专利名称：降低应激对皮肤调理的作用的方法
技术领域：
本发明涉及降低长期心理应激对皮肤调理的作用的方法。本发明还涉及用于该方法的化合物和鉴定合适的化合物的实验方法。
背景技术：
经纵向研究表明，因日常生活导致的神经内分泌应激是年龄相关病症的主要内驱力。另外，多项消费者研究表明，心理应激对个人健康状况至关重要。但对于这种应激对皮肤外观的影响及其根本的生物学机制却知之甚少。
发明概述我们开发出一种模拟慢性应激作用的模型系统，并用这个系统研究了慢性应激对皮肤的作用。我们运用该模型，发现用糖皮质激素对皮肤细胞进行慢性处理所代表的慢性应激，会导致皮肤对急性应激做出有利反应的能力降低。具体地说，我们发现慢性应激细胞中，表达基质降解和基质合成所需蛋白质的能力降低，基质降解和基质合成过程是皮肤修复和维持所必需的。换言之，我们发现慢性应激导致与皮肤调理明显有关的皮肤基质的重建受到损害。
我们还发现，正如与皮肤炎症反应有关的蛋白质的表达增加所显示的一样，慢性应激皮肤细胞显示对急性应激的敏感性显著增加。
这些发现使我们能够开发出一种鉴定能够降低心理诱导应激等神经内分泌介导应激对皮肤调理的作用的化合物的实验方法。运用这一实验方法，我们鉴定出许多降低慢性糖皮质激素暴露对皮肤细胞对急性应激反应能力的有害作用的药物。
因此，第一方面，本发明提供降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的方法，该方法包括给予个体能够抑制真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激的组合物。
在一个相关方面，本发明提供能够抑制真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激的组合物在制备用于降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的组合物中的用途。
优选所述组合物经口服或局部给药。
在一个优选的实施方案中，所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质能够抑制与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，第二种物质能够抑制真皮细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
优选所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀(mevinolin)、没药酸(commipheric acid)、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞(wolfberry)提取物、香菇提取物、激活素(activin)、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香(boswellia)提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
第二方面，本发明提供包含第一种物质和第二种物质的组合物，其中第一种物质能够抑制与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，第二种物质能够抑制真皮细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
在一个相关方面，本发明提供包含第一种物质和第二种物质的组合物，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
在一个优选的实施方案中，所述组合物的形式为营养补充剂(nutritional supplement)或化妆品组合物。
第三方面，本发明提供用于能够降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的化合物的鉴定方法，该方法包括(i)在糖皮质激素受体激动剂存在下，在无候选化合物时将会导致细胞经受慢性应激的条件和时间内，使真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞与候选化合物接触；(ii)使细胞经受急性应激；(iii)分析细胞中的一种或多种细胞标记，所述标记选自炎性细胞募集标记，其中所述细胞是与皮肤炎症反应有关的细胞；基质降解标记，其中所述细胞是真皮细胞；和/或基质合成标记，其中所述细胞是真皮细胞；和(iv)确定候选化合物是否影响所述的一种或多种细胞标记的状态。
优选步骤(iv)包括将所述标记在有候选化合物时的状态与所述标记在无候选化合物时的状态进行比较。
优选炎性细胞募集标记是ICAM-1和/或vCAM-1的表达水平。
优选基质降解标记选自MMP-1、MMP-2和/或MMP-9的表达水平。
优选基质合成标记选自前胶原-1、胶原I和/或胶原III的表达水平。
本发明还提供用于降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的组合物的制备方法，该方法包括(i)在糖皮质激素受体激动剂存在下，在无候选化合物时将会导致细胞经受慢性应激的条件和时间内，使真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞与候选化合物接触；(ii)使细胞经受急性应激；
(iii)分析细胞中的一种或多种细胞标记，所述标记选自炎性细胞募集标记，其中所述细胞是与皮肤炎症反应有关的细胞；基质降解标记，其中所述细胞是真皮细胞；和/或基质合成标记，其中所述细胞是真皮细胞；(iv)确定候选化合物是否影响所述的一种或多种细胞标记的状态；(v)选择出步骤(iv)中所鉴定的影响所述的一种或多种细胞标记状态的候选化合物；和(vi)将所述化合物与化妆品或药物可接受的载体或稀释剂混合。
发明详述本文所用的所有科技术语与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同，除非另有说明。
实验方法本发明的实验方法可用于鉴定缓解慢性应激对皮肤的作用的化合物。使用体外模型，测试药物降低或防止对下述细胞的作用的能力经受慢性应激的真皮细胞、与皮肤炎症反应有关的细胞或源自糖皮质激素等糖皮质激素(GC)受体激动剂处理的细胞。缺乏试验药物时，将细胞暴露于GC受体激动剂一段时间，在细胞对急性应激(例如氧化应激)的反应上产生有害作用。因此，经过预处理期后，使细胞经受急性应激，检测关键标记的状态，特别是炎症/炎性细胞募集标记、基质合成标记和/或基质降解标记的状态，以测定GC受体激动剂介导的应激的作用。
用于本实验方法中合适的细胞分为两类(1)与炎症反应有关的细胞和(2)真皮细胞。
皮肤中与炎症反应有关的细胞包括内皮细胞、脂肪细胞、免疫细胞、肥大细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans′cells)和造血源(haemopoietic origin)的细胞，例如T淋巴细胞、巨噬细胞、白细胞和嗜中性粒细胞及其衍生细胞。优选的细胞是内皮细胞。
真皮细胞包括真皮滤泡细胞(真皮乳头和结缔组织鞘)、真皮成纤维细胞、毛囊角质形成细胞和黑素细胞、皮脂腺细胞，例如皮脂细胞(sebocytes)及其衍生细胞。优选的细胞是成纤维细胞和黑素细胞。细胞通常来源于哺乳动物。
测定炎症状态的标记时，优选的细胞类型包括内皮细胞，测定基质更新(matrix turnover)的标记时，优选的细胞类型包括真皮成纤维细胞，更优选新生儿真皮成纤维细胞。
另一优选的细胞类型是毛囊黑素细胞，因为这些细胞负责提供毛发色素。因此，这些细胞可用于本发明的实验方法，以鉴定可用于降低心理应激对毛发脱色/毛发变白的作用的药物。
