专利名称：治疗性营养组合物或联合药物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种能够用于治疗重症患者或者用于改善线粒体功能的营养组合物。更特别地，本发明涉及包含高浓度氨基酸、抗氧化剂或其组合的组合物在治疗重症患者或改善线粒体功能中的用途。
背景技术：
许多年来已经认识到营养缺乏和免疫状态改变之间的关系。而且，某些重症救护情况可能进一步加重营养缺乏，使患者倾向于免疫功能受损以及较高的发展感染并发症、器官功能障碍和死亡的危险。因此，在过去几十年来，大量实验研究已经研究了诸如谷氨酰胺、精氨酸、ω-3脂肪酸等营养物的免疫调节性质。几种添加了一种或多种这些营养物的营养制剂已经开发并且在当前可以获得。“免疫营养物”、“免疫增强饮食”和其它术语用来描述这些产品。遗憾的是，尽管开发了这些产品，但是没有充分地科学地理解这些营养物在重症救护情况中对临床上重要的结果具有什么样的效果。
获益于各种基质或营养物的治疗将随宿主的基础病理生理学和该基质是否影响细胞免疫功能和/或炎症介质的合成和/或活性氧簇(ROS)的产生和/或线粒体功能而不同。免疫活性需要最低水平的主要营养物(谷氨酰胺、精氨酸和ω-3脂肪酸)。然而，特别是对于产生过量一氧化氮(NO)的精氨酸和产生二十碳化合物(eicosanoid)合成的ω-3脂肪酸，过量的这些营养物可能具有免疫抑制效果，并且可能与较差的临床结果有关。
假定这种异源的和可变的治疗反应，人们不能在手术患者(或AIDS、肥胖等患者)中检查免疫营养物的临床试验以及将这些结果推广到重症患者。一般说来，选择的手术患者在手术应激后具有最低的细胞因子活化和一定程度的细胞防御功能的抑制，这使他们处于较高的获得性感染发病率和死亡率的危险中。由此得出结论，刺激细胞防御系统的营养物可以减少选择的手术患者中的感染并发症。相反，与伴随重症的全身炎症应答有关的改变更加强烈、复杂、可变，并且所知甚少。
推荐的肠胃外营养摄取或标准剂量的微量营养物基于健康受试者的需要和代谢，在重症患者中具有极小的意义。在高剂量时，显示维生素C、维生素E和硒具有一定的助氧化剂性质(Abuja PMWhenmight an antioxidant become aprooxidant？Acta Anaesthesiol Scand 1998；42(Suppl 112)229-230；Spallholz JEThe negative effects of excessiveamounts of naturally occuring selenium.The selenium-TelluriumDevelopment Association 1998；二月)。因此，较多并不一定导致较好的结果。需要进一步的研究来确定对临床结果可能具有有益效果的微量营养物的理想剂量，特别是在与谷氨酰胺联合施用时。另外，给重症患者提供高含量的谷氨酰胺有几个困难，这是由于溶解度和稳定性有限的问题，特别是对于具有体积受限的情况的患者。
线粒体功能障碍在重症患者中可能是一个问题，这是由于大量因素，包括但不限于，活性氧簇(ROS)引起的损伤或治疗性化合物的毒副作用。其他患者组，如癌症患者，也可能具有线粒体功能障碍，这是癌症治疗方案的副作用。其他患者组，如AIDS/HIV患者，也可能具有线粒体功能障碍，这是抗病毒治疗方案的副作用。再有另外一些患者组可能在遗传学上倾向于线粒体功能障碍。因此，改善线粒体功能的方法可能有利于重症患者以及其他具有线粒体功能障碍的患者。
因此，需要确定主要的营养物，以及它们在治疗重症或改善线粒体功能上可能提供有益结果的施用途径。
发明内容
本发明涉及一种能够用于治疗重症患者或改善线粒体功能的营养组合物。更特别地，本发明涉及含有高浓度氨基酸、抗氧化剂或其组合的组合物在治疗重症患者或改善线粒体功能中的用途。
本发明的一个目的是提供改善的治疗性营养组合物、治疗性营养联合药物或其使用方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种组合物，其含有每升溶液大约35至大约380克或介于之间的任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺，和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克或介于之间的任意范围或量的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克或介于之间的任意范围或量的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素E，浓度为每升大约20至大约4000毫克或介于之间的任意范围或量的β-胡萝卜素，及其组合。
上述组合物可以肠胃外施用，用于治疗重症患者或改善线粒体功能。
根据本发明的一个方面，提供了总体积为大约50至大约1000毫升的单位剂量形式，该单位剂量形式含有每升溶液大约35至大约380克或介于之间的任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺，和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克或介于之间的任意范围或量的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克或介于之间的任意范围或量的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素E，浓度为每升大约20至大约4000毫克或介于之间的任意范围或量的β-胡萝卜素，及其组合。
上述单位剂量形式可以肠胃外施用，用于治疗重症患者或改善线粒体功能。
根据本发明的一个方面，提供了一种联合药物，其包括每升溶液大约35至大约380克或介于之间的任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺，和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克或介于之间的任意范围或量的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克或介于之间的任意范围或量的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素E，浓度为每升大约20至大约4000毫克或介于之间的任意范围或量的β-胡萝卜素，及其组合。在某些实例中，该联合药物的成分同时施用，而在另外一些实例中，这些成分分开施用。在某些实例中，使用相同的施用模式施用该联合药物的成分，而在另外一些实例中，使用不同的施用模式施用这些成分。
上述联合药物可以肠胃外施用，用于治疗重症患者或改善线粒体功能。
在某些实例中，单位剂量的总体积可以是大约50至大约1000毫升或介于之间的任意范围或量。例如，总体积可以是大约200至大约500毫升。作为另一个例子，总体积可以是大约1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介于之间的任意体积。
在某些实例中，硒可以以每升溶液大约400至大约10000微克的浓度或介于之间的任何范围或量使用。例如，硒浓度可以是大约1000至大约4000微克每升。作为另一个例子，硒可以以每升溶液大约400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、8000、9000或10000微克的浓度或介于之间的任意浓度使用。
在某些实例中，谷氨酰胺可以以每升溶液大约35至大约380克的浓度或介于之间的任意范围或量使用。例如，谷氨酰胺浓度可以是每升溶液大约50至大约150克。作为另一个例子，谷氨酰胺可以以每升溶液大约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、150、160、170、180、190、200、250、300或350克的浓度或介于之间的任意浓度使用。
在某些实例中，本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式可以在不存在脂质或碳水化合物的情况下制备。
根据本发明的一个方面，提供了一种治疗重症患者的方法，包括给需要这种治疗的重症患者施用本发明的组合物或联合药物。作为一个例子，以大约0.3g谷氨酰胺/kg体重到大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量或介于之间的任意范围或量给患者肠胃外施用本发明的组合物。作为另一个例子，以大约400至大约2000微克硒的每日剂量或介于之间的任意范围或量给患者施用本发明的组合物。
