专利名称：新型人用狂犬疫苗的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人用狂犬疫苗及其制备方法，特别涉及含有纳米铝佐剂的狂犬疫苗及其制备方法。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒引起的仅能依靠疫苗和高免血清预防的急性传染病，病死率为100％，是病死率最高的急性传染病，临床上尚无特效疗法[Jacob H，ShmuelR，Michael G，et al.Successful Postexposure Rabies Prophylaxis after ErroneousStarting Treatment.Preventive Medicine.1999；2928-31]。人一旦有被狂犬病毒感染的可能机会，往往采用紧急接种疫苗的处理办法，针对狂犬病的特点，要求抗体产生早、滴度高[Hanion CA，Niezgoda M，Morrill PA，et al.The incurable woundrevisitedprogress in human rabies prevention？Vaccine.2001，192273-2279]。
目前世界大量生产的狂犬疫苗有四种第一种以美国为代表的二倍体细胞，经过浓缩超离制备的狂犬疫苗；第二种以法国为代表的Vero细胞为培养基质的，生产冻干灭活疫苗。第三种和第四种以中国为代表的地鼠肾和日本的鸡胚、鸭胚。
现有狂犬疫苗的制备主要通过以下方法在细胞中接种狂犬病毒毒种；收获病毒液；病毒液的灭活；澄清超滤；纯化；稀释分装。其中多数疫苗需要加入铝佐剂。主要起吸附作用。
铝佐剂吸附抗原的主要机制包括静电力、疏水作用以及基团交换[Vogel FR，Hem SL.InPlotkin SA，Orenstein MD，editors.Vaccines.4th ed.New YorkSanders]。磷酸根与铝在共价键的无机等价交换作用下，形成了内球表面。磷酸根对铝原子的连接比氢氧根更强，从而代替了氢氧根离子[Hingston FJ，AtkinsonRJ，Quirk JP.Specific adsorption of anions.Nature(London).1967，2151459-1461.和Liu J，Feldkamp JL，White JL，et al.Adsorption of phosphate by aluminumhydroxycarbonate.J Pharm Sci.1984，731355-1358.]。
目前商业用的铝佐剂主要为氢氧化铝和磷酸铝，但通常所指的铝佐剂主要是氢氧化铝，它实际上是Al(OH)3(aluminum hydroxide)分子内脱水的纤维状结晶态产物偏氢氧化铝(aluminum oxyhydroxide)，分子式为AlOOH。
目前公认丹麦产的Alhydrogel为标准，其胶粒大小为3.07微米。铝佐剂的等电点pI(isoelectric point)＝11.4，在机体pH＝7.4的间质液中带正电荷，能很好的吸附酸性蛋白抗原的特点①使用时间长从1926年开始使用；②安全有效；③价廉；④广泛应用；⑤对某些疫苗辅佐效果弱或无佐剂活性；⑥易诱导IgE的表达；⑦注射部位偶有出现红斑、皮下结节、接触性过敏反应和肉芽肿性炎症等，甚至有的还出现比较严重的局部反应。
如果将铝佐剂制备成纳米级颗粒，由于比表面积急剧增大，具有表面反应活性高、表面活性中心多、吸附能力强等这些优异性质，从而可能吸附更多的抗原，而且还能够产生爆释效应，铝佐剂的粒径是影响铝佐剂吸附度的主要因素。德国科学家Kreuter et al(1982年)首次将纳米技术应用于疫苗佐剂，他们用流感病毒抗原与纳米多聚甲基丙烯酸酯(PLC)聚合后免疫小鼠，发现该疫苗可以保护小鼠免受鼠流感病毒的侵袭。而且，该疫苗比一般佐剂和未使用佐剂的疫苗对温度变化更稳定。而我们对纳米铝佐剂的体液免疫应答的研究结果，其机制可能是由于纳米颗粒的粒径小，不仅可以吸附更多的抗原蛋白，而且也易于被抗原呈递细胞(APC细胞)摄取，即初次免疫后的爆释效应(burst-released)，Raghuvanshi等[Raghuvanshi RS，Katare YK，Komal Lalwani，et al.Improved immune responsefrom biodegradable polymer particles entraiepepng tetanus toxoid by use of differentimmunization protocol and adjuvants.International Journal of Pharmaceutics.2002，245109-121]也观察到该爆释效应，他们制备了纳米PLGA佐剂(Polylactide-co-glycolide)包载破伤风类毒素，与其微米粒子物理混合后，免疫小鼠发现抗体滴度形成两个波峰。