用于抑制细菌芽孢的非抗菌四环素剂型的应用的制作方法

专利名称：用于抑制细菌芽孢的非抗菌四环素剂型的应用的制作方法
技术领域：
本申请要求于2005年7月15日提交的美国专利申请序列号 11/182,500和2005年12月23日提交的美国专利申请序列号 11/317,635的优先权，将其说明书全文结合于此作为参考。
背景技术：
一些种类的病原和非病原细菌具有为响应例^!c营养i夹乏之类 的不利环境条件而形成芽孢的能力。这样的芽孢是稳定的，并且高 度耐热、耐化学试剂和耐千燥。
细菌芽孢通常保持代谢惰性(metabolically inert)直到它们遇 到适合芽孢萌发形成营养细胞的环境。然后细菌的生长型进行生长 和繁殖。通常是芽孢形成的病原菌的生长型引起哺乳动物的疾病 (例如，炭疽热)。
通常，对已经或者在未来可能被细菌芽孢感染的，或者具有活 性感染的人给予的传统药物治疗(例如，抗生素)是通过抑制细菌 的生长型起作用。因此，在传统药物治疗能抑制细菌的生长或者杀 死细菌之前，人体中一定存在着活性生长型。
但是， 一旦营养细胞出现，即开始产生有毒分子。营养细胞产 生的毒素是造成哺乳动物的致命性和/或致病的主要原因。化合物四环素是指四环素类、四环素化合物、四环素右f生物等 的一类抗生素4匕合物中的一员。化合物四环素表^见出以下的通常结 构
CONH2
结构A
四3不素的3不4亥(ring nucleus)的编号方式^ 口下:
结构B
四环素，以及土霉素和金霉素衍生物存在于自然界，并且是熟 知的抗生素。尽管必须保留某些元素，^旦是可以》f饰天然的四环素 而不丧失它们的抗生特性。Mitscher已经在The Chemistry of Tetracyclines, Chapter 6, Marcel Dekker, Publishers, New York (1978) 中对可以和不可以在四环素的基本结构进行的》务饰进行了综述。据 Mitscher所说，可以修饰四环素环体系5-9位的取代基而不会完全 丧失抗生特性。
但是，对于基本环体系的改变或者置换4和10-12位的取代基 通常导致合成的四环素具有非常小的或者实际上没有抗孩t生物活
棚
O
、、、
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H皿性。化学修饰的非抗菌四环素(下文中的COL)的一些例子为4-去二曱胺四环素、4-去二甲胺生环素(6-去甲-6-去氧-4-去二甲胺四环 素)、4-去二曱胺米诺环素(7-二甲胺-6-去曱-6-去氧-4_去二甲胺四环 素)和4-去二曱胺强力霉素(5-羟基-6-去氧-4-去二甲胺四环素)。
除了它们的抗孩史生物特性，四环素还—皮纟皮露具有一些其它的用 途。例如，还已知四环素通过非抗生机制来抑制哺乳动物(包括人 类)细胞和组织产生的"交原质^皮坏酶的活性。这样的酶包括基质金 属蛋白酶类(MMP)，其包看舌月交原酶类(MMP-1、 MMP-8 一口 MMP-13 )、白明月交酶类(MMP-2和MMP-9)和其它酶类(例力口 MMP-12、 MMP-14)。参见Golub等，J.尸e"o^ "Z. W" 20:12-23 (1985); Golub等，Cr,Y. 6>ra/S/o/. Me^ 2:297- 322 (1991);美国
专利第4,666,897号、第4,704,383号、第4,935,411号、第4,935,412 号。还已知四环素抑制哺乳动物骨格肌中的损一€和蛋白质降解(美 国专利第5,045,538号)，抑制可诱导的NO合酶(美国专利第 6,043,231号和第5,523,297号)和磷脂酶A2 (美国专利第5,789,395 号和第5,919,775号)并且提高哺乳动物细胞中IL-10的产生。这些 特性-使四环素可用于治疗许多疾病。