根据本发明的一个方面，提供了一种改善线粒体功能的方法，包括给需要这种治疗的患者施用本发明的组合物或联合药物。作为一个例子，以大约0.3g谷氨酰胺/kg体重到大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量或介于之间的任意范围或量给患者肠胃外施用本发明的组合物。作为另一个例子，以大约400至大约2000微克硒的每日剂量或介于之间的任意范围或量给患者施用本发明的组合物。在某些实例中，患者具有与线粒体功能障碍相关的细胞退化。
本发明的一个优点是这些组合物可以小量配制，因此可以给体积受限的患者施用。
该发明概述没有必要描述本发明的所有特征。
通过以下描述，并参考附图，本发明的这些和其它特征将更加明显。在附图中图1示出了第1组/对照(图1A)、第2组(图1B)、第3组(图1C)、第4组(图1D)和第5组(图1E)患者的各种器官系统的平均日SOFA得分(SOFA评分系统的概述见表6)的图；图2示出了第1组/对照(图2A)、第2组(图2B)、第3组(图2C)、第4组(图2D)和第5组(图2E)患者的总日SOFA得分(对于每名患者将每个器官系统的SOFA得分相加来计算总SOFA得分)的图，在图2F的单图中汇集了来自图2(A-E)的回归线；
图3示出了第2组(图3A)、第3组(图3B)、第4组(图3C)和第5组(图3D)患者红细胞中谷胱甘肽(GSH)含量的图，在图3E的单图中汇集了来自图3(A-D)的回归线；图4示出了第2组(图4A)、第3组(图4B)、第4组(图4C)和第5组(图4D)患者中硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS；脂质过氧化作用的指标和氧化应激的标志)的血浆浓度的图，在图4E的单图中汇集了来自图4(A-D)的回归线；图5示出了第2组(图5A)、第3组(图5B)、第4组(图5C)和第5组(图5D)患者中线粒体DNA和核DNA水平之比(mtDna/nDNA；线粒体功能的一个指标)的图，在图5E的单图中汇集了来自图5(A-D)的回归线；图6示出了被归类为存活的或死亡的个体患者的mtDna/nDNA比的图，以较大的点示出了回归线；图7示出了被归类为第2组患者或第3、4、5组患者的个体患者的mtDna/nDNA比的图，以较大的点示出了回归线；图8示出了第1组/对照、第2组、第3组、第4组和第5组患者的肌酸酐血浆浓度(肾功能的一个指标)的回归线图。
发明详述本发明涉及一种能够用于治疗重症患者或改善线粒体功能的营养组合物。更特别地，本发明涉及包含高浓度氨基酸、抗氧化剂或其组合的组合物在治疗重症患者或改善线粒体功能中的用途。
以下描述了优选的实施方案。
几项以前的随机化试验未能证明当经肠提供关键营养物时对重症患者有效的治疗(Novak等人.Glutamine supplementation in seriousillnessA systematic review of the eVidence，Crit.Care Med.2002；30；2022-29)。但是，鉴于胃肠道作为细胞因子来源和白细胞活化和活性氧簇形成的主要作用，直接向胃肠道腔提供关键营养物在理论上是有意义的。不希望受限于理论，缺少观察到的治疗效果的一个原因可能是当经肠提供并与肠营养产品组合时，患者可能在耐受肠进食上有困难，从而限制关键营养物的摄入。在某些实例中，本发明通过肠胃外施用高浓度的关键营养物而不需要存在典型地包含在营养补充剂中的大量营养物，例如脂质或碳水化合物，将这些关键营养物的提供与肠(或肠胃外)营养的提供分离开来。然而，为了有利于特定患者或患者群体，任选地可以向本发明的组合物中添加这些大量营养物或一起使用。
本发明的一个方面涉及一种组合物，其包含每升溶液大约35至大约380克或介于之间任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺和选自硒、维生素C、锌、维生素E、β-胡萝卜素及其组合的抗氧化剂。在某些实例中，可以选择两种或多种抗氧化剂。在某些实例中，可以给患者肠胃外施用该组合物。在另外一些实例中，该组合物可以用于治疗重症患者。另外，该组合物可以用于治疗线粒体功能障碍或改善线粒体功能障碍患者的线粒体功能。
在本发明的某些实例中，该组合物可以用来治疗重症及患有线粒体功能障碍的患者。
在本发明的某些实例中，给重症患者或线粒体功能障碍患者肠胃外施用一种组合物，该组合物包含每升溶液大约35至大约380克或介于之间任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克或介于之间的任意范围或量的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克或介于之间的任意范围或量的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素E，浓度为每升大约20至大约4000毫克或介于之间的任意范围或量的β-胡萝卜素，及其组合。作为另一个例子，所述抗氧化剂是浓度为每升大约1000至大约4000微克的硒，谷氨酰胺的浓度为每升溶液大约50至大约100克。在某些实施例中，该组合物可以包含两种或多种抗氧化剂。在某些实例中，包含本发明的组合物的单位剂量形式的总体积为大约50至大约1000毫升或介于之间的任意范围或量。例如，总体积为大约1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介于之间的任意体积。此外，该组合物优选不含脂质、碳水化合物或既不含脂质也不含碳水化合物。
“重症”、“重症救护”“病危”或其它变化形式涉及需要在重症监护病房(ICU)接受治疗的患者或具有死亡或发展多器官衰竭危险的患者，例如，表现多器官功能障碍证据或与多器官功能障碍发生有关的证据的患者，这是本领域技术人员应当认识到的。
不希望受理论的束缚，认为活性氧簇(ROS)在重症的病理生理学中起关键作用。ROS不仅导致细胞成分的直接损伤，而且引发细胞因子的释放，该细胞因子进一步激活炎症级联(Grimble RF.Nutritionalantioxidant and the modulation of inflammationTheory and practice，New Horizons 1994；2175-1 85)。自由基能够激活驻留的巨噬细胞或枯否氏细胞，这些细胞释放炎症细胞因子(例如，TNF、IL-1、IL-6、IL-18)。这些致炎介质又引起炎症细胞(单核细胞和白细胞)的活化和向组织和器官内的流入，并且可以直接引起线粒体功能障碍，导致进一步的局部缺血和组织损伤。此外，被活化的枯否氏细胞也产生大量的氧自由基，由此产生缺陷的炎症循环、细胞活化和ROS产生。
在一个极其简单的模型中，宿主对侵入的微生物的应答可以分为两类1)细胞防御，包括先天(非特异性)免疫和获得性(特异性)免疫，和2)全身炎症应答。细胞防御功能包括多形核粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的所有功能以及它们的增殖行为。相反，免疫活性细胞引发的全身炎症应答主要在组织水平上起作用。全身炎症反应的特征在于介质、自由基和活化的免疫细胞对代谢、血管和支气管系统的内皮、血小板和平滑肌的效果。
各种基质或营养物的疗效将随患者的基础病理生理学和该基质是否影响细胞免疫功能和/或炎症介质的合成和/或ROS的产生、线粒体功能或其组合而不同。例如，对于通过过量一氧化氮(NO)产生的精氨酸和通过二十碳化合物合成的ω-3脂肪酸，过量的这些营养物可能具有免疫抑制效果，并且可能与较差的临床结果有关。作为另一个例子，进一步刺激全身炎症应答的营养物可能对重症患者有害。不希望受理论的束缚，重症患者的特征似乎在于同一患者或患者群体中共存的过度炎症(hyperinflammation)和细胞免疫功能障碍。因此，对于重症患者，加强细胞防御(特异性和非特异性免疫功能)和改善活性氧簇，而不间接提高炎症应答的营养物可能是期望的。
本发明的某些实施例提供了通过减轻或改善(例如)过度炎症、细胞免疫功能障碍或氧化应激而可能有益于重症患者的谷氨酰胺、抗氧化剂或其组合。此外，重症患者以及其他患者组，例如癌症患者或AIDS患者，可能受益于线粒体功能的改善。
在本发明的一个方面，提供了一种联合药物，包括每升溶液大约35至大约380克或介于之间任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克或介于之间的任意范围或量的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克或介于之间的任意范围或量的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素E，和浓度为每升大约20至大约4000毫克或介于之间的任意范围或量的β-胡萝卜素。在某些实例中，一种联合药物可以包括谷氨酰胺和两种或多种抗氧化剂。
在某些实例中，包括谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物可以肠胃外施用，用于治疗重症患者，而在另外一些实例中，该联合药物可以用于肠胃外施用以改善线粒体功能。
