污染的细菌和真菌的存活和连续的生长和扩增。它能产生分解感兴趣的临床材料的酶，如病毒颗粒，病毒核酸和宿主遗传标记。卫生巾的不可渗透的外层在阻止污染内衣裤和/或外衣的同时，提供了快速蒸发水分的屏障，产生了保持细菌和真菌生长的有利条件。
自我获得的子宫颈阴道灌洗液业已被提倡作为采集HPV检测样本的手段。该方法涉及将器械插入阴道，然后用液体和它的收集物灌洗。该方法同样涉及到购买这种器械的问题，存在与上述例子相同的潜在的羞辱感的缺陷。另外，某些患者认为将异物插入阴道是受到冒犯。
出于相同的原因，患者可能不喜欢插入阴道棉塞作为采集样本的手段的想法。这种方法和其他方法涉及将异物插入阴道，通常不能被处女所接受。
使用其他器械，主要是拭子，不过还有棉纸，患者自己可以获得阴道和阴门样品。不过，样品的数量在某些情况下可能不足以检查，因为它只包括一次采集的样品。出于相同的原因，采集尿液可能不能提供理想的灵敏度，因为它将HPV颗粒从阴道口冲洗到样本容器中，其数量可能不足(在尿液中呈现72％的阳性，而在匹配的宫颈拭子中呈现出98％的阳性；参考文献22)。
因此，需要不用患者出现在诊所，却能够采集到最大数量的阴道排出物的样本采集方法，它不会使患者受到羞辱，并且还有利于样本的保存，稳定性，以及输送样本到实验室进行检查。
发明概述本发明提供了用于采集，保存和转运来自女性下生殖道的数量上和质量上优良的临床样本的改进方法，以便转运到简单的器械上，进行宫颈癌标记的检测，如HPV，宿主遗传标记和替代标记，如其他性传播疾病。
定义″异倍体″表示不具备染色体的单倍体数量的整倍数。
″抗体″是蛋白(免疫球蛋白)，它能识别并且结合抗原，作为免疫反应的一部分。
″抗原″表示具有分子表面结构的物质，它能诱导免疫反应，即诱导抗体产生，和/或与它的专一性抗体起反应(抗原-抗体反应)。
″细胞凋亡″表示生理学细胞死亡，编程的细胞死亡，在发育过程中使生物成型的过程，以及作为抑制病毒复制或对后代细胞造成不可挽回的遗传学损伤的增殖的手段。它是一种主动过程，需要基因转录和能量的消耗。
″细胞周期″表示有丝分裂之间的一系列事件，通常划分成G0(G表示间隙)，G1，S(S表示合成期，在此期间DNA复制)，G2和M(M表示有丝分裂)期。不进行分裂的细胞被认为处在G0期。从G0过渡到G1的细胞被认为倾向于完成了细胞周期并且分裂。
″细胞周期蛋白″是在细胞周期中表达的蛋白。其含量在细胞周期的不同阶段显著不同，与它们的相应的配偶体不同，细胞周期蛋白-依赖型激酶，它们的含量在细胞周期中不会波动。这种复合物是通过磷酸化激活的，并且激活了的激酶随后会使与有丝分裂，DNA复制，核纤层的解聚作用，和有丝分裂纺锤体形成相关的蛋白磷酸化。
″细胞周期蛋白-依赖型激酶(CDKs)″是只有在与细胞周期蛋白形成复合物之后才具有活性的酶。
″细胞周期蛋白-依赖型激酶抑制剂″包括两种类型的蛋白，所谓的INK4抑制剂，包括p16，p15，p18和p19，它们能对细胞周期蛋白D/CDK4和细胞周期蛋白D/CDK6起作用，以及第二种类型，它包括p21，p27和p57，第二种类型能抑制所有的CDKs。
″杂交″表示两个单链互补DNA链的融合(DNA/DNA杂交)，或互补性DNA和RNA链的融合(DNA/RNA杂交)。
″LOH(杂合性丧失)″表示等位基因的丧失。当发生LOH时，通过突变性失活使其余的等位基因失活，导致了相应基因功能的完全丧失。如果所述基因产物是肿瘤抑制剂的话，就不能抑制肿瘤发生。
″MDM-2″表示肿瘤蛋白，它能通过与p53的转录激活结构域结合抑制p53，阻止它调控它的目标。MDM-2表达是通过p53激活的，并且通过蛋白酶体促进p53的降解。
″微卫星″表示非常简单的DNA序列，小型的(通常小于0.1kb)的串联重复，例如，通常为1-4bp(CA)n。