一些出版物涉及四环素在治疗与能够形成芽孢的细菌的传染 相关的病症上的用途。例如，于2004年1月14日7>开的美国专利 申请/>开第2004/0014731号4皮露了将四环素给药于哺乳动物从而 保护和/或治疗哺乳动物的与产生外毒素的细菌相关的病症。在美国 公开的专利申请第2004/0014731号中披露的这样的细菌的一个例 子为炭疽芽胞杆菌(Sac///i ""Amc/s )(即，引起炭疽热的细菌)。
但是，只有细菌的生长型产生外毒素。因此，在公开的美国专 利申讳-7>开第2004/0014731号中没有4皮露或者暗示抑制芽；包的萌 发。Altbo腿等人(/"/Wow a"d/m扁",'(y, 2002, 70:6231-624 l)检测 了四环素对鼻内感染炭疽芽；包一干菌，Amc,;O芽^包的月豕鼠的作
用。Altboum等人所披露的实验中的四环素以抗生素剂量给药于感 染后的豚鼠。作者l艮道，14天的四环素治疗防止了治疗中^皮感染动 物的死亡。但是， 一旦终止四环素治疗，感染炭疽芽孢杆菌(及 aw /zrac,; )的Vollum菌4木的8只动物1"义有2只存活，感染ATCC 6605 菌抹的9只动物仅有1只存活。
Natalizi等人(^""c/o,7c"， 1966, 4:218-229 )体外才企测了 土霉素 和其枯草芽孢杆菌孢子萌发的影响。作者推断土霉素 在芽孢的起始阶段(例如，萌发)没有作用。
因此，存在抑制细菌芽孢变成具有感染性的营养细胞的需要。

发明内容
已经发现通过本发明可以实现这些目'标和其它目标，在一个具 体实施方式中，本发明提供了一种用于在需要细菌芽孢的哺乳动物 中抑制细菌芽孢变成具有感染性的营养细胞的方法。该方法包含将 有效量的非抗菌四环素剂型(或制剂)给药于哺乳动物。
在另夕l、一个具体实施方式
中，本发明提供了一种用于在需要细 菌芽孢的哺乳动物中抑制细菌芽孢长出的方法。该方法包含将有效 量的非抗菌四环素剂型(或制剂)给药于哺乳动物。
抑制细菌芽孢
本发明涉及在需要细菌芽孢的哺乳动物中抑制细菌芽孢变成 具有感染性的营养细^^的方法。该方法包含将有效量的非抗菌四环 素剂型给药于哺乳动物。细菌芽3包通过经过多个阶,殳，如萌发和长出，可以变成具有感 染性的营养细胞。术语"萌发"表示芽孢外被的降解。本文中所用
的"长出"表示细菌从芽孢外一皮脱离(escape )。关于细菌芽孢的萌 发阶革爻的综述，尤其参见Setlow, Cwr. Op/", 71//cw&'o/, 2003, 6:550-556。
本发明不限于细菌芽《包在变成感染性细力包的过程中的<壬4可特 定阶段的抑制。更准确地说，本发明涉及抑制细菌芽孢变成感染性 的营养细;3包。因此，非抗菌四环素剂型可以抑制在变成感染性的营 养细胞中的细菌芽孢的任何特定阶段。
术语"感染性营养细胞"是产生毒素并且造成哺乳动物的疾病 的细菌细力包的形式。这样的细力包可以形成芽3包并且在其感染性营养 状态下产生外毒素。这样的细菌的例子包括芽孢杆菌属和梭菌属。 属于芽孢杆菌属的细菌的例子包括炭疽芽孢杆菌(Sac/〃w awArac/s )、 #古草芽孑包才干菌(Soc/〃ws sm6"//^ )、错^犬芽孑包才干菌(Sac/〃"5 cerews )。 属于才炎菌属的纟田菌的1"列子包4舌肉毒冲炎菌(C7oW〃'^ww Z o/w/z'"wm )、 产气荚月莫才炎菌 (C7os Wc//'mw / e;yH"gem1 )、 石皮4另风才发菌