细胞可以是仅在细胞培养物中进行为数有限的传代的原代细胞，或是无限增殖化细胞系。术语“从其衍生的”是指从原代细胞培养物获得的无限增殖化细胞系。
用本领域众所周知的标准细胞培养技术使细胞生长和传代。培养基通常补充了特定细胞类型所需的动物源性血清制品和生长因子。
在实验的第一阶段，细胞用一种或多种糖皮质激素等糖皮质激素(GC)受体激动剂进行预处理，该GC受体激动剂与GC受体结合并激活GC受体。GC受体激动剂具体的实例包括地塞米松、氢化可的松、皮质醇、泼尼松龙和倍他米松。
用一种或多种GC受体激动剂进行预处理，包括有可能在细胞对给予的其它化合物(例如促肾上腺皮质素释放激素(CRH)做出反应时，产生该激动剂。然而，优选的是预处理包括向培养基中添加GC受体激动剂，即直接处理，而不是刺激细胞原位产生糖皮质激素。
通常在培养基中加入浓度为1nM-10μM的GC受体激动剂。
细胞优选用GC受体激动剂预处理至少2天，更优选至少3天或4天，最优选至少5天。通常，定期(例如每日)给予GC受体激动剂，因为这很可能更近似地模拟慢性应激的持续作用。
由于本发明的目的是为了确定药物是否能够拮抗GC受体激动剂的作用，因此在预处理阶段，一般是在开始时，便向培养基中加入候选药物。这可方便的在加入GC受体激动剂的同时进行。再者，通常候选药物也是定期(例如每日)给予的。
预处理之后，对细胞施加急性应激，检测细胞对急性应激的反应。急性应激包括氧化应激(例如乙酸肉豆蔻佛波醇)、其它形式的化学应激、机械应激或电磁应激例如UV辐射。
在一个或多个合适的时间点，收获组织培养上清液和/或细胞沉淀，并进行测试，以检测目标标记的状态。例如，可用基于核酸的检测技术，例如PCR或杂交，或者基于蛋白质的检测技术，例如免疫测定，检测目标基因的表达水平。
合适的炎症状态标记包括胞间黏着分子(ICAM)如ICAM-1和vCAM等。合适的基质合成标记包括前胶原-1、胶原I和胶原III，合适的基质降解标记包括MMP-1、MMP-2和MMP-9(金属基质蛋白酶)。
用于本发明方法中的下述合适的药物，与仅有GC受体激动剂的对照相比，将降低炎症状态/炎性细胞募集标记的水平，优选至仅有溶媒的对照的至少+20％或+10％。
用于本发明方法中的下述合适的药物，与GC受体激动剂对照相比，将增加基质合成标记和/或基质降解标记的水平，优选至仅有溶媒的对照的至少约-50％或约-20％。
测试目标标记状态的合适的时间点，通常随具体标记而变化。例如，在急性应激后3小时至7小时间内，优选对ICAM-1表达进行至少一次测定。相比之下，在急性应激后18小时至36小时内，优选对MMP-1表达进行至少一次测定。
候选药物可包括糖皮质激素受体拮抗剂、PPAR-γ受体激动剂、AP-1/NF-κB抑制剂、PXR激动剂、LXR激动剂、皮质醇抑制剂和磷酸酶抑制剂。一般地讲，可从组合文库、肽和肽模拟物、确定的化学实体(defined chemical entities)和天然产物文库中，筛选出作为GC介导的慢性应激抑制剂的活性成分。
用于本发明方法的药物直接靶向糖皮质激素对皮肤的慢性作用。因此，可能需要证实，试验药物在急性应激处理步骤中，不直接影响目标细胞标记的表达，而是在预处理步骤中影响GC受体激动剂的作用。例如，这可通过在预处理步骤中，使用包括试验药物但无GC受体激动剂的对照加以证实。
降低心理介导的应激对皮肤的作用的方法本发明基于以下发现，即皮肤细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞慢性暴露于糖皮质激素时，能够使皮肤对付急性应激的机制遭到破坏。这一发现提示，阻断糖皮质激素对皮肤细胞的有害作用，将降低心理介导的应激对人和其它动物皮肤的作用。进而，将降低或改善心理应激对皮肤调理的作用。
因此，本发明提供降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的方法，该方法包括给予个体能够抑制糖皮质激素诱导的慢性应激对皮肤的作用的组合物，尤其是给予抑制糖皮质激素诱导的慢性应激在皮肤对急性应激(例如氧化应激和/或暴露在UV下)反应中的作用的组合物。因为我们已确定，糖皮质激素诱导的慢性应激对皮肤的作用包括降低皮肤的基质更新，增强对急性应激的炎症反应，在一个优选的实施方案中，所述组合物能够降低这两种不同的作用。这可通过单一活性成分或分别靶向各个作用的两种单独的成分得以实现。
因此，在一个优选的实施方案中，所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质抑制与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，第二种物质抑制真皮细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。优选与皮肤炎症反应有关的细胞是内皮细胞。优选真皮细胞是成纤维细胞。
基质更新进而可分为两个过程——基质降解和基质合成。优选组合物包含降低慢性GC介导的应激对这两个过程的有害作用的物质。
另一方面，本发明提供降低心理介导的应激对人或动物毛发颜色的作用的方法，该方法包括给予个体组合物，所述组合物抑制糖皮质激素诱导的慢性应激对黑素细胞的作用，尤其是抑制糖皮质激素诱导的慢性应激在细胞对急性应激反应中的作用。
可通过多种途径给予组合物，例如局部给予或系统给予如口服给予。组合物通常以每日三次或每周两次的频率给药。
组合物本发明的组合物和用于本发明方法的组合物，优选包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质能够抑制与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，第二种物质能够抑制真皮细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
这类物质包括PPAR-γ激动剂、AP-1/NF-κB抑制剂、PXR激动剂、LXR激动剂、皮质醇抑制剂和磷酸酶抑制剂。具体实例包括人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物、枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc和乳香提取物。
可用本发明的上述实验方法对其它活性剂进行鉴定。特别是可运用本发明中使用与炎症反应有关细胞的实验，检测炎性细胞募集标记(例如ICAM-1表达或vCAM表达)，对活性剂进行鉴定，所述活性剂降低慢性GC介导的应激在皮肤对急性应激的炎症反应中的作用。可运用本发明使用真皮细胞的实验，检测基质降解和/或基质合成反应的标记(例如MMP-1和/或前胶原-1的表达)，对活性剂进行鉴定，所述活性剂降低慢性GC介导的应激对皮肤基质更新过程(即基质降解和/或基质合成)的作用。
在一个优选的实施方案中，所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
局部用组合物本发明的组合物可局部给予受治疗者，即直接将组合物涂抹或涂敷在包括头皮的皮肤上。可通过将安全有效量的上述活性物质与药物可接受的局部用载体混合，制备此类组合物。
用于本发明的局部用组合物可制成多种多样的产品类型。这些类型包括但不限于洗剂、乳膏剂、凝胶剂、棒状制剂(stick)、喷雾剂、软膏剂、糊剂、精油、摩丝和化妆品。这些产品类型可含有几种类型的载体系统，包括但不限于溶液、乳液、凝胶、贴皮剂和固体。
