专利名称：胚泡着床相关因子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及胚泡着床相关因子EMO-2在促进胚泡着床等方面的用途。
背景技术：
胚胎着床是哺乳动物生殖过程中所特有的一个重要步骤。因着床过程完成后才算真正怀孕，所以针对胚胎着床过程进行生育调控，不存在伦理问题，是一个理想的生育调控药具作用环节。此外，随着卵母细胞的体外培养和成熟、体外受精、受精卵的体外培养和发育等技术不断提高，移植后胚胎能否顺利着床，目前已成为影响人工辅助生育技术(ART/IVF)成功率的关键。
胚胎相对于母体来说，是一个半异体组织，易受母体排斥，只能在一个特定的时间段内(即″着床窗″)才能被母体子宫内膜组织接纳。胚胎着床过程的完成有赖于母体子宫与胚胎的同步发育、母体子宫内膜容受性和″着床窗″的形成、以及母体子宫组织局部免疫耐受性的形成，涉及细胞的增殖和分化、局部免疫功能的调节。雌、孕激素在着床中的作用已很明确，现有的笛体类避孕药就是基于它们在生殖过程中的作用发展起来的。但是，由于雌、孕激素是内分泌激素，其作用是全身性的，因此还不是最理想的生育调控因子。近年来，在胚胎着床期间子宫组织局部发挥作用的非激素类因子越来越得到人们的重视，已成为生殖生物学研究领域的一个热点。
由于种种原因，人们对与胚泡着床有关的因子还知之甚少，因此本领域迫切需要开发新的胚泡着床相关因子。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的胚泡着床相关EMO-2因子及其用途。
在本发明的第一方面，提供了EMO-2基因(及其编码蛋白)的用途，它被用作促进胚泡着床的促进剂。
本发明还提供了EMO-2基因(及其编码蛋白)的另一用途，它被用于制备促进胚泡着床的药物。
在本发明的第二方面，提供了EMO-2拮抗剂的用途，它被用作体外抑制胚泡着床的抑制剂。
本发明还提供了EMO-2拮抗剂的另一用途，它被用于制备抑制胚泡着床的药物。
在另一优选例中，所述的药物为避孕药。
在另一优选例中，所述的拮抗剂是EMO-2的反义核酸或抗EMO-2多肽的抗体。
在本发明的第三方面，提供了EMO-2激动剂的用途，它被用作体外促进胚泡着床的促进剂。
本发明还提供了一种EMO-2激动剂的另一用途，它被用于制备促进胚泡着床的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种确定测试化合物是否是EMO-2的拮抗剂或激动剂的方法，它包括步骤(a)将测试化合物和EMO-2多肽加入体外培养的胚泡作为测试组，并将EMO-2多肽加入体外培养的胚泡作为对照组；(b)观察测试组和对照组胚泡着床情况，如果测试组的胚泡着床数量大于对照组，则表示测试化合物是EMO-2的激动剂；如果测试组的胚泡着床数量小于对照组，则表示测试化合物是EMO-2的拮抗剂。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％)的EMO-2多肽、其激动剂或其拮抗剂以及药学上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了小鼠EMO-2多肽的全长氨基酸序列。
图2A和2B显示了EMO-2的反义核酸在体外可有效抑制胚泡发育。
具体实施例方式
本发明人通过深入研究发现，EMO-2基因在着床后小鼠胚胎中的表达水平明显高于着床前。研究表明，反义核酸可通过阻断EMO-2 mRNA的翻译过程，在体外可以有效地抑制胚泡从透明带中孵化出来，在体内则能明显地降低正常着床的胚胎数。这说明EMO-2基因在胚胎着床过程中起着重要的促进作用。
在本发明中，术语“EMO-2蛋白”、“EMO-2多肽”、“EMO-2因子”或“胚泡着床相关蛋白EMO-2”等可互换使用，都指具有胚泡着床相关因子EMO-2氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，这些术语还包括在其他哺乳动物(如人、狗、牛、羊、猴)中的具有促进胚泡着床功能的同系物或同源蛋白。
小鼠的Emo-2的cDNA基因登录号是556728，AY372183，全长5700bp(SEQ IDNO1)，ORF位于78-1439位，编码一个全长为454个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO2和图1)。
应理解，由于鼠等哺乳动物的EMO-2蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。
一类特别优选的蛋白是EMO-2类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中EMO-2的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据EMO-2的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。
如本文所用，“分离的EMO-2蛋白或多肽”是指EMO-2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EMO-2多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括EMO-2多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EMO-2因子相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“EMO-2多肽”指具有促进胚泡着床等EMO-2因子活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与EMO-2因子相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EMO-2因子的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EMO-2DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EMO-2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EMO-2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EMO-2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EMO-2多肽序列的至少约50个连续氨基酸，通常至少约100个连续氨基酸，较佳地至少约150个连续氨基酸，更佳地至少约200个连续氨基酸，最佳地至少约300个连续氨基酸。
