专利名称：：在放射和/或化学疗法治疗前预敏化癌症的方法和新的细胞因子混合物的制作方法引言本发明涉及在诸如化学疗法、放射疗法或者免疫疗法的治疗性处理前预敏化癌症的突破性方法和用在该方法中的新的细胞因子混合物。细胞因子混合物是无血清并且无丝裂原的混合物，其由相对于白介素2(IL-2)具有特定比率的细胞因子如IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF组成，所述混合物可有效诱导癌性细胞进入增殖细胞周期阶段，从而增加它们对化学疗法、放射疗法和免疫疗法的敏感性。一种此类新的细胞因子混合物是白细胞白介素注射液(LeukocyteInterleukinInjection，LI)或者Multikine，其可以单独使用或者与用于治疗癌症的其他药物组合使用，从而增加癌症治疗的成功率和癌症患者的无病存活率。
背景技术：
：癌症，尤其是实体瘤的当前治疗主要包括外科手术，其次是放射疗法和/或化学疗法。Dunne-DalyCF，″Principlesofradiotherapyandradiobiology″，SeminOncolNurs.1999Nov；15(4)250-9；HensleyML等人，″AmericanSocietyofClinicalOncologyclinicalpracticeguidelinesfortheuseofchemotherapyandradiotherapyprotectants.″，JClinOnco1.1999Oct；17(10)3333-55。与这些疗法结合，使用了不能区分正常细胞和癌性细胞的毒性化学治疗剂，如吉西他滨、长春碱、顺铂、氟尿嘧啶、Gleevec、甲氨喋呤。这些和其他毒性化学治疗剂尽管有效，但是不能增加总体患者存活。此外，尽管有化学疗法和放射疗法为协同组合，当前的治疗通常还不能提高癌症患者的5年存活率。甚至抗表皮生长因子受体剂、抗血管生成药物和使用诸如利妥昔单抗、爱必妥(Erbitux)和赫赛汀(Herceptin)的免疫疗法和免疫佐剂疗法也不能显著增加癌症患者的5年存活率。此外，通过前述疗法或者它们的协同组合的任一种还没有不分癌症类型改善癌症患者的完全缓解或无疾病存活。研究用来提高无疾病存活率或者导致完全缓解的一种治疗方式是控制癌性细胞的细胞分裂周期。具体地，周期中肿瘤细胞一般比周期外肿瘤细胞对放射和化学疗法更敏感，因为在细胞周期中需要复杂的生物化学和生物分子过程，如依赖酶的DNA复制、依赖酶的磷酸化、信号级联、转录活化分子复合体的结合和解离，和细胞结构元件的大分子装置的形成和解离。通过诱导肿瘤细胞进入细胞周期阶段，抑制任一种复杂的生物化学过程的抗代谢剂，如核糖核苷酸还原酶(RNA)抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂或者DNA聚合酶抑制剂可以用于停止细胞周期从而阻止肿瘤增殖。然而，利用细胞周期的已知方法局限于顺序应用化学治疗剂同步细胞周期停滞。例如，一种已知方法用嘧啶类似物使恶性细胞停滞在细胞周期的S期，然后暴露于高浓度的抗代谢物。B.Bhutan等人，CancerRes.33888-894(1973)。应用抗代谢物后，该群体内的很少细胞或者没有细胞可以前进超过该停滞点。WVogel等人，Hum.Genet.45193-8(1978)。其他成果包括通过改变细胞群体内细胞周期分布而控制细胞分裂周期。这些方案刺激恶性细胞从休眠期进入细胞周期，从而在敏感的DNA复制期内增加它们对抗代谢物药物作用的敏感性。HHEuler等人，Ann.Med.Interne.(Paris)145296-302(1994)；BCLampkin等人，J.Clin.Invest.502204-14(1971)；Alama等人，AnticancerRes.10853-8(1990)。相反地，其他已知的方法抑制正常细胞进入S期，从而保护正常细胞免受趋化性药物的伤害。用化学治疗剂同步细胞周期阶段的另一已知方法是REMoran等人，CancerTreat.Rep.6481-6(1980)描述的所谓的脉冲剂量化学疗法。在该方法中，注入羟基脲将小鼠中的白血病肿瘤细胞阻止在细胞周期的S期。注入后，细胞被“释放”以继续细胞周期，其中对小鼠给予第二种治疗剂(Ara-C)的“脉冲”。目的是在周期中细胞通过敏感的细胞周期S-期时使第二种治疗剂的影响最大。然而，结果表明尽管在羟基脲注入后就用Ara-C治疗的小鼠表现出提高的存活率，但是在羟基脲注入后稍后用Ara-C治疗的小鼠没有显示出提高的存活率。显然，简单地同步化细胞周期与不同时作用的第二种治疗剂不能改进这两种治疗剂的作用。然而，利用细胞周期的已知方法仍继续寻求剂量、药物代谢动力学、顺序和用药时间之间的最佳但是被动的协同。可以预期，将细胞群体限制在细胞对伤害特别敏感的敏感细胞周期阶段可能使细胞杀伤动力学转向更高的效率，并通过减小暴露于毒性药物而使副作用有更大的降低。然而，利用细胞周期停滞或者静态同步化的实际实验已经让人失望，因为已知的方法不能有效地诱导细胞进入细胞周期。相反，所有已知的方法都简单地安排细胞周期停滞或者静态同步化与靶细胞群体的协同组合的时间。而且，用于实现所述细胞周期的治疗剂如嘧啶和羟基脲可导致对正常细胞的伤害。当然，另一种方法将是诱导细胞进入细胞周期阶段，而不是停滞细胞周期或者同步化细胞周期。然而，如从现有技术预测到的，诱导细胞进入细胞周期增加了肿瘤快速生长和复发的风险。但是已知组合物在提高无疾病存活率或者导致完全缓解方面的不断失败提示需要以某种方式诱导恶性细胞进入细胞周期，该方式不使肿瘤增殖但是增加残留肿瘤对用放射和/或化学疗法进行的后续治疗的敏感性。因此，需要诱导肿瘤细胞进入选自(细胞周期的不同阶段)G1、S、G2和M的细胞周期的方法，其中该新方法可以与化学疗法、免疫疗法和放射疗法协同应用。还需要预敏化癌症肿瘤，以及通常也需要新的无血清且无丝裂原的细胞因子混合物，该混合物由特定比率的IL-1β比IL-2、TNF-α比IL-2、IFN-γ比IL-2和GM-CSF比IL-2所组成，所述混合物在诱导肿瘤细胞进入细胞周期阶段或者预敏化癌症中出乎意料地表现出比已知的组合物好得多的功效。发明概述本发明部分地基于预敏化一般的癌症的方法和新的无血清且无丝裂原的细胞因子混合物，该混合物具有IL-1β与IL-2、TNF-α与IL-2、IFN-γ与IL-2和GM-CSF与IL-2的特定比率。因此，本发明使得能开发作为药物或者作为佐剂的组合物，以与治疗性癌症治疗如化学疗法、免疫疗法和放射疗法结合使用。在本发明的实施方案中，公开了用无血清且无丝裂原的细胞因子混合物改善肿瘤或者免疫系统疾病的常规化学疗法或者放射疗法的方法。该方法为与放射疗法或者其他细胞杀死性物理方式结合的癌症治疗提供了预敏化步骤。还考虑了用于诱导肿瘤细胞进入选自(细胞周期的不同阶段)G1、S、G2和M的敏感细胞周期阶段的方法。本发明不限于任何一种具体类型的癌症并且可以包括任何类型的癌症。特定应用包括围绕肿瘤施用无血清且无丝裂原的细胞因子混合物，每周三次，持续两周，每次约20IU到1600IU，或者特别地400IU或者800IU，或者以每周5次，每次约20IU到1600IU，或者400IU或者800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2国际标准86/504(WorldHealthOrganizationISInternationalStandardforHumanIL-2，86/504)给出的白介素-2的国际单位。另一实施方案包括无血清且无丝裂原的细胞因子制剂，如新颖的并且非显而易见的浓度的白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine。该细胞因子制剂还可以是药物组合物的一部分。在特定应用中，该新的无血清并且无丝裂原的细胞因子制剂具有细胞因子与白介素2(IL-2)的特定比率，如下IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5，优选0.7+/-0.1(IL-1β/IL-2)、TNF-α与IL-2的比率为3.2-11.3，优选9.5+/-1.8(TNF-α/IL-2)、IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9，优选6.0+/-1.1(IFN-γ/IL-2)，以及GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8，优选4.0+/-0.5(GM-CSF/IL-2)。在其他特定应用中，无血清并且无丝裂原的细胞因子制剂或者药物组合物还具有白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine中不同的细胞因子和其他小生物活性分子，其中每种小生物活性分子与IL-2的比率如下IL-3与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15，IL-6与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9，IL-8与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6，IL-1α与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19，IL-10与IL-2的比率为2.82-3.22，优选3.0+/-0.18，IL-16与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68，G-CSF与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81，TNF-β与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63，MIP-1α与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0，MIP-1β与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7，RANTES与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13，EGF与IL-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008，PGE2与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87，TxB2与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83。本领域经常治疗癌症患者的技术人员知道对于此类癌症的治疗有许多不同的方案并且那些方案对特定患者的应用将依赖于多种因素的考虑，这些因素为例如，癌症的阶段、癌细胞的扩散程度，例如，它们是否转移，和患者的身体素质。本领域技术人员常规地调节具体患者的具体治疗的参数，如剂量、持续时间、施用途径和施用的形式，并且本领域技术人员不用过度实验就可以调节那些参数。组成了本公开一部分的附图和表格阐明并且与说明书一起解释本发明的原理。本领域技术人员将明白参考附图和下面的详细描述，本发明的其他方面将变得显而易见。附图简述本专利或申请含有至少一幅彩图。当请求并且支付了必要费用后，将由专利局提供带有彩图的该中请或者专利申请公布的拷贝。现在将通过下面的描述和特定实施方案并借助附图更详细地解释本发明。图1代表白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的作用方式。图2代表白细胞白介素注射液(LI)处理对患有头和颈的口腔鳞状细胞癌(OSCC)的患者中肿瘤周期中细胞的百分数的影响(根据LI处理组中OSCC中Ki-67阳性细胞的免疫组织化学外观)。数据以平均值±SEM给出(n＝25，对照，n＝11，LI-处理组)(*P＜0.05)(0＝对照，未处理组)。图3代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对通过CD45标志物检测的淋巴样细胞在肿瘤表面(区1.0)；肿瘤中心(区2.0)和肿瘤表面界面(区3.0)处口腔鳞状细胞癌(OSCC)中基质淋巴样细胞的形态方面的影响.数据以平均值±SEM给出(n＝27，对照组，n＝11，LI-处理组)(*P＜0.05)。图4代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对口腔鳞状细胞癌(OSCC)中周期中细胞百分数在形态测定方面的影响。Ki-67阳性细胞已经在基质隔室和肿瘤上皮巢中被计数。数据以平均值±SEM给出(n＝25，对照，n＝11，LI-处理组)(*P＜0.05)(0＝对照，未处理组)。图5代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对通过CD45标志物检测的淋巴样细胞在OSCC中上皮内淋巴样细胞的形态测定方面的影响。区1.0＝肿瘤表面；区2.0＝肿瘤中心；区3.0＝肿瘤-基质界面。