联合药物的成分不一定配制在同一组合物中。在某些实例中，包括谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物可以配制在同一组合物中；而在另外一些实例中，谷氨酰胺和抗氧化剂可以配制在单独的组合物中。在另外的实例中，谷氨酰胺和抗氧化剂剂量的一部分可以在同一组合物中提供，其余的剂量在分别的组合物中提供。
联合药物的成分不一定使用相同的施用模式施用。在某些实例中，包括谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物可以使用相同的施用模式施用，而在另外一些实例中，谷氨酰胺和抗氧化剂可以通过单独的施用模式施用。在一个实例中，谷氨酰胺和抗氧化剂肠胃外施用。在另外一个实例中，谷氨酰胺肠胃外施用，而抗氧化剂经肠施用。在另外一些实例中，谷氨酰胺和抗氧化剂剂量的一部分可以通过相同的施用模式(例如肠胃外)提供，其余的剂量通过单独的施用模式(例如经肠)提供。
在某些实例中，包括谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物同时施用，而在另外一些实例中，谷氨酰胺和抗氧化剂在分开的时间施用。在另外一些实例中，在持续数天的治疗方案中，谷氨酰胺和抗氧化剂可以在某些时间期限内同时施用，而在另外的时间期限内在分开的时间施用。一般来说，谷氨酰胺和抗氧化剂每日(24小时的时间期限)施用。但是，为了方便、有效或实用起见，本领域技术人员基于不同的时间期限，例如但不限于72小时、48小时、36小时、24小时、12小时、6小时或3小时或介于之间的任何时间期限，可以容易地施用谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物。
在ROS或氧自由基的许多有害活性中包括对线粒体DNA(mtDNA)的直接损伤。mtDNA损伤的渐进性积累可以使细胞不能有效地进行氧化磷酸化反应，从而导致生物能量缺乏的细胞。随着时间过去，线粒体DNA损伤积累，并且导致线粒体和细胞功能障碍，具有随后器官衰竭及最终死亡的可能。此外，在老年患者中常常观察到氧化剂保护性超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶的减少。因此，在许多患者中ROS的有害作用的增加可能同时伴随有针对ROS的保护所需的酶和线粒体代谢物的减少。
线粒体产生维持哺乳动物生命所需的90％以上的能量。因此，线粒体功能障碍可以阻止细胞维持和更新自身的能力，甚至可能导致细胞死亡。
众所周知，线粒体功能障碍导致大量有害的结果，包括但不限于，钙缓冲受损，产生自由基，线粒体通透性转变的活化和继发的兴奋性中毒。
根据United Mitochondrial Disease Foundation，Inc.(www.umdf.org)，线粒体功能障碍可导致对脑、心、肝、骨骼肌、肾和内分泌和呼吸系统的细胞的大量损害。来自长寿命组织、具有高能量需求的细胞，如神经元、胰岛细胞、心和肌细胞，可能特别容易具有线粒体功能障碍。根据哪种细胞受到影响，症状可包括运动控制、肌无力和疼痛、胃肠道病症和吞咽困难、发育不良、心脏病、肝病、糖尿病、呼吸系并发症、癫痫发作(seizures)、视觉/听觉问题、乳酸性酸中毒、发育迟缓和易患感染。
与线粒体功能障碍有关的细胞退化是各种疾病的一个重要因素。已知线粒体功能障碍是几种疾病中的重要因素，所述疾病包括但不限于进行性婴儿灰质营养不良(阿尔佩斯病)、NADH脱氢酶(NADH-CoQ还原酶)缺陷(复合物I缺陷)、泛醌-细胞色素c氧化还原酶缺陷(复合物III缺陷)、呼吸链的复合物IV缺陷引起的细胞色素c氧化酶缺陷(复合物IV缺陷/COX缺陷)、慢性进行性外眼肌麻痹综合征(CPEO)、卡恩斯-塞尔综合征(KSS)、莱伯遗传性视神经病(LHON)、肌阵孪癫痫破碎红纤维综合症(MERRF)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)。已知与线粒体功能障碍有关的另外一些变性性疾病，如美国专利No.20020173543(于2001年12月14日提交)所述，包括阿耳茨海默氏病、糖尿病、帕金森氏病、神经元和心肌缺血、亨延顿舞蹈病、和其他有关的聚谷氨酰胺病、延髓肌萎缩、马-约病(SCA-3)、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(DRPLA)和脊髓小脑性共济失调、张力障碍、莱伯遗传性视神经病、精神分裂症和肌退化性病症，如线粒体脑病、乳酸性酸中毒和中风(MELAS)。另外，作为诸如癌症治疗或AIDS/HIV患者的抗逆转录病毒治疗等治疗性治疗的毒副作用，可能导致线粒体功能障碍。例如，大多数抗生素(包括但不限于四环素、红霉素和氯霉素)和抗病毒剂可能引起线粒体功能障碍。因此，本文所述的组合物、联合药物或单位剂量形式可用于治疗具有广泛不同的遗传性和获得性病因学的多种病症，它们通常与线粒体功能障碍有关。
美国专利公开No.20020173543描述了线粒体功能障碍的各种后果，包括但不限于(i)ATP产量减少，(ii)高反应性自由基(例如超氧化物、过氧化亚硝酸盐和羟基和过氧化氢)的产生增多，(iii)细胞内钙稳态的紊乱，和(iv)启动凋亡级联的因子的释放。美国专利公开No.20020173543描述了几种测定线粒体完整性的方法，包括(i)使用2-，4-二甲基氨基苯乙烯基-N-甲基吡啶(DASPMI)对线粒体通透性转变(MPT)的测定；(ii)用线粒体保护剂处理的细胞凋亡的测定；和(iii)分离的线粒体中电子传递链(ETC)活性的测定。如本文所述，可以比较线粒体和核DNA水平，以测定线粒体的功能。本领域技术人员已知其他测定。
本发明人发现谷氨酰胺、抗氧化剂或其组合可以改善线粒体功能，并且可能有益于重症患者以及其他患者组，例如癌症患者或患有某些神经变性疾病的患者。
氨基酸谷氨酰胺在体内氮转运中起中心作用，是快分裂细胞的，特别是淋巴细胞的燃料，是谷胱甘肽的前体，并且具有许多其它的基本代谢功能。在正常生理条件下，人体大量合成谷氨酰胺，因此认为它是非必需的。
在分解代谢疾病患者中谷氨酰胺可能成为条件必需氨基酸。几项研究表明，在过度身体锻炼后、在大手术后(Blomqvist BI，HammarqvistF，von der D，Wernerman JGlutamine and alpha-ketoglutarate preventthe decrease in muscle free glutamine concentration and influence proteinsynthesis after total hip replacement.Metabolism 1995；441215-1222)和重症期间(Parry-Billings M，Evans J，Calder PC，Newsholme EADoesglutamine contribute to immunosuppression after major burns？Lancet1990；336523-525)，谷氨酰胺水平下降。
在动物研究中，谷氨酰胺缺乏与肠上皮完整性的丧失有关，而谷氨酰胺补充在完全胃肠外营养过程中降低了肠粘膜萎缩，保持了肠和肠外IgA的水平。但是，关于动物模型中的细菌转移，补充了肠胃外或肠谷氨酰胺的制剂的研究显示混合的结果。其中一些显示降低，而另外一些证明没有这种效果。
已经提出谷氨酰胺补充有益于人体保持胃肠结构、降低肠通透性、保持骨骼肌、改善氮平衡、提高免疫细胞功能(Novak等人，Glutamine supplementation in serious illnessA systematic review of theevidence.Crit Care Med 2002；30；2022-29)。然而，尚未对重症患者建立在临床上重要的剂量和施用途径。此外，由于物理和化学性质，临床条件下游离L-谷氨酰胺的使用可能是不利的。首先，在加热灭菌或长时间贮存过程中由于结晶和氨释放，谷氨酰胺是不稳定的。其次，游离谷氨酰胺在水中具有低溶解度(在20摄氏度下约为36g/L H2O)，因此难以给重症患者，特别是体积受限的患者施用足够的谷氨酰胺。
与单独使用游离谷氨酰胺相比，本发明的某些实例允许更高浓度的前体谷氨酰胺分子形式的谷氨酰胺。因此，本发明的组合物包含前体谷氨酰胺分子，该分子含有浓度为每升溶液大约35克至大约380克或介于之间的任意范围或量的谷氨酰胺。例如，谷氨酰胺的浓度可以是每升溶液大约50至大约150克。作为另一个例子，谷氨酰胺的浓度可以是每升溶液大约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360或380克，或介于之间的任意浓度。
在许多因素中，每种特定前体谷氨酰胺分子的溶解度性质决定了谷氨酰胺浓度的上限。例如，丙氨酸-谷氨酰胺二肽在20摄氏度下具有每升568克的溶解度。这种二肽的饱和溶液含有浓度为每升大约380克的谷氨酰胺。作为另一个例子，甘氨酸-谷氨酰胺二肽的饱和溶液(在20摄氏度下溶解度为每升154克)含有浓度为每升大约110克的谷氨酰胺。