用于本发明的配制成溶液剂的局部用组合物，通常包括药物可接受的水溶剂或有机溶剂。术语“药物可接受的水溶剂”和“药物可接受的有机溶剂”是指能够使活性物质分散或溶解于其中的溶剂，且具备可接受的安全性能(例如刺激特征和致敏特征)。合适的有机溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇(200-600)、聚丙二醇(425-2025)、聚乙烯吡咯烷、丙二醇-14丁基醚、甘油、1，2，4-丁三醇、山梨醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇、异丙醇、丁二醇及其混合物。这些用于本发明的溶液剂优选含有约0.001％至约10％、更优选约0.01％至约8％、再更优选约0.1％至约5％、也优选约0.5％至约3％的活性物质，和优选约50％至约99.99％、更优选约90％至约99％可接受的水溶剂或有机溶剂。
如果将用于本发明的局部用组合物制成气雾剂，以喷射的方式施用于皮肤，需向溶液组合物中加入推进剂。
局部用组合物可制成含有润肤剂的溶液剂，润肤剂即用于防止或减缓干燥以及保护皮肤的材料。已知各种各样合适的润肤剂，并可用于本文(参见Sagarin，Cosmetics，Science and Technology(化妆品科学与技术)第二版，第一册，第32-43页(1972))。这类组合物优选含有约2％至约50％局部用药物可接受的润肤剂。
如果将载体制成乳剂，优选约1％至约10％、更优选约2％至约5％的载体系统含有乳化剂。乳化剂可以是非离子乳化剂、阴离子乳化剂或阳离子乳化剂。例如McCutcheon′s Detergents and Emulsifiers(McCutcheon洗涤剂和乳化剂)，北美版(North American Edition)，第317-324页(1986)公开了合适的乳化剂。
单相乳化护肤制剂，例如水包油型和油包水型的洗剂和乳膏剂，在化妆品领域是众所周知的。此类乳剂可稳定和增强活性物质的渗透性。也可使用水包油包水型等多相乳剂组合物。一般地讲，此类单相或多相乳剂含有作为必需成分的水、润肤剂和乳化剂。
可使用的另一个乳化载体系统是微乳载体系统。此类系统含有约9％至约15％角鲨烷、约25％至约40％硅油、约8％至约20％脂肪醇、约15％至约30％聚氧乙烯失水山梨糖醇单脂肪酸(以商品名吐温(Tweens)出售)或其它非离子表面活性剂和约7％至约20％水。
还可使用脂质体制剂。该制剂可稳定活性物质，也可改进不能充分渗透的活性物质的释放。可根据Mezei和Gulasekharam，Journal ofPharmaceutics and Pharmacology，第34册(1982)，第473-474页所述方法或其修改方法，先将活性物质与二棕榈酰基磷脂酰胆碱等磷脂、胆甾醇和水混合，制备此类组合物。用于形成脂质体的合适的组合物的表皮脂质可以代替磷脂。然后将脂质体制剂掺入上述的一种局部用载体系统(例如凝胶或水包油乳液)中，以制备脂质体制剂。Mezei，M.，“Liposomes as a Skin Drug Delivery System(作为皮肤递药系统的脂质体)”，Topics in Pharmaceutical Sciences(制药科学专题(D.D.Breimer和P.Speiser主编)，Elsevier Science Publishers B.V.，NewYork，N.Y.，1985，第345-358页中，描述了局部使用脂质体的其它组合物及其化妆品/药物用途。
如果将局部用组合物制成棒状凝胶或棒状化妆品，可按前述文献的方法，在乳膏剂或洗剂中加入适量的增稠剂，制备这类组合物。
局部用组合物也可制成化妆品，例如粉底化妆品。粉底化妆品是以适量增稠剂、色素和日用香料为基础的溶液或洗液。
局部用组合物除包括上述组分外，还可包括其它各种各样的油溶性原料和/或水溶性原料，这些原料以其领域规定的水平，按常规用于局部用组合物中。
组合物中还存在各种水溶性原料。这些原料包括保湿剂、蛋白质和多肽及防腐剂。另外，本文所用的局部用组合物可包含常规化妆品辅助剂，例如染料、遮光剂(例如二氧化钛)、色素和香料。
用于本发明的局部用组合物还可包括安全有效量的渗透增强剂。优选的渗透增强剂的量占组合物的约1％至约5％。美国专利6,068,834中描述了可用渗透增强剂的实例。组合物中也可包括其它常规的护肤品添加剂。例如可使用胶原、透明质酸、弹性蛋白、水解产物、樱草油、霍霍巴油、表皮生长因子、大豆皂苷(soybeansaponins)、粘多糖及其混合物。
组合物中还可包括各种维生素。例如可使用维生素A及其衍生物、维生素B2、生物素、泛酸、维生素D及其混合物。
本发明的组合物中，可能需要包括一种或多种防晒剂。例如Cosmetics，Science and Technology第二版(1972)，第1册，第VIII章，第189页及其后的参考文献，描述了各种各样的常用防晒剂。还可参见美国专利6,068,834。
防晒剂必须与活性物质相容。组合物优选含约1％至约20％、更优选约2％至约10％的防晒剂。准确的用量随所选择的防晒剂和所需要的防晒因子(Sun Protection Factor，SPF)而变化。
本发明的任何组合物中还可加入改善组合物的皮肤直接性，尤其是增强组合物的耐水冲洗性或耐擦除性的成分。提供此益处优选的成分是乙烯和丙烯酸的共聚物。美国专利4,663,157公开了含有这一共聚物的组合物。
本发明涉及降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的方法。此方法包括在皮肤或皮肤部位，例如头皮或面部，给予安全有效量的本发明组合物。活性剂的用量和使用频率将随皮肤的最初状态而变化。
可使用任何不超过毒性水平的剂量，因此，设计出一些剂型，尤其是局部用剂型，“剂量”为提供所需效果的任何用量，该用量由于使用频率和使用量可能非常之大，以致于最大有效量是不切实际的。
在局部用组合物中使用的安全有效量的活性物质，通常每次使用约1μg/cm2皮肤至约1mg/cm2皮肤，优选每次使用约2μg/cm2皮肤至约800μg/cm2皮肤，更优选约30μg/cm2皮肤至约700μg/cm2皮肤，最优选约75μg/cm2皮肤至约250μg/cm2皮肤。使用频率范围一般约每天四次至约每周两次，更优选约每天三次至约隔天一次，更优选至少每天两次。
药物组合物本发明的组合物可与药物可接受的载体或稀释剂联用以制备药物组合物。适用于此类组合物的药物可接受的稀释剂或载体，在制药领域广为人知。本发明的组合物通常含1-90％(重量)活性物质，例如1-50％(重量)活性物质。
药物组合物可由固体剂型组成，例如片剂、硬明胶胶囊剂、软明胶胶囊剂、整装粉剂和药物微胶囊剂。或者，药物组合物可由液体剂型组成，例如水或非水溶液剂、乳剂或混悬剂。
用于口服给药的固体组合物为本发明优选的组合物。本发明的固体组合物优选按单位剂型制备，例如片剂剂型和胶囊剂型。可根据已知方法，在存在崩解剂(例如玉米淀粉)和润滑剂(例如硬脂酸镁)时，将活性化合物与惰性稀释剂(例如磷酸钙)混合，压片，制备合适的片剂。如果需要，可通过已知方法给此片剂包肠溶衣，例如使用邻苯二甲酸醋酸纤维素。同样，可通过常规方法，或以小珠粒的形式，加入或不加入赋形剂，制备含有活性化合物的胶囊剂，例如硬明胶胶囊剂或软明胶胶囊剂等，如果需要，按已知方法给此片剂包肠溶衣。可根据本领域技术人员已知的方法制备片剂，以便提供控制释放的本发明化合物。
本发明药物组合物的控释剂型包括速释制剂(例如可溶性颗粒剂或熔融充填速释胶囊剂(melt filled fast release capsules))、延释制剂(例如用诸如邻苯二甲酸醋酸纤维素的肠溶包衣提供的片剂)，尤其是缓释制剂。许多缓释制剂的类型为本领域技术人员所熟知。通常，可将活性化合物装入用纤维素醚/丙烯酸酯共聚物等缓释包衣(releaseretarding coating)制成的胶囊内，或者可将活性化合物结合到离子交换树脂珠粒等小颗粒上。或者，可将活性化合物掺入含有缓释剂(release retarding agent)的骨架中，所述缓释剂为例如黄原胶等亲水树胶、羟丙基甲基纤维素等纤维素衍生物、或多糖、蜡或塑料材料。
还可将活性化合物制成固体剂型，其中的两种活性药物被分隔开。例如剂型可以是双层片剂，其中活性药物含在不同片层中。可制成不同的片层，以便提供各药物的最佳释放特性。