数据以平均值±SEM给出(n＝27，对照组，n＝11，LI-处理组)(*P＜0.05)。图6代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对口腔鳞状细胞癌(OSCC)中白介素2受体阳性(CD-25)淋巴样细胞的密度的影响(根据关于基质密度的形态测定法)。区1.0＝肿瘤表面；区2.0＝肿瘤中心；区3.0＝肿瘤-基质界面。数据以平均值±SEM给出(n＝27，对照组，n＝11，LI-处理组)(*P＜0.05)。图7代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对口腔鳞状细胞癌(OSCC)中白介素2受体阳性(CD-25)淋巴样细胞的密度的影响(根据关于上皮内密度的形态测定法)。区1.0＝肿瘤表面；区2.0＝肿瘤中心；区3.0＝肿瘤-基质界面。数据以平均值±SEM给出(n＝27，对照组，n＝11，LI+处理组)(*P＜0.05)。图8代表口腔鳞状细胞癌的对照病例对该试验中对照组(病例10)内T细胞的密度、CD3-阳性细胞的免疫定位的影响(最初放大倍数×400)。图9代表口腔鳞状细胞癌的白细胞白介素注射液(LI)处理对LI处理的CD3-阳性T细胞的密度、CD3-阳性细胞的免疫定位的影响(病例31，最初放大倍数×400)。图10代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对口腔鳞状细胞癌(OSCC)中CD3阳性细胞密度的影响(根据关于基质密度的形态测定法)。区1.0＝肿瘤表面；区2.0＝肿瘤中心；区3.0＝肿瘤-基质界面。数据以平均值±SEM给出(n＝27，对照组，n＝25，LI-处理组)(*P＜0.05)。图11代表增加剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理对口腔鳞状细胞癌(OSCC)中CD3阳性细胞密度的影响(根据关于上皮内密度的形态测定法)。区1.0＝肿瘤表面；区2.0＝肿瘤中心；区3.0＝肿瘤-基质界面。数据以平均值±SEM给出(n＝27，对照组，n＝25，LI-处理组)(*P＜0.05)。本发明和优选实施方案的详细描述本发明涉及预敏化癌症的一般方法和由特定比率的IL-1β比IL-2、TNF-α比IL-2、IFN-γ比IL-2和GM-CSF比IL-2组成的新的无血清且无丝裂原的细胞因子混合物。一种此类新的细胞因子混合物是白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine，其已被证明具有免疫调节能力。癌症患者中免疫抑制的临床重要性出乎意料地影响了治疗性处理和尤其是肿瘤细胞进入细胞周期阶段之前预敏化癌症的方法。通过细胞因子如IL-2、IFN-α-γ或者IL-12的注入完成头颈癌患者的免疫恢复。Whiteside，″Immunobiologyandimmunotherapyofheadandneckcancer″，CurrOncolRep2001；346-55。在头颈癌中，基于白介素的细胞因子疗法导致免疫增强。CortesinaG等人，″Interleukin-2iniectedaroundtumor-draininglymphnodesinheadandneckcancer″，HeadNeck1991；13125-31；DeStefani等人，″Treatmentoforalcavityandoropharynxsquamouscellcarcinomawithperilymphaticinterleukin-2clinicalandpathologiccorrelations″，JImmunother1996；19125-33；Valente等人，″InfiltratingleukocytepopulationsandT-lymphocytesubsetsinheadandnecksquamouscellcarcinomasfrompatientsreceivingperilymphaticinjectionsofrecombinantinterleukin2″，ModPathol1990；3702-8；WhitesideTL等人，″Evidenceforlocalandsystemicactivationofimmunecellsbyperitumoralinjectionsofinterleukin2inpatientswithadvancedsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck″，CancerRes1990；535654-62；Barrera等人，″Combinationimmunotherapyofsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck″，ArchOtolaryngolHeadNeckSurg2000；126345-51；Verastegui等人，″Anaturalcytokinemixture(IRX-2)andinterferencewithimmunesuppressioninduceimmunemobilizationandregressionofheadandneckcancer″，IntJImmunopharmacol1997；19619-27；Hadden等人，″Interleukinsandcontrasuppressioninduceimmuneregressionofheadandneckcancer″，ArchOtolaryngolHeadNeckSurg1994；120395-403。例如，如通过细胞毒性淋巴细胞[CTL]和迟发型超敏[DTH]应答所测量的，人(r)hIL-2成功地用于改善头颈癌患者的免疫功能。T细胞的减弱的应答通过T细胞受体(TCR)、其关键信号传递组分、ζ链和zap-70的表达的降低、不产生IL-2和T细胞的增强的凋亡来证明。WhitesideTL.，″Immunobiologyandimmunotherapyofheadandneckcancer″，CurrOncolRep2001；346-55。研究头颈癌中受损的T细胞功能的原因的研究表明Fas-FasL系统、TGF-β和PGE2以高水平表达。然而，体内施用rIL-2增加了CD25+细胞以及自然杀伤(NK)细胞、人白细胞抗原(HLA)-DR+淋巴细胞和T细胞的密度。在另一系列研究中，当在淋巴管周围或者肿瘤周围施用细胞因子混合物时，已经观察到阳性临床应答。然而，这些研究都没有将增强的免疫应答和确定的继续治疗如手术、放射疗法和/或化学疗法关联起来。本技术Multikine或者白细胞白介素注射液(LI)是从人外周血单核细胞(包括T细胞、B细胞和巨噬细胞)产生的无血清、无丝裂原、无抗生素的制剂。在白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine中有三个“家族”的细胞因子，它们一起赋予白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine独特的生物学活性。它们包括直接细胞毒性/细胞抑制和杀病毒/病毒抑制细胞因子，如TNF-α，和IFN-γ、淋巴增殖性细胞因子，如IL-1，和IL-2和趋化细胞因子，如IL-6、IL-8和MIP-1α。此外，组成白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的不同细胞因子和小生物分子都来自包括T细胞、B细胞和巨噬细胞在内的人外周血单核细胞的凝集素(例如，PHA)体外刺激。在菲可帕克梯度上的离心从供体全血分离白细胞(包括T细胞、B细胞和巨噬细胞)，一系列洗涤(用生理学缓冲的介质)有助于分离淋巴细胞以及除去血红细胞、细胞碎屑和来自供体全血的分离的白细胞组分的其他不想要的细胞组分。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine含有不同的细胞因子，每种细胞因子相对于白介素2(IL-2)以如下特定比率存在IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5，优选0.7+/-0.1(IL-1β/IL-2)；TNF-α与IL-2的比率为3.2-11.3，优选9.5+/-1.8(TNF-α/IL-2)；IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9，优选6.0+/-1.1(IFN-γ/IL-2)；以及GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8，优选4.0+/-0.5(GM-CSF/IL-2)。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine中不同细胞因子的剩余者和其他小生物活性分子也存在于每种制剂内，小生物活性分子与IL-2的比率如下IL-3与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15；IL-6与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9；IL-8与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6；IL-1α与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19；IL-10与IL-2的比率为2.82-3.22，优选3.0+/-0.18；IL-16与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68；G-CSF与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81；TNF-β与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63；MIP-1α与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0；MIP-1β与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7；RANTES与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13；EGF与IL-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008；PGE2与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87；TxB2与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine用表征方案进行测试并且不含有下面的细胞因子和其他小生物活性分子IL-4、IL-7、和IL-15、TfR、sICAM、PDGF-AB、IFN-α、EPO、LTC4、TGF-β2、碱性FGF、血管生成素、sE-选择蛋白、SCF、和LIF。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine仅含有痕量(仅高于测定法的检测水平)的IL-12和LTB4。在生产方法中，通过分级梯度离心从人供者“血沉棕黄层”分离单核细胞并用PHA培养以增强培养的供者白细胞的产生和分泌IL-2和其他细胞因子，如美国专利5,093,479、4,390,623、4,388,309、4,406,830、4,661,447、4,681,844和4,464,355所公开的，将它们引入本文作为参考。随后，培养上清液被无菌收集、澄清并接受商业化病毒排除过程。然后将上清液进一步通过超滤和微滤浓缩约10倍。此时，加入人血清白蛋白(Inj.USP)，将浓缩物缓冲到生理pH并按照标签要求达到目标IL-2浓度(例如400IU/mL)。将浓缩物进行再次微滤(0.22微米级滤器)并无菌分配到无菌血清型小瓶中并标上其IL-2含量。通过细胞毒性T淋巴样细胞系(CTLL-2)对放射性标记的胸苷掺入测量产物效能。最终的注射剂进一步通过ELISA测试5种标志细胞因子IL-2、IL-Iβ、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的存在。在含有2.2ml药物、标签说明为IL-2(400IU/ml)的硼硅玻璃无菌小瓶中冷冻提供用于肿瘤周围、肿瘤内、淋巴管周围或者皮下施用的白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine。对白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine进行同一性、无菌性、细菌内毒素、pH和总蛋白质浓度质量控制测试。检查每瓶的微粒污染和外观。制剂的总蛋白质含量为约3mg/mL(或者+/-1mg/mL)，其中提供的物质无菌无热原。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine指定的过期日期是药物在-20℃下保存时从生产日期开始24个月。