″微卫星不稳定性″表示某些肿瘤细胞的现象特征，其中，在DNA复制期间，重复拷贝数量的微卫星会发生随机改变。
″p53″是肿瘤抑制基因产物，它的功能是变化无常的，并且包括在DNA损伤时抑制细胞周期，并且如果DNA损伤不能够修复的话则诱导细胞凋亡。由于它在预防肿瘤方面的重要作用，发现它在略微超过50％的人类肿瘤中失活。
″聚合酶链反应(PCR)″表示在试管中制备一段DNA序列的很多拷贝的技术。它采用重复的热循环，包括双链DNA的变性，合适的寡核苷酸引物的退火，以及通过聚合酶使所述引物延伸。
″多形性″表示两种或两种以上变体(定位基因，表型，序列变体，染色体结构变体)在群体中以显著的频率存在。
″原癌基因(细胞癌基因)″表示真核基因，它能调控细胞生长或分裂，并且当它以截短的形式存在于逆转录病毒中时，向癌基因那样起作用，能够在整合到细胞基因组中之后导致真核细胞的恶性转化。
″逆转录酶″表示存在于RNA病毒中的酶复合物，并且它可以由RNA模板合成DNA。
″逆转录PCR(RT-PCR)″表示用于扩增RNA的技术，涉及利用所述逆转录酶首先合成与一段目标RNA互补的DNA(cDNA)，然后对所述cDNA进行PCR。
″单一核苷酸多形性(SNPS)″表示出现在个体之间的常见的DNA序列变异。
″端粒末端转移酶″表示核糖核蛋白酶，它能在端粒上添加核苷酸碱基。
附图的简要说明

图1是具有通过电泳分离的DNA扩增产物的一片琼脂糖凝胶的照片，示出了对风干的阴道排出物和阳性对照的样品中的HPV专一的带的存在，和在阴性对照中缺乏这种带。
用溴化乙锭对琼脂糖凝胶进行染色，以便在紫外线下面突出扩增的DNA。通过电泳对DNA进行大小分离，并且在预期的位置上出现了独特的带(450bps)，与位于顶部的100bps DNA大小序列梯进行比较(在该照片上100&200bps的带看不太清楚)。在存在HPV的情况下，由于扩增只能对特定类型的引物(此时为MY09/11)发生，450bps的清晰的带的存在是在样本中存在HPV的指标。阴性对照(临床样品和水)是阴性的。阳性对照是阳性的。
本发明优选实施方案的详细说明根据本发明，样本采集的整个过程是由患者在她本人住所的隐秘之处使用自己购买的任何成品类型的一次性内衣裤完成的，优选吸水性和多孔内衣裤。或者，普通内衣裤，女用裤袜，或具有干净卫生纸的一次性压印或拭子也是可以接受的。普通衣物是可以接受的，但要理解它被用作临床样品并且不会返回给患者。
内衣裤的柔软的织物或其他用品在本发明中被认为是器械，被裁剪适合阴道口的解剖学轮廓，有利于甚至是少量的来自所述阴道口的阴道排出物被转移到所述器械的吸收材料上。比较硬的卫生巾可以只能吸收更大量的排泄到卫生巾上的排出物。如果排出物的量较小的话，它会倾向于黏着在阴道口的皮肤上，而不是黏着在卫生巾的织物上。
细菌和真菌对内衣裤或卫生巾的污染是不可避免的，因为它们可能已经存在于阴道排出物中以及皮肤上，并且因为阴道口靠近肛门。
由于所述器械织物是薄的和多孔的，阴道排出物中的水很容易从内表面渗透到外表面，并且排泄到环境中。如果穿着裙子而不是外裤的话，会促进天然干燥过程。由此获得的风干有助于本发明的成功，因为阴道排出物的风干抑制了细菌的酶促活性和宿主多形核中性粒细胞通过降解过程对病毒颗粒，病毒核酸，宿主遗传标记和其他感兴趣的材料的降解。阴道排出物的风干还能抑制细菌和真菌过度生长。
没有必要向所述器械中添加抗细菌和抗真菌剂。另外，所述添加剂有可能是致敏性的，抑制性的，或使随后的实验室研究复杂化，或者因为其他原因而不可接受。
不过，本发明并不排除将所述添加剂用作辅助手段或抑制特殊织物的使用，这些织物本身对细菌或真菌过度生长具有抑制作用。如通过提取水分，从而使得分泌物干燥，或者通过提供不利于微生物生长的环境，然而决不会伤害患者，导致过敏反应，或破坏随后对样品进行的实验室检查。