黏性液体充填剂(viscous liquid fill)、液体糊状充填剂或触变液体充填剂等液体充填剂组合物也适用于口服给药。可通过将活性化合物与某些天然植物油脂肪酸的酯(例如GelucireTM，由Gattefosse公司出售，可提供不同释药速率)混合，得到熔融充填组合物。合适的熔融充填胶囊剂含有10-80％活性物质和20-90％脂肪酸酯赋形剂，该赋形剂含有一种或多种多元醇酯和天然植物油脂肪酸的甘油三酯。
优选口服液体组合物包含1-10％(重量)的活性物质与1-50％(重量)的稀释剂，其余用无菌水补足。组合物可任选含有悬浮剂、增稠剂、醇等助溶剂和/或防腐剂。合适的稀释剂包括山梨醇、木糖醇或蔗糖等甜味剂。合适的悬浮剂或增稠剂包括纤维素胶、琼脂或天然树胶如黄原胶。还可加入本领域技术人员熟知的矫味剂或其它掩味剂，例如糖精、糖精钠、乙酰舒泛钾或天冬甜素。
适于胃肠外给药的本发明组合物，可通过将活性物质与用于该给药形式的已知的药物联合制备，例如由活性物质加上合适溶剂(例如盐水)制成的无菌混悬剂或无菌溶液剂。
优选的给药方式为口服、局部和胃肠外(例如皮下注射、肌内注射、关节内注射、静脉注射等)。因此，具体的给药方式包括但不限于口服、经皮、黏膜、舌下、肌内、静脉内、腹膜内和皮下给药，以及局部用药。最优选的使用方法为局部或口服。
化合物的给药量取决于药物组合物中化合物的生物利用度，特别是口服给药时。然而一般情况下，本发明化合物的给药量约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0.1mg/kg体重至约30mg/kg体重。药物组合物的量(为每剂所需化合物量的函数)取决于配方中化合物的百分比、稳定性、释药特征和其它制药参数。
优选的注射给药方法取决于所使用的特定活性物质的溶解度和稳定性。
给药途径和处方剂量仅作为指导，因为熟练的从业人员能够容易地确定用于任何具体患者和病症的最佳给药途径和剂量。
另一种系统给药方式包括在食品中给予前述的任何组合物，因此没有必要使用任何药理上可接受的载体。
本文所用术语“食品”包括食品本身和饮料。合适的食品本身包括抹酱、乳制品(包括牛奶和酸牛奶)、点心、方便食品/零食、早餐谷物食品和压块干粮、熟食、面包和冷冻甜点食品例如冰淇淋、冰糕和果汁饮料及酸牛奶冰淇淋。食品还包括膳食/营养补充剂。合适的饮料包括茶、茶味饮料、咖啡、软饮料(例如果汁汽水等)和果汁。
食品中特别补充了本发明的活性成分，使得其中活性成分的含量高于正常含量。
下面将参照下述实施例对本发明作进一步说明，所述实施例仅用于说明而非限制。
实施例参照以下
图1表示HUVEC中ICAM-1表达水平的曲线图。
图2表示HMVEC-d细胞中ICAM-1表达水平的曲线图。
图3表示HUVEC中ICAM-1表达水平的曲线图。
图4表示HUVEC中ICAM-1表达水平的曲线图。
图5表示新生儿真皮成纤维细胞中MMP-1表达水平的曲线图。
图6表示得自成人的真皮成纤维细胞中MMP-1表达水平的曲线图。
图7表示新生儿真皮成纤维细胞中MMP-9表达水平的曲线图。
图8表示新生儿真皮成纤维细胞中前胶原-1表达水平的曲线图。
图9-13表示HUVEC中ICAM-1表达水平的曲线图。
实施例实施例1慢性应激对内皮细胞炎症状态的作用实验方法概要已开发出一种体外模型以研究慢性应激对内皮细胞炎症状态的影响。
a.让细胞在6孔(9.5cm2)板中生长。
b.5天内每天加入合成的糖皮质激素(地塞米松)进行预处理，使细胞经受“慢性应激”。
c.在时间点T0时，收获组织培养上清液和细胞沉淀。
d.用1μM乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)使细胞经受氧化应激。
e.在PMA处理后的6小时、24小时和48小时(分别为T6、T24和T48)，收获组织培养上清液和细胞沉淀。
f.检测所有组织培养上清液的乳酸脱氢酶(LDH)，以衡量细胞毒性以及白介素-6的合成。
g.所有细胞经计数(Beckman Coulter Counter)，沉淀，检测细胞裂解液中ICAM-1(胞内黏着分子-1)的表达水平。
材料与方法内皮细胞的培养将HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞，TCS Biologicals)在EGM-2(内皮生长培养基，Biowhittaker)中进行培养和传代，该EGM-2补充了肝素、VEGF(血管内皮生长因子)、硫酸庆大霉素、抗坏血酸、HEGF(人内皮生长因子)、氢化可的松、HFGF-B(人成纤维细胞生长因子B)、R3-IGF-1(长R胰岛素样生长因子-1(long R insulin-like growth factor)和FBS(胎牛血清)。
将HMVEC-d细胞(人真皮微血管内皮细胞，Clonetics)在EGM-2MV(微血管内皮生长培养基，Biowhittaker)中进行培养和传代，该EGM-2MV补充了VEGF(血管内皮生长因子)、硫酸庆大霉素、抗坏血酸、氢化可的松、HFGF-B(人成纤维细胞生长因子B)、R3-IGF-1(长R胰岛素样生长因子-1)和FBS(胎牛血清)。
通常在实验开始前48小时，将细胞接种于6孔组织培养皿中，接种密度为每孔2ml完全培养基中约5000细胞/cm2，然后于37℃、5％CO2下孵育。
附加实验方案在含有除氢化可的松外所有补充成分的EGM-2中进行预处理，并配制实验溶液。
五日内，每天用1μM地塞米松(合成的糖皮质激素，Sigma D8893)或1-100nM CRH(促肾上腺皮质素释放激素，Calbiochem 05-23-0050)对内皮细胞进行预处理。预处理后，使用1μM PMA(Sigma P8139)使细胞经受氧化应激24小时。
在预处理过程中，向细胞中加入受体拮抗剂。这些拮抗剂包括糖皮质激素受体拮抗剂、2μM米非司酮(Sigma M8046)和两种CRH受体拮抗剂、200nM Astressin(Sigma A4933)和200nMα-螺旋CRF肽拮抗剂(Sigma C2917)。
五日内，每天用0.1％乙醇溶媒预处理内皮细胞，再加入PMA及糖皮质激素或CRH，研究急性地塞米松和重组CRH的作用。
收获样品和细胞计数收获细胞前，留意任何细胞形态的变化。在5天预处理期后(T0)、加入PMA后6小时和24小时(T6和T24)、以及除去PMA后24小时(T48)，收获组织培养上清液和内皮细胞。将所有组织培养上清液贮藏在-20℃下。
向各孔中加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen 25300-054)，将该板于37℃孵育直到细胞脱离。在accuvette中，将50μl细胞悬液加入到9.95ml等中子素II(Isoton II，Beckman Coulter)中，在CoulterParticle Counter Z1中用140μm孔径对0.5ml该细胞悬液进行两次计数。
用微量离心机，将剩余的950μl原细胞悬液以13000rpm离心10分钟。弃去上清液，细胞沉淀用500μl Dulbecco PBS溶液洗涤，按前法离心。按前法弃去上清液，细胞裂解前将细胞沉淀贮藏于-20℃下。根据Coulter Counter数据估计细胞数/沉淀。
细胞毒性实验(Promega)用Promega CytoTox 96非放射性细胞毒性实验，检测所有组织培养上清液的细胞毒性。本实验定量测定了细胞裂解所释放的乳酸脱氢酶(LDH，为细胞活力的良好指标)。向96孔微量滴定板的各孔中加入50μl组织培养上清液或对照培养基，做两个重复。加入50μlCytoTox试剂，充分混合。在室温下，将该板避光孵育30分钟。30分钟后，向各孔中加入50μl终止溶液，读取该板在492nm下的吸光度。吸光度数值是对照培养基两倍以上的任何试验样品都被视为有细胞毒性。各样品所得到的结果均未表现出任何细胞毒性的迹象。