定义IL-2-白介素2(IL-2)CD4+辅助T淋巴细胞合成的15.5kD的糖蛋白(正式地称作T细胞生长因子)。IL-2对产生它的CD4+T淋巴细胞和免疫系统的其他细胞(包括B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK[自然杀伤细胞]细胞和其他的)具有自分泌效应。IL-1β-白介素1β(IL-1β)活化的单核吞噬细胞合成的17kD细胞因子，其以游离形式存在于循环系统中并且介导炎症应答。它作用于CD4+T淋巴细胞以帮助促进它们的增殖，并且作为生长和分化因子作用于B淋巴细胞。它还诱导单核吞噬细胞的IL-6合成。TNF-α-肿瘤坏死因子α(TNF-α)受刺激的单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞等合成的157个氨基酸(aa)残基蛋白质，以三聚体形式存在于循环系统中。TNF介导直接抗肿瘤作用，导致肿瘤细胞裂解，促进白细胞募集，诱导血管发生并促进成纤维细胞增殖。IFN-γ-γ干扰素(IFN-γ)活化的T淋巴细胞和NK细胞合成的21-24-kD糖蛋白同型二聚体，是单核细胞的强烈活化剂，增加单核细胞破坏细胞内微生物和肿瘤细胞的能力。它具有直接的抗病毒和抗增殖活性，并且导致许多细胞类型表达II型MHC(主要组织相容性复合体)细胞表面分子复合体，以及增加I类MHC的表达。GM-CSF-粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)在循环中作为单体被发现的127aa蛋白质，由巨噬细胞和T淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。它是造血细胞的生长因子，并且刺激骨髓单核细胞谱系的生长和分化。IL-3-白介素-3(IL-3)活化的CD4+T辅助细胞合成的20-kD淋巴因子，其通过促进一些造血细胞的增殖和促进T淋巴细胞的增殖和分化而作为集落刺激因子。IL-6-白介素-6(IL-6)活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生的26-kD细胞因子。它作用于许多细胞并且在使得活化的B淋巴细胞分化成分泌抗体的浆细胞中有特殊功能，并且诱导肝细胞形成急性期蛋白质(参与炎症反应)以及血纤维蛋白原。IL-8-白介素-8(IL-8)巨噬细胞和内皮细胞产生的8-kD蛋白质。它是嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的强烈的趋化因子，并且促进嗜中性粒细胞附着到内皮细胞。IL-1α-白介素1α(IL-1α)从33-kD前体分子切除的17-kD细胞因子(像IL-1β)，由活化的单核吞噬细胞合成，很少在循环中以游离形式被发现，并且作为膜结合的物质。它帮助IL-1β介导炎症反应。IL-10-白介素-10(IL-10)CD4+和CD8+淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和活化的B淋巴细胞和角质化细胞产生的18-kD多肽。它抑制巨噬细胞尤其向TH-1型细胞呈递抗原的能力，并分泌IL-6和TNF。IL-16-白介素-16(IL-16)CD8+T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、和呼吸上皮细胞产生的14-kD四聚体蛋白。它对于CD4+T淋巴细胞和单核细胞具有强力的化学引诱性质。G-CSF-单核细胞集落刺激因子(G-CSF)巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和基质细胞产生的22-25kD同型二聚体糖蛋白。它增加骨髓中的粒细胞祖细胞，并且维持血液嗜中性粒细胞的增加。它还增强嗜中性粒细胞显示出增强的超氧化物产生，超氧化物被认为在微生物感染的细胞和肿瘤细胞的破坏中是重要的。TNF-β-肿瘤坏死因子β(TNF-β)活化的淋巴细胞产生的25-kD蛋白质。它可以杀死培养的肿瘤细胞，并刺激成纤维细胞增殖。此外，它模拟TNF-α的多数其他作用。MIP-1α-巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1α)巨噬细胞和其他细胞产生的66-aa单体蛋白质。它是单核细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱剂。RANTES-T淋巴细胞产生的8kD蛋白质，是单核细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱剂，并且促进炎症。EGF-表皮生长因子(EGF)53-aa残基的三硫酸化的多肽。EGF是酪氨酸激酶家族成员，具有多种功能，包括刺激促有丝分裂应答和帮助伤口愈合。PGE2-前列腺素E2(PGE2)PGE2属于通过环加氧酶酶促反应从花生四烯酸衍生的生物活性脂类的家族。它由活化的单核细胞释放并且阻断淋巴细胞和巨噬细胞上MHCII类表达。TxB2-血栓烷B2(TxB2)TxB2是通过异构化前列腺素和通过血栓烷合成酶内过氧化PGH2从不饱和脂肪酸衍生的生物活性化合物的成员。TxB2在血栓栓塞性疾病和过敏性反应中具有生理作用。CD25+细胞-CD25是单链糖蛋白，通常称作白介素-2-受体(IL-2R)的α链或者Tac-抗原，其具有55kDa的分子量并且存在于活化的T细胞和B细胞和活化的巨噬细胞上。它作为IL2的受体。CD25抗原与IL-2R的β链一起形成IL-2的高亲和性受体复合体。CTLL-2(细胞系)-从C57B1/6小鼠得到的小鼠细胞毒性T淋巴细胞的细胞系。该T细胞系依赖于外源IL-2生长和增殖。Fas-FasL-Fas/Fas配体系统。Fas抗原，一种介导细胞凋亡的细胞表面跨膜蛋白质，和嗜中性粒细胞上互补的Fas活化的细胞因子的组合，将细胞凋亡信号转导到细胞中。Fas是属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的I型膜蛋白，FasL是TNF家族的成员。FAS配体是31kDa(千道尔顿)的膜结合的蛋白质(278个氨基酸)。Fas-Fas配体系统在包括自体反应性淋巴样细胞的清除在内的许多生物过程中起重要作用。Fas配体主要在活化的T淋巴细胞中表达并且是细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的主要效应分子。HLA-DR+淋巴细胞-含有人白细胞抗原(HLA)-DR抗原的淋巴细胞，HLA-DR抗原是由在位于6号染色体上的白细胞基因座中发现的glue序列确定的一组多态性糖蛋白，所述基因座是人中主要组织相容性基因座。IU(国际单位)-通过与特定重量和浓度的国际参照标准相比，如与人IL-2的WHO首次国际标准86/504相比，生物制剂的效价的测量单位。国际单位是所公布的报导生物活性单位的唯一公认的和标准化的方法，并且是国际共同研究努力的结果。U(对生物活性的测量单位)-多种称为“单位”的速记法，其作为参照出自每个实验室，为进行工作的实验室所特有的。每个“单位”在一个实验室与另一个实验室之间是不同的，并且不在全世界上公认为标准，如国际单位(IU)。单核浸润-单核细胞、浆细胞和淋巴细胞存在于它们“通常”不存在的组织中；或者这些细胞以大数目或者丰度成簇存在于它们通常仅以小数目存在的地方。TCRζ链-T细胞受体ζ链。ζ亚基是TCR复合体的一部分并且靶向TCR细胞表面受体与其配体(抗原)的相互作用。延伸到细胞质(胞质溶胶)的ζ亚基当T细胞活化时在它的酪氨酸残基磷酸化并且在TCR连接后参与信号转导。TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)-从它们浸润的肿瘤中分离的T淋巴细胞。肿瘤浸润淋巴细胞有很小的或者没有细胞毒性。TIL主要包括CD4+CD8+T细胞，并且可以通过在IL-2存在下培养在体外扩增。这些细胞通过IL-2的处理活化并且经常对它们所分离自的肿瘤比对正常淋巴因子活化的细胞更具攻击性。TIL的细胞毒性活性可以通过IFN-γ增强。可以通过TGF-β在体内阻断TIL的抗肿瘤活性。ZAP70-与TCRζ链结合的70kDζ相关蛋白质，其是胞质溶胶中存在的酪氨酸激酶。ZAP70被认为ζ参与保持T淋巴细胞受体信号，介导信号转导，其最终产生IL-2。ZAP70基因在T细胞和自然杀伤细胞中表达并且定位于人类染色体2q12。ζ(Zeta)链-见TCRζ链-ζ链基因位于人的1号染色体。该蛋白质的细胞外结构域长为9个氨基酸，而跨膜结构域含有带负电荷的天冬氨酸残基，细胞质结构域长为113个氨基酸。细胞质尾含有在CD3链的细胞质尾中发现的3个抗原识别基序。ζ链还结合其他受体，如NK细胞的Fc(片段，结晶的)-γ受体。USP-美国药典专著。P-“p＜0.01”数理统计学中的一个术语，表示在预置条件下一种事件发生的概率水平。ANOVA(方差分析)-如在统计学和数学教科书，例如，″HandbookofStatisticalMethodsforEngineersandScientists″，HarrisonM.Wadsworth，Jr.，Ed.，McGrawHill1990，和″StatisticalOperationsAnalysisofHealthResearchData″，RobertP.HirschandRichardK.Riegelman，Eds.BlackwellScienceInc.，1996中描述的单因子分析。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的作用方式和表征白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine是在本文描述的设定条件下产生的天然来源的和天然发生的人细胞因子混合物，为具有生物活性、最小毒性和免疫调节性混合物。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以用作抗癌和抗病毒治疗或者作为新辅助疗法，对于癌症、感染性疾病和其他应答免疫调节的疾病状态有广谱应用。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以通过本领域已知的方法制备。Mizel等人，″PurificationtoApparentHomogeneityofMurineInterleukin1″，JImmunol.126834(1981)；Togawa等人，″CharacterizationofLymphocyte-ActivatingFactor(LAP)ProducedbyHumanMononuclearCellsBiochemicalRelationshipofHighandLowMolecularWeightFormsofLAF″，JImmunol.1222112(1979)；Lachman等人，″PurificationofHumanInterleukin1″，Chem.Abstr.94137539t(1981)ofJ.Supramolec.Struct.13457(1980)；Lachman等人，″PartialPurificationofHumanLymphocyteActivatingFactor″，Chem.Abstr.93165824e(1980)ofPrep.Biochem.10387(1980)；Mizel等人，″CharacterizationofLymphocyteActivatingFactorObtainedfromtheMurineMicrophageCellLineP388D1″，Chem.Abstr.9393346a(1980)，ofBiochem.Charact.Lymphokines，Proc.Int.LymphokineWorkshop2nd(1979)pp.411-418；Economou等人，″Purification，PhysicochemicalCharacterizationandaBiologicalRoleofLymphocyteActivatingFactor(LAF)″，Chem.Abstr.9393347b(1980)ofBiochem.Charact.Lymphokines，Proc.Int.LymphokineWorkshop，2nd(1979)pp.419-421；Simon等人，″TheRoleofSubcellularFactorsinPulmonaryImmuneFunctionPhysicochemicalCharacterizationofTwoDistinctSpeciesofLymphocyte-ActivatingFactorProducedbyRabbitAlveolarMacrophages″，J.Immunol.1261534(1981)。动物研究也表明“混合的白介素”在体外具有免疫调节和免疫刺激活性(Hadden等人，″MixedInterleukinsandThymosinFractionVSynergisticallyInduceTLymphocyteDevelopmentinHydrocortisone-TreatedAgedMice″，Cell.Immunol.144228-236(1992))。