在纳米粒子的快速爆释(burst-released)抗原后，快速呈递给MHC-II类分子，从而获得了较早的抗体应答[Men Y，Audran R，Thomasin C，et al.MHC class Iand class II-restricted processing and presentation ofmicroencapsulated antigens，Vaccine，1999；171047-1056]。爆释效应是“抗原储存库”效应的快速释放。在辅佐狂犬病毒的研究中，纳米铝佐剂的确能够在免疫后的第7天，就呈现出阳性抗体。在免疫后第7天至第12天，抗体效价均显著性高于传统的狂犬疫苗。
发明内容
本发明提供一种新型人用狂犬疫苗，其特征是，使用纳米铝佐剂材料，使市售的人用狂犬疫苗更多地被纳米铝佐剂所吸附，效果优于常规铝佐剂所吸附的传统的人用狂犬疫苗。
本发明的新型人用狂犬疫苗可以在第一次免疫接种之后快速地产生应答，适合于紧急预防接种。新型人用狂犬疫苗还大大降低了副作用，注射疫苗部位的炎症性结节明显减少甚至根本没有。
本发明是通过以下技术方案实现的，将氢氧化铝原料制成颗粒直径为1-999纳米的纳米级微粒、将此氢氧化铝微粒作为疫苗配方中铝佐剂的原料，优选的氢氧化铝颗粒粒度为1-400纳米，更优选的为1-100纳米，最优选的为72纳米。
本发明通过电子显微镜观测的方法对氢氧化铝微粒进行粒度测定，以得到合格的质量稳定的纳米级氢氧化铝微粒。
测定方法见本发明实施例。
本发明的疫苗含有经过纯化的可作为疫苗应用的狂犬病毒灭活疫苗原料，以及经本发明方法制备的纳米铝佐剂，必要时可加入疫苗保护剂，如人血白蛋白。
本发明的疫苗原料可以采用已知技术制备，也可以在市场上买到。
本发明的疫苗，各成分所占比例为狂犬病毒灭活疫苗原料60-80％；纳米铝佐剂占20-40％，推荐的最佳比例为狂犬病毒灭活疫苗原料70％；纳米铝佐剂占30％。
本发明所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂用量为0.1-5.0摩尔每升，所述狂犬疫苗的剂量为5.0-60微克每支。优选的纳米铝佐剂用量为1.0摩尔每升。
本发明的疫苗其制备方法为，将以上成分按照制备疫苗制剂的常规技术，经过混合，制成可供注射的医药用疫苗制剂。
本发明的纳米铝佐剂，可以采用化学法和机械法两种方法。化学法能够制得纳米级的粉体。机械粉碎法成本低、产量大，是制备超微粉体的主要手段，现已大规模应用于工业生产。超微粉碎可分为干法粉碎和湿法粉碎根据粉碎过程中产生粉碎力的原理不同，干法粉碎有气流式、高频振动式、旋转球(棒)磨式、锤击式和自磨式等几种形式；湿法粉碎主要是胶体磨和均质机。本发明可以通过以上任意的方法得到粒径在1-999纳米的铝佐剂产品，优选使用化学法。
如以下方法取一定量的A1C13、环己烷和蒸馏水于烧杯中，再加入中性离子保护剂、助表面活性剂，然后用高速分散均质机搅拌，使其乳化成为微乳液。倒入有盖的反应瓶加热搅拌，缓慢逐滴加入过量氨水，盖上盖子，反应3小时，即为Al(OH)3溶胶，采用冷冻干燥法或真空干燥法，得到干粉。
其中助表面活性剂为混合表面活性剂，由苯扎溴铵与正辛醇混合，质量比以1∶4；1∶3；1∶2；8∶5；1∶1；2∶1；3∶1；4∶1的配比，最佳配比为1∶1。其中混合表面活性剂与环己烷按照质量比为1∶9、1∶4、1∶3、4∶1、9∶1、3∶1、5∶0。氨水的使用剂量为1-50毫升，推荐剂量为10毫升，添加氨水的滴速约10-50滴每分钟，推荐滴速约30滴每分钟，保持体系的pH值在8以上，推荐pH值为10，反应时间为0.5-5小时，最佳时间为2小时；使用的水为实验室用途的纯净水，推荐使用去离子水；乙醇浓度为75-100％，推荐浓度为95％；反应体系中加入丙酮的目的是破乳，使用浓度为1.0摩尔每升，推荐使用分析纯。
本发明优选的方法列在本发明实施例中。
本发明采用本发明的纳米铝佐剂材料吸附大量的人用狂犬疫苗，从而形成了新型的人用狂犬疫苗。新型的人用狂犬疫苗在具备了常规狂犬疫苗优点的基础上，还能够快速激活机体的免疫应答，造成注射部位的炎性反应明显减小，甚至根本没有炎性反应。
本发明的有益效果列在本发明的实施例中。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1，本发明所涉及的纳米铝佐剂的制备方法取一定量的AlCl3、环己烷和蒸馏水于烧杯中，再加入再加入苯扎溴铵-正辛醇-环己烷-AlCl3溶液体系，然后用高速分散均质机搅拌，使其乳化成为微乳液。倒入有盖的反应瓶加热搅拌，缓慢逐滴加入过量氨水，盖上盖子，反应3小时，采用冷冻干燥法或真空干燥法，即为Al(OH)3溶胶。