本发明还涉及EMO-2多肽的类似物。这些类似物与天然EMO-2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的EMO-2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
EMO-2多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗EMO-2因子功能低下或丧失所致的疾病(如因胚泡着床能力低下而导致的不孕)，和用于筛选促进或对抗EMO-2因子功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组EMO-2因子筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激EMO-2因子功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对EMO-2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于EMO-2基因产物或片段。较佳地，指那些能与EMO-2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EMO-2因子的分子，也包括那些并不影响EMO-2因子功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EMO-2基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EMO-2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EMO-2因子或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断EMO-2功能的抗体以及不影响EMO-2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用EMO-2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与EMO-2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗EMO-2的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的EMO-2。
本发明中的抗体作为EMO-2的拮抗剂，还可用于抑制胚泡着床，从而用于避孕。给予适当剂量的抗体可以阻断EMO-2的产生或活性。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与EMO-2发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。例如，能与EMO-2结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)口服、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、阴道内或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明EMO-2多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的EMO-2蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
EMO-2的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于EMO-2的无表达或异常/无活性的EMO-2的表达所致的胚泡着床水平低下。反义核苷酸可以抑制胚泡着床，从而用于避孕。
本发明还涉及定量和定位检测EMO-2水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括放射免疫测定等方法。试验中所检测的EMO-2水平，可以用作解释EMO-2因子在不孕等疾病中的重要性和用于诊断。
一种检测检测样品中是否存在EMO-2因子的方法是利用EMO-2因子的特异性抗体进行检测，它包括将样品与EMO-2因子特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EMO-2因子。
本发明的主要优点在于，胚泡着床对EMO-2对有明显的依赖性，如果缺少EMO-2则着床不能成功。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1EMO-2cDNA的克隆1.实验动物ICR小白鼠，雌性小鼠28±2g，7-8周，成熟期。雄性小鼠30±2g，二雄一雌合笼，第二天早晨，查阴栓，发现阴栓日为妊娠第一天。
2.胚泡收集小鼠腹部用75％酒精消毒，打开腹腔，取出子宫，用PBS从子宫一端冲出胚泡，置于凹玻片上，在解剖镜下迅速收集胚泡于一小管，置于液氮，保存待用。
3.总RNA提取应用Quickprep Micro mRNA Puriflcation Kit(AmershamPharmacia Biotech)试剂提取总RNA。
4.反转录(RT)使用两种酶AMV和MMLV，经过反转录从mRNA得到cDNA(单链)。
5.DD-PCR(反转录扩增)单链cDNA经过DD-PCR得到双链cDNA。扩增中使用两种引物，随机引物和锚引物。