不被本发明的任何理论束缚，一种可能的假设是“混合的白介素”如白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的局部/区域注射克服了局部免疫抑制。随后，发生对肿瘤抗原的耐受性的打破并且允许发生有效的局部抗肿瘤免疫应答。已证实在肿瘤区域中局部滴注白介素或者向肿瘤中实际转染白介素基因显著增强了抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤消退，如Golumbek等人，″TreatmentofEstablishedRenalCancerbyTumorCellsEngineeredtoSecreteInterleukin-4″，Science254713-716(1991)报导。然而，这些研究都没有发现诱导恶性细胞进入细胞周期阶段而不导致肿瘤的积极增殖的非常意外的效果。出乎意料地，手术前施用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine导致细胞周期阶段中肿瘤细胞数增加而不增加肿瘤更快生长和更快复发的风险(如从现有技术预测的)。诱导肿瘤细胞进入细胞周期的能力似乎是白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine特有的并且可能是由于该试验的药物中存在的不同细胞因子的协同作用和这些细胞因子对宿主的免疫系统和宿主细胞的差别作用。关于手术前用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理的患者的复发率的数据表明在用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理后24个月没有显示出癌症的复发。值得注意的是，一小群8名顺序处理的患者在24个月的随访期内没有一名复发患者。形成鲜明对比的是，文献教导在手术后18-24个月内，类似患者的复发率为约50％。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine没有诱导存在于肿瘤的淋巴样细胞的活跃增殖。对应地，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理后，基质Ki-67+细胞减少而Ki-67+癌细胞的频率增加。从而，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理诱导周期中肿瘤细胞数增加，导致残留肿瘤对放射和/或化学疗法继续治疗的敏感性增加。尽管用天然和重组细胞因子进行的其他研究在癌症疗法的治疗中显示出功效，但是那些研究没有教导诱导进入细胞周期或者将白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine与化学疗法、免疫疗法和放射疗法协同组合的新方法。例如，使用天然的人和重组IL-2和其他细胞因子进行的研究以及在局部区域疗法中表明在多个部位免疫增强和抗癌活性。具体地，IL-2在胸膜腔、肝和膀胱中显示出活性，而IFN-α在卵巢中显示出活性，IFN-β在脑中显示出活性，如Yasumoto等人，″Inductionoflymphokine-activatedlillercellsbyintrapleuralinstillationsofrecombinantinterleukin-2inpatientswith，malignantpleurisyduetolungcancer″，CancerRes1987；472184-7；Mavilgit等人，″Splenicversushepaticarteryinfusionofinterleukin-2inpatientswithlivermetastases″，JClinOncol1990；8319-24；Pizza等人，″Tumorregressionafterintralesionalinjectionofinterleulin-2(IL-2)inbladdercancer.Preliminaryreport″，IntJCancer1984；34359-67；Berek等人，″Intraperitonealrecombinantα-interferonfor″salvage″immunotherapyinstageIIIepithelialovariancanceragynecologiconcologygroupstudy″，CancerRes1985；454447-53；和Fettel等人，″Intratumoradministrationofbeta-interferoninrecurrentmalignantgliomas-AphaseIclinicalandlaboratorystudy″，Cancer1990；6578-83报导。甚至，已经证明IFN-γ在皮肤中显示出活性，而TNF-α在外生殖器中显示出活性，而多种细胞因子的混合物在头和颈中显示出活性，如Edwards等人，″Theeffectofintralesionalinterferongammaonbasalcellcarcinomas″，JAmAcadDermatol1990；22496-500；Irie等人，″Acaseofvulvacancerrespondingtotherecombinanthumantumornecrosisfactor(PT-950)localinjectiontherapy″，GanNoRinsho1988；34946-50；以及Pulley等人，″Intravenous，intralesionalandendolymphaticadministrationoflymphokinesinhumancancer″，LymphRes1986；5S157-63。此外，对在颈静脉淋巴管外周或颈静脉淋巴管外周和下颚下进行手术之前施用10天重组IL-2的研究显示了不定的坏死和淋巴细胞浸润，如Valente等人，″InfiltrationleukocytepolulationsandT-lymphocytesubsetsinheadandnecksquamouscellcarcinomasfrompatientsreceivingperilymphaticinjectionsofrecombinantinterleukin-2″，ModPathol1990；3702-8以及DeStefani等人，″Treatmentoforalcavityandoropharynxsquamouscellcarcinomawithperilymphaticinterleukin-2clinicalandpathologiccorrelations″，JImmunother1996；19125-33报导。此外，对切除的肿瘤进行显微镜检查表明淋巴细胞浸润的增加与IL-2的临床观察相关，如Saito等人，″Immunohistologyoftumortissueinlocaladministrationofrecombinantinterleukin-2inheadandneckcancer″，NipJibiGakkaiKaiho1989；921271-6报导。然而，尽管在20名头颈癌患者中在公认的高剂量的重组IL-2(800,000U四周[U＝单位])下有两例减轻，上面的研究都没有在切除的肿瘤的总体尺寸上显示出改变，如Sainto等人，“ClinicalevaluationoflocaladministrationofrIL-2inheadandneckcancer”，NipJibiGallaiKaiho.1989；921271-6所报道。此外，前述研究受到患者数目少的限制并且受到缺少与对照组进行病理学比较的阻碍。Vlock等人，″PhaseIbtrialoftheeffectofperitumoralandintranodalinjectionsofinterleukin-2inpatientwithadvancedsquamouscellcarcinomaoftheheadandneckanEasternCooperativeOncologyGrouptrial″，Immunother1994；15134-139；Musiani等人，″Effectoflowdosesofinterleukin-2injectedperilymphaticallyandperitumorallyinpatientswithadvlmcedprimaryheadandnecksquamouscellcarcinoma″，JBioiResModi1989；8571-578。尽管DeStefani等人最近对202名OSCC患者进行的随机化的多中心III期研究表明在手术前向同侧(ipsylateral)颈部淋巴结链淋巴管周围施用低剂量(5000U/天[U＝单位])重组人IL-2导致无疾病存活率的显著(p＜0.01)增加，其又导致更长的总存活率(p＜0.03)，但是DeStefani等人没有评价该治疗方案在细胞周期中的作用和它对放射和化学疗法的改善的影响。DeStefani等人，″ImprovedSurvivalWithPerilymphaticInterleukin2inPatientsWithResectableSquamousCellCarcinomaoftheOralCavityandOropharynx″，Cancer2002；9590-97。此外，尽管教导5000U/天，但是不能参考DeStefani等人对所施用的生物制品的“高”和“低”剂量的教导，对本发明和DeStefani等人的进行比较，因为其所施用的药物效价是没有定义的U(单位)。相比而言，本发明验证并完成了完全USP分析方法验证程序，以用IU(国际单位)确定白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的生物活性。本领域技术人员应理解通过免疫组织化学Ki-67标志物或者其他等同方法如通过使用PCNA标志物、p53标志物测量的肿瘤细胞增殖可以用作预后参数，deVicente等人，″ExpressionofcyclinD1andKi-67insquamouscellcarcinomaoftheoralcavityclinicopathologicalandprognosticsignificance″，OralOncol2002；38301-8；Bettendorf等人，″PrognosticrelevanceofKi-67antigenexpressionin329casesoforalsquamouscellcarcinoma″，ORLJOtorhinolaryngeolRelatSpec2002；64200-5。流式细胞术或者常规染色方法和显微术的使用与临床、组织病理学以及肿瘤分期和分类(TNM、肿瘤、结节、转移)与其他方法结合用来指示疾病过程的侵袭性。Kerdpon等人，″Expressionofp53inoralmucosalhyperplasia，dysplasiaandsquamouscellcarcinoma″，OralDisease1997；386-92。Ki67细胞增殖标志物分化并且仅对于细胞周期阶段中的细胞是特异的。G1是第一生长阶段；S是第二阶段，其标志是细胞启动DNA合成，其中细胞DNA复制，G2是DNA复制后的第二生长阶段，其中细胞大小加倍。M是细胞周期的最后阶段，在该阶段发生有丝分裂，其中细胞从最初的亲本细胞分裂成子细胞。每个所得的细胞含有最初亲本细胞DNA的完整拷贝。对细胞周期中的细胞特异的Ki67不能在处于G0中的细胞中发现，G0是细胞的休眠期。在G0中，细胞不经历细胞复制、增殖或者DNA复制。值得注意的是，细胞周期的阶段现象是包括肿瘤细胞在内的所有活的真核细胞共有的性质。为了检测细胞增殖，在肿瘤切除后确定残留的肿瘤细胞巢中Ki-67的存在。Raybaud等人，″NuclearDNAcontent，anadjuncttop53andKi-67asamarkerofresistancetoradiationtherapyinoralcavityandpharyngealsquamouscellcarcinoma″，IntJ.OralMaxillofacSurg2000；2936-41；Koelbl等人，″p53andKi-67aspredictivemarkersforradiosensitiveityinsquamouscellcarcinomaoftheoralcavity？Animmunohistochemicalandclinicopathologicstudy″，IntJRadiatOncolBiolPhys2001；49147-54。通常，可以在经历细胞周期G1、S、G2和M的细胞中但是不在“休眠”的肿瘤细胞(G0)中发现Ki-67。鉴于周期中肿瘤细胞是放射和化疗敏感的，则周期外肿瘤细胞总体上是放射和化疗耐受的。在残留肿瘤的手术切割前用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理的头颈癌患者的肿瘤通过免疫组织病理学进行研究和分析。