在早上，所述器械被作为普通内衣裤穿着任意时间段，通常直到在当天的晚些时候更换。建议患者穿着裙子而不是裤子，并且不要在内衣裤的顶部穿着其他贴身衣物。在所述阶段结束时，患者将所述器械取出，并且将它放入自己购买的，以前没有用过的带拉链的塑料袋中。
在装入塑料袋之前或之后，如果所述器械仍然是湿润的，用消费者使用类型的电吹风使用柔和的冷风进行大约1分钟的短时间干燥。
在轻柔地提供过量空气之后，对所述带拉链的塑料袋进行密封，不进行净化、添加防腐剂、脱水剂或其他处理剂。
然后，将所述样品(含有阴道排出物的器械)装入普通信封中，并且与回信地址一起尽早邮寄给有关实验室(特殊的标识符，而不是姓名，和电子邮件，地址，和/或电话号码)。
患者提供能够识别样品的特殊的“名称”或“标识符”，以便检测报告能够以匿名形式通过邮件，报纸，海报，互联网，或其他方式提供。所述识别信息不应当是患者的真实姓名，不过必须是独特的并且只有本人知道。
为了避免故意地、恶意地将有关结果移植给其他人，常用名称可能是不可接受的。这样的样本可能在不进行检测的情况下销毁。
另一方面，来自看医生的患者的样本允许与患者的真实姓名和联系信息结合，以便能够将结果直接通过卫生机构通知他们。
在所述实验室中，将收到的样本打开，登记和检测。
用于DNA提取的样本的初步制备包括以下步骤1.在采用净化设备的合适的生物安全实验室中分别开启样本袋。
2.通过肉眼区分包括肉眼可见的污渍的样本部位，它通常位于内衣裤的接触最多的部位。
3.切割或打下0.2×0.2cm-1×1cm大小的具有沾有样本的完整厚度的小片。
4.将获得的样本插入Eppendorf试管中，然后进行DNA提取。
5.在提取之后，通过光谱测定法选择性测定DNA含量，以便确定在随后的扩增之前是否需要稀释。
6.如果需要的话，对提取的DNA进行稀释。
为了进行HPV检测，按以下方式处理提取的DNA1.通过PCR反应或其他核酸扩增方法扩增来自提取的DNA的HPVDNA，使用采用任何数量的引物对的任何次数的独立反应，或在一次反应中使用多个引物对。
2.通过大小分离识别扩增的产物，采用凝胶电泳或杂交(微阵列，巨阵列，斑点印迹，线状印迹，颠倒的线状印迹，或抗体-型检测)，以便检测HPV菌株并且进行分类，如果存在的话。
宿主遗传材料研究为了研究细胞DNA恶性或恶性转化前的标记，按上述方法提取DNA。然后对所述DNA进行分析，所述分析包括，但不局限于p16或其他肿瘤抑制剂的启动子序列的过度甲基化，微卫星改变(LOH或不稳定性)，原癌基因的扩增，抑制，肿瘤抑制基因的突变性失活或LOH(杂合性的丧失)，SNP(单一核苷酸多形性)，如p53基因多形性，或基因表达形式的改变。
宿主基因表达的研究为了分析诸如p16INK4a(由CDKN2A编码)，MCMs(小型染色体保持)或TERT(端粒末端转移酶的催化性亚基)的某些mRNA类型的超量表达，以上成分是在大部分宫颈上皮内瘤样病变中超量表达的，提取所述样本中的mRNA，然后将它逆转录成cDNA，并且随后或同时采用核酸扩增的定量方法定量。
宫颈癌替代标记的研究为了检测宫颈瘤的替代标记，可以通过核酸技术对性传播的感染中提取的DNA进行分析，如沙眼衣原体，淋病奈瑟球菌，梅毒螺旋体，腺伴随病毒，阴道滴虫等。
实施例1.检测阴道排出物中的HPV。
我们能够检测来自45个样品的风干的阴道排出物中的HPV(100％)，这些样品是从组织学上证实了患有宫颈HPV感染或宫颈瘤的女性获得的。
我们采用以下方法从所述样本中提取DNA1.添加600μl细胞裂解溶液和3μl蛋白酶K(20mg/ml)。涡旋搅拌，以便混合并且在56℃下过夜。
2.将样品冷却到室温(RT)。使用安装在自动吸液管上的无菌的长10μl的吸液管头取出样本，并且通过贴在试管内按压排出所述裂解物。
3.将200μl蛋白沉淀溶液添加到所述细胞裂解液中，在高速下剧烈涡选搅拌20秒，以便混合。