细胞裂解液的制备将所有细胞沉淀按每2.5×106细胞1ml细胞裂解缓冲液在冰上裂解30分钟。裂解缓冲液含有1％NP-40、0.1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、6mM氯化钠和0.05M Tris，pH 7.6。使用前，加入蛋白酶抑制剂混合物(1000X；Sigma P8340)，裂解缓冲液的浓度为10μl/ml。用沉淀研杵使部分裂解的细胞沉淀充分匀浆，于4℃以20,000g离心20分钟，除去不需要的细胞碎片。澄清的细胞裂解液于-80℃冷藏备用。总蛋白质测定(Pierce)用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒，测定各细胞裂解液的总蛋白质浓度。由所提供的2mg/ml BSA母液制备一套0-1200μg/ml蛋白质范围的8种标准溶液。向96孔平底微量滴定板的各孔中加入10μl标准溶液或细胞裂解液，做两个重复。按照试剂盒的使用说明，用50份A试剂和1份B试剂制备试剂溶液。向微量滴定板的各孔中加入200μl的终试剂。将该板混匀，加盖，于37℃孵育30分钟，读出562nm下的吸光度。绘制蛋白质标准曲线，用于确定各细胞裂解液中的蛋白质浓度。
ICAM-1的ELISA(R&D Systems)按照生产商的使用说明，用人sICAM-1DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems DY720)，估计各细胞裂解液中的ICAM-1蛋白质。
在室温下，捕捉抗体用PBS稀释至终浓度为4μg/ml，用100μl包被96孔微量滴定板的各孔过夜。然后，该板用洗涤缓冲液(0.05％吐温20的PBS溶液)洗涤3次。向各孔中加入300μl封闭缓冲液(1％BSA、5％蔗糖和0.05％叠氮化钠的PBS溶液)，将该板在室温下孵育1小时，然后按前述方法进行洗涤。然后，各细胞裂解液用试剂稀释液(1％BSA的PBS溶液)按1/200进行稀释，将100μl加入到抗体包被板的各孔中，做两个重复。用试剂稀释液制备浓度范围为0-1000pg/ml的8个ICAM-1标准液，将100μl标准液加入到该板的适当孔中，做两个重复。每一板通常使用一套独立的标准液。将该板在室温下孵育2小时后，再次进行洗涤。将检测抗体稀释至终浓度为100ng/ml，向各孔中加入100μl检测抗体，将该板在室温下孵育2小时。按前法洗板。向各孔中加入100μl用试剂稀释液按1/200稀释的链霉抗生物素-HRP缀合物，将该板在室温下避光孵育20分钟。最后一次洗板后，向各孔中加入100μl底物溶液(1∶1的显色试剂A和显色试剂B混合物，R&D Systems DY999)。于室温避光孵育20分钟后，加入50μl 2N硫酸使显色反应终止。使用570nm校正波长测量该板在450nm下的吸光度。
将平均吸光度对ICAM-1浓度作图，绘制标准曲线，通过回归分析计算出最佳拟合曲线。考虑裂解液的稀释倍数，由此计算出样品中未知的ICAM-1浓度。
为使细胞数目和总蛋白质浓度的差异标准化，最终结果用ngICAM-1/mg总蛋白质表示。
白介素6的ELISA(R&D Systems)按照生产商的使用说明，用QuantiGlo Q6000人IL-6实验(R&DSystems)测试各组织培养上清液的IL-6蛋白质浓度。
用校准稀释液配制6个IL-6标准液，浓度范围为0-3000pg/ml。向各孔中加入50μl实验稀释液和150μl组织培养上清液或标准液，做两个重复。将该板放在水平定轨板振荡器(horizontal orbital plateshaker)上，室温下孵育2小时，随后用洗涤缓冲液洗板4次。向各孔中加入200μl IL-6缀合物，将该板放在水平定轨板振荡器(约500rpm)上，室温下孵育3小时。按前法洗板。向各孔中加入200μl底物溶液，将该板放在桌面上，室温下孵育40分钟。用设置为1分钟滞后时间、每孔1秒读数时间、总和法和自动放大(gain on)的发光计，测定各孔的相对光单位(relative light unit，RLU)。
将平均RLU对IL-6浓度作图，绘制标准曲线，通过回归分析计算出最佳拟合曲线。由此估计所有样品中未知的IL-6浓度。
结果1μM糖皮质激素慢性处理后再加1μM PMA氧化应激对HUVEC中ICAM-1合成的影响使经受了慢性应激的内皮细胞再经受1μM PMA氧化应激(按方法与材料中所述方法)，在指定时间点(t0、t6、t24和t48)，收获细胞以测定ICAM-1表达的变化。使用此额外的急性应激(24小时)模拟皮肤损伤和/或损害(例如UV辐射)。直接与未处理细胞对照相比时，观察到诱导的ICAM-1合成与分泌显著较高(参见图1)。此外，氧化应激前经过糖皮质激素处理的细胞中诱导的ICAM-1合成，显著高于氧化应激前未进行糖皮质激素处理细胞中诱导的ICAM-1合成。
相信ICAM-1的诱导反映出皮肤中有较高程度的炎性细胞募集。
用HMVEC-d细胞重复这些实验。得到类似结果。
1μM PMA氧化应激过程中，1μM糖皮质激素急性处理对HUVEC中ICAM-1合成的影响我们研究了“急性应激”在内皮细胞模型中的作用。重要的是，向仅用溶媒预处理(5天)的内皮细胞中加入PMA的同时，加入合成的糖皮质激素。急性GC处理有效地抑制了氧化应激后诱导的ICAM-1表达，因此减轻了内皮细胞的炎症状态。
用HMVEC-d细胞重复这些实验。得到类似结果。
1μM糖皮质激素慢性处理HUVEC后再加1μM PMA氧化应激的过程中，GC受体拮抗剂(2μM米非司酮)对ICAM-1合成的影响慢性GC预处理步骤中，向细胞中加入GC受体拮抗剂(米非司酮)，再用PMA处理后，氧化应激所诱导的ICAM-1表达的增加显著降低，低于未接受慢性GC处理细胞中的情况(图3)。这些观测结果表明，应激所诱导的ICAM-1表达的增加是通过GC受体介导的。
用HMVEC-d细胞重复这些实验。得到类似结果。
在1μM PMA氧化应激过程中，促肾上腺皮质素释放激素处理对HUVEC中ICAM-1合成的影响经POMC及其所有糖皮质激素的肽衍生物诱导后，应激导致有效激活皮肤促肾上腺皮质素释放激素(CRH)。CRH是皮肤中控制诱导和启动下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的一种关键、主要的肽。我们研究了用CRH慢性处理HUVEC是否会导致与经慢性GC处理的细胞中所观察到的类似的ICAM-1水平的激剧变化。
5天内，每天向内皮细胞中加入重组CRH。然后，如前所述，使经处理的细胞和未经处理的细胞经受氧化应激，24小时内，在各时间点收获细胞。
用重组CRH慢性处理内皮细胞，导致ICAM-1分泌显著增加，表明炎症程度较高(数据未显示)。然而，观察到在经GC处理的细胞中，ICAM-1的合成增加，并且始终高于经CRH处理细胞中ICAM-1的合成。
在CRH预处理步骤中，加入CRH受体拮抗剂(astressin、α-螺旋CRF肽拮抗剂)，仅部分阻断用CRH慢性处理的内皮细胞在氧化应激后ICAM-1诱导的增加(数据未显示)。这些细胞合成的ICAM-1水平大约降低到用CRH预处理5天后，经氧化应激诱导的ICAM-1水平的一半。令人惊奇的是，使用糖皮质激素受体拮抗剂(米非司酮)，ICAM-1的合成不会恢复到之前所观察到的基础水平。在用GC慢性处理内的内皮细胞中，米非司酮完全阻断用PMA氧化应激所诱导的ICAM-1分泌的增加(参见图3)。这种部分阻断作用可能是因为无效受体拮抗剂所致，或者，事实上，是因为CRH受体并不主要负责诱导ICAM-1所致。有可能是重组CRH通过刺激GC，引起CRH/GC联合反应。GC受体拮抗剂的滴定可能进一步抑制ICAM-1的水平。
人脐静脉内皮细胞中IL-6表达的变化我们观察到，与经溶媒处理后再用PMA氧化应激的细胞相比时，GC处理的慢性应激的内皮细胞中，白介素6的合成与分泌增加。溶媒或糖皮质激素本身并不引起IL-6分泌增加。