Timár等人，″TheeffectofLeukocyteInterleukin，Injectionontheperi-andintratumoralsubpopulationofmononuclearcellsandontumorepithelia-Apossiblenewapproachtoaugmentingsensitivitytoradiationandchemotherapyinoralcancer.Amulti-centerPhaseI/IIclinicaltrial″，TheLaryngoscope113，December2003。研究以盲法进行并且由三名独立的有资格的病理学家进行，这些病理学家对于该处理和处理的或者对照患者群体都不知情。临床研究分析了一组54名口腔鳞状上皮细胞癌患者(H&NC)作为I-II期临床试验的一部分。对这些患者进行了治疗方案、肿瘤和临床应答的安全性的研究，并研究单核浸润的组成和细胞周期速率。用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine预敏化癌症的治疗方案是基于为头颈癌患者开发的治疗方法而设计的，该方法被证明以统计学显著方式显著增加肿瘤细胞周期化，目的是使得这些肿瘤细胞对用放射和/或化学疗法的继续治疗更敏感。所述治疗包括在可见或者可触及的肿瘤块的周围边缘皮内施用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine。在肿瘤块的周围边缘围绕肿瘤施用日剂量为约20IU至1600IUIL-2的白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine，两周疗程内进行10次皮下每日注射。另一疗程为40IU至800IU。另一个范围是35IU至75IU。所建议的治疗的另一个特定的非限制性实例预期以55IUIL-2的日剂量施用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine，通常在2周内共10次皮下日注射。患者表1和表2中提供了关于白细胞白介素注射液(LI)处理的和对照患者组的信息。包括54名患者，对照组中27名患者，处理组中27名患者。表1白细胞白介素、注射对照组患者信息F.mouth＝口底表2白细胞白介素注射液(LI)处理组的患者信息HD高累积剂量的白细胞白介素注射液(8000IU，按照IL-2当量)，MD＝中等剂量(4800IU)ID＝低剂量(2400IU)用白细胞白介素(LI)或者Multikine对癌症的治疗方案本发明考虑的用白细胞白介素(L1)或者Multikine预敏化癌症的治疗方案的另一实施方案是基于为头颈癌患者开发的治疗方法而设计，该方法被证明以统计学显著方式显著增加肿瘤细胞周期化，目的是使得这些肿瘤细胞对用放射和/或化学疗法的继续治疗更敏感。所述治疗包括在下颌下颈部淋巴结链区域中皮下施用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine。以约20IU至I600IUIL-2的日剂量10次皮下/真皮下每日注射白细胞白介素(LI)或者Multikine的两周疗程在肿瘤块周围边缘围绕肿瘤施用1/2，在肿瘤块同侧(ipsylateral)的下颌下淋巴链施用1/2。另一疗程为40IU至800IU。再一个范围是35IU至75IU。所建议的治疗的再一个特定的非限制性实例考虑在两周的疗程中以55IUIL-2的日剂量施用白细胞白介素(LI)或者Multikine，通常共10次皮下每日注射。处理组的27名患者在剂量升级研究中接受围绕肿瘤施用白细胞白介素(LI)或者Multikine。以下面的方式进行白细胞白介素(LI)或者Multikine施用对于每个测试的剂量组，以下面的剂量在两周期限(每周3次)内围绕肿瘤注射日剂量低剂量，每天400IU(IL-2的国际单位)[IL-2当量](8名患者)，中等剂量，每天800IU(IL-2当量)(12名患者)，和高剂量，每周5次，每天800IU(IL-2当量)(7名患者)。所有白细胞白介素(LI)或者Multikine注射液都在真皮内施用于可见的/可触及的肿瘤块的外周边缘。在最初施用白细胞白介素(LI)或者Multikine后21天到28天之间进行旨在切除残留肿瘤块的外科手术。局部/区域放射疗法在伤口愈合后在手术后不同的时间在手术后患者中开始，并且取决于个体患者从手术介入的恢复。放射疗法通常在手术后2到4天开始。单次静脉内输注环磷酰胺300mg/m2在白细胞白介素(LI)或者Multikine施用之前，环磷酰胺输注在第一次Multikine施用前3天。吲哚美辛(25mg)由患者自己口服施用(随着食物)，每日三次，在环磷酰胺施用后3天开始，直到手术前24小时。硫酸锌(50mg)和多种维生素补充物每天一次自助施用，在环磷酰胺施用后3天开始，直到手术前24小时。这些药物对肿瘤细胞周期都没有影响并且以这些药物的正常癌症治疗剂量的1/5-1/3以下的剂量施用。白细胞白介素由ChesapeakeBiologicalLaboratories，Inc.，Baltimore，MD装填和提供，对于CEL-SCICorporation，其在密封的硼硅玻璃血清型小瓶中以冷冻方式提供，含有2.2mL400IU/mL(IL-2当量)，用于肿瘤周围、肿瘤内、淋巴管周围或者皮下施用。该制剂的总蛋白质含量为约3mg/mL(或者+/-1mg/mL)。提供的物质无菌和无热原。试验药指定的过期日期为当保存在-20℃时从生产日期开始24个月。环磷酰胺USP(Bristol-Myers-Squibb，Morton，UK)以无菌粉剂提供，用于在静脉内输注前重构，每100mg环磷酰胺含有45g氯化钠、75mg甘露醇，或者约82mg碳酸氢钠。吲哚美辛USP(Sanofi-Synthelabo，Paris，France)以25mg片剂提供用于随着食物自助口服施用。硫酸锌(50mg)(R.P.SchererCorporation，Clearwater，FL)和非处方药多种维生素由诊所为每名患者提供用于自助施用。病理学研究由DepartmentofTumorProgression，NationalInstituteofOncology，Budapest，Hungary(J.T.)进行。由一个病理学方案指导本研究和描述了手术切除的样品的制备和固定和总体的、宏观和显微镜检查，以及病理学和免疫组织化学步骤。样品最初由每个参加的研究所的病理学部门收集和处理，如病理学方案中详述。然后将样品运输到中心病理学研究室以接收、进一步处理和进行病理学评估。对口腔病变的诊断是基于所怀疑的病变的探查切除活组织检查，选择分类为T2-3N0-2M0的癌用于以如前述的LI或者Multikine处理方案进行免疫疗法。在LI或者Multikine处理期结束后和手术前，评估临床应答，并且根据肿瘤应答将患者排定用于肿瘤切除(手术除去残留肿瘤)、小切除活组织检查，或者对于完全临床应答，不进行活组织检查。因此，两种形式的LI或者Multikine处理后病理学样品可用于免疫组织化学或者病理学分析1)完整肿瘤和2)肿瘤活组织检查样品。后一种由于它们的小尺寸而限制了这些样品的病理学分析程度。组织学分析将切除的组织置于含有盐水缓冲的甲醛的之前加有标签的容器中，过夜固定后将组织用石蜡包埋并制备5μm玻片用于H&E染色和免疫组织化学分析。对H&E染色的切片进行组织学分析和美国癌症联合委员会(AmericanJointCommitteeonCancer)分级。对三种不同的肿瘤区域进行组织病理学分析表面(区1.0)、中心(区2.0)和肿瘤基质界面(区3.0)。从H&E玻片评估坏死肿瘤细胞的发生。通过两种方法确定头颈癌肿瘤中上皮组分相对于基质的百分数首先，结缔组织根据Mallory染色(毛状体染色)和通过ImagePro分析软件(MediaCibernetics，SilverSpring，MD)对玻片测量癌细胞巢(肿瘤上皮)的面积。其次，用DAKo(Glostrup，Denmark)的标记癌细胞的泛-细胞角蛋白(pan-cytokeratine)抗体(A1A3+CK19)标记含有切除的组织的载玻片来通过免疫组织化学检测细胞角蛋白，将载玻片在显微镜下检查并用ImagePro分析软件分析。确定癌细胞的增殖分数将石蜡切片用识别Ki-67抗原(DAKO)的小鼠单克隆抗体标记以阐明周期中的细胞群体的比例。在所选视野的三个分开区域中以×20的最初放大倍数计数周期中肿瘤细胞的频率。此外，还采用与上皮内肿瘤细胞相同的标准确定周期中基质细胞。每个区域评估了至少3×100个肿瘤细胞。单核细胞浸润的表征通过对肿瘤样品的石蜡切片免疫组织化学分析确定肿瘤细胞巢附近存在的单核细胞。将切片脱蜡并用微波处理以恢复抗原性。仅使用以前证明对石蜡切片染色有一致性的商业抗体。用抗髓过氧化物酶抗体(小鼠单克隆抗体，DAKO)标记嗜中性粒细胞，用小鼠单克隆抗-CD34抗体(DAKO)标记造血干细胞。通过CD68抗原的表达(小鼠单克隆抗-CD68，DAKO)鉴定巨噬细胞群体，通过纤毛标志物的表达(小鼠抗-纤毛，Immunotech，Paris，France)鉴定树突细胞。通过LCA抗原表达(小鼠单克隆抗-CD45，DAKO)鉴定淋巴样细胞。通过小鼠单克隆抗-CD20标记B细胞群体并通过大鼠多克隆抗-CD3抗体(都来自DAKO)鉴定T细胞.通过CD8的表达(通过小鼠单克隆抗-CD8，DAKO)来鉴定细胞毒性T细胞，用CD57抗原(小鼠单克隆抗-CD57抗体，Novocastra，NewcastleonTyne，UK)鉴定NK细胞。通过使用针对IL-2R的小鼠单克隆抗体CD25(Novocastra)鉴定肿瘤上皮和基质内的表达白介素-2受体(IL-2R)的细胞。在所有情况中，合适的同种型对照抗体用作阴性对照。所有免疫组织化学标记都用DAKOLSAB-2试剂盒进行，用生物素化的抗-小鼠/抗-兔免疫球蛋白G接头和链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶来揭示特异结合的抗体。所用的发色团是氨基-乙基咔唑(AEC)(红色)标记。将切片用苏木精复染以显示细胞核。热点考虑基于类似于微血管密度的测量的“热点”技术确定单核细胞的密度。在每个研究的肿瘤区域，测量最高肿瘤浸润单核细胞密度区中浸润细胞的密度，从而使组织中细胞浸润的极端不均一性降到最小。病理学研究设计来自LI或者Multikine处理的和对照(非LI处理的)组的肿瘤活组织检查样品用H&E染色，通过肿瘤的显微镜下的外观来评估。进行CD3、CD8、纤毛和CD25标记，只要样品的大小允许进行所有四种标记步骤。在对照组和LI处理组中(其中进行完整肿瘤去除)，整个肿瘤组织可用于分析；因此，使用完整的分析程序。使用40倍的最初放大倍数来选择玻片用于观察，在玻片的所选区域的病理学分析中使用100倍的最初放大倍数。由三名独立的病理学家对每名患者的肿瘤切片进行组织学评估。在病理学家之间不一致的地方达成了两方同意的决定。由三名相同的病理学家进行形态测定，他们对临床背景的知识和每个病例(LI-处理的病例或者对照病例)的处理结果都不知情。统计学分析通过ANOVA单因子分析来分析数据，＜0.05(α＝0.05)的p值被认为是统计学上显著的。结果组织学评估OSCC的对照组由如通过Broder的分类法确定的不同的角质化等级(BRI-BR3)的扁平细胞癌组成。Odell等人，″TheProgosticValueofIndividualHistologicGradingParametersinSmallLingualSquamousCellCarcinomas；TheImportanceofthePatternofInvasion″，Cancer74789(1994)。LI处理组与对照组在肿瘤类型方面无差异，如表III和IV中所示。这进一步通过细胞角蛋白免疫染色模式来证明，揭示了在两个肿瘤组中CK-19或者pan-CK的高度异质性表达。表3组织学，对照组SCC＝鳞状细胞癌BR＝Broder等级(角质化)Size＝最大宽度×最大深度(mm)Superfic表面的(仅在空气-肿瘤界面)Unicell.仅单细胞坏死；Microfocal坏死仅存在于显微病灶中；Field汇合区表4组织学和病理学；白细胞白介素注射液处理组B＝仅切除活组织检查SCC＝鳞状细胞癌BR＝Broder等级(角质化)Size＝最大宽度×最大深度(mm)Superfic表面的(仅在空气-肿瘤界面)Unicell.仅单细胞坏死；Microfocal坏死仅存在于显微病灶中；Field汇合区HD＝高累积剂量的白细胞白介素注射液(8000IU，按照IL-2当量)MD＝中等剂量(4800IU)LD＝低剂量(2400IU)肿瘤基质尽管存在Hadden等人，″Interleukinsandcontrasuppressioninduceimmuneregressionofheadandneckcancer″，ArchOtolaryngolHeadNeck.Surg120395(1994)；Verastegui等人，″Anaturalcytokinemixture(IRX-2)andinterferencewithimmunesuppressioninduceimmunemobilizationandregressionofheadandneckcancer″，IntJImmunopharmac19619(1997)；和Barrera等人，″CombinationImmunotherapyofsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck″，Arch.