4.以14,000rpm的速度离心5分钟。沉淀的蛋白会形成紧密的沉淀物，如果所述蛋白沉淀物不紧密的话，重复离心过程。
5.将含有DNA的上清液(留下沉淀的蛋白沉淀物，它被弃掉)吸入装有600μl 100％异丙醇的1.5ml干净的微型离心机试管中。添加1.0μl糖原溶液(20mg/ml，DNA载体)。
6.柔和颠倒50次混合所述样品。
7.以14,000rpm的速度离心2分钟。根据产量，能够看见或看不见白色DNA沉淀物。如果预计DNA产率低(＜1μg)的话，将离心时间延长到5分钟。
8.尽可能地将上清液吸走，并且最终的吸液需要10μl的吸液管。
9.添加300μl 70％的乙醇，并且颠倒试管若干次，以便洗涤DNA沉淀物。
10.以14,000rpm的速度离心5分钟，小心地将上清液尽可能地吸走，最后的吸液需要10μl的吸液管。沉淀物可能是疏松的，因此要缓慢地吸液，并且观察沉淀物。打开试管盖子，在室温下使沉淀物风干15分钟。
11.添加30μl DNA水合溶液。
用提取的DNA，我们在两个独立的试管中对每一种样本进行了PCR，使用不同的引物对引物序列引物GP5+/6+(参考文献23)PCR引物-GP5+(5′→3′)TTTGTTACTGTGGTAGATACTACPCR引物-GP6+(5→3′)CTTATACTAAATGTCAAATAAAAAG引物MY09/11(参考文献24)PCR引物-MY09(5′→3′)(正向)CGTCCMAARGGAWACTGATCPCR引物-MY11(5′→3′)(反向)GCMCAGGGWCATAAYAATGG*目标专一性俘获探针的简并序列和半探针用小写字母表示。以下是可以采用的核酸r＝A或G；y＝C或T；m＝A或C；k＝G或T；w＝A或T(A，腺苷；C，胞嘧啶；G，鸟苷；T，胸腺嘧啶)。
反应1.引物对GP5+/6+

PCR条件引物对HPV GP5+/6+热启动94℃ 4分钟变性94℃ 1分钟退火40℃ 2分钟 |X 40轮延伸72℃ 1分钟30秒最终延伸72℃ 4分钟培养4℃直到凝胶电泳在凝胶电泳上的预期大小140-150bps。
反应2.引物对MY09/11

PCR条件引物时HPV MY09/11热启动94℃ 5分钟变性94℃ 1分钟退火55℃ 1分钟30秒 |X 40轮延伸72℃ 1分钟最终延伸72℃ 5分钟培养4℃直到凝胶电泳在凝胶电泳上的预期大小450bps。
在扩增之后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳，以便对PCR产物进行大小分离。在图1中示出了典型的凝胶照片。
我们的实验的早期结果在同等综述的杂志中进行过报道(参考文献5)。
参考文献5披露了对卫生巾上的人乳头瘤病毒的成功检测。本发明对所披露的检测方法进行了改变，包括提供一种器械以取代普通卫生巾，用于采集阴道排出物，它能促进阴道排出物的风干，同时所述器械靠近所述阴道口。正如以前所讨论的，阴道排出物的干燥减弱或中断了细菌的酶促活性和宿主多形核中性粒细胞对病毒颗粒，病毒核酸，宿主遗传标记以及其他感兴趣的遗传材料的降解，所述降解是通过分解过程进行的。阴道排出物的风干还能防止细菌或真菌过度生长。
以下内容引自参考文献5，以便说明来自阴道排出物样品的HPV的成功检测。
通过聚合酶链反应(PCR)在患有中空细胞病，宫颈上皮内瘤样病变，或鳞状上皮癌的17位女性的卫生巾上采集的月经血或阴道排出物中100％地成功地检测到了人乳头瘤病毒。
我们提倡这种形式的宫颈癌筛查，因为它的高灵敏度和被患者的所接受。Diagn.Cytopathol.2003；28140-141.2003Wiley-Liss，Inc。
研究了对宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染的检测，作为宫颈癌筛查的手段。某些研究人员业已检测了阴门棉塞2上的HPV，并且业已证实了高度的患者接受性3，并且与医生指导的拭子4一致。
