专利名称：一种注射用银杏达莫粉针剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药制药领域，具体涉及一种注射用银杏达莫粉针剂的制备方法。
背景技术：
血小板活化因子PAF是由血小板和多种炎症细胞产生和分泌的一种内原性磷脂，PAF是迄今发现最有效的血小板聚齐诱导剂，具有广泛的生物活性，PAF不仅能够导致血栓形成和心脑血管疾病，还能导致其他疾病如哮喘、休克、炎症、胃溃疡、肾病等。大量文献与专利证明银杏总内酯是血小板活化因子PAF天然、专一、高效拮抗剂，其药理作用有对中枢神经系统的保护作用、对缺血损伤的保护作用、抗休克作用、抗过敏作用、抗菌消炎作用、抗器官移植中的排斥反应、降低肛门静脉压提高全身血管耐受性。因此，银杏总内酯是银杏叶提取物中具有很高生物活性的有效部位，是银杏制剂中不可缺少的有效成分。银杏总黄酮具有扩血管、抗炎、镇痛、抗自由基、降血脂、抗肿瘤及抗白血病等众多药理作用，因此，提高银杏叶总黄酮的含量能够提高银杏叶制剂的药理作用。
银杏酸是银杏叶中含有的一种有机酸，该有机酸是一种致敏物质，毒性较大，药理实验表明，银杏酸可使人出现恶心、呕吐、腹泻、食欲减退等不适症状，因此，银杏叶提取物作为药品食品时，应严格控制银杏酸的含量。
《国家药品监督管理局国家药品标准》第一册213页记录银杏达莫注射液的质量标准为每1ml含银杏总黄酮0.90-1.10mg，双嘧达莫0.36-0.44mg，对银杏叶的有效部位银杏总内酯的含量和银杏叶有毒成分银杏酸的限量未作要求；查阅国际通用银杏叶提取物的标准为银杏总黄酮＞24％，银杏总内酯＞6％，银杏酸＜5ppm，其有效部位含量较低，毒性成分含量较高。
发明内容
基于以上情况，本发明对银杏叶运用了现代工艺手段大孔吸附树脂法对银杏总黄酮进行纯化，使其含量大于40％，运用CO2超临界萃取法纯化银杏总内酯，使其含量大于10％，去除无效有毒成分银杏酸，使其含量限定为小于1ppm。
本发明目的是运用大孔吸附树脂法和CO2超临界萃取法有机的结合，提高银杏叶有效部位银杏总黄酮、银杏总内酯的含量，最大程度地提高银杏达莫粉针剂的药理活性，并进一步提高其药效，运用CO2超临界萃取法去除银杏叶有毒无效成分银杏酸，降低其含量，减少银杏达莫粉针剂的副作用。并以提取纯化后的银杏叶提取物与双嘧达莫按比例混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一.工艺制法取干燥银杏叶，放入中药多功能提取罐中，以50％-70％的乙醇进行提取，共提取2-4次，每次1-3小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加3-6倍蒸馏水，用酸调PH值为2-6，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔树脂柱，先用PH值为2-6的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的10-15倍；再用PH值为2-6的10％-30％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的6-10倍；最后用PH值为5-6的60％-80％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的6-10倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为15-40Mpa，萃取温度为50-70℃，流量为5-10L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为乙醇、丙酮中的一种或两种混合组成。解析釜1、2的压力均为4-6Mpa，解析温度为30-50℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间1-3小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物与双嘧达莫按1～3∶3～1的比例进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
二.检测分析1.本发明银杏叶提取物与市售银杏银杏叶提取物的含量比较总黄酮、银杏总内酯是银杏叶提取物重要有效部位，其含量的高低决定着银杏达莫粉针剂的药理活性，银杏酸是银杏叶中有毒成分，应限制其含量，因此，我们通过检测分析这三种物质的含量来说明本发明的实际意义。
原料本发明银杏叶提取物(北京乾露春科技有限公司实验室提供)市售银杏叶提取物(北京绿色金可生物技术股份有限公司)(1)银杏总黄酮检测分析运用高效液相色谱法进行检测。
高效液相色谱仪日本岛津公司LC-10A液相色谱仪检测器日本岛津公司紫外检测器试剂0.4％磷酸(分析纯)、甲醇(分析纯)北京化工厂提供标准品槲皮素中国生物检定所提供色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，0.4％磷酸溶液∶甲醇(1∶1)为流动相。
测定方法精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，其中最大的三个高峰，按保留时间依次为槲皮素(Q)、山奈酚(K)、异鼠李素(I)，以外标法计算Q、K、I，以下式计算总黄酮的含量Q*2.50+K*2.59+I*2.44
经过检测和计算，银杏总黄酮含量如表1所示。
(2)银杏总内酯的检测分析运用高效液相色谱法进行检测。
高效液相色谱仪日本岛津公司LC-10A液相色谱仪检测器日本岛津公司RID-6A差示光检测器试剂甲醇(分析纯)、四氢呋喃(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)由北京化工厂提供标准品白果内酯、银杏内酯A、B、C标准品由沈阳药科大学天然药化实验室提供。
色谱及检测条件用辛烷键合硅胶为填充剂，水∶甲醇∶四氢呋喃(75∶20∶5)为流动相，差示折光检测器，柱温30℃，流速1.0ml/min.
