专利名称：鬼针草总黄酮在制备防治病毒性肝炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鬼针草总黄酮的用途，确切的说是鬼针草总黄酮在制备防治病毒性肝炎药物中的用途。
背景技术：
鬼针草又名婆婆针、鬼杈草，小鬼针，粘身草等，其药用历史悠久，始载于唐·陈藏器《本草拾遗》，谓“鬼钗草，味苦平，无毒，主蛇及蜘蛛咬，杵碎傅之，亦杵绞汁服。生地畔，有桠，方茎，子作钗脚，着人如衣针，北方呼之为鬼针。”鬼针草类药材全草均可用药，味苦性平而无毒，具有清热解毒，散瘀消肿等功效，主治疟疾、腹泻、痢疾、肝炎、急性肾炎、胃痛、噎膈、肠痈、咽喉肿痛、跌打损伤、蛇虫咬伤等。为了更好的认识和了解这一自然资源，更好的开发与利用，现将鬼针草的研究与开发现状综述如下。
鬼针草为菊科(Compositae)管状花亚科鬼针草属(Bidens L.)植物为一年生草本，其药材资源非常丰富，主要分布于我国东北、河北、山东、山西、河南、江苏、云南、四川、两广等地，生于水边、河岸、湿地、荒地及山坡等处，极易采集。鬼针草的化学成分鬼针草所含化学成分种类较多，文献报道曾从该植物中分离得到挥发油类、甾醇、查耳酮、橙酮、聚乙炔类等，其活性成分以聚乙炔类和黄酮类成分为主。已分离出多种聚乙炔类成分。乙醇提取物的正丁醇部分鉴定出4个黄酮成分，为金丝桃甙(hyperoside)、奥卡宁(okanin)、异奥卡宁-7-O-葡萄糖甙和海生菊甙(maritimein)。鬼针草各部位中黄酮类成分有较大差异，在花果期，叶和花序中总黄酮含量较高(分别为6.67％和6.68％)，茎枝中含量较低(0.89％)。叶中分离鉴定了21种挥发性成分，主要为脂肪烷和脂肪酸类，另外含少量的醛、酮烯、腈、胺及呋喃类成分；其中脂肪类化合物占相当比例。分离出的4种酚酸类成分，经理化测试及光谱分析，分别鉴定为水杨酸、原儿茶酸、没食子酸、脂肪酸类化合物。还有甾体类化合物如菠甾醇、胡萝卜苷，谷甾醇、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。
鬼针草含有丰富的氨基酸，如天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸等17种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸，总蛋白质157.89g/kg，总游离氨基酸含量达139.89g/kg，必需氨基酸总量57.09g/kg。鬼针草所含氨基酸与传统名贵药材亚香棒虫草、冬虫夏草相比，在种类上多了胱氨酸，在含量上脯氨酸、谷氨酸高于两者，其他氨基酸含量相当另外鬼针草中还含有11种人体必需微量元素，测定结果表明，Mg含量最高，P、Fe、Ca含量较高，Cu、Zn次之，Mn、Co、Ni、Mo、Cr含量最低，鬼针草中含有丰富的P，是其调节神经、催眠、镇静等作用的内在原因。
维生素在鬼针草中也有分布，如维生素B1、维生素B2、β-胡萝卜素。
鬼针草药材资源丰富，药用历史悠久，在民间验方中有小人参之称。其生物活性多样，且作用温和持久，具有较高的药用价值，尤其对消化系统、中枢神经系统及心血管系统显示较强的药理作用。近年来对鬼针草药材进行了一些开发和利用，目前国内的鬼针草产品有悦年片、鬼针草口服液、鬼针草保健冲剂等，但也仅限于防治高血压等心血管疾病，还未见对鬼针草总黄酮在抗病毒性肝炎方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供鬼针草总黄酮的新用途，即在制药中的新应用。
实际上，本发明提供了鬼针草总黄酮在制备预防或治疗病毒性肝炎的药物中的应用。
病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的传染病，迄今公认可分为甲、乙、丙、丁、戊五种型别，其传染性强、传播途径复杂，发病率高，且有大量的病毒携带者，这类人群既是潜在的发病对象，并与肝硬化、肝癌有密切关系。病毒性肝炎在全球分布不同，根据流行情况可将世界各地划分为高、中、低流行区。中国为甲、乙型肝炎的高流行区域，丙肝呈中度流行。肝炎尤其是乙肝的流行严重危害人民的健康，对社会经济发展具有不容忽视的制约作用，肝炎的防治问题已成为全世界医学界共同关注的重要课题。