(2000)的以前报导，但是还是不能证明癌细胞巢的“片段化”。然而，在对照组中27名中的8名和LI处理组中17中的6名患者中鉴定了富含基质的肿瘤。用Mallory毛状体染色对癌细胞巢和肿瘤基质的特异标记有助于区别这些区域。使用形态测定法测定对照和LI处理组中上皮巢的百分数。该分析没有揭示显著差异，从而提示LI处理不影响肿瘤-基质比。坏死和增殖还评估了使用组织学分析显示在表3和表4中的LI处理对肿瘤坏死的影响和LI处理对癌细胞增殖的影响(图2)，以及通过Ki-67标志物检测的周期中细胞的特定鉴定。组织学分析鉴定了在LI处理组和对照组中区域坏死或者微型病灶、表面或者单细胞坏死，如表5所示。OSCC中任何类型的坏死的不存在在来自所研究的不同LI处理组(57％-63％)的所有肿瘤中都相似，如表5所示。大于1％肿瘤体积的范围内测量的区域坏死在表3和4的多种肿瘤组中也是相似的。表5白细胞白介素注射液处理对口腔鳞状细胞癌中坏死的存在的影响通过Ki-67表达检测周期中细胞鉴定的宿主细胞的癌细胞和基质细胞，如单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞在图2中显示(100倍放大倍数)。对Ki-67阳性癌细胞密度的形态测定分析表明除了所使用的最高LI剂量之外，LI处理诱导周期中肿瘤细胞显著增加(P＜0.05)，如图4所示。另一方面，主要在肿瘤的基质区中发现的周期中宿主细胞的发生率随着LI剂量的增加而降低(图4)，并且对于最低和最高剂量，证明效果是显著的(P＜0.05)。这些发现支持如下结论用白细胞白介素注射液(LI)处理或者Multikine处理导致癌细胞进入细胞周期阶段，但是不导致宿主免疫细胞或者基质细胞进入周期。因此，本发明预期白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理基于Ki-67抗原的表达诱导高比例的肿瘤细胞群体进入细胞周期。关于在手术前用白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理然后通过放射疗法处理或者观察等待的患者的复发率数据没有显示出白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理后24个月时复发率的增加。一小组8个顺序的白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理的患者在24个月的随访期内没有一个复发患者。相比，文献认定这些患者的复发率在手术后18-24个月时为约50％。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理没有表现出诱导存在肿瘤的淋巴样细胞的活跃增殖，并且对应的基质Ki-67+细胞减少，而Ki-67+癌细胞的频率在白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine处理后增加。从而，LI或者Multikine处理增加了周期中肿瘤细胞数，导致残留肿瘤对接下来用放射和/或化学疗法的治疗的敏感性增加。单核细胞浸润在基质隔室和定义为上皮内浸润的癌细胞巢中评估单核细胞浸润。使用常规H&E染色，从对照和LI处理组切除的肿瘤之间没有鉴定到明确的差异。对照组在这方面也是高度异质性的。具体地，一些肿瘤的特征是密集白细胞浸润，而其他肿瘤特征是浆细胞浸润。还有其他的特征是淋巴样细胞浸润。测量上皮内和肿瘤基质内通过CD68标记鉴定的巨噬细胞的密度。巨噬细胞的上皮内密度与基质的相当。与LI处理的肿瘤相似，在对照肿瘤中也具有相对高密度的上皮内巨噬细胞。还通过形态测定法测定OSCC中髓过氧化物酶阳性嗜中性粒细胞白细胞的密度。这些研究表明LI处理后，在基质和上皮内嗜中性粒细胞密度没有统计学显著差异。在OSCC的三个区域上进行形态测定测量。肿瘤表面定义为区域1.0。肿瘤中心定义为区域2.0。通常称作侵入边的肿瘤-基质界面定义为区域3.0。对于这些区域，没有观察到巨噬细胞或者结缔组织比的显著差异。然而，为了表征OSCC中淋巴浸润，不管样品之间的实际相似性或者差异，研究了这三个区域之间的区别。白细胞白介素注射液处理对口腔鳞状细胞癌中树突细胞的影响通过CD1a标志物鉴定树突细胞，其揭示在肿瘤周围正常上皮内富含浸润物。该富集浸润物模式在癌细胞巢中明确地减少。在对照或者LI处理组中肿瘤基质中鉴定的树突细胞没有显著差异。在癌症病例中，上皮内树突细胞浸润是异质性的，与处理组无关。白细胞白介素注射液处理对口腔鳞状细胞癌中淋巴样细胞浸润的影响通过OSCC的不同区域内白细胞共同抗原(ICA，CD45)的表达鉴定淋巴样细胞，表明在肿瘤基质内存在的淋巴细胞比癌细胞巢中明显更稠密，比例为约1∶10。相对于淋巴样浸润物，在任意处理组中OSCC的从表面到侵入边的不同区域之间没有观察到显著的位置差异。如图3所示，除了研究的最低剂量之外，LI处理在基质淋巴样浸润物中诱导增加的倾向不是统计学显著的。然而，仅仅最低剂量的LI处理诱导上皮内CD45细胞显著(P＜0.05)增加，如图5所示。最高剂量的11个降低了CD45阳性细胞的上皮内密度，尽管改变不是统计学显著的。白细胞白介素注射液处理对口腔鳞状细胞癌中白介素-2受体α阳性(CD25阳性)淋巴样细胞的影响发现约10％的基质或者上皮内淋巴样细胞在OSCC样品中表达IL-2Ra。在LI处理的OSCC病例的不同区域内CD25阳性淋巴样细胞的发生率没有显著差异。用LI处理仅在最低LI剂量下增加了基质(除了区1表面外)和上皮内CD25阳性淋巴样细胞的发生率(P＜0.05)，如图6和7所示。白细胞白介素注射液处理对口腔鳞状细胞癌中B细胞密度的影响在所有LI处理组中，通过CD20标志物鉴定的B细胞仅在肿瘤基质中发现。在对照病例中不同区中B细胞的密度没有差异。LI处理诱导B细胞从表面区再分布到侵入边。然而，趋势不是统计学显著的。白细胞白介素注射液处理对口腔鳞状细胞癌中T细胞的影响通过CD3标志物鉴定OSCC中单核细胞浸润物的T细胞亚群。T细胞的上皮内密度低于对照组肿瘤中T细胞的基质密度的5％，如图8所示(400倍放大倍数)。然而，在不同对照患者中，CD3-阳性T细胞的数目和百分比存在很大差异。如图9所示，LI处理组中CD3-阳性T细胞更占优势(400倍放大倍数)。在LI处理的肿瘤中，CD3-阳性T细胞的基质密度在多数肿瘤区中降低30％到40％，并且研究了LI剂量，如图10所示。然而，由于个体差异，差异不是统计学显著的，如图10所示。与肿瘤基质中的发现相比，LI处理诱导上皮内T细胞密度显著增加(P＜0.05)，没有显著依赖于LI处理的剂量，如图11所示。在对照组中，在OSCC的基质中发现的约50％的T细胞可认为是细胞毒性T细胞，其特征是CD8标志物。类似于CD3-阳性细胞，LI处理诱导OSCC基质中CD8-阳性细胞的发生率降低，通常降低30％-40％。但是差异不是统计学显著的。在无处理的对照OSCC病例中，在上皮内发现约10％的基质细胞毒性T细胞。尽管在多种剂量、主要在两种较低剂量下LI处理诱导上皮内CD8细胞的一定增加，但是该增加依赖于肿瘤中的不同区和所研究的个体病例并且不是统计学显著的。自然杀伤细胞的检测本研究中浸润口腔癌的NK细胞没有在整个患者组中被检测到。在OSCC中没有检测到NK细胞不是由于免疫反应的技术失败，因为在与所研究的肿瘤组织相邻的区域中成功地检测到神经细胞和退化肌细胞中的N-CAM(CD57)。检测口腔鳞状细胞癌中CD34-阳性造血干细胞以前的报导表明OSCC肿瘤可以在它们的基质中含有CD34-阳性干细胞。Schmidt等人，″MechanismsofimmunesuppressioninpatientswithheadandneckcancerpresenceofCD34+cellswhichsuppressimmunefunctionswithincancersthatsecretegranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor″，CHnCancerRes195(1999)；Young等人，″Mechanismsofimmunesuppressioninpatientswithheadandneckcancerinfluenceontheimmuneinfiltrateofthecancer″，IntJCancer67333(1996)。然而，在对54个石蜡包埋的样品的当前研究中没有检测到CD34-阳性单核细胞。这不是由于技术失败所造成，因为在研究的所有OSCC病例中容易地检测到肿瘤微脉管系统中CD34-阳性内皮细胞。讨论从当前对54名OSCC患者的病理学研究得到的数据表明OSCC是免疫原性肿瘤并且LI处理诱导向肿瘤的淋巴细胞性浸润。如同在其他癌症类型中，在从不同患者得到的肿瘤样品之间关于OSCC的单核浸润物的组成存在个体差异，提示有必要进行单独分析以确定细胞浸润物的哪些组分在OSCC的疾病诊断或者治疗性应答中起重要作用。淋巴细胞白介素(LI)处理对OSCC的单核细胞浸润物的组成具有特定影响。没有看到对基质、上皮内巨噬细胞、嗜中性粒细胞白细胞或者抗原呈递细胞如CD1a阳性细胞的影响。另一方面，在对照和LI处理组中，肿瘤周围正常上皮含有最高密度的树突细胞。不被本发明的任何一种理论束缚，这提示OSCC可以分泌直接在肿瘤部位干扰或者抑制抗原呈递细胞活性的因子。因为患有恶性黑素瘤的患者具有相似的树突细胞分布，所以，这可以是OSCC的一般现象而不是处理特异的。用LI以本文提供的剂量处理对OSCC的该特征没有影响。用最低剂量的白细胞白介素注射液(LI)处理诱导淋巴样细胞在OSCC的癌细胞巢中显著积累，而对基质密度没有显著影响。此外，以400UI/天，每周三次的LI处理增加了肿瘤基质内和上皮内表达CD25的淋巴样细胞的密度。可能存在LI制剂中天然IL-2的相对高局部浓度的反馈抑制回路。对淋巴样细胞的B细胞群体的分析表明基质B细胞没有受到LI处理的显著影响并且B细胞不存在于上皮内。对作为LI治疗靶标的T细胞子集的分析没有产生结论性结果。尽管LI对OSCC的处理诱导了CD3-阳性和CD8-阳性T细胞的基质密度的降低趋势，但是独立于LI剂量，对于CD3阳性细胞观察到LI处理后上皮内密度的显著增加(P＜0.05)。不被本发明的任何具体理论束缚，注意到另一T细胞子集如CD4-阳性T细胞可能受到LI处理的影响。白细胞白介素注射液(LI)处理对OSC的一些特征如细胞角蛋白的表达和Broder等级没有影响。在LI处理后，肿瘤-基质比率也没有改变。在对照无处理组和LI处理组之间，LI处理周期和残留肿瘤的手术切除结束时癌细胞巢的坏死宏观或微观形式的发生率没有差异。基于Ki-67抗原的表达，LI处理诱导高比例的肿瘤细胞群体进入细胞周期。LI诱导OSCC肿瘤细胞进入细胞周期是由于该试验药物(其包括LI-1β、IL-2、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF)中存在的不同细胞因子的协同作用和这些细胞因子对宿主的免疫系统和肿瘤的差别影响。来自一个研究中心的一小组8名顺序LI处理的患者在24个月所随访期没有一名患者复发。因为周期中肿瘤细胞的增加代表了更快生长和更快复发肿瘤的风险，所以对照(无LI处理)组相比，研究了在LI处理患者中的复发率。关于手术前用LI处理的患者(其继续用放射疗法治疗或者观察等待)中复发率的初步数据没有显示出治疗方案后24个月时复发率的增加。由DeStefani等人进行的对202名OSCC患者的最近的随机化多中心III期研究表明手术前10天向同侧颈淋巴结链中围绕淋巴管施用低剂量(5000LI/天)重组人IL-2显著增加了无疾病存活(P＜0.01)，其又导致更长的总体存活率(P＜0.03)。但是，LI处理的主要靶标群体是CD3-阳性T细胞。因此，LI处理诱导基质浸润性T细胞向肿瘤上皮内的转移，其对于抗肿瘤作用和破坏是重要的.用LI处理没有显示出诱导存在肿瘤的淋巴样细胞的活跃增殖。相应地，基质Ki-67阳性细胞减少，而LI处理后Ki-67阳性癌细胞的频率增加。从而，LI处理似乎诱导定型的抗肿瘤T细胞向癌细胞巢迁移并增加了周期中肿瘤细胞数，导致增加了残留肿瘤对用放射疗法、化学疗法或者它们两者的随后治疗的易感性。