用电子显微镜方法测定氢氧化铝氢氧化铝粒经，结果氢氧化铝粒度为72纳米。
实施例2，新型人用狂犬疫苗的制备方法将制备的纳米铝佐剂配成0.1毫克每毫升(以水为溶剂)，超声波分散纳米铝佐剂溶液20分钟，加入市售无佐剂人用狂犬疫苗剂量为5.0微克每支，将人用狂犬疫苗与纳米铝佐剂按3∶1的体积混合，4℃吸附一周，以15000转每分钟离心30分钟，采用ELISA双抗体夹心法检测上清中Rabies v抗原浓度。按照以上介绍的方法，新型人用狂犬疫苗被吸附在单位质量的纳米铝佐剂上的数量较常规铝佐剂的提高了10-20倍。
实施例3，本发明的新型人用狂犬疫苗免疫小鼠的结果主要试剂及其配制包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)组成Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，Na2N3 0.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6。
封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)组成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸盐缓冲液(PB)A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)组成NaH2PO4·H2O 27.6g溶于超纯水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)组成Na2HPO4·7H2O 53.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g)溶于超纯水1000ml。
样本稀释液(PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水)成分PB A液19ml；PB B液81ml；NaCl 18.5g；超纯水1000ml。
洗涤液(PBST，pH7.4)组成PBS液1000ml加Tween 20 0.5ml，硫柳汞0.1g，调至pH7.4。
底物液(OPD-H2O2)组成及其来源OPD(邻苯二胺<盐酸盐>)。
A液(0.1mol/L柠檬酸溶液)组成柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1000ml；B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液)组成Na2HPO4·12H2O 71.7g，加蒸馏水至1000ml。
终止液(2mol/LH2SO4溶液)组成双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG。
主要仪器酶标仪、电子天平、pH测定仪、96孔聚苯乙烯酶联板、电热恒温水热箱、微量多头细胞收集器。
实验方法健康Balb/c小鼠20只，雌性，6～8周龄，体重10～16克，随机分为实验组、对照组各10只，按相同的方法和剂量免疫小鼠。ELISA测定抗体滴度。
间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体，结果以双复孔平均OD值表示，待测标本OD值/阴性对照OD值＞2.1判定为阳性。
免疫Balb/c小鼠后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第12天、第14天、第16天，每组每次取3只小鼠，眶静脉采血，按照等体积收集混合血清，ELISA法测定抗狂犬病毒IgG抗体。当血清以1∶100稀释后，测定血清的OD值，纳米铝佐剂组与常规铝佐剂组比较，阳性血清产生时间早，在免疫后第7天即可出现抗狂犬病毒IgG抗体；并且OD492值明显较高，在免疫后第7天～第12天，新型人用狂犬疫苗所产生的抗体较传统的人用狂犬疫苗的显著提高。
实施例4，安全实验参照文献报道的方法[赵晶，王立新，明胶微球乙肝疫苗动物免疫效果研究，中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(3)236-239]对以上实验小鼠，于免疫后的第3天、第7天和第14天各观察1次，并观察小鼠脾脏变化。本发明的新型人用狂犬疫苗免疫的小鼠健存，体重增加，无全身异常反应，皮下硬结明显小于传统人用狂犬疫苗注射小鼠。