6.差异显示差异显示使用蛋白测序分析电泳仪(1)电泳仪的装量，灌胶(6％变性测序胶)(2)上样各种DD-PCR产物的样品(3)预电泳及电泳(4)干胶和曝光(5)刻取差异片段，在冲片后分析差异片段，并进行编号，然后参照胶与X光上的标记，刻取差异片段。冷冻保存待用。
7.DD-PCR差异片段的回收与扩增及PCR产物的纯化。
8.目的片段与载体Pucm-T(购自上海博彩生物科技公司公司)的连接，成为Pucm-T-Tar载体，转化到大肠杆菌，进行克隆(按制造商的产品说明书进行)。
9.重组克隆筛选蓝/自斑筛选，重组克隆为白色。
10.插入片段的序列分析，将插入到上述载体Pucm-T中的插入片段用ABI377全自动序列分析仪进行分析，获得各插入片段的全长序列。
结果发现有一个差异表达蛋白的cDNA如SEQ ID NO1所示，被命名为EMO-2基因。
EMO-2cDNA为5700bp(SEQ ID NO1)，第78-1439位为完整的开放读框，编码含454个氨基酸残基的多肽(图1和SEQ ID NO2)。
实施例2EMO-2的原位杂交用SEQ ID NO1中第207-398位的核苷酸片段为探针，用以下方法进行原位杂交取怀孕第4天，第5天小鼠子宫内膜，以4％多聚甲醛室温固定2.5小时，固定后样品经梯度脱水，石蜡包埋，切片。切片经脱蜡与制备好的线性DNA模板探针，进行预杂交和杂交。
结果表明，EMO-2基因具有较高的胚泡特异性，其他组织无杂交。
实施例3EMO-2反义核酸对胚泡着床的体外抑制作用本实施例使用的反义核酸或对照核酸如下反义核酸是序列如下的寡核苷酸5’-GTCTTCTGTGGGCTGCTCCTCA-3’(SEQ ID NO3)对照核酸为随机序列的寡核苷酸5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAGA C-3’(SEQ ID NO4)将转染剂LipofectAminTM2000Reagent(Invitrogen公司)和上述反义核酸或对照核酸的混合液(浓度为1μg/μl)，加入小鼠的胚泡培养液中(每孔加入100μl培养液和6μl混合液，终浓度为0.056μg/μl)，观察对胚泡生长的影响。
结果发现，体外培养妊娠第4天的小鼠囊胚，用EMO-2的反义RNA进行功能封闭时，可显著抑制胚泡的生长，抑制胚泡从透明带逸出(图2A和2B)。
实施例4EMO-2反义核酸对胚泡着床的体内抑制作用本实施例使用的反义核酸或对照核酸如下反义核酸是序列如下的寡核苷酸5’-GTCTTCTGTGGGCTGCTCCTCA-3’(SEQ ID NO3)对照核酸为随机序列的寡核苷酸5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAGA C-3’(SEQ ID NO4)将转染剂Mirus TransITPolymer Solution(Madison公司，WI，USA)和上述反义核酸或对照核酸的混合物(浓度为1μg/μl)，按表1所示剂量于妊娠第4天下午将反义核酸直接注射入每侧子宫，然后在第9天统计正常着床的胚胎数。
结果表明，EMO-2反义核酸能够明显降低正常着床的胚胎数(见表1)。
表1 EMO-2核酸对小鼠着床的影响(重复3次试验)
实施例5EMO-2的重组表达在该实施例中，以抽提的小鼠胚泡mRNA为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增RT-PCR，获得EMO-2DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-aaaCATATGatgagcttcatagattgagc-3’(SEQ ID NO5)该引物含有NdeI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；3’端引物序列为5’-tatGGATCCcaggaaacacaggctctagcct-3’(SEQ ID NO6)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和EMO-2的部分编码序列。
EMO-2 cDNA PCR产物纯化后经NdeI/BamHI酶切再与质粒pUC18按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的EMO-2蛋白cDNA NdeI/BamHI酶切片段克隆至表达载体pGEX-2T(Pharmacia，Piscataway，NJ)，形成载体pGEX-2T-EMO-2，然后转化人DH5α。阳性克隆用NdeI/BamHI酶切鉴定插入方向，酶切产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了完整的EMO-2编码序列。
挑表达EMO-2的阳性DH5α克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到EMO-2蛋白，分子量大小与预计值相符。
实施例6抗EMO-2抗体的产生1.多肽的合成以合成多抗原肽(MAP)的方式进行多肽的合成，MAP的核心是一种没有免疫原性的Lys(赖氨酸)核心，目的抗原多肽的C端偶联在Lys的两个氨基酸上。可以形成8个重复序列的多抗原肽。得到的两种合成多肽的抗原片段如下抗原多肽EMO-2NAla-Glu-Ser-Ser-Arg-Thr-Phe-Pro-Glu-His-Cys-Ala-Pro-Ser-Arg-Leu-Ala(SEQ ID NO7)抗原多肽EMO-2CThr-Val-Pro-Arg-Lys-Arg-Arg-Ala-Arg-Gly-Lys-Val-Lys-Leu-Ala-Gly(SEQ ID NO8)2.产生抗体用如上合成的2种多肽分别作为免疫原，每次以0.4mg/Kg多点注射兔的皮下，抗原溶于生理盐水并和等体积的Freund’s完全佐剂乳化，每隔二周进行一次加强免疫，用固相酶免疫测定方法，进行抗血清效价的鉴测。待抗血清的效价达到要求时，即可从兔的颈动脉取全血，并分离出血清，得到二种抗EMO-2的抗血清(抗EMO-2N抗血清和抗EMO-2C抗血清)。-20℃冷冻待用。
按实施例4的方法进行胚泡着床的体内抑制试验，不同点在于用抗血清(不用转染剂)替换反义核酸。结果如表2所示。