测定法取对照品溶液及供试品溶液各50μl，注入液相色谱仪，测定，用外标计算白果内酯及银杏内酯A，B，C的含量，求和即得萜类内酯的总量。
经过检测和计算，银杏总内酯量如表1所示。
(3)银杏酸的检测分析运用反相银化高效液相色谱法进行检测分析。
高效液相色谱仪日本岛津公司LC-10A液相色谱仪检测器日本岛津公司紫外检测器试剂甲醇(分析纯)、乙酸(分析纯)由北京化工厂提供标准品银杏酸对照品沈阳药科大学天然药化实验室提供。
色谱及检测条件色谱柱为Waters C18ODS(21mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇5％乙酸水溶液(90∶10)，流速0 25mL·min-1，柱温30℃。
测定法取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标计算银杏酸的含量。
经过检测和计算，银杏酸如表1所示。
表1银杏叶成分的比较
按照上述方法有进行两次检测分析，计算数据如表2.3所示表2银杏叶成分的比较
表3银杏叶成分的比较
结论通过以上数据可以得到，本发明工艺得到的银杏总黄酮、银杏总内酯较传统工艺得到的有效部位含量要高的多，本发明工艺得到的银杏叶提取物的银杏酸含量要比传统工艺的银杏酸的含量低的多。因此，本发明工艺具有相当大的实际意义。
2.本发明银杏达莫粉针剂与市售银杏达莫注射液中银杏叶提取物含量比较。
原料本发明银杏达莫粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)市售银杏达莫注射液(南京金陵制药股份有限公司生产，购自北京白塔寺医药批发公司)方法检测分析银杏总黄酮、银杏总内酯、银杏酸含量测定同1，经过检测分析计算，得到表4表4两种银杏达莫注射制剂银杏成分的比较
结论通过实验我们经过计算可以得到，本发明银杏达莫粉针剂与市售银杏达莫注射液比较，银杏总黄酮、银杏总内酯含量在知己中含量大大提高，而银杏酸的限量在本发明银杏达莫粉针剂未检出，充分说明本发明工艺具有实际意义。
二.药理学实施例实施例一利用血栓法测定本发明银杏达莫粉针剂和市售银杏达莫注射液对大白鼠血栓形成的影响。
1.实验药物生理盐水(空白组)由北京乾露春科技有限公司实验室提供。
市售银杏达莫注射液(南京金陵制药股份有限公司生产，购自北京白塔寺医药批发公司)本发明银杏达莫粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)2.实验动物体重300-400克的大白鼠30只，雌雄不分。分成三组，每组10只。
3.实验方法将大白鼠麻醉(戊巴比妥钠30-40mg/kg，ip)，仰卧位固定，分离气管，插入一塑料套管，并分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管的中段放入一根长6厘米的丝线，以肝素生理盐水溶液，充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15分钟后断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。将空白组和另外两组给药组的动物血栓湿重进行记录，进行计算，如表5所示表5各给药组的血栓重量
结论从药理实验中，我们可以得到，本发明银杏达莫粉针剂、市售银杏达莫注射液与空白组都有极显著差异(P＜0.01)，银杏达莫粉针剂与市售银杏达莫注射液有显著差异(P＜0.05)，因此，本发明银杏达莫粉针剂有着更强的药理作用。
实施例二利用在体心肌梗死法测定本发明银杏达莫粉针剂和市售银杏达莫注射液对大白鼠心肌梗死情况的影响。
1.实验药物市售银杏达莫注射液(南京金陵制药股份有限公司生产)购自北京白塔寺医药批发公司。
本发明银杏达莫粉针剂由北京乾露春科技有限公司实验室提供2.实验动物雄性大鼠250-300克20只，分成两组。
3.实验方法取雄性大鼠20只，乌拉坦0.65g/kg腹腔浅麻醉后，背位固定，用大半个橡皮球连接到人工呼吸机，进行人工呼吸，大鼠胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线切开皮肤约2厘米，在第四或第五肋间钝性分离基层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处节扎左冠脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸腔，停止人工呼吸，分别用两种制剂对10只大鼠进行实验，得到数据计算如表6所示表6银杏达莫注射制剂的药理学比较
从实验我们可以得知，本发明银杏达莫粉针剂与市售银杏达莫注射液相比较有极显著(P＜0.01)差异。
结论通过以上药理实验可以得到，本发明银杏达莫粉针剂与市售银杏达莫注射液相比较有着更强的药理作用。
四.制备实施例实施例一取干燥银杏叶1000克，放入中药多功能提取罐中，以50％的乙醇进行提取，共提取2次，每次1小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加3倍蒸馏水，用酸调PH值为2，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔吸附树脂柱，先用PH值为2的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的10倍；再用PH值为2的10％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的6倍；最后用PH值为5的60％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的6倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为15Mpa，萃取温度为50℃，流量为5L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为无水乙醇，解析釜1、2分别为4Mpa，解析温度为30℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间1小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物156.3克与双嘧达莫312.6克进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