目前临床常用的抗肝炎药大体可分为三类①抗病毒药；②免疫调节剂；③保肝药等。在诸多治疗方案中，针对病因实施抗病毒疗法是一个重要方向。干扰素是首先获得广泛认可的抗病毒药物，也是目前治疗乙肝首选药物，但仅对30％～40％的乙肝患者有长期效果。核苷类似物如拉米呋定(Lamividine)等虽具有较好的疗效，但停药以后复发率相当高。一些新的治疗方案如反义核酸、核酶等，由于一系列重要问题，如病毒表达载体的安全性，基因转移靶细胞的导入方法，治疗后如何终止导入基因的表达等尚未解决，因而只能停留在实验中。总的来说，目前缺乏安全有效的抗肝炎病毒的药物。
而现代医学的治疗战略正在从对抗疗法转向调节对策，从抗病毒的研究趋向于改变机体，促进机体防御能力的研究。这个发展方向，正是中医药的优势和特点。根据传统中医理论，病毒性肝炎乃湿热疫毒侵犯肝胆，导致肝脾功能损伤等有关，故治疗本病应滋养肝肾、清热利湿、健脾化痰、解毒降酶等。本发明遵循这一治疗原则，基于长期治疗经验，发现鬼针草具有清热解毒，散瘀消肿等功效，对病毒性肝炎具有很好的治疗作用。为将其开发成对防治病毒性肝炎的有效药物提供非常珍贵的依据。我们提取其有效部位总黄酮，通过体内外实验证实其有显著的抗病毒性肝炎作用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用鬼针草总黄酮的药理实验及结果来说明其在防治病毒性肝炎药物中的应用。
鬼针草总黄酮防治病毒性肝炎试验如下(一)鬼针草总黄酮的制备取鬼针草生药粉碎，40-80％的乙醇回流提取2-3次，提取液合并，回收乙醇，减压浓缩得浸膏。浸膏水溶，静置，过滤，澄清液上树脂柱，水洗后收集40-95％乙醇洗脱部分，回收乙醇，减压浓缩，干燥即得提取物，所述提取物显鬼针草总黄酮。鬼针草总黄酮为黄绿色粉末，具有芳香味，易潮解；其主要成分总黄酮含量为20-60％。提取物可加入相应辅料，制成片剂、胶囊、缓释片、滴丸、冲剂、微粒剂，并进一步纯化制成针剂。
(二)实验1.鬼针草总黄酮对四氯化碳致小鼠急性化学性肝损伤的保护作用(1)材料及试剂鬼针草总黄酮；0.1％CCl4；联苯双酯；ALT，AST试剂盒南京建成生物技术公司；昆明种雄性小鼠60只，体重18-22g，由安徽医科大学动物实验中心提供。
(2)方法正常小鼠60只随机分6组，灌胃给药(鬼针草总黄酮80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg，阳性药对照组联苯双酯100mg/kg)或等体积生理盐水(正常对照、模型)，每天2次，连续7d，于末次给药后2h，正常对照组ip10ml/kg花生油，其余5组均ip0.1％CCl410ml/kg，禁食16h后自小鼠后眼眶静脉从取血，测定血清ALT，AST活性，并取肝脏左叶同一部位，固定，做病理切片，进行肝脏病理组织学HE染色检查，结果以光镜下肝脏病理损伤程度评分和病理照片作为标准。
肝组织病变程度分级方法光镜下检查，按肝脏坏死程度分为5级0级，正常或肝脏有轻微变性，肝细胞无坏死；I级，点状坏死，坏死占肝小叶＜1/4；II级，点灶状坏死，坏死占肝小叶1/4-1/3；III级，灶状坏死，坏死占肝小叶＜1/2；IV级，片状坏死，坏死占肝小叶＞1/2。
(3)结果表1结果表明，CCl4显著升高小鼠血清中ALT、AST活性，而鬼针草总黄酮显著降低CCl4致急性化学性肝损伤小鼠血清中过高的ALT、AST活性。
表1鬼针草总黄酮对小鼠血清中ALT、AST的影响(n＝10，x±s)
**p＜0.01与对照组相比；##p＜0.01与模型组相比表2结果显示，模型组肝组织可见炎症细胞浸润，出现不同程度的坏死。鬼针草总黄酮可明显减轻肝脏炎症细胞浸润和坏死。
表2鬼针草总黄酮对CCl4致急性化学性肝损伤小鼠病理组织学的影响
1、鬼针草总黄酮抗乙肝病毒试验(1)抗乙肝病毒体内试验以感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的广州麻鸭为实验动物模型。1日龄广州麻鸭50只经腿静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性血清，每只0.2ml。感染13天后经腿胫静脉取血，测血清DHBV-DNA全部阳性。随机分为5组，鬼针草总黄酮组分别以100mg/kg.d、200mg/kg.d和400mg/kg.d给药，阳性对照药无环鸟苷(ACV)以100g/kg.d给药，病毒对照组以等量生理盐水灌胃，每天2次，共14天。于给药前(T0)、给药第7天(T7)、14天(T14)自鸭腿胫静脉取血，分离血清，测鸭血清中DHBV-DNA的水平，结果见表3。