表2 EMO-2抗血清对小鼠着床的影响
*给药时间为妊娠第4天下午6:00到下午6:30实施例7筛选EMO-2的拮抗剂按实施例4所述方法，将以下两组物质(替换反义核酸和转染剂)施用于怀孕小鼠，然后观察对胚泡着床的体内抑制作用(a)候选物质+EMO-2因子；(b)EMO-2因子。
如果组(a)的胚泡着床率在统计学上显著低于组(b)的胚泡着床率，则表明该候选物质是EMO-2的拮抗剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市计划生育科学研究所<120>胚泡着床相关蛋白及其用途<130>044190<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5700<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(78)..(1439)<223>
<400>1catatttggc agctactggg tggaatagag ggtctaacag taggcccttg gcactttatt 60ctcttgaagc tgttaaa atg agc ttc ata gat ttg agc aac aag atg cca 110Met Ser Phe Ile Asp Leu Ser Asn Lys Met Pro1 510tca ctg ctg ttt ggt acg gaa aac gtc cca ttt tcc ttt cat gtg aaa158Ser Leu Leu Phe Gly Thr Glu Asn Val Pro Phe Ser Phe His Val Lys15 20 25tca gtg tcc agc tgc atg gct gag tcc tcc agg act ttt cct gag cac206Ser Val Ser Ser Cys Met Ala Glu Ser Ser Arg Thr Phe Pro Glu His30 35 40tgc gct cca tcg agg ctt gcc tta aca gag gcc tcc cag tgc tca gct254Cys Ala Pro Ser Arg Leu Ala Leu Thr Glu Ala Ser Gln Cys Ser Ala45 50 55cca gct ccc aag tgg acc ttc tct ttt ttc ttg tcc cat ggt tgc cct302Pro Ala Pro Lys Trp Thr Phe Ser Phe Phe Leu Ser His Gly Cys Pro60 65 70 75ggg atg gcc aca ttc agg gaa gac act ggc ctc agt agt cag aca cac350Gly Met Ala Thr Phe Arg Glu Asp Thr Gly Leu Ser Ser Gln Thr His80 85 90act cag gct cct ctc caa gaa tat gga ggc act gcc ata gtt cag acc398Thr Gln Ala Pro Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Thr Ala Ile Val Gln Thr95 100 105agg gca gac cgc tct ggc ctt ggc ctt cac aca ctt cta gca ctt tgt446Arg Ala Asp Arg Ser Gly Leu Gly Leu His Thr Leu Leu Ala Leu Cys110 115 120tca ccc gga tgt tac cga atc tgg aca aaa aga cgg aac ttc tcc agt494Ser Pro Gly Cys Tyr Arg Ile Trp Thr Lys Arg Arg Asn Phe Ser Ser
125 130 135aat atg cct atc atg cag agg ctc ttc ctg acc cag ttt aca cag ggc 542Asn Met Pro Ile Met Gln Arg Leu Phe Leu Thr Gln Phe Thr Gln Gly140 145 150 155cta aaa ggg tta agg tct cca gcc tct ata gca gat aag gtc ttc tgt 590Leu Lys Gly Leu Arg Ser Pro Ala Ser Ile Ala Asp Lys Val Phe Cys160 165 170tct ctg ccc tac tcg gtg ggc cgg gtg ttg tcc ctt tgg agc cag cac 638Ser Leu Pro Tyr Ser Val Gly Arg Val Leu Ser Leu Trp Ser Gln His175 180 185ggg ccc tct tgt acc ttc aaa ttg cca gct ctt cat tcc acc cct agc 686Gly Pro Ser Cys Thr Phe Lys Leu Pro Ala Leu His Ser Thr Pro Ser190 195 200aag cag cag ggg agc ctg aac gcc ctg agc agc cac acc acc ata cca 734Lys Gln Gln Gly Ser Leu Asn Ala Leu Ser Ser His Thr Thr Ile Pro205 210 215aat gtg cct ctt cca ggc atg gga gct gcc cac acc acc aac agc agt 782Asn Val Pro Leu Pro Gly Met Gly Ala Ala His Thr Thr Asn Ser Ser220 225 230 235cac ctg agg cta gag cct gtg ttt cct gcc ttg gtg cca