实施例二取干燥银杏叶2000克，放入中药多功能提取罐中，以60％的乙醇进行提取，共提取3次，每次2小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加4倍蒸馏水，用酸表调值为4，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔吸附树脂柱，先用PH值为5的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的13倍；再用PH值为5的20％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的8倍；最后用PH值为5.5的70％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的8倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为25Mpa，萃取温度为55℃，流量为7.5L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为丙酮，解析釜1、2分别为4.5Mpa，解析温度为35℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间2小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物274.5克与双嘧达莫823.5克按比例进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
实施例三取干燥银杏叶1500克，放入中药多功能提取罐中，以70％的乙醇进行提取，共提取4次，每次3小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加6倍蒸馏水，用酸调PH值为6，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔吸附树脂柱，先用PH值为6的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的15倍；再用PH值为6的30％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的10倍；最后用PH值为6的80％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的10倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为40Mpa，萃取温度为70℃，流量为10L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为无水乙醇∶丙酮＝1∶1，解析釜1、2分别为6Mpa，解析温度为50℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间3小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物210.3克与双嘧达莫210.3克按比例进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
实施例四取干燥银杏叶1000克，放入中药多功能提取罐中，以65％的乙醇进行提取，共提取3次，每次3小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加5倍蒸馏水，用酸调PH值为5，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔吸附树脂柱，先用PH值为5的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的14倍；再用PH值为4的25％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的8倍；最后用PH值为6的75％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的8倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为30Mpa，萃取温度为60℃，流量为8L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为无水乙醇∶丙酮＝1∶2，解析釜1、2分别为5Mpa，解析温度为35℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间3小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物160.8克与双嘧达莫241.2克按比例进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
实施例五取干燥银杏叶1000克，放入中药多功能提取罐中，以60％的乙醇进行提取，共提取3次，每次3小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加6倍蒸馏水，用酸调PH值为5，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔树脂柱，先用PH值为6的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的15倍；再用PH值为5的10％-30％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的10倍；最后用PH值为6的75％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的10倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为30Mpa，萃取温度为70℃，流量为10L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为乙醇∶丙酮＝1∶1。解析釜1、2的压力均为6Mpa，解析温度为50℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间3小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物158.4克与双嘧达莫79.2克进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