比游离谷氨酰胺具有更高溶解度的前体谷氨酰胺分子的使用允许以小于1.5-2升的体积施用较高含量的谷氨酰胺，1.5-2升的体积与补充谷氨酰胺的完全胃肠外营养有关。本发明的单位剂量形式一般具有大约50至大约1000毫升的总体积或介于之间的任意范围或量。例如，总体积可以是大约200至大约500毫升。作为另一个例子，单位剂量形式的总体积可以是大约500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介于之间的任意体积。
因此，本发明通过以较小的体积达到谷氨酰胺的有效剂量而有益于重症患者。有效剂量的一个例子是大约0.3g谷氨酰胺/kg体重至大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量，或介于之间的任意范围或量。其它例子包括大约0.4g谷氨酰胺/kg体重至大约0.8g谷氨酰胺/kg体重，或大约0.5g谷氨酰胺/kg体重至大约0.7g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量，或从介于之间的任意剂量开始的范围，包括但不限于0.35、0.4、0.45、0.5或0.55g谷氨酰胺/kg体重。
谷氨酰胺在患者体内可以由前体谷氨酰胺分子释放。前体谷氨酰胺分子的例子包括但不限于用烷基、羧基、乙酰基、酯或酰胺基衍化的谷氨酰胺。谷氨酰胺前体分子的一种优选形式是含有谷氨酰胺的短链肽。该短链肽的长度优选为2个残基至大约10个残基，包括例如二肽或三肽。涉及由不同残基和不同残基长度组成的短链肽混合物。例如，本发明的组合物可以包含短链肽，该短链肽选自丙氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺、甘氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺、甘氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-谷氨酰胺、精氨酸-谷氨酰胺、脯氨酸-谷氨酰胺、丝氨酸-谷氨酰胺、缬氨酸-谷氨酰胺及其任意组合。因此，不需要类似高浓度的另外一种氨基酸即可达到所需的谷氨酰胺高浓度。
除了一起使用各种类型的含有谷氨酰胺的短链肽以外，也可以使用单一类型的谷氨酰胺前体或不同谷氨酰胺前体的任意组合，条件是总谷氨酰胺浓度高到足以治疗重症患者。例如，α-酮戊二酸可以与含有谷氨酰胺的短链肽组合。作为另一个例子，羧基衍生化的谷氨酰胺前体分子可以与游离谷氨酰胺和长度为2-5个残基的含谷氨酰胺短链肽的混合物相组合。
本领域技术人员应当知道获得含有谷氨酰胺的短链肽的各种来源。例如，可以使用N-保护的氨基酸酯作为亲电子试剂，游离谷氨酰胺作为亲核试剂，使用植物无花果蛋白酶，实现酶催化的二肽的合成(Furst PNew developments in glutamine delivery，Amer Soc NutritionalSci 20012562s-2568s)。此外，可以从诸如角豆蛋白(1998年12月15日授权的美国专利No 5,849,335)等天然富含谷氨酰胺的蛋白质的水解产物中分离含有谷氨酰胺的短链肽。另外，含有谷氨酰胺的短链肽也可以从构建的转基因细胞或生物中获得，该转基因细胞或生物产生具有被识别蛋白质酶切位点隔开的含谷氨酰胺序列重复单位的蛋白质(2003年11月18日授权的美国专利No.6,649,746))。此外，含有谷氨酰胺的二肽可以作为商品获得，例如Dipeptiven，Glamin和Intestamin(Fresenius Kabi，Uppsala，Sweden)。
Dipeptiven是含谷氨酰胺二肽N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的20％溶液。100ml Dipeptiven含有20g N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(＝8.20gL-丙氨酸，13.46g L-谷氨酰胺)。该二肽在水中高度可溶(在20℃下为568g/l H2O)，并且在加热灭菌和贮存期间保持稳定。相反，游离谷氨酰胺的物理和化学性质(低溶解度，20℃时为36g/L H2O，和较差的贮存特性)妨碍了它在水溶液中的应用。因此，没有游离谷氨酰胺的缺点的ala-gln二肽是在临床条件下可以作为游离谷氨酰胺前体的短链肽的一个非限制性实例。
Dipeptiven可以肠胃外施用，优选静脉内输注。静脉内输注后，二肽ala-gln快速水解为氨基酸L-谷氨酰胺和L-丙氨酸。由于几乎存在于身体所有区室内的高肽酶活性，这可以得到保证。几项研究通过测定游离丙氨酸和谷氨酰胺的量证明，在静脉内输注后人体中的ala-gln二肽水解。给健康志愿者快速静脉注射不同量的ala-gln后，报道了2.4至3.8分钟的半衰期和1.92 1/分钟的血浆清除率。计算的分布体积与胞外区室相当。给健康志愿者连续4小时输注24mg ala-gln/kg体重/小时后，观察到谷氨酰胺和丙氨酸血浆浓度的快速等摩尔升高。在输注期在血浆中只发现痕量的ala-gln。输注结束15分钟后，该二肽在血浆中不再检测到。另外，在尿中未检出ala-gln。其它氨基酸的浓度未受影响。ala-gln溶液良好耐受，没有主观不适的报道(Albers S，WemermannJ，Stehle P，Vinnars E，Furst P.Availability of amino acids supplied byconstant intravenous infusion of synthetic dipeptides in healthyVolunteers.Clinical Science 1989；76643-648)。
Glamin是含有30.27g/L甘氨酰-L-谷氨酰胺(gly-gln)的氨基酸溶液。象ala-gln二肽一样，gly-gln在加热灭菌和贮存期间保持稳定。gly-gln的溶解度(在20摄氏度下为154g/L H2O)小于ala-gln(568g/L)，但却比游离谷氨酰胺(36g/L)高大约5倍。Glamin可以肠胃外施用，优选静脉内输注在某些实例中，本发明的组合物可以与肠胃外或肠补充剂组合使用。例如，Intestamin是含有谷氨酰胺作为二肽和抗氧化剂的肠补充剂(每100ml Intestamin含有60μg硒、4mg锌、2mgβ-胡萝卜素、100mg维生素E和300mg维生素C)。推荐的每日剂量(RDD)递送500ml的体积内的营养物。因此为具有有限肠耐受及需要补充谷氨酰胺和抗氧化剂的重症患者的饮食管理设计了产品。500ml的RDD递送30g作为二肽提供的谷氨酰胺。Intestamin用作肠胃外或肠营养的肠补充剂。
随机化临床试验的结果显示，在重度胰腺炎患者中应用Intestamin是安全的、良好耐受的。而且，几项观察研究的结果显示含有谷氨酰胺的肠补充剂在手术后早期情况下良好耐受，Intestamin的大剂量微量营养物供应与5天内低术后血浆值的更正有关(BergerMM，Goette J，Stehle P，Cayeux M，Chiolero R，Schroeder J.Enteralabsorption of a solution with high dose antioxidants and glutamine earlyafter upper gastrointestinal surgery.ClinNutr 2002，Vol.21，Supplementl，p17)。
本发明的一个方面涉及抗氧化剂的施用，例如但不限于硒、维生素C、锌、维生素E、β-胡萝卜素或其组合。
硒是谷胱甘肽酶功能的一种必需的辅因子，对细胞免疫功能具有有利的作用。硒通过其他含有硒代半胱氨酸的含硒蛋白质可以具有另外的影响。在哺乳动物中已知有大约20种含硒蛋白质。硒作为氨基酸硒代半胱氨酸插入蛋白质内。这些蛋白质具有一系列新发现的抗氧化活性，即氧化还原稳定性质，包括基因表达的调节。
Pharmacological Basis of Therapeutics第9版，The McGraw-HillCompanies，1996的第1540页报告，元素硒的推荐每日供给量为每天10至75微克。较高的硒剂量在重症患者治疗或改善线粒体功能方面可能具有显著的效果。本发明包括给重症患者或线粒体功能障碍患者施用每天大约400至大约2000微克的每日剂量。每天大约400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000微克的剂量或介于之间的任意剂量可能是有用的。
硒可以作为元素硒或作为元素硒前体的无毒性有机或无机盐、螯合物或其它硒化合物掺入本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式中。在本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式中，硒可以用作能够被身体吸收的几种无毒、有机或无机硒化合物之一。