aag tct tgc 830His Leu Arg Leu Glu Pro Val Phe Pro Ala Leu Val Pro Lys Ser Cys240 245 250ttg gta aca gaa gcc gct gtc agc aca ctg ctg ctc tct gcc tct gag 878Leu Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Thr Leu Leu Leu Ser Ala Ser Glu255 260 265ctc gca gtt cct ggc tgt gat gag ctg gat ggt gtg tca gca gcc tgc 926Leu Ala Val Pro Gly Cys Asp Glu Leu Asp Gly Val Ser Ala Ala Cys270 275280ccc cga cca cag agc agc cct gca cag cag aaa gag gct gag cca gag 974Pro Arg Pro Gln Ser Ser Pro Ala Gln Gln Lys Glu Ala Glu Pro Glu285 290 295aag aga cca aag aaa gtc tca cag atc cgc atc cgg aaa acc att cct1022Lys Arg Pro Lys Lys Val Ser Gln Ile Arg Ile Arg Lys Thr Ile Pro300 305 310 315aaa cca gat ccc aac ctt acc cca atg ggc ctg cct cgg ccc aaa agg1070Lys Pro Asp Pro Asn Leu Thr Pro Met Gly Leu Pro Arg Pro Lys Arg320 325 330tta aag aag aag gag ttt agt tta gag gaa atc tat aca aac aag aat1118Leu Lys Lys Lys Glu Phe Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Lys Asn335 340 345tac aag tct cct cct gcg agc agg tgt tta gag acc atc ttt gag gaa1166Tyr Lys Ser Pro Pro Ala Ser Arg Cys Leu Glu Thr Ile Phe Glu Glu350 355 360ccc aaa gaa cga aat ggt acc ctg atc tct atc agc cag cag aaa agg1214Pro Lys Glu Arg Asn Gly Thr Leu Ile Ser Ile Ser Gln Gln Lys Arg365 370 375aag cgt gtt ctg gaa ttc cag gat ttt acc gtc cct cga aag aga cga1262Lys Arg Val Leu Glu Phe Gln Asp Phe Thr Val Pro Arg Lys Arg Arg380 385 390 395gct cga ggt aag gtg aag ctg gcc ggc agc ttc acc agg gcc cag aag1310Ala Arg Gly Lys Val Lys Leu Ala Gly Ser Phe Thr Arg Ala Gln Lys
400 405 410gcg gct ctg cag act cag gag ctg gac gct ctt ctg att cag aag ctg 1358Ala Ala Leu Gln Thr Gln Glu Leu Asp Ala Leu Leu Ile Gln Lys Leu415 420 425atg gaa ctg gag acg ttc ttt gcc aag gag ggg gag cag gag cat cag 1406Met Glu Leu Glu Thr Phe Phe Ala Lys Glu Gly Glu Gln Glu His Gln430 435 440cca gct gct gag aac agt tcg ggg tct cca ctt tgaacttttg cagacctccc1459Pro Ala Ala Glu Asn Ser Ser Gly Ser Pro Leu445 450tggatgaggt tccttgattt tagccctgtg cccaaaccac tcacaatgcc cagcccatga1519atttttactt atttcaaggt gcagcctttt tagaagctgg tgaagaaggg ccctctaatt1579ctactgctga gtctagagcc tcaggaatgc tccctttctc ctggggatgg tcctgagtga1639ccaggccacc tccttcccgt ctcccatcac tggtggaaaa gccacacatc ttaagcaaca1699ctaggaatct aaggcctcgt tgtctgtgtg tccacacgaa agctcctctc cattcatggt1759gctgctcgcc caagatgact tagaaacctg gcctggggag gacctggctg cctggtctgt1819gtgttctcac cagcttgtta tggtgactga gaaagatgaa ctggtgtgtt tcttgactct1879gattctgtct gcccaggacc tttattctga gagaatgtgt gtttgtgtgt gtttgtggct1939tttccccatc ttttctccca tctgtgactg cgggtcacta gtgccagagg agccgtccag1999gccccagcgt aagttgcact ttttaatgtt atggtgttga ttattttcat ttttcttctt2059cttttgtttt tgtattattg