实施例六取干燥银杏叶2000克，放入中药多功能提取罐中，以70％的乙醇进行提取，共提取4次，每次3小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加5倍蒸馏水，用酸调PH值为4，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔树脂柱，先用PH值为5的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的12倍；再用PH值为4的25％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的7倍；最后用PH值为5的65％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的8倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为200Mpa，萃取温度为65℃，流量为8L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为丙酮。解析釜1、2的压力均为5Mpa，解析温度为35℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间2小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物276.2克与双嘧达莫92.1克进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
实施例七取干燥银杏叶1500克，放入中药多功能提取罐中，以60％的乙醇进行提取，共提取4次，每次3小时，提取后合并滤液，滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加6倍蒸馏水，用酸调PH值为6，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣。取滤液上大孔树脂柱，先用PH值为5的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的13倍；再用PH值为4的25％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的10倍；最后用PH值为6的75％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的9倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用。取上述残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，萃取釜压力为25Mpa，萃取温度为65℃，流量为8L/h，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，携带剂为无水乙醇。解析釜1、2的压力均为6Mpa，解析温度为50℃，当解析釜1、2条件稳定后，萃取时间3小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料。干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。将纯化后的银杏叶提取物210.5克与双嘧达莫140.1克进行混合，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
权利要求
1.一种注射用银杏达莫粉针剂及其制备方法，其特征在于该粉针剂是由中药银杏叶提取的有效部位与双嘧达莫制成，该粉针剂中银杏叶有效部位银杏总黄酮的含量不小于40mg/g，银杏总内酯的含量不小于10mg/g，银杏酸应小于1PPM。
2.一种注射用银杏达莫粉针剂的制备方法，其特征在于包括银杏叶有效部位的提取纯化及有效部位与双嘧达莫制成的粉针制剂制备方法共两部分内容。
3.根据权利要求2所述的注射用银杏达莫粉针剂的制备方法，包括中药有效部位的提取纯化，具体有以下步骤(1)取干燥银杏叶，放入中药多功能提取罐中，以50％-70％的乙醇进行提取，共提取2-4次，每次1-3小时，提取后合并滤液；(2)滤液减压浓缩成至原药材的3-4倍的浸膏，浸膏加3-6倍蒸馏水，用酸调PH值为2-6，沉降三次，过滤，分成滤液和残渣；(3)取(2)中滤液上大孔树脂柱，先用PH值为2-6的蒸馏水洗脱，洗脱用蒸馏水为柱体积的10-15倍；再用PH值为2-6的10％-30％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的6-10倍；最后用PH值为5-6的60％-80％乙醇洗脱，洗脱用乙醇为柱体积的6-10倍，洗脱液回收乙醇，浓缩干燥粉碎后备用；(4)取(2)中残渣，干燥粉碎后放入CO2超临界萃取设备的萃取釜中，当萃取釜条件稳定后，启动携带剂泵，打入一定量的携带剂，当解析釜1、2条件稳定后，既解吸釜的压力、温度达到要求时，萃取时间1-3小时，当解析釜无液体流出时，取出萃取釜中的物料，干燥粉碎后备用，解析釜中物料弃去。(5)将(3)(4)中两种纯化后的银杏叶提取物进行混合，得到银杏达莫粉针剂的原料。
4.根据权利要求3中所述的调PH值的酸为盐酸或乙酸或硫酸。
5.根据权利要求3中所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性的大孔吸附树脂。
6.根据权利要求3中所述CO2超临界萃取中，萃取釜压力为15-40Mpa，萃取温度为50-70℃，流量为5-10L/h，解析釜1、2的压力均为4-6Mpa，解析温度为30-50℃。
7.根据权利要求3中所述CO2超临界萃取中，携带剂为乙醇、丙酮中的一种或两种混合组成。
8.根据权利要求2所述的制备方法，所述制剂制备方法包括以下步骤将权利要求3最后所得的原料与双嘧达莫按1～3∶3～1的比例进行混料，按照粉针剂的要求制成银杏达莫粉针剂。
全文摘要
本发明公开了一种注射用银杏达莫粉针剂及其制备方法，其特征在于该粉针剂是由中药银杏叶提取纯化的有效部位银杏总黄酮、银杏总内酯与双嘧达莫混合制成的粉针剂。银杏总黄酮是通过醇提水沉法提取，通过大孔吸附树脂法进行纯化，使银杏总黄酮含量提高；银杏总内酯通过醇提水沉法提取，通过CO
文档编号A61P7/00GK1557455SQ20041003912
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月10日 优先权日2004年2月10日
发明者张正生 申请人:张正生