讨论我们已经清楚地证实，在内皮细胞中加入重组糖皮质激素对PMA所刺激的ICAM-1表达表现出显著的趋异作用。我们的结果首次说明，与未处理细胞对照相比时，用GC慢性处理的内皮细胞，如何显著地增加炎症状态。然而，对比之下，急性剂量的GC显著抑制炎症状态。我们提出，内皮细胞对急性GC处理和慢性GC处理截然不同的反应，可能是由于皮肤内局部HPA轴形成日趋严重的功能异常所造成的。皮肤内特别高的炎症水平可能导致产生并刺激促炎细胞因子和蛋白酶，而促炎细胞因子和蛋白酶都可能使皮肤病恶化。从经急性和慢性CRH处理内皮细胞后得到相似的观测结果，进一步证实了此工作假设。
IL-6是免疫系统的众多介质之一，有助于调节HPA轴的功能。IL-6通常是作为级联式产生IL-1α和TNF-α的结果而被释放的。令人惊奇的是，我们无法在GC处理内皮细胞或未处理内皮细胞的上清液中检出这些促炎细胞因子(数据未显示)。本报告所提供的数据提示，可通过增加CRH的分泌(及最终的GC水平)，以依赖剂量的方式，通过激活IL-6(所述级联反应的终产物)，使得免疫系统发挥作用以影响HPA轴活性。本报告中，我们证明了与未处理细胞对照相比，慢性GC处理的内皮细胞的IL-6水平显著较高。这一数据符合我们的设想，即这些受慢性应激的内皮细胞具有缺陷HPA轴，在此反馈环的反应性变化，可能阻碍IL-6的负调节(通过GC和AP-1间的相互作用)。
总之，我们相信该炎症模型对我们理解在慢性损害有关皮肤中的局部HPA轴的变化，将证明具有无法估量的意义。我们正在进行的研究表明，慢性GC处理导致GC受体水平的负调节，因此，在皮肤内形成缺陷反馈环。我们在此模型中，继续测试了一系列的营养剂，以观察是否可以减少炎性细胞募集的诱导，如实施例3中所述。
实施例2慢性应激对真皮基质重建的影响皮肤的真皮基质组分主要由弹性纤维、胶原纤维、蛋白质多糖和其它糖蛋白组成。这一结缔组织复合体作为真皮的支架，使细胞(如成纤维细胞)可以在上面附着。这类组织的主要蛋白质组分为胶原，即一种非均质性质的纤维状蛋白。I型胶原是皮肤中占优势的结构蛋白，衰老的皮肤外观主要归咎于I型胶原的破坏。正常的原纤维生成需要多种翻译后修饰，其中包括前体前胶原经蛋白酶解转化为胶原。因此，前胶原I的估计量可以反映出即将合成的胶原I分子的量。事实上，受损的衰老皮肤的组织学特征典型地包括压扁、变硬、紊乱的胶原纤维束。年轻健康的皮肤保持降解和清除这种无序基质致密固体团的能力。
因此，基质降解在皮肤基质重建中是值得考虑的因素，基质金属蛋白酶-1(MMP-1)等真皮蛋白酶的释放，可有助于从皮肤上除去堆集的、杂乱的胶原纤维。MMP为成员超过25个的大家族，负责降解结缔组织(有关综述参见Woessner，1994，Ann N Y Acad Sci 73211-21)。它们是结构上相关的内肽酶，介导胞外基质和基底膜不同的大分子组分的降解，可分为4个不同的亚家族胶原酶、明胶酶、溶基质蛋白酶和膜MMP。人类皮肤表达各种MMP，但仅MMP-1(胶原酶)显示出能够攻击天然原纤维胶原。此外，还显示出MMP-1由角质形成细胞和成纤维细胞进行表达，因此，伤口愈合过程中，MMP-1在维持正常的胶原更新和基质重建中发挥重要作用。
另外，还证实了暴露在紫外辐射(UVR)下，在体内诱导人皮肤的MMP-1。因此，长期以来，MMP-1被认为是皮肤胶原分解的主要起始因子。也显示UVR诱导MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)；以及能够进一步降解由溶胶原酶所形成片段的酶。总之，MMP-1的释放可将天然胶原纤维切割成较小的片段，该片段然后由明胶酶、MMP-2和MMP-9进一步降解。相信皮肤暴露在UVR下在受损的结缔组织中，MMP作为主要介质发挥作用。
本研究中，为了更好地理解慢性应激对皮肤中真皮基质重建的影响，因此我们在糖皮质激素慢性处理原代人真皮成纤维细胞，再经受PMA急性应激后，测定了真皮基质降解标记(MMP-1)和真皮基质合成标记(前胶原I)的变化。实验方法类似于实施例1所述方法，只是所测试的细胞是真皮成纤维细胞，以及细胞用于测试原胶原-1、MMP-1和MMP-9的表达。
材料与方法(不同于实施例1)真皮细胞的培养将原代人真皮成纤维细胞在补充了10％FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco)中进行培养和传代。按常规将细胞接种于6孔组织培养皿中，接种密度为每孔2ml完全培养基中约5000细胞/m2，并于37℃、5％CO2下孵育24小时。处理前24小时，弃培养基，让细胞在加有1％FBS的DMEM中生长。
附加实验方案用含低血清(1％FBS)的DMEM配制预处理溶液和实验溶液。5天内，每天用1μM地塞米松(一种合成的糖皮质激素；Sigma D8893)对真皮成纤维细胞进行预处理。随后，细胞用1μM PMA(Sigma P8139)进行氧化应激24小时。
人活性MMP-1和MMP-9的ELISA(R&D Systems)按照生产商的使用说明，用人活性MMP-1和MMP-9 Fluorokine酶试剂盒(分别为R&D Systems F1M00和F9M00)，估计各细胞上清液中的MMP-1蛋白和MMP-9蛋白。
用校准稀释液配制6个MMP-1标准液和MMP-9标准液，浓度范围分别为0.39-12.5ng/ml和0.25-16ng/ml。向各孔中加入100μl实验稀释液和150μl组织培养上清液或标准液，做两个重复。将该板放在水平定轨板振荡器上，于室温孵育3小时，然后用洗涤缓冲液洗涤4次。向各孔中加入200μl APMA，在湿润环境下，将该板于37℃避光孵育2小时。按前述方法洗板。向各孔中加入200μl底物溶液，并在湿润环境下，将该板于37℃避光孵育17-20小时。用设置为1×20mS积分时间(integration time)、板速约6的荧光板，激发波长定为320nm，发射波长定为405nm，测定各孔的相对荧光单位(RFU)。
分别将平均RFU对MMP-1浓度和MMP-9浓度作图，绘制标准曲线，并通过回归分析计算出最佳拟合曲线。由此估计所有样品中未知的活性MMP-1蛋白浓度或活性MMP-9蛋白浓度。
前胶原IC-肽的EIA试剂盒(Takara Bio Inc.)胶原I是由前体分子原胶原I合成的。因此，游离前肽的量，化学计量上反映出所合成的胶原I的量。I型前胶原C肽酶免疫测定(EIA)试剂盒可定量测定I型前胶原C肽(PIP)。
用样品稀释液配制8个PIP标准液，浓度范围为0-640ng/ml。向各孔中加入100μl抗体-过氧化物酶缀合物溶液和20μl细胞裂解液(1μg蛋白质)或标准液，做两个重复。将该板密封，于37℃孵育3小时，然后用400μl PBS洗涤4次。然后向各孔中加入100μl底物溶液，将该板放在桌面上，室温下孵育15分钟。该时间过后，向各孔中加入100μl终止溶液，用读板仪读出450nm下的吸光度。
将平均吸光度对PIP浓度作图，绘制标准曲线，并通过回归分析计算出最佳拟合曲线。由此估计所有样品中未知的PIP浓度。
结果来源于新生儿的人真皮成纤维细胞中MMP-1表达的变化经受慢性应激的新生儿真皮成纤维细胞用1μM PMA进行氧化应激(如方法与材料中所述)，在指定时间点(T0、T6、T24和T48)收获细胞以测定MMP-1表达的变化。这一额外的急性应激(时间仅为24小时)用于模拟皮肤的损伤和/或损害(例如UVR)。直接与未处理细胞对照相比时，观察到MMP-1的合成和分泌受到显著抑制和阻抑(T6约60％、T24约80％、T48约70％)——参见图5。
对MMP-1的这种抑制可能反映出皮肤中缺乏降解真皮基质(特别是胶原I型原纤维)的能力。