ctgcatgttt ggggtctcta aatgtgattt taaaccattt2119tgtaagacat taaggagaaa gacaatttac gtcttaggag aatatgtgac aggcattgat2179cagcacatgg aggggcagtg ttcccaacca tgtgtttcag gcagccctcc cccaccccca2239gcttttcatg tagttcacta gaggaagcac ttttcacctc cttctcagtc ctgcccactg2299aatacacata ttcatttagt gacgtgcata aaagcagatt tctctcgtaa ccacttaaaa2359actgttaagg tggagtgtgg gtttctctga aatgttggta tatgatgaag ttagcagtgg2419tgtcagaggc tgaccaagag tgttttcagc tgctagagtg cctggttctg tcaagggcca2479gagccagtgc tctctgagag tgcctcgtgg actctgctcc ctcgtcaaac ctactggaaa2539ggtttgcatg ctacaagtag cacagttcct aggtttgcgc ccagaggagt ctgcaggcgg2599taggctgccg tctgtcgtct gagcagcagg ccctcagagc tcaccctccc cagtgtcctt2659actgtgctcc ttcctctcct gtgtgttctc atcccaccct ctctcccatt cattcttcac2719acctaccgct cagaggtcag aagttcaaac tgcttggctg atggctaaga tgctcaagct2779agctgctgaa caatgctcat ttcttcccat tctcctggct tggtccaggg acatttctct2839gttcgtctgt agagaagagt gagcagtgct gtcctggaat gttggccaac gcttctacga2899ttctttcatt ccccatttgt cagtggctaa ggagaagggg caccaccagt tcagggtctt2959tatgtgcctt tcctttgcgg gttggtggtc tgggccaccc tgaaacagtt aaactggaca3019taagtatggg gaaacgtatc atgtccttca cctcctcagc tgtttaaata agttaacaca3079cacctgctgg tgtatggaga cttgaaggtc acagctctat cacagaagag aacaagctag3139tttgcacgat ggtcttcagc agtgtatgca gatcctggtt tacacatgat gcccagacca3199tacacacgtg acctgtgttc acctgaatct ctctctccct cgttggggca ggagttttag3259ttactcagtg cttctgaact ctgtgttgtt acttcaggga ctgaaatgag ttacacattt3319tgcccttcta caagtacatc taagacactg tacattagac agcttgcaag ctagtgggca3379gcaaacagcc tttcatcagt ttaaccacca tggttactgg ggcatcagat taccccaaaa3439aggtgaggtg tccacagctg gggtaccacc agtatacaga cctttagaat ttgtccatga3499ctagtgtggc atgtaagagg ctggaaacac tggtctggac tcttagcatc tcggagcaca3559ggacttgtcc tgggaatgga agaggaaatc tgccatcttg gtctgccctc cagctcagaa3619ctaagagact cagccacacc tgtcttacca tcatgtttca cagtggtcag ccagcctcag3679agacacctta gtgtcctcag aaccttggtc tttgacaatg actggaggtg gtggctgctg3739gcatgtcacc tgccaaacct ataggagtgg ttctgtaaag gtagaatttc tgaggatggg3799gacttgccac tcaagtgatg agaagctgac attaagcaca acatacctag ctgtagctca3859cctccagaag tttagtgttt tcatgattat ggggaaagaa gacaaatttc aggttcagcc3919
agatttcagt cgtttccttg gccacctttc agtctctcgc cagagcagcc tcttccctca3979ctagtgcctg tcttcttttc ctcccctgct gtcccatccc gcctctccac ccatctagtt4039gtacctcatc acctgttaaa gcagattgtg tctgtcttcc tgctgccctt actataagag4099ctgactgaga gaggtgcagt gggaagagat gaagcttttt tgccttactg gagcctgaag4159agctcagaaa ctcatgctgt gaatcctaaa ctctgtgctc ctccaagagc tgtgaaaatc4219atgacttttt tttttttttt ttccacaatt ttgcctgaaa gggtcttctg tgagggctcc4279agagccagcc tgaggtcagt tctagatccc accctctggg catccttccc ctgggtgtgt4339cctctgccca ccaggctaag agcagcagca agtctgcagg gctgtggcag