表3各组鸭体内DHBV-DNA比较(OD值，x±s)
注与本组给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与病毒对照组同期比较，#P＜0.05，##P＜0.01表3结果显示鬼针草总黄酮对降低鸭乙肝病毒感染引起的DHBV-DNA的升高有显著作用，其中以400mg/kg.d组作用最为显著。
(2)抗乙肝病毒体外试验采用HepG22.2.15细胞，对药物的抗乙肝病毒作用进行测试。将2.2.15细胞复苏培养后用0.06％胰蛋白酶消化并将2.2.15细胞轻轻吹打分散成单个细胞悬液，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成细胞浓度为3×105个/ml的细胞悬液，按0.1ml/孔分别种于96孔板，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱内培养，2天后加用含药培养维持液0.1ml/孔。药物鬼针草总黄酮用含2％胎牛血清的培养液配制成10、5、2.5、1.25、0.63、0.31mg/ml六种浓度，每种药物浓度均加4孔，每4天换液1次，于培养第12天轻轻吸取培养细胞上清液用ELISA法测定HBsAg和HBeAg。结果见表4表4鬼针草总黄酮对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用
表4结果显示鬼针草总黄酮对HBsAg的抑制率均在70％以上，对HBeAg抗原的抑制作用在0.63mg/ml以上时较为明显。此结果表明鬼针草总黄酮能够显著抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg，具有较强的体外抑制2.2.15细胞表达乙肝病毒抗原的作用，提示鬼针草总黄酮在体外试验中有效抑制HBV的作用。
上述实验结果表明，本发明具有几个方面的优点1、本发明发掘了鬼针草总黄酮新的药用前景，开拓了一个新的药用领域；2、本发明的鬼针草总黄酮采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害；3、本发明鬼针草总黄酮的原药资源非常丰富，具有良好的社会和经济效益；4、本发明的鬼针草总黄酮适用于病毒性肝炎，作用于多个环节，疗效确切；5、本发明为将鬼针草进一步开发成新药提供了强有力的基础。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步地描述。
实施例1称取鬼针草生药10kg，粉碎后加入80％乙醇100L，热回流提取2次，每次1h，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩得浸膏。浸膏水溶，静置，过滤，澄清液上大孔树脂柱，水洗后收集80％乙醇洗脱部分。回收乙醇，减压浓缩，干燥即得提取物，提取物为鬼针草总黄酮。鬼针草总黄酮为黄绿色粉末状，具有芳香味，易潮解；其主要成分总黄酮含量为20-60％。提取物可加入相应辅料，制成片剂、胶囊、缓释片、滴丸、冲剂、微粒剂，并进一步纯化制成针剂。
鬼针草总黄酮临床推荐剂量300-1200mg/天，口服，一日三次。
权利要求
1.鬼针草总黄酮在制备防治病毒性肝炎药物中的应用，其特征在于鬼针草总黄酮在制备防治病毒性肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明属中药领域，涉及一种抗病毒性肝炎的药物，具体涉及鬼针草总黄酮在制备防治病毒性肝炎药物中的用途。本发明药物清热解毒、活血散淤、舒肝健脾，特别是具有改善肝功能、提高机体的免疫能力，调节免疫紊乱的作用，从而增强机体抵抗肝炎病毒的能力，抑制肝炎病毒的复制。本发明适用于各型病毒性肝炎，并作用于多个环节，疗效确切。用于治疗或预防病毒性肝炎采用口服给药，服用方便，毒副作用小，长期服药无危害。
文档编号A61P1/00GK1887301SQ200510097338
公开日2007年1月3日 申请日期2005年12月30日 优先权日2005年12月30日
发明者陈飞虎, 李俊, 钟明媚, 吕雄文 申请人:安徽医科大学