来源于成人的人真皮成纤维细胞中MMP-1表达的变化经受慢性应激的成人真皮成纤维细胞也用1μM PMA进行氧化应激，在指定时间点(T0、T6、T24和T48)收获细胞以测定MMP-1表达的变化。如在来源于新生儿的成纤维细胞中所观察到的一样，直接与未处理细胞对照相比时，MMP-1合成受到的抑制和阻抑是显著的(T6约85％、T24约10％、T48约80％)——参见图6。
已知皮肤中MMP-1的水平是随实足年龄而增加的，因此，与在GC处理的来源于新生儿的成纤维细胞中所观察到的活性MMP-1的水平相比，在GC处理的来源于成人的成纤维细胞中所观察的活性MMP-1水平显著较高并不足为奇(GC处理的成人成纤维细胞中约25ng/ml，而GC处理的新生儿成纤维细胞中为15ng/ml)。此外，似乎在未处理的成人真皮成纤维细胞对照中，活性MMP-1的总水平可使Fluorokine MMP-1 ELISA中的单克隆抗体饱和(注意在整个研究中，所示[MMP-1]的ELISA数据都不大于～35ng/ml)。
完成这些观察后，用来源于新生儿的成纤维细胞进行所有随后的实验。
来源于新生儿的人真皮成纤维细胞中MMP-9表达的变化前面表明MMP-9是最高效的蛋白酶之一，有助于清除皮肤中由MMP-1所产生的胶原片段。因此，我们测定了该模型中MMP-9合成的变化。观察到与MMP-1相同的模式即直接与未处理细胞对照相比时，在经受慢性应激的真皮成纤维细胞中，检测到MMP-9合成和分泌受到显著抑制和阻抑(图7)。而MMP-9的水平经证明，显著地低于MMP-1的水平，连续观察到相似的表达模式。
来源于新生儿的人真皮成纤维细胞中IL-6表达的变化我们观察到与经溶媒处理后再加PMA氧化应激的细胞相比时，GC处理的经慢性应激的真皮成纤维细胞中，白介素6的合成和分泌受到显著的抑制(在T6和T24时合成减少～80％)——数据未显示。
来源于新生儿的人真皮成纤维细胞中前胶原I合成的变化I型胶原，一种皮肤中重要的结构组分，由称作前胶原I的前体分子合成，其中被称为前肽的大型额外结构域经酶切除。因此，我们检测了I型前胶原的变化，进而化学计量上反映出胶原合成水平的变化。
经受慢性应激的人类新生儿真皮成纤维细胞用1μM PMA进行氧化应激，在指定时间点(T0、T6、T24、T48和T72)收获细胞以测定前胶原-1表达的变化。直接与未处理细胞对照相比时，观察到前胶原-1的合成受到了显著抑制(特别在T6时，～50％)——参见图8。
前胶原1合成的这种抑制很可能反映出皮肤中缺乏合成新的真皮基质纤维的能力。
讨论为了测定慢性应激对皮肤的影响，我们将真皮成纤维细胞用糖皮质激素进行处理，再进行急性氧化应激，然后测定MMP-1和MMP-9的变化，其中MMP-1是与皮肤衰老有关的最突出的真皮蛋白酶之一，MMP-9是急性剂量的UVR后皮肤所释放的一种关键的明胶酶。我们还测定了I型前胶原C肽的水平(胶原I合成量的良好指标)。我们的结果首次证明，在经受慢性应激的皮肤中，基质清除(MMP-1、MMP-9)和基质修复(前胶原I)均被显著抑制。因此，基质降解和基质合成都被抑制。
这些数据加上我们之前所描述的在经受慢性应激的皮肤中炎症显著恶化的观测结果(参见实施例1)，表明慢性应激在造成结缔组织损伤(因变性胶原纤维和异常弹性组织清除削弱所致)时发挥了重要作用。
总之，对有关基质重建和慢性应激的此类皮肤相关标记的鉴定，为我们提供了一种极好的体外模型，从而确定新的干扰途径，以降低应激对皮肤调理的作用。我们已经运用该模型鉴定出抑制慢性糖皮质激素暴露对皮肤细胞的有害作用的药物，正如下面在实施例3中所描述的一样。
实施例3鉴定抑制糖皮质激素介导的对皮肤细胞—炎症的作用的药物材料与方法采用与实施例1所述相同的方法，只是在预处理期间向细胞中加入各种试验药物(见表1)。
表1在经受慢性应激的人脐静脉内皮细胞中所选试验药物一览表
各实验中包括溶媒对照和地塞米松对照。
没药酸的提取方法用330g guggul脂质作为原料，得到128g产物(收率42.6％)。该产物经气相色谱测定含28.2％没药酸。用适于分离的己烷/乙酸乙酯比率，通过硅胶处理，进一步加工100g该产物。用80/20(体积/体积)己烷/乙酸乙酯，在750g硅胶60柱中进行硅胶处理。虽然皂化产物不完全溶于该混合物中，但仍可将该混合物加到柱上。再加入80/20溶剂时，柱被阻塞，但是，当60/40比率的溶剂流过时，柱被疏通。
60/40流分的薄层色谱(TLC)板显示，在没药酸斑点和溶剂前沿间的组分(高洗脱组分)的浓度高于标准液中所观察到的浓度，为前述所得到的富含没药酸的流分，已知纯度70％。50/50样品含有更接近基线的高水平组分(低洗脱组分)，将其弃去。在60/40溶剂中，第一次硅胶处理的总产量为34.7g(14.7％)，50/50溶剂中为3.2％。
第一次硅胶处理的60/40提取液，再经过第二轮硅胶处理进行纯化，不过这次使用150g硅胶柱。在这次硅胶柱处理过程中，未遇到不溶性情况。样品经蒸发，收集流分并进行分析。TLC板显示60/40流分比70％没药酸标准液含有较多的洗脱物质。这是因为其移动需要80/20溶剂。TLC板还显示出50/50流分更是如此，柱遗留物含有较少的洗脱物质。第二次硅胶处理后，收集到加入柱中浓缩物的92％，其中23.5g或10％(总的)来自60/40流分，8.3g或3.4％来自80/20流分。另外，对60/40流分进行分析，通过GC发现含77.9％没药酸，80/20流分含49％没药酸。
结果经过用合成的糖皮质激素(1μM地塞米松)进行5天慢性应激的内皮细胞，用1μM PMA进行氧化应激24小时。此期间，检测衡量炎症反应的ICAM-1合成。在预处理期间，向细胞中加入可能的活性物质(见表1)。
放弃本研究中任何显示出LDH显著增加(即有细胞毒性)的药物。在整个研究中，未观察到细胞形态或细胞数目的显著变化。
结果见表2。在经受慢性应激的内皮细胞中抑制ICAM-1合成的药物将在下文作更详细的讨论。在此阶段并不能完全忽略在所示浓度下不抑制ICAM-1合成的药物，因为没有进行剂量反应研究。整个研究中主要使用的是最高的上限浓度(无毒性迹象)。
表2
洛伐他汀在地塞米松存在下，向HUVEC中按常规加入该药物时，观察到ICAM-1表达被显著抑制。ICAM-1抑制水平几乎与未处理细胞对照完全相同，仅低于只用溶媒预处理的细胞中，由PMA诱导的ICAM-1水平——参见图9。
环格列酮和没药酸，两者皆为PPARγ激动剂，在用地塞米松慢性处理的内皮细胞中，抑制由PMA氧化应激诱导的ICAM-1合成的增加。由GC处理的细胞所分泌的ICAM-1水平，几乎降到仅用溶媒预处理的细胞中，由PMA诱导的ICAM-1水平——参见图10和图11。
人参Rc和人参Rb1流分这两个流分在用地塞米松慢性处理的内皮细胞中，均抑制由PMA氧化应激诱导的ICAM-1合成的增加。证明人参皂苷Rc比人参Rb1更有效——数据未显示。
姜黄素在用地塞米松慢性处理的内皮细胞中，这一JNK/AP-1抑制剂显示抑制由PMA氧化应激诱导的ICAM-1合成的增加。由经处理的细胞所分泌的ICAM-1水平，几乎降到仅用溶媒预处理的细胞中，由PMA诱导的ICAM-1水平——数据未显示。
22-(R)-羟基胆甾醇在用地塞米松慢性处理的内皮细胞中，该氧甾醇类LXR配体表明由PMA氧化应激诱导的ICAM-1合成的增加被显著抑制。由经处理的细胞所分泌的ICAM-1水平，几乎降到仅用溶媒预处理的细胞中，由PMA诱导的ICAM-1水平——参见图12。
冈田酸该天然海洋聚醚产品是强效丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂。在本研究中，我们在地塞米松存在下加入冈田酸，观察到在用地塞米松慢性处理的内皮细胞中，显著地抑制由PMA氧化应激诱导的ICAM-1合成的增加。由经处理的细胞所分泌的ICAM-1水平，几乎降到仅用溶媒预处理的细胞中，由PMA诱导的ICAM-1水平——参见图13。