caggtccgag4399gctgcagtgc agccaagtgg acccagccct ccatctcccc aggctggggc tcagtctctt4459ctgtaccatg tgcattaaga tctgtgcaag accaactttt aggttgtgat actttcctcc4519tggtacctgg ggggagggga gtatgcagtt ggtgctttct ttaatatcct tggtttgttt4579ctatagcttt tcccctggta tcatgaaaag ggccttttta atgaccacat tgtgggtggc4639tgtatccaaa gcataaataa ttggccagtg gtatggaatg tcctcacctg cattcctgtc4699aggagagggc tactttcctg gactgaacta tatagaactg gctaggaaga tgagttaaat4759tttgttcaaa tcacaattaa tattccaatt tagccacact ttgaccagca aaagccatct4819tggttgtgaa gctggggccc tcatttagcc gccatccagc ccagcatgct aaaatctgag4879gctcattctg tctttataag actgtctggt gttggttgga ttttaattct caacaagagg4939cccccttgaa ctaggatctg ggccagtaag ttgctgtccc tagtgttcct gtattatcat4999ggctaatagt tcagtgaaat gtgtccatct ttggtaatgc tagtatacat gataccctac5059agttcctttt ctgtttgata gtttgtgact ctaaatgccc actgttacat taattaattt5119atggaaataa atttttcttg aaaaccattc agataattgt caaggctatt ttgttcttta5179gggcttggta gtaggtttga attttcccgg taatattcca attagacatg ctccctccca5239ccttaatagg tgtgcttgcc tctcctgtgc cagaacctcc ctcacattcc tgcatggtca5299cttccatcac gtcatccaga tctttacatt cccagatcgc tggtcttgaa cgtggtcccc5359tcccattcca tatctgctgc ccgcacaccc caaggcattt tgttatggct cctcccccct5419gtctgtgcta ataactataa caaaagctct acaaggtcag gacctttcat tttcttagct5479ctagaccctt ctggtctctt tggtacctag aacaatgttt tatatttaca gctgtttacc5539gcctaaatat cgttttggtc agtgaactgc atattaccat aagatggtaa tggagctgaa5599aaattcctgg gacctagcga ggtcacagct gtgatgatgt gttttactca ggtcttggtg5659caaacaagcc agtgcattgc cagtcttgta aaaatgtagc a5700<210>2<211>454<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Met Ser Phe Ile Asp Leu Ser Asn Lys Met Pro Ser Leu Leu Phe Gly1 5 10 15Thr Glu Asn Val Pro Phe Ser Phe His Val Lys Ser Val Ser Ser Cys20 25 30Met Ala Glu Ser Ser Arg Thr Phe Pro Glu His Cys Ala Pro Ser Arg35 40 45Leu Ala Leu Thr Glu Ala Ser Gln Cys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Trp50 55 60Thr Phe Ser Phe Phe Leu Ser His Gly Cys Pro Gly Met Ala Thr Phe65 70 75 80Arg Glu Asp Thr Gly Leu Ser Ser Gln Thr His Thr Gln Ala Pro Leu85 90 95Gln Glu Tyr Gly Gly Thr Ala Ile Val Gln Thr Arg Ala Asp Arg Ser
100 105 110Gly Leu Gly Leu His Thr Leu Leu Ala Leu Cys Ser Pro Gly Cys Tyr115 120 125Arg Ile Trp Thr Lys Arg Arg Asn Phe Ser Ser Asn Met Pro Ile Met130 135 140Gln Arg Leu Phe Leu Thr Gln Phe Thr Gln Gly Leu Lys Gly Leu Arg145 150 155 160Ser Pro Ala Ser Ile Ala Asp Lys Val Phe Cys Ser Leu Pro Tyr Ser165 170 175Val Gly Arg Val Leu Ser Leu Trp Ser Gln His Gly Pro Ser Cys Thr180 185 190Phe Lys Leu Pro Ala Leu His Ser Thr Pro Ser Lys Gln Gln Gly Ser195 200 205Leu Asn Ala Leu Ser Ser His Thr Thr Ile Pro Asn Val Pro Leu Pro210 215 220Gly Met Gly Ala Ala His Thr Thr Asn