我们检验了根据在卫生巾上采集到的月经血或阴道排出物的PCR诊断生殖道HPV感染的假说。我们一共征募到了10位患者，7位具有HPV感染的病理学诊断，2位具有1级宫颈上皮内瘤样病变，1位具有宫颈的浸润性鳞状上皮癌。
通过吹风机将污染的月经或含有月经血的卫生巾风干，放入带拉链的塑料袋，并且通过普通邮件邮寄给我们。用无菌剪刀切割所述卫生巾的小片(1cm×1cm×1mm)，用于直接DNA提取。我们将相同的扩增方法用于两种类型的样本，采用共有的引物GP5+和GP6+(生物活组织检查和卫生巾)并且用于不同类型的反应(仅针对卫生巾)，引物MY09和MY11。在进行40轮扩增之后进行凝胶电泳。在所有的卫生巾上100％地检测到了HPV(10/10)。使用引物对GP5+/6+有9个样本是阳性的。一个样本(病例4)用GP5+/6+检测时是阴性，用MY09/11检测时呈阳性。
尽管病例的数量较小，但100％的灵敏度是令人鼓舞的。重要的是，即使是最低限度污染的卫生巾(9号病例)也含有足够检测的HPV DNA。该研究支持了在长达7周之后并且尽管受到了血液的污染，在卫生巾上采集到的阴道排出物中仍然可检测到HPV DNA的假设。
在HPV感染流行和/活PAP试验率低下的群体中，可以通过首先检测污染的卫生巾上的HPV状态，对女性进行定向PAP试验或阴道镜检查。尽管阴性检测并不是完全可靠的，阳性HPV检测适当地解决了女性进行PAP试验的麻烦，窘迫和时间。在检测HPV时，患者甚至可以选择匿名形式。这样，可以通过两种方法中的至少一种对更多的患者进行筛查。这种方法的改良可以扩展到对较大群体的女性进行宫颈癌筛查。
注意额外的证据对月经期间污染的卫生巾的7个其他样本进行了检测，结果100％为阳性。
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权利要求
1.检测传染性疾病因子或宿主遗传标记的存在的方法，包括将包括吸收性和多孔材料的器械简单地作为压印或拭子或者在一定时间内放置在女性患者的阴道口上，以便采集阴道排出物；在所述器械接近所述阴道口的同时促进风干至少一部分采集到的阴道排出物；和测定传染性疾病因子或宿主遗传标记在至少部分干燥的阴道排出物中的存在。
2.如权利要求1的方法，其中，所述器械是普通的或一次性内衣裤。
3.如权利要求1的方法，还包括将所述干燥的阴道排出物保存在容器中的步骤，不添加脱水剂、防腐剂或其他添加剂。
4.如权利要求1的方法，其中，所述传染性疾病因子是人乳头瘤病毒。
5.如权利要求4的方法，其中，所述测定人乳头瘤病毒存在的步骤包括核酸扩增和扩增产物的专一性鉴定。
6.如权利要求4的方法，还包括鉴定高危、中危和低危险人乳头瘤病毒的步骤。
7.如权利要求1的方法，其中，所述宿主遗传标记是细胞DNA的恶性或恶化前的转化。
8.如权利要求1的方法，其中，所述宿主遗传标记是细胞mRNA。
9.如权利要求8的方法，其中，所述mRNA被选择性地扩增、鉴定和定量。
10.如权利要求1的方法，其中，所述传染性疾病因子是性传播疾病因子。
11.如权利要求10的方法，其中，所述性传播疾病因子的存在被用作启动宫颈癌筛查的替代标记。
全文摘要
本发明提供了检测传染性疾病因子或宿主遗传标记的存在的方法，包括将吸收性和多孔材料的器械放置在女性患者的阴道口上；在所述器械靠近所述阴道口的同时，促进风干至少一部分采集到的阴道排出物；和测定传染性疾病因子或宿主遗传标记在至少部分干燥的阴道排出物中的存在。
文档编号A61B17/42GK1738912SQ200380108767
公开日2006年2月22日 申请日期2003年12月24日 优先权日2002年12月26日
发明者唐舜荣, O·W－H·钱, T-C·周, V·于 申请人:唐舜荣