讨论本研究中，最有效的干涉剂包括具有抗炎性质的许多核孤独受体(PXR、LXR、PPAR-γ)的选择性激活剂。另外，主动抑制关键转录因子(如NF-κB和AP-1)的营养化合物，被证明是良好的ICAM-1表达抑制剂。在该体外筛选模型中，所采用的一种其它决定性类型的抑制剂为天然海洋聚醚产品，即冈田酸，显示抑制丝氨酸/苏氨酸类磷酸酶。该作用方式中的主动抑制可提供新的干扰途径，以防止应激所诱导的转录活性糖皮质激素的累积。
实施例4鉴定抑制糖皮质激素介导的对皮肤细胞—基质重建的作用的药物采用实施例2所述的相同方法，只是在预处理阶段向细胞中加入各种试验药物。
枸杞的提取方法将干粉状植物材料(～10g)放入套筒(thimble)中，向筒中加入200ml丙酮，并加热该装置。使该溶液与沸石(boiling chips)一起回流16小时，然后在氮气下使丙酮蒸发。将最终残余物在氮气中贮藏于-20℃。
结果观察到环格列酮、激活素(Powerherbs，Power Health Product Ltd.，York，UK)、香菇提取物(Bio-Support，Worcester，UK)、枸杞提取物(K.Hunter，Unilever Research Colworth，UK——参见上文)、乳香提取物(Alchem International Ltd.，New Delhi，India)、姜黄素、没药酸、人参Rb1流分和人参Rc流分，在用PMA诱导的急性应激后，全都抑制糖皮质激素对MMP-1表达水平和前胶原表达水平的作用。
有关上述各个部分的本发明的各种特征和实施方案，做必要的修正后，适当地用于其它部分。因此，适当时，可将某部分所具体说明的特征和其它部分所具体说明的特征合在一起。
上述说明书中所提及的所有出版物的内容通过引用结合到本文中。本发明所述的方法和产品的各种修改和变化，在不偏离本发明的范围时，对本领域的技术人员是显而易见的。虽然本发明对于有关特定优选的实施方案进行了描述，但应理解为所要求保护的发明不应过多地局限于这些具体的实施方案。事实上，对实施本发明所述方法的各种修改，如果对所属相关领域的技术人员来说是显而易见的，则落入所附权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种能够抑制真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激的组合物在制备用于降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述组合物经口服给药。
3.权利要求1的用途，其中所述组合物经局部给药。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质能够抑制与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，第二种物质能够抑制真皮细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
6.一种降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的方法，该方法包括给予个体能够抑制真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激的组合物。
7.权利要求6的方法，其中所述组合物经口服给药。
8.权利要求6的方法，其中所述组合物经局部给药。
9.权利要求6-8中任一项的方法，其中所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质能够抑制与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，第二种物质能够抑制真皮细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
10.权利要求6-8中任一项的方法，其中所述组合物包含第一种物质和第二种物质，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
11.一种包含第一种物质和第二种物质的组合物，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
12.一种包含第一种物质和第二种物质的营养补充剂，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
13.一种包含或补充了第一种物质和第二种物质的化妆品组合物，其中第一种物质选自人参Rb1、人参Rc、姜黄素、22-OH-胆甾醇、环格列酮、洛伐他汀、没药酸、冈田酸、甘草提取物及其混合物；第二种物质选自枸杞提取物、香菇提取物、激活素、人参Rb1、人参Rc、姜黄素、环格列酮、没药酸、乳香提取物及其混合物，条件是所述第一种物质和第二种物质是不同的。
14.一种能够降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的化合物的鉴定方法，该方法包括(i)在糖皮质激素受体激动剂存在下，在无候选化合物时将会导致细胞经受慢性应激的条件和时间内，使真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞与候选化合物接触；(ii)使细胞经受急性应激；(iii)分析细胞中的一种或多种细胞标记，所述标记选自炎性细胞募集标记，其中所述细胞是与皮肤炎症反应有关的细胞；基质降解标记，其中所述细胞是真皮细胞；和/或基质合成标记，其中所述细胞是真皮细胞；和(iv)确定候选化合物是否影响所述的一种或多种细胞标记的状态。
15.权利要求14的方法，其中步骤(iv)包括将所述标记在有候选化合物时的状态与所述标记在无候选化合物时的状态进行比较。
16.权利要求14或权利要求15的方法，其中所述炎性细胞募集标记是ICAM-1的表达水平。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述基质降解标记是MMP-1和/或MMP-9的表达水平。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述基质合成标记是前胶原-1的表达水平。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述急性应激是氧化应激。
20.权利要求14-19中任一项的方法，其中步骤(i)所述的时间是至少4天。
21.一种用于降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的组合物的制备方法，该方法包括(i)在糖皮质激素受体激动剂存在下，在无候选化合物时将会导致细胞经受慢性应激的条件和时间内，使真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞与候选化合物接触；(ii)使细胞经受急性应激；(iii)分析细胞中的一种或多种细胞标记，所述标记选自炎性细胞募集标记，其中所述细胞是与皮肤炎症反应有关的细胞；基质降解标记，其中所述细胞是真皮细胞；和/或基质合成标记，其中所述细胞是真皮细胞；和(iv)确定候选化合物是否影响所述的一种或多种细胞标记的状态；(v)选择出步骤(iv)所鉴定的影响所述的一种或多种细胞标记状态的候选化合物；和(vi)将所述化合物与化妆品或药物可接受的载体或稀释剂混合。
全文摘要
提供一种降低心理介导的应激对人或动物皮肤的作用的方法，该方法包括给予个体能够抑制真皮细胞或与皮肤炎症反应有关的细胞的糖皮质激素诱导的慢性应激的组合物。还提供用于该方法的组合物和鉴定合适的组合物的实验方法。
文档编号A61K31/366GK1913888SQ200480041658
公开日2007年2月14日 申请日期2004年12月6日 优先权日2003年12月18日
发明者K·E·巴雷特, S·P·格兰杰, G·詹金斯, L·J·温赖特 申请人:荷兰联合利华有限公司