药物安全性、试验性功效和组合物在190名HIV和HIV/HPV感染的患者中测试了白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine，没有与LI或者Multikine施用相关的严重不利事件，如Harris等人，″Immunologicapproachestothetreatmentofprostatecancer″，SeminOncol.1999Aug；26(4)439-7；Timar等人，″TheeffectofLeukocyteInterleukin，Injectiononthepen-andintratumoralsubpopulationofmononuclearcellsandontumorepithelia-Apossiblenewapproachtoaugmentingsensitivitytoradiationandchemotherapyinoralcancer.Amulti-centerPhaseVRclinicaltrial″，TheLaryngoscope[113December2003]；Brown等人，″APhaseIOpen-LabelStudyofLeukocyteInterleukin，InjectioninHIV-Iinfectedindividualspreliminaryevidenceforimproveddelayed-typehypersensitivityresponsestorecallantigens″，AntiviralTherapy5(supplement)18，2000；Taylor等人，″ImmunotherapywithLeukocyteInterleukin，Injectionforhumanpapillomavirus(HPV)inducedcervicaldysplasiainHIVpatients″，AnnualMeetingoftheInternationalSocietyforInterferonandCytokineResearch，Cleveland，OH，October2001；`Taylor等人，″ImmunotherapywithLeukocyteInterleukin，Injectionforhumanpapillomavirus(HPV)inducedcervicaldysplasiainHIVpatients″，33rdSGOConference，Miami，FL，March2002所报导的。Multikine还显示出在小鼠、大鼠、豚鼠和狗中进行的动物毒理学研究中是安全的。此外，还测试并阐明了Multikine在头颈癌和宫颈非典型增生中的试验性功效。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以还与一种或多种药学上可接受的载体或者佐剂一起用作免疫调节组合物的组分，无论是预防性还是治疗性的。当被提供用于预防时，在任何感染或者疾病的迹象之前提供免疫调节组合物。尽管白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以以纯的或者基本上纯的形式施用，但也可使用药物组合物、剂型或者制剂。用于临床和人类的本发明制剂包含如上述的白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine以及一种或多种药学上可接受的载体，以及任选的其他治疗成分，特别是治疗性免疫佐剂。载体必须在与制剂的其他成分相容的意义上是“可接受的”并且对其受体是无毒的。通常，将活性成分与液体载体或细分的固态载体或者两者均匀并紧密地结合，然后如果必要，将产物形成所希望的剂型来制备制剂。本文所用的术语“药学上可接受的载体”指任何载体、稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、介质、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、香料或者增甜剂。制剂可以以单位剂型方便地存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。适于静脉内、肌内、皮内或者腹膜内、经鼻等施用的制剂方便地包含活性成分的无菌水溶液，溶液优选与受体的血液等渗。本发明的化合物还可以经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、口含、阴道或者通过植入的贮库制剂以含有常规的无毒性药学上可接受的载体、佐剂和运载体的剂型施用。本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、室内、胸骨内和颅内注射或者输注技术。可以通过将固体活性成分溶于含有生理上可接受的物质如氯化钠(例如，0.1-2.0M)、甘氨酸等等并且具有与生理条件相容的缓冲pH的水中以产生水溶液并使得溶液无菌来制备此类制剂。这些制剂可以存在于单位或者多剂量容器，如密封的安瓿或者小瓶中。本发明的化合物还可以以无菌注射制剂的形式施用，例如，作为无菌可注射水性或者油性混悬剂施用。可以用合适的分散或者湿润剂和悬浮剂，根据本领域已知的技术配制这些混悬剂。无菌注射制剂还可以是无菌的肠胃外可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射溶液剂或者混悬剂，例如，作为1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂为水、林格液和等渗氯化钠溶液等。此外，无菌的不挥发油方便地用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯和甘油二酯。脂肪酸，如油酸和其甘油酯衍生物，包括橄榄油和蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化形式可以用于制备注射剂。这些油溶液或者悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或者分散剂。本发明的化合物还可以局部施用，特别当所治疗的疾病涉及局部应用容易接近的区域或者器官时，包括眼睛、皮肤或者下肠道的疾病。可容易地为这些区域的每一种地制备合适的局部制剂。对于眼睛的局部应用，或者眼科使用，可以将化合物配制为等渗的、pH调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，或者优选地，配制为等渗的、pH调节的无菌盐水中的溶液，使用或不使用如苯扎氯铵的防腐剂。备选地，眼科使用的白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以配制在软膏剂如凡士林中。对于皮肤的局部应用，化合物可被配制在合适的软膏剂中，该软膏剂含有悬浮或者溶解在例如具有一种或多种下面物质的混合物中的化合物矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。备选地，化合物可被配制在合适的洗剂或者乳膏中，该洗剂或者乳膏含有悬浮或者溶解在例如具有一种或多种下面物质的混合物中的活性化合物矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、十六醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和具体施用方式而变。一些因素包括所用的特定化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康、性别、饮食；施用时间、排泄速率、药物组合和所治疗的具体疾病的严重性和施用形式。制药方法也可以用于控制作用持续时间。通过使用聚合物复合或者吸收所述肽，可以得到控释制剂。通过选择合适的大分子(例如，聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-醋酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、或者硫酸鱼精蛋白)和大分子浓度以及结合方法以便控制释放来进行受控递送。例如，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以结合进疏水聚合物基质以在数天内控释。此类控释膜是本领域公知的。特别优选经皮递送系统。可以用于本发明的通常用于本目的的聚合物的其他实例包括不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，其可以在外部或者内部使用。一些水凝胶，如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)或者聚(乙烯醇)也可以使用，但是具有比其他聚合物释放系统如上面提到的那些系统较短的释放周期。备选地，可以不将这些活性剂结合进聚合物颗粒，而是可以将这些物质捕获在例如通过凝聚技术或者通过界面聚合作用制备的微囊剂中，例如，分别为羟基甲基纤维素或者明胶微囊剂和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊剂，或者胶体药物递送系统，如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊剂或大乳剂中。为了对中枢神经系统靶标治疗上有效，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine当在外周施用时也应该容易穿透血脑屏障。不能穿透血脑屏障的化合物可以通过室内途径或者适于施用于脑的其他合适的递送系统有效施用。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine还可以单独以试剂盒的形式或者以上述的药物组合物的形式提供。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的施用可以通过常规方法进行。例如，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以在合适的稀释剂如盐水或者水，或者完全或者不完全佐剂中使用。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以以适于免疫系统刺激的任何合适途径施用，所述途径为注入静脉内、腹膜内、肌内、皮下、经鼻、口、直肠、阴道等等。如上面提到的，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine可以用于预防或者治疗目的。当被预防性地提供时，在由于疾病引起的任何症状的迹象之前或者症状之前提供白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine。当被治疗性地提供时，白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine在疾病发作时(或者之后)或者在疾病的任何症状出现时提供。白细胞白介素注射液(LI)或者Multikine的治疗性施用起缓解该疾病和改善常规的治疗结果的作用。由此描述了本发明，显然本发明可以在许多方面做出修改。不应认为此类修改背离本发明的精神范围并且所有此类修改旨在包括在所附权利要求的范围内。权利要求1.在治疗性处理前预敏化癌的方法，其包括步骤对癌施用治疗有效量的无血清且无丝裂原的细胞因予混合物。2.权利要求1的方法，其中所述治疗性处理选自化学疗法、免疫疗法和放射疗法。3.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次约20IU至1600IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。4.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次约40IU至800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。5.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次约35IU到75IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。6.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次55IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。7.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次400IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人1L-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。8.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。9.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用五次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。10.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物的一半被围绕肿瘤施用在肿瘤块的外周边缘，且所述混合物的另一半被施用在肿瘤块同侧的下颌下淋巴管链，每周施用三次，持续两周，每次约20IU至1600IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。