无机硒化合物的例子有亚硒酸盐或硒酸盐阴离子形式的含硒的脂肪族金属盐。有机硒化合物一般比无机化合物毒性低。有机硒化合物的非限制性例子包括在链中具有大约7-11个碳原子的硒胱氨酸、硒甲硫氨酸单和双硒基羧酸。也可以使用硒基氨基酸螯合物。此外，也可以使用作为商品获得的硒基化合物。
为了给具有有限体积需要的患者提供有效剂量，本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式包含高浓度的硒。例如，硒的浓度可以是每升溶液大约400微克至大约10000微克或介于之间的任意范围或量。例如，硒的浓度可以是每升大约1000至大约4000微克。硒浓度的另外的例子包括但不限于每升溶液大约400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、8000、9000或10000微克的浓度或介于之间的任意浓度。
硒是抗氧化剂的一个非限制性例子，可以与前体谷氨酰胺分子组合使用，用于治疗重症患者或改善线粒体功能。本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式可以无限制地包含任意类型的抗氧化剂。例如，抗氧化剂可以选自硒、β-胡萝卜素、维生素E、维生素C、锌及其任意组合。与硒的举例说明一样，为了在重症患者或线粒体功能障碍患者中达到显著的临床效果，本发明涉及剂量高于对健康个体的推荐饮食供应量(RDA)或容许上限摄取水平(UL)的其他抗氧化剂。例如，在The National Academies发表的Dietary Reference Intake报告(该报告可以从www.nap.edu获得)已经测定了RDA和UL值。本发明包括浓度至少高于RDA水平的抗氧化剂。在某些非限制性实例中，抗氧化剂浓度高于UL。
β-胡萝卜素是天然存在的维生素原A，具有脂质抗氧化性质。另外，β-胡萝卜素是脂溶性的，并且在循环脂质中浓缩。在体外，β-胡萝卜素是一种不同寻常的类型的链断裂的脂质抗氧化剂。由于它有许多偶联的双链，β-胡萝卜素表现出良好的自由基捕获抗氧化剂行为。在本发明的上下文中，可以以每天10mg至1000mg的剂量或介于之间的任意范围或剂量提供β-胡萝卜素。
维生素E(α-生育酚)是一种脂溶性维生素。它的主要功能是作为脂质抗氧化剂保护脂质免于氧化修饰。维生素E的水溶性衍生物(例如，如美国专利Nos.6,022,867和6,645,514所公开的)已知，并且可以在基于水的组合物中使用。此外，也可以使用稳定的水可混合乳剂提高维生素E的溶解度。在本发明上下文中，可以以每天500mg至3000mg的剂量或介于之间的任意范围或剂量提供维生素E。
维生素C是水溶性抗氧化剂，它对于胶原蛋白的产生是关键的，因此是创伤愈合所需的。此外，维生素C帮助保护脂溶性维生素A和E以及脂肪酸免于氧化。维生素C也参与铁吸收。在本发明上下文中，可以以每天1000mg至5000mg的剂量或介于之间的任意范围或剂量提供维生素C。
锌是一种具有抗氧化性质的必需微量矿物质。锌在细胞生物学中起关键作用，并且参与事实上非常重要的细胞过程，如转录、翻译、离子转运等。在本发明的上下文中，可以以每天20mg至200mg的剂量或介于之间的任意范围或剂量提供锌。
在人体中存在复杂的内源防御系统，用来保护组织免于活性氧簇(ROS)或活性氮-氧簇(RNOS)诱导的细胞损伤。特定酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶(包括它们的辅因子硒、锌、镁和铁)，巯基供体(即谷胱甘肽)和维生素(包括但不限于维生素E、C和β-胡萝卜素)，形成功能上重叠的防御机制的网络。在重症患者中有越来越多的证据表明由于ROS/RNOS产生增加和消除能力降低之间局部或系统的不平衡，这些防御机制可以被打破。此外，大量的研究提供了证据表明低内源性抗氧化剂“贮存”与自由基产生的增加、系统炎症应答加强、随后的细胞损伤、死亡率增加、甚至较高的重症死亡率有关(Alonso de Vega JM，Diaz J，Serrano E等人.Oxidativestress in critically ill patients with systemic inflammatory responsesyndrome.Crit Care Med 2002；301782-1786)。本发明提供有效剂量的内源抗氧化剂微量营养物，来抵消循环抗氧化剂的消耗，从而抵抗可以导致线粒体功能障碍的毒性氧自由基的过度产生。此外，可以任选地在肠或肠胃外营养范围外提供外源性抗氧化剂，例如，在不含碳水化合物或脂质时。
因此，本发明的某些实例提供组合物、联合药物或单位剂量形式，其含有每升溶液大约35至大约380克或介于之间的任意范围或量的作为短链肽提供的谷氨酰胺，和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克或介于之间的任意范围或量的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克或介于之间的任意范围或量的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克或介于之间的任意范围或量的维生素E，和浓度为每升大约20至大约4000毫克或介于之间的任意范围或量的β-胡萝卜素。在某些实例中，抗氧化剂是浓度为每升大约1000至大约4000微克或介于之间的任意范围或量的硒，谷氨酰胺的浓度为每升溶液大约50至大约150克或介于之间的任意范围或量。在某些实例中，可以给重症患者或线粒体功能障碍患者肠胃外施用组合物、联合药物或单位剂量形式。此外，任选地不含脂质、碳水化合物或脂质和碳水化合物。该组合物、联合药物或单位剂量形式可以以大大低于通常获得的肠胃外营养组合物的体积配制，并且可以用于给体积受限的患者施用。
本发明的某些实例涉及包含高浓度谷氨酰胺、抗氧化剂或其组合的组合物、联合药物或单位剂量形式在治疗重症患者或线粒体功能障碍患者中的用途。因此，治疗包括给需要这种治疗的患者施用如下组合物、联合药物或单位剂量形式，其含有每升溶液大约35至大约380克或介于之间的任意范围或量，例如每升溶液大于35克的作为短链肽提供的谷氨酰胺，和选自硒、维生素C、锌、维生素E、β-胡萝卜素及其组合的抗氧化剂，或用于改善线粒体功能障碍患者的线粒体功能。
在某些实例中，本发明的组合物或联合药物可以制备为易于施用的单位剂量形式。单位剂量形式是用于治疗重症患者或线粒体功能障碍患者的适量的谷氨酰胺和抗氧化剂，可以作为常规方案的一部分给患有施用。单位剂量形式可以是任何方便的形式，包括但不限于干燥固体、冻干粉末、冻干剂或液体。例如，含有谷氨酰胺和抗氧化剂的组合物可以作为分别测量的固体贮存，然后在施用前可以容易地溶解在适量的盐水溶液中。作为另一个例子，包括谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物可以以两个单独的预先确定的体积包装并且贮存，然后可以直接给患者施用。
根据制备肠胃外使用的药物形式采纳的常规技术制备本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式。本发明的组合物和单位剂量形式一般配制用于肠胃外施用，但是也可以使用其它施用方法实现提高的谷氨酰胺、抗氧化剂或其组合的施用。本发明的组合物优选以液体形式施用，单位剂量形式小于1000毫升的体积。例如，体积为大约1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介于之间的任意体积。作为另一个例子，体积为大约50毫升至大约500毫升或介于之间的任意范围或体积。
如实施例所述，本发明的组合物、联合药物或单位剂量形式已经给患者施用，并且观察到几个益处。例如，使用监测患者中线粒体DNA(mtDNA)相对于核DNA(nDNA)水平的测定法，包括谷氨酰胺和硒的联合药物显示改善线粒体功能。在另外的实施例中，例如，氧化应激标记物的减少和谷胱甘肽水平的保持表明，患者证明了氧化或自由基损伤得到改善。在另外一些实施例中，可以给患者施用包括谷氨酰胺和抗氧化剂的联合药物，而对器官功能或炎症细胞因子水平没有任何明显的不良作用。
本发明将在下列实施例中进一步说明。
实施例实施例1亚硒酸在Dipeptiven/生理盐水混合物中的相容性以大体积溶液施用营养物，如全肠胃外营养，限制了在体积受限患者中的应用。因此，为了提高谷氨酰胺和硒联合药物的临床应用，需要确定这种联合药物是否能够小量提供。一个问题是亚硒酸可能还原为元素硒，元素硒是不可溶的，可以形成颗粒物质。因此，评价了通过连续静脉内输注提供谷氨酰胺二肽与硒的相容性。