Ser Ser His Leu Arg Leu Glu225 230 235 240Pro Val Phe Pro Ala Leu Val Pro Lys Ser Cys Leu Val Thr Glu Ala245 250 255Ala Val Ser Thr Leu Leu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala Val Pro Gly260 265 270Cys Asp Glu Leu Asp Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Arg Pro Gln Ser275 280 285Ser Pro Ala Gln Gln Lys Glu Ala Glu Pro Glu Lys Arg Pro Lys Lys290 295 300Val Ser Gln Ile Arg Ile Arg Lys Thr Ile Pro Lys Pro Asp Pro Asn305 310 315 320Leu Thr Pro Met Gly Leu Pro Arg Pro Lys Arg Leu Lys Lys Lys Glu325 330 335Phe Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Pro Pro340 345 350Ala Ser Arg Cys Leu Glu Thr Ile Phe Glu Glu Pro Lys Glu Arg Asn355 360 365Gly Thr Leu Ile Ser Ile Ser Gln Gln Lys Arg Lys Arg Val Leu Glu370 375 380Phe Gln Asp Phe Thr Val Pro Arg Lys Arg Arg Ala Arg Gly Lys Val385 390 395 400Lys Leu Ala Gly Ser Phe Thr Arg Ala Gln Lys Ala Ala Leu Gln Thr405 410 415Gln Glu Leu Asp Ala Leu Leu Ile Gln Lys Leu Met Glu Leu Glu Thr420 425 430Phe Phe Ala Lys Glu Gly Glu Gln Glu His Gln Pro Ala Ala Glu Asn435 440 445Ser Ser Gly Ser Pro Leu450<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>3gtcttctgtg ggctgctcct ca 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>4tgaggagcag cccacagaag ac 22<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>5aaacatatga tgagcttcat agattgagc29<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>6tatggatccc aggaaacaca ggctctagcc t31<210>7<211>17<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>7Ala Glu Ser Ser Arg Thr Phe Pro Glu His Cys Ala Pro Ser Arg Leu
1 5 10 15Ala<210>8<211>16<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>8Thr Val Pro Arg Lys Arg Arg Ala Arg Gly Lys Val Lys Leu Ala Gly1 5 10 1权利要求
1.一种EMO-2基因的用途，其特征在于，它被用作促进胚泡着床的促进剂。
2.一种EMO-2基因的用途，其特征在于，它被用于制备促进胚泡着床的药物。
3.一种EMO-2拮抗剂的用途，其特征在于，它被用作体外抑制胚泡着床的抑制剂。
4.一种EMO-2拮抗剂的用途，其特征在于，它被用于制备抑制胚泡着床的药物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物为避孕药。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂是EMO-2的反义核酸或抗EMO-2多肽的抗体。
7.一种EMO-2激动剂的用途，其特征在于，它被用作体外促进胚泡着床的促进剂。
8.一种EMO-2激动剂的用途，其特征在于，它被用于制备促进胚泡着床的药物。
9.一种确定测试化合物是否是EMO-2的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于，它包括步骤(a)将测试化合物和EMO-2多肽加入体外培养的胚泡作为测试组，并将EMO-2多肽加入体外培养的胚泡作为对照组；(b)观察测试组和对照组胚泡着床情况，如果测试组的胚泡着床数量大于对照组，则表示测试化合物是EMO-2的激动剂；如果测试组的胚泡着床数量小于对照组，则表示测试化合物是EMO-2的拮抗剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的EMO-2多肽、其激动剂或其拮抗剂以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种胚泡着床相关因子EMO－2。EMO－2因子具有促进胚泡着床的功能，而EMO－2的反义核酸及其多肽抗体可抑制胚泡着床。本发明还公开了利用这种EMO－2因子筛选促进或抑制胚泡着床的化合物的方法。
文档编号A61P15/00GK1795928SQ20041009337
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者刘承权, 袁瑶, 王健, 王忠兴 申请人:上海市计划生育科学研究所