实施例5，新型人用狂犬疫苗的制备方法将制备的纳米铝佐剂配成5.0摩尔每升(以水为溶剂)，超声波分散纳米铝佐剂溶液20分钟，加入市售无佐剂人用狂犬疫苗 剂量为60微克每支，将人用狂犬疫苗与纳米铝佐剂按3∶1的体积混合，4℃吸附一周，以15000转每分钟离心30分钟，采用ELISA双抗体夹心法检测上清中Rabies v抗原浓度。按照以上介绍的方法，新型人用狂犬疫苗被吸附在单位质量的纳米铝佐剂上的数量较常规铝佐剂的提高了10-20倍。
实施例6，新型人用狂犬疫苗的制备方法将制备的纳米铝佐剂配成1.0摩尔每升(以水为溶剂)，超声波分散纳米铝佐剂溶液20分钟，加入市售无佐剂人用狂犬疫苗剂量为10微克每支，将人用狂犬疫苗与纳米铝佐剂按3∶1的体积混合，4℃吸附一周，以15000转每分钟离心30分钟，采用ELISA双抗体夹心法检测上清中Rabies v抗原浓度。按照以上介绍的方法，新型人用狂犬疫苗被吸附在单位质量的纳米铝佐剂上的数量较常规铝佐剂的提高了10-20倍。
实施例7，新型人用狂犬疫苗的制备方法将制备的纳米铝佐剂配成3.0摩尔每升(以水为溶剂)，超声波分散纳米铝佐剂溶液20分钟，加入市售无佐剂人用狂犬疫苗 剂量为40微克每支，将人用狂犬疫苗与纳米铝佐剂按3∶1的体积混合，4℃吸附一周，以15000转每分钟离心30分钟，采用ELISA双抗体夹心法检测上清中Rabies v抗原浓度。按照以上介绍的方法，新型人用狂犬疫苗被吸附在单位质量的纳米铝佐剂上的数量较常规铝佐剂的提高了10-20倍。
权利要求
1.一种新型的人用狂犬疫苗，其特征在于，含有人用狂犬疫苗，和纳米铝佐剂，其配方比例为狂犬病毒灭活疫苗原料60-80％；纳米铝佐剂占20-40％。
2.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，其配方比例为狂犬病毒灭活疫苗原料70％；纳米铝佐剂占30％。
3.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为1-999纳米。
4.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为1-400纳米。
5.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为1-100纳米。
6.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为平均粒经72纳米。
7.如权利要求l所述的狂犬疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤将狂犬病毒灭活疫苗原料和纳米铝佐剂按照制备疫苗制剂的常规技术，经过混合，制成可供注射的医药用疫苗制剂。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，其中所述纳米铝佐剂的制备包括以下步骤取AlCl3、环己烷和蒸馏水于烧杯中，再加入再加入苯扎溴铵-正辛醇-环己烷-AlCl3溶液体系，然后用高速分散均质机搅拌，使其乳化成为微乳液。倒入有盖的反应瓶加热搅拌，缓慢逐滴加入过量氨水，盖上盖子，反应3小时，即为Al(OH)3溶胶，采用冷冻干燥法或真空干燥法。
9.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂用量为0.1-5.0摩尔每升，所述狂犬疫苗的剂量为5.0-60微克每支。
10.如权利要求1所述的狂犬疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂用量为1.0摩尔每升。
全文摘要
新型人用狂犬疫苗的制备方法及用途，其基本特征在于将市售的无佐剂的人用狂犬疫苗吸附于纳米铝佐剂上，所生成的新型人用狂犬疫苗，新型人用狂犬疫苗所采用的纳米铝佐剂的颗粒直径为1－999纳米，成分为氢氧化铝化合物。颗粒直径为1－999纳米的氢氧化铝化合物具有分散性好、不含杂质等优点，所用设备、工艺简单，是一种具有良好发展前途的制备方法，纳米铝佐剂增加10－20倍地吸附人用狂犬疫苗，形成了本发明所指的新型人用狂犬疫苗，本发明所指的新型人用狂犬疫苗具有明显的“爆释”效应，在免疫后的第7天就会产生明显的抗体应答，适合于紧急预防接种。使用安全，注射部位基本无、甚至根本无炎症结节。
文档编号A61P31/00GK1824302SQ20051013519
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者吕凤林, 何萍 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院