A.试验设计1.试验制剂使用下列试验制剂·a)MicroSe 40μg/ml，Baxter 10ml，Lot 120669(硒酸USP)·b)Dipeptiven Fresenius Kabi 100ml，Lot SD 1667(20％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)注射用水溶液，pH5.4-6.0)Dipeptiven是含谷氨酰胺二肽N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(AlaGln)的20％溶液。100ml Dipeptiven含有20g N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(＝8.20g L-丙氨酸，13.46g L-谷氨酰胺)。该二肽在水中高度可溶(在20℃下为568.0g/l H2O)，并且在加热灭菌和贮存期间保持稳定。相反，游离谷氨酰胺的物理和化学性质(具有有限的溶解性和较差的贮存特性)妨碍了它在水溶液中的应用。因此，没有游离谷氨酰胺的缺点的AlaGln二肽在临床条件下作为游离谷氨酰胺的前体。每克Dipeptiven含有0.7克游离谷氨酰胺，产生总剂量为0.35克/kg/天的谷氨酰胺。
该研究中使用的硒是亚硒酸注射液(MICRO Se，Sabex IncQuebec，Canada)。它是为全肠胃外营养而提供的静脉内溶液的添加物。每ml MICRO Se含有65.36μg亚硒酸(相当于40μg硒/ml)。
2.容器和载体溶液使用以下载体溶液和容器·a)250ml 0.9％NaCl USP，Lot W4H16C0，Baxter(PVC-袋)·b)250ml 0.9％NaCl USP，Lot J4H721，B.Braun(非-PVC-袋)·c)500ml 0.9％NaCl USP，Lot W4H09B1，Baxter(PVC-袋)，·d)500ml 0.9％NaCl USP，Lot J4H636，B.Braun(非-PVC-袋)3.试验混合物，其制备、贮存条件和采样在层流条件下制备试验混合物，方法是使用无菌注射器通过注射孔从袋中的0.9％NaCl USP溶液中抽取相应的体积，然后加入Dipeptiven。弃去抽取的这些量的生理盐水溶液，使用无菌注射器通过注射孔向袋中0.9％NaCl USP的剩余部分中加入相同体积的Dipeptiven。
在这些步骤之后，用无菌注射器加入12.5ml(约500μg硒)MicroSe(40μg/ml)。
250ml和500ml的两种不同大小使用两个不同性质的袋，非-PVC-聚烯烃-袋和PVC-袋。
以下表1中给出了得到的试验样品的组成。
表1.试验样品的组成
*数值是在假定体积相加下，基于0.9％NaCl USP的理论摩尔渗透压浓度308mOsm/1和Dipeptiven的921mOsm/l而计算的。
采样时间为室温贮存后0、24、48、72和96小时。
用于硒测定的样品通过0.22μm滤膜过滤，以除去可能的硒沉淀物。
用以下如表2所示的组成制备具有过量硒的其他应激混合物。
表2.应激混合物的组成
试验期0、96小时后贮存条件室温每种组合物分析2袋样品。
4.试验参数和方法使用以下试验参数和方法·外观根据欧洲药典·变色根据欧洲药典·UV-光吸收E 4/400(在4cm单元中在400nm处的消光)·亚可见颗粒物质根据欧洲药典·pH根据欧洲药典·根据方法AP-S542的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺测定(根据Fresenius Kabi AP-542)·硒测定(根据USP的原子吸收法)4.1外观根据欧洲药典该试验是关于可见颗粒物质，乳色/不透明度(根据欧洲药典，第8版，StrasbourgCouncil of Europe；2005)，沉淀和气泡产生。
4.2变色根据欧洲药典根据欧洲药典，将来自试验溶液的样品与标准颜色溶液比较。
4.3 UV-光吸收E 4/400(在4cm单元中在400nm处的消光)根据欧洲药典，利用UV/VIS-双光束分光光度计(Hitachi U-2000)进行测量。使用一个4cm石英玻璃杯测量400nm处的吸光度。也用水进行测量作为参比溶液。
4.4亚可见颗粒物质根据欧洲药典用9064型颗粒计数器(HIAC-ROYCO)进行根据欧洲药典的光阻断法检测。测量到颗粒的量＞10μm/ml和＞25μm/ml。如果检测单元中存在的颗粒平均数不超过25个计数/ml≥10μm和3个计数/ml≥25μm，则溶液满足试验的需要。
4.5 pH根据欧洲药典根据欧洲药典使用pH-计(pH-计761 Calimatic，Knick)进行检测。
4.6 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(AlaGln)测定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(AlaGln)水平通过HPLC测定。
4.7硒测定(根据USP的原子吸收法)根据USP用原子吸收法检测硒。
为了排除有机基质对样品的干扰，选择氢化物法的变化形式。
方法描述在氮下用碱硼氢化钠将硒还原为氢化物，并转移到原子吸收光谱仪的样品单元中。在196.0nm处以2.0nm的裂隙进行测量。
使用来自Perkin Elmer的原子吸收光谱仪272，Hydride-systemMHS-1和EDL灯。
试剂·硼氢化钠p.A.Merck(产品号106371)·氢氧化钠p.A.Merck(产品号106495)·盐酸37％p.A.Merck(产品号100317)用蒸馏水由试剂制备在3％氢氧化钠和3％盐酸中的1.5％硼氢化钠。
样品制备将在250ml袋中的30μl混合物和在500ml袋中的60μl混合物加入5ml 1.5％HCl。应激样品预先用水1∶10稀释。按照Perkin Elmer推荐的程序向该样品溶液中加入过量的硼氢化碱溶液。
标准制剂也使用MicroSe 40μg Baxter Lot 120669作为标准，它是用于测定稳定性的一批。在进行适应性检测之前使用第二独立工作标准检测该产品的硒含量。用105％的硒说明(declaration)证实与根据USP的说明(95-105％的说明)的一致性。
方法在实际使用条件下的适应性向第3点的Dipeptiven和0.9％NaCl USP的混合物中加入450、500和550μg的硒(形式为11.25、12.50和13.75ml Microselen 40μg/ml)，以检查在根据第3点的90％、100％和110％硒添加量时该方法的回收率。
测定结果(三次实验的平均值和标准差)在下表3中给出。
结果表3的结果显示混合物的回收率在102-111％之间，标准差在3.3-6.3％之间。对于稀释的有机基质中痕量元素的分析方法来说，这是令人满意的。
表3.混合物的回收率
*x＝平均值4.8时程检测研究溶液的制备，贮存条件，和采样研究方案使用不同范围的高和低浓度的AlaGln和硒来覆盖被认为在临床上相关的浓度的例子。使用两种不同的静脉袋大小(250ml和500ml)的生理盐水(0.9％NaCl)。所有情况均使用聚氯乙烯(PVC)和非-PVC袋。首先抽取将要加入袋中的Dipeptiven的体积，然后将125ml和200ml的Dipeptiven加入250ml袋，将125和250ml的Dipeptiven加入500ml袋。在这些步骤之后，将500μg硒(12.5mlMicro Se)加至每个袋中。除了这些标准混合物以外，我们还加入过量的硒(125ml Micro Se，200ml Dipeptiven，和50ml盐水)，以进一步评价高剂量硒和没有生理盐水的一种溶液(仅有250mlDipeptiven和12.5ml Micro Se)的稳定性。所有测试溶液都使用无菌条件在层流条件下制备然后将样品贮存在室温下0、24、48、72和96小时，在这些时间时进行以下的观察和检测。
试验参数和方法所有检测都按照欧洲药典进行(Ph.Eur.；European Pharmacopeia，第8版.StrasbourgCouncil of Europe；2005)，欧洲药典阐述了用于在制药中使用的物质组合物的常用标准。仔细检查检查混合物的可见颗粒物质、乳色/不透明度、沉淀、变色和气泡产生。也利用光阻断法用9064型颗粒计数器(HIAC-ROYCO)检测混合物的亚可见颗粒物质。测得颗粒的量≥10μm/ml和≥25μm/ml。如欧洲药典所述，如果检测的单位中存在的颗粒平均数不超过25个计数/ml≥10μm和3个计数/ml≥25μm，则该溶液满足检测的需要。为了定量变色，利用UV/VIS-双光束分光光度计(Hitachi U-2000)将样品进行UV光吸收E 4/400(在4cm单元中在400nm处的消光)检测。因此，使用一个4cm石英玻璃杯测量400nm处的吸光度，也用水进行测量作为参比溶液。
按照欧洲药典用pH-计(pH-Meter 761 Calimatic，Knick)测量所有溶液的pH。最后，按照实验室标准程序用高效液相层析(HPLC)法测定AlaGln的浓度。使用等度反相C18-HPLC法，在214nm处进行UV检测，使用磷酸二氢钾缓冲液(0.05摩尔)作为流动相，测定谷氨酰胺二肽。用于测定硒水平的样品首先通过0.22um滤膜过滤，除去可能的硒沉淀物，然后用原子吸收法测定。为了排除有机基质对样品的干扰，根据欧洲药典选择氢化物法的变化形式。AlaGln和硒的含量在每个时间点测定两次，结果表示为平均值。初始或基线值(时间＝0)设置为等于100％。