11.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物的一半被围绕肿瘤施用在肿瘤块的外周边缘，且所述混合物的另一半被施用在肿瘤块同侧的下颌下淋巴管链，每周施用三次，持续两周，每次约40IU至800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。12.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物的一半被围绕肿瘤施用在肿瘤块的外周边缘，且所述混合物的另一半被施用在肿瘤块同侧的下颌下淋巴管链，每周施用三次，持续两周，每次400IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。13.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物的一半被围绕肿瘤施用在肿瘤块的外周边缘，且所述混合物的另一半被施用在肿瘤块同侧的下颌下淋巴管链，每周施用三次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。14.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物的一半被围绕肿瘤施用在肿瘤块的外周边缘，且所述混合物的另一半被施用在肿瘤块同侧的下颌下淋巴管链，每周施用五次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。15.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕淋巴管施用，每周施用三次，持续两周，每次约20IU至1600IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。16.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕淋巴管施用，每周施用三次，持续两周，每次约40IU至800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。17.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕淋巴管施用，每周施用三次，持续两周，每次400IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。18.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕淋巴管施用，每周施用三次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。19.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕淋巴管施用，每周施用五次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。20.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物包含选自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的细胞因子，它们与白介素-2(IL-2)的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9；以及GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。21.权利要求20的方法，其中所述细胞因子的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；IFN-γ与IL-2比率为4.9-7.1；以及GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。22.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物是Multikine。23.权利要求1的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物是白细胞白介素注射液(LI)。24.诱导肿瘤细胞进入选自G1、S、G2和M的细胞周期的方法，其包括步骤对癌细胞施用治疗有效量的无血清且无丝裂原的细胞因子混合物。25.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次约20IU至1600IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。26.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次约40IU至800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。27.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次约35IU至75IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。28.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次55IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。29.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次400IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。30.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用三次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。31.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物被围绕肿瘤施用，每周施用五次，持续两周，每次800IU，其中IU代表世界卫生组织首次关于人IL-2的国际标准86/504给出的白介素-2的国际单位。32.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物包含选自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的细胞因子，它们与白介素-2(IL-2)的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9；以及GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。33.权利要求32的方法，其中所述细胞因子的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；IFN-γ与IL-2比率为4.9-7.1；以及GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。34.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物是Multikine。35.权利要求24的方法，其中所述无血清且无丝裂原的细胞因子混合物是白细胞白介素注射液。36.无血清且无丝裂原的细胞因子混合物，其包含选自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的细胞因子，它们与白介素-2(1L-2)的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9；以及GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。37.权利要求36的无血清且无丝裂原的细胞因子混合物，其中所述细胞因子的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；IFN-γ与1L-2比率为4.9-7.1；以及GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。38.用于治疗癌症的药物组合物，其包含选自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的细胞因子并任选地结合药学上可接受的赋形剂、载体或者添加剂，所述细胞因子与白介素-2(IL-2)的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9；和GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。39.权利要求38的药物组合物，其中所述细胞因子的特定比率如下IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；IFN-γ与IL-2比率为4.9-7.1；和GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。40.权利要求39的药物组合物，还包含IL-3，其与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15。41.权利要求39的药物组合物，其还包含IL-6，其与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9。42.权利要求39的药物组合物，其还包含IL-8，其与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6。43.权利要求39的药物组合物，其还包含IL-1α，其与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19。44.权利要求39的药物组合物，其还包含IL-10，其与IL-2的比率为2.82-3.22，优选3.0+/-0.18。45.权利要求39的药物组合物，其还包含IL-16，其与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68。46.权利要求39的药物组合物，其还包含G-CSF，其与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81。47.权利要求39的药物组合物，其还包含TNF-β，其与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63。48.权利要求39的药物组合物，其还包含MIP-1α，其与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0。49.权利要求39的药物组合物，其还包含MIP-1β，其与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7。50.权利要求39的药物组合物，其还包含RANTES，其与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13。51.权利要求39的药物组合物，其还包含EGF，其与1L-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008。52.权利要求39的药物组合物，其还包含PGE2，其与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87。53.权利要求39的药物组合物，其还包含TxB2，其与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83。全文摘要本发明涉及在治疗性处理如化学疗法、放射疗法或者免疫疗法前用于预敏化癌症的突破性方法和用于该方法中的新的细胞因子混合物。细胞因子混合物是无血清且无丝裂原的混合物，其由相对于白介素2(IL－2)具有特定比率的细胞因子如IL－1β、TNF－α、IFN－γ和GM－CSF组成，所述混合物可有效诱导癌性细胞进入增殖细胞周期阶段，从而增加它们对化学疗法、放射疗法和免疫疗法的敏感性。一种此类新的细胞因子混合物是白细胞白介素注射液(LeukocyteInterleukinInjection，LI)或者Multikine，其可以单独使用或者与用于治疗癌症的其他药物组合使用，从而增加癌症治疗的成功率和癌症患者的无病存活率。文档编号A61K38/20GK101014354SQ200580029169公开日2007年8月8日申请日期2005年6月28日优先权日2004年6月29日发明者E·塔洛尔申请人:塞尔-赛公司