结果任何混合物在任何时间点均没有浑浊、变色或亚可见颗粒物质的证据。所有溶液的pH随时间稳定。对于任何混合物，AlaGln和硒的浓度随时间没有明显变化(见表4)。
表4.Dipeptiyen(AlaGln)和硒的测定结果(％)
图例NaCl-氯化钠；AlaGln-N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；Se-硒所有结果都用非聚氯乙烯(PVC)袋报告。结果与在PVC袋中的结果类似。
-未做。
稳定性研究方案覆盖了各种浓度的两种活性成分硒和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的混合物的各种例子，也考虑大小/体积以及用于主要包装材料的不同材料。
这个相容性研究显示在临床研究的预期混合物/剂量范围内，活性成分L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和硒是稳定的，并且试验中的所有样品满足大体积肠胃外剂的一般规格，在96小时室温贮存下没有显著改变。
在两个主要的袋系统PVC袋和非PVC袋之间未见差异，也未记录到对250ml和500ml袋的体积/大小的任何依赖性。
结果表明，当活性成分AlaGln和硒组合时，在室温下贮存96小时未引起营养物物理或化学性质的任何变化。在两个主要的袋系统PVC袋和非PVC袋之间未见差异，袋的大小或生理盐水的体积之间也未见任何差异。在室温下贮存时，谷氨酰胺二肽(AlaGln)和硒在溶液中显示相容可达96小时。通过提供研究用营养物作为单一静脉内施用，给患者施用这些营养物发生错误的危险减少。
实施例2谷氨酰胺二肽和抗氧化剂在重症患者中的施用研究设计单中心、公开标签、I期剂量范围临床试验，使用预期的对照设置Kingston General Hospital(RGH)，三级保健ICU，Ontario，Canada研究人群进入ICU的机构通气的成年患者(≥18岁)，具有血流灌注不足的临床表现。出于安全的原因排除体重过轻(＜50kg)的患者和严重头部创伤患者(GCS＜8或者需要脑室造口术)。
血流灌注不足的临床表现定义为·需要血管加压药(去甲肾上腺素、肾上腺素、去氧肾上腺素、≥5mg/kg/min的多巴胺或加压素)1小时以上；或·收缩压≤90mmHg或平均动脉压≤70mmHg，1小时以上，尽管有足够的流体冲击；或者·不清楚的代谢性酸中毒，pH≤7.30或碱过量≥5.0，与血液乳酸盐浓度升高(≥4mmol/l)有关。
研究干预如表5所总结的，将患者顺序加入5个组之一·第1组满足研究合格标准的30名患者，用于测定研究测定值的基线率，包括不利事件、器官功能和透析的需要。该组不接受谷氨酰胺/硒，但是如同后面几组一样进行相同的常规临床和生物化学测定，例外是血清氨、氨基酸水平、谷胱甘肽过氧化物酶和其它机械标记物(IL-18，TBARS等)。这些测定值用来确定研究测定值的基线率，包括不利事件、器官功能和透析的需要。
·第2组下面7名患者接受标准剂量的Dipeptiven，0.5g/kg/天的谷氨酰胺二肽(0.35克/kg/天的谷氨酰胺)，静脉内，不经肠·第3组下面7名患者静脉内接受Dipeptiven，0.5g/kg/天的谷氨酰胺二肽(0.35克/kg/天的谷氨酰胺)，每天经由鼻胃管输注经肠提供作为250ml Intestamin的21.25克/天的谷氨酰胺二肽(15克/天的谷氨酰胺)和150微克硒(在表5中表示为″1/2can″)；·第4组下面7名患者静脉内接受Dipeptiven，0.5g/kg/天的谷氨酰胺二肽(0.35克/kg/天的谷氨酰胺)，每天经由鼻胃管输注经肠提供作为500ml Intestamin的42.5克/天的谷氨酰胺二肽(30克/天的谷氨酰胺)和300微克硒(在表5中表示为“full can”)；
第5组下面7名患者肠胃外接受与第4组相同剂量的Dipeptiven，经肠接受相同剂量的Intestamin(在表5中表示为“full can”)，但是肠胃外接受另外500微克硒(总计800微克)。
表5.研究干预概述
^″full can ″是500mL Intestamin入组后，尽可能快地开始施用Dipeptiven和肠胃外硒。持续到死亡或到最多21天而退出。最初的复苏后，开始施用Intestamin，持续到营养支持中断、死亡或离开ICU。如果个体患者达到预先确定的安全阈值，则停止任一种研究补充剂。在收集基线数据(第1组)后确定最后的安全性阈值，并分析。如果一组中3/7的患者(42％)达到安全性阈值，则不进行进一步的剂量增加，但是在以前的剂量范围处将评价另外5名患者。所有患者都根据临床实践指南进食；肠进食将按照临床实践开始。
当提供Dipeptiven时，至少在24小时的20小时里经由静脉内中心线连续提供每日剂量。当提供Intestamin时，至少在一天24小时的20小时里经由鼻胃管或鼻肠饲管输注每日体积。与谷氨酰胺/硒剂量无关，所有患者都按照临床实践指南进食；按照临床实践开始并进行肠进食。当患者施用肠进食和Intestamin时，需要2个泵，用管直接连接到进食管的两个口，或利用“Y”形连接器将来自两个泵的管与原位的一个进食管连接起来。关于肠进食和肠研究药物施用相对于高胃残留的延迟，同我们的普通实践一样，在高胃残留体积24小时时或者在高危患者(连续麻醉、收缩(inotropes)或麻痹的患者和那些不能升高其床头的患者)中立即开始动力药和/或采用小肠进食。
后果该研究的最主要后果是序贯器官衰竭评价(SOFA得分)改变(delta)。第二个后果是谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、TBARS、IL-18、血清化学(BUN、AST、ALT、GGT、氨和血浆氨基酸和二肽水平)、肠营养耐受、机械通气持续时间，入院时间，和28天死亡率。
多器官功能障碍被认为是重症患者死亡前最后的共同途径。每种器官(呼吸、肾等)可以分开考虑或综合起来考虑，使用评分系统，如序贯器官衰竭评价(SOFA；见表6)。
表6.SOFA得分系统的总结
a肾上腺素能药物施用至少1小时(剂量以μg/kg·min表示)在入组时(开始研究干预之前)和之后在ICU中每日，测定每日参数，以计算每个器官系统的基线、每日、总SOFA和SOFA的改变，以及综合(白细胞计数，血清肌酐，动脉血气，吸入氧分离，血压，血管加压药的使用，尿输出和格拉斯哥昏迷评分)。根据在对照组中观察到何种改变，建立与器官功能障碍有关的停止原则，如果满足该原则，研究患者将取消研究干预。根据对照组建立如下的终止原则关于综合SOFA得分，2天或更多天SOFA由基线增加＞3，并且不是由于基础疾病引起的。肾衰竭的发展和/或开始透析不认为是终止研究干预的标准。取消临床干预的所有患者仍然每日评价其器官功能障碍(或消除)的进展。
除了以上指出的测定外，当临床上可以时，监测肝功能检测的常规测定指标(AST，ALT，GGT)和血液尿素氮。每日从常规临床实践抽取的血液中检测胆红素和CRP。对于第2、3、4组，在基线时从研究患者中抽取14ml血液，在星期一、三、五抽取12ml血液，而在研究方案中，在停用Dipeptiven和/或Intestamin12小时后抽取，在研究方案中每周两次(星期二和星期四)抽取2ml血液。处理该血液，贮存，并送至实验室检测血浆氨、氨基酸和二肽水平，以及其它标记物，包括谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和T-BARS。最后，评价患者的肠营养耐受，机械通气持续时间，入院时间，和28天死亡率。
样品大小和持续时间作为阴性对照的预期组中的30名患者和预期加入剂量范围研究的28名患者来自KGH，6个月。
显著性在该剂量研究中测试的治疗策略说明了谷氨酰胺和抗氧化剂的需要的剂量和持续时间。可以进一步利用这些结果通知重症患者进行谷氨酰胺和抗氧化剂补充的大的、多中心的、III期随机化试验。
结果58名重症患者在两年期间加入，接受剂量逐渐增加的谷氨酰胺和抗氧化剂(干预概述见表5)。测定第1-5组的各种器官系统(心血管(CVS)；中枢神经系统(GNS)；凝血系统；肾；肝；呼吸(P/F比))的日SOFA得分。SOFA得分的降低指示改善。图1A至1E分别示出了第1-5组的平均日SOFA得分。
图2A至2E分别示出了第1-5组个体患者的总日SOFA得分的图。图2F中编绘的回归线显示第1-5组的日综合SOFA得分相似，并且在整个研究干预中遵循类似的下降趋势表明对第2-5组施用的高剂量的谷氨酰胺和抗氧化剂无毒性，并且对器官功能没有副作用。第2组所示的SOFA得分的增加(见图2B中第6天至第10天的范围)是由于7名患者中的2名在死亡前的SOFA得分显著升高所致。发现这两名患者的死亡和SOFA得分的升高是由于基础疾病所致，与研究干预无关。
由于谷氨酰胺是氮供体，高剂量的谷氨酰胺预期可使尿素和氨升高至不希望的水平。尿素和氨水平的测定显示略微而不显著的提高。如所预期的，硒水平显著升高，特别是在第5组中。但是，这些化合物水平的升高不会不利地影响肾功能，如图8中稳定的肌酐水平和图1A至E中降低的SOFA得分所示。
图3至7示出了研究干预对红细胞中谷胱甘肽(GSH)含量、氧化应激标记(TBARS)、线粒体功能指标(mtDNA/nDNA)的影响。
图3示出了第2组(图3A)、第3组(图3B)、第4组(图3C)和第5组(图3D)患者红细胞中谷胱甘肽(GSH)含量的图，以较大的点示出了回归线。第2组的线性回归线证明GSH水平降低，P值具有显著性(P＝0.0336)。其它第3-5组都不显示这种类型的显著性降低。该结果暗示接受较大抗氧化剂补充的组中GSH水平较高地保持。
图4示出了第2组(图4A)、第3组(图4B)、第4组(图4C)和第5组(图4D)患者中硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)的血浆浓度的图。用TBARS分析作为氧化应激的标记。第2-4组TBARS水平的线性回归线没有达到显著性的P值。但是，第5组的TBARS线性回归线显示下降的斜率，达到显著性(P＝0.0278)，暗示较高的抗氧化剂补充可以改善氧化应激的消除。
图5示出了第2组(图5A)、第3组(图5B)、第4组(图5C)和第5组(图5D)患者的线粒体DNA和核DNA水平之比(mtDNA/nDNA)的图。mtDNA/nDNA是线粒体功能的测定指标。第3、5组的线性回归线显示在治疗过程中线粒体功能改善，两条回归线都显示显著性的P值(分别为P＜0.0001和P＝0.0280)。此外，在单张图(图5E)上对第2-5组的线性回归线的编绘也达到了显著性(P＝0.0012)。
图6示出了被归类为“存活的”或“死亡的”个体患者的mtDNA/nDNA比的图，并以较大的点示出了回归线。该结果表明改善的线粒体功能显然与存活率有关，因为“存活的”或“死亡的”患者的线性回归线达到显著性(P＝0.04)。
图7示出了被归类为第2组患者或第3、4、5组患者的个体患者的mtDNA/nDNA比的图，并以较大的点示出了回归线。另外，线性回归线达到显著性(P＝0.033)。该结果表明第3、4、5组中的每一组都证明与第2组相比线粒体功能显著改善，提示抗氧化剂和谷氨酰胺补充能够改善线粒体功能。
这些附图中的数据表明逐渐增加的谷氨酰胺和抗氧化剂剂量的效果是改善的线粒体功能，较高的氧化应激标记物的减少，较高的谷胱甘肽保存，对器官功能没有明显副作用。此外，如同IL-18的稳定水平所说明的(数据未示出)，炎症细胞因子没有恶化。
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已经参照一个或多个实施方案描述了本发明。但是本领域技术人员应当清楚，在不背离如权利要求书限定的本发明范围的情况下可以进行大量的变化和修改。
权利要求
1.一种组合物，包含每升溶液大约35至大约380克作为短链肽提供的谷氨酰胺，和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克的维生素E，和浓度为每升大约20至大约4000毫克的β-胡萝卜素。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述抗氧化剂是浓度为每升大约1000至大约4000微克的硒。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述谷氨酰胺的浓度为每升溶液大约50至大约150克。
4.根据权利要求2的组合物，其中不含脂质或碳水化合物。
5.含有权利要求1所述的组合物、总体积为大约50至大约1000毫升的单位剂量形式。
6.根据权利要求5的单位剂量形式，其中所述抗氧化剂是浓度为每升大约1000至大约4000微克的硒。
7.根据权利要求5的单位剂量形式，其中所述谷氨酰胺的浓度为每升溶液大约50至大约150克。
8.根据权利要求5的单位剂量形式，其中所述总体积为大约50至大约500毫升。
9.一种治疗重症患者的方法，包括给需要这种治疗的重症患者肠胃外施用权利要求1所述的组合物。
10.根据权利要求9的方法，其中以大约0.3g谷氨酰胺/kg体重至大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
11.根据权利要求9的方法，其中所述抗氧化剂是硒，并且以大约400至大约2000微克的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
12.一种治疗重症患者的方法，包括给需要这种治疗的重症患者肠胃外施用权利要求4所述的组合物。
13.根据权利要求12的方法，其中以大约0.3g谷氨酰胺/kg体重至大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
14.根据权利要求12的方法，其中所述抗氧化剂是硒，并且以大约400至大约2000微克的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
15.一种改善线粒体功能的方法，包括给需要这种治疗的患者肠胃外施用权利要求1所述的组合物。
16.根据权利要求15的方法，其中以大约0.3g谷氨酰胺/kg体重至大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
17.根据权利要求15的方法，其中所述抗氧化剂是硒，并且以大约400至大约2000微克的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
18.一种改善线粒体功能的方法，包括给需要这种治疗的患者肠胃外施用权利要求4所述的组合物。
19.根据权利要求18的方法，其中以大约0.3g谷氨酰胺/kg体重至大约0.9g谷氨酰胺/kg体重的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
20.根据权利要求18的方法，其中所述抗氧化剂是硒，并且以大约400至大约2000微克的每日剂量给所述患者施用所述组合物。
21.根据权利要求1的组合物，其中给重症患者肠胃外施用所述组合物。
22.根据权利要求4的组合物，其中给重症患者肠胃外施用所述组合物。
23.根据权利要求1的组合物，其中为了改善患者的线粒体功能而肠胃外施用所述组合物。
24.根据权利要求4的组合物，其中为了改善患者的线粒体功能而肠胃外施用所述组合物。
25.根据权利要求5的单位剂量形式，其中给重症患者肠胃外施用所述组合物。
26.根据权利要求5的单位剂量形式，其中为了改善患者的线粒体功能而肠胃外施用所述组合物。
27.一种联合药物，包括每升溶液大约35至大约380克作为短链肽提供的谷氨酰胺，和抗氧化剂，该抗氧化剂选自浓度为每升大约400至大约10000微克的硒，浓度为每升大约1000至大约20000毫克的维生素C，浓度为每升大约20至大约800毫克的锌，浓度为每升大约500至大约12000毫克的维生素E，和浓度为每升大约20至大约4000毫克的β-胡萝卜素。
28.根据权利要求27的联合药物，其中所述抗氧化剂是浓度为每升大约1000至大约4000微克的硒。
29.根据权利要求27的联合药物，其中所述谷氨酰胺的浓度为每升溶液大约50至大约150克。
30.根据权利要求28的联合药物，其中不含脂质或碳水化合物。
31.一种治疗重症患者的方法，包括给需要这种治疗的重症患者肠胃外施用权利要求27所述的联合药物。
32.一种治疗重症患者的方法，包括给需要这种治疗的重症患者肠胃外施用权利要求30所述的联合药物。
33.一种改善线粒体功能的方法，包括给需要这种治疗的患者肠胃外施用权利要求27所述的联合药物。
34.一种改善线粒体功能的方法，包括给需要这种治疗的患者肠胃外施用权利要求30所述的联合药物。
35.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述谷氨酰胺和所述抗氧化剂同时施用。
36.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述谷氨酰胺和所述抗氧化剂分别施用。
全文摘要
本发明可以总结如下。给重症患者肠胃外施用的或者用于改善线粒体功能的联合药物。该联合药物包括在临床上有效的足够浓度的谷氨酰胺前体分子和抗氧化剂。该联合药物可以在不存在脂质和碳水化合物的条件下制备。该联合药物可以小量制备，从而有利于体积受限的患者。也提供了含有该联合药物的组合物或单位剂量形式和施用该联合药物、组合物或单位剂量形式的方法。
文档编号A61K31/015GK101084003SQ200580044021
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月21日 优先权日2004年12月21日
发明者D·K·海兰德 申请人:重症救护联络公司