)、？艮难斗炎菌(C/oWnWww c/,，"7e)、诺氏才炎菌 (C7cxstn'(i/wm "ov_y/)、;容iSJ只才炎菌 (C7c^str/tZ/ww /7/sZo/j^/cmw ) ,口败 毒梭菌 (C7os/WWww se/ 〃cww )。
根据本发明，如果细菌芽孢分化为感染性营养细胞的分化率被 降低至少约10%,优选被降低至少约25%,更加优选被降低至少约 50%，甚至更加优选被降低至少约75%,则认为细菌芽孢被抑制变 成感染性的营养细胞。最佳地，四环素剂型完全抑制细菌芽《包变成 感染性营养细胞。
在一个具体实施方式
中，非抗菌四环素剂型抑制细菌芽孢的萌 发。如果芽孢的萌发率被降低至少约10%,优选至少约25%，更加
ii优选至少约50%，并且甚至更加优选至少约75%，则认为细菌芽孢
的萌发一皮抑制。最佳地，四环素剂型完全抑制细菌芽孢的萌发。 在另一个具体实施方式
中，非抗菌四环素剂型抑制细菌芽3包的
长出。如果芽孢的长出率被降低至少约10%,优选至少约25%，更 加优选至少约50。/。，并且甚至更加伊二选至少约75%,则i人为细菌芽 孢长出一皮抑制。最佳地，四环素剂型完全抑制细菌芽孢的长出。
任何哺乳动物都可以受益于本发明的方法。合适的哺乳动物包 4舌人类、农场动物、家养动物、实-险室动物等。农场动物的一些例 子包括母牛、猪、马、山羊等。家养动物的一些例子包括狗、猫等。 实验室动物的一些例子包括大鼠、小鼠、兔、豚鼠等。
在一个具体实施方式
中，需要抑制细菌芽孢变成感染性营养细 胞、抑制细菌芽孢萌发或者抑制萌发的芽孢长出的哺乳动物包括具 有产生与感染性细菌营养细"包相关的疾病或病症的风险的哺乳动 物。具有产生与感染性细菌营养细力包相关的疾病或病症的风险的哺 乳动物包括易于、 一皮怀疑已经或者已经暴露于细菌芽孢的哺乳动 物。暴露于细菌芽孢可能是无心的或者故意的，例如由于生物恐怖 活动。这样的哺乳动物通常为人类，并且包4舌，例如军事人员、处 理动物皮毛的人员、在特别易感染区域生活的人员、治疗或者治疗 过感染的人或动物的卫生〗呆1"建专业人员，以及4妾触、或者存在细菌 芽孢测试呈阳性的邻近区域的人员。通常，易于、怀疑已经或者已 经暴露于细菌芽孢的哺乳动物都不知道已经感染上细菌芽孢。
在另外一个具体实施方式
中，需要抑制细菌芽孢变成感染性营 养细胞、抑制细菌芽孢萌发或者抑制萌发的芽孢长出的哺乳动物是 已知已经感染上能够变成感染性营养细胞的细菌芽孢的哺乳动物。非抗菌四环素剂型可以在炭疽热中的外毒素的毒性水平，例如 致死因素，出现前的任何时间被给药于哺乳动物。优选地，在怀疑 暴露于或者已知感染了细菌芽孢之后，尽可能快地进行非抗菌四环 素剂型的给药。
例如，在怀疑暴露于或者已知感染了细菌芽孢之后，在约一个 月内，优选在约两周内，更加优选在一周内，甚至更加优选在两天 内，然而甚至更加优选在一天内，并且最优选在十二个小时内进4亍 非抗菌四环素剂型的给药。
对于易于暴露于细菌芽孢的哺乳动物，在可能暴露于细菌芽孢 之前的某一时间进行非抗菌四环素剂型的》会药，其中在发生可能的 暴露时候四环素剂型达到足够的四环素化合物的血浆水平从而抑 制细菌芽孢变成感染性营养细胞。例如，可能暴露于细菌芽孢之前 达到约一个月，优选达到约一周，更加优选达到约一天，甚至更加 优选达到约12个小时，甚至更加优选到达约6个小时，并且最优 选在1个小时内进行非抗菌四环素剂型的给药。
非抗菌四环素剂型(或制剂)
在本"i兌明书中，非抗菌四环素剂型(或制剂)包含抗菌四环素 化合物、非抗菌四环素化合物或者它的药物可接受盐的低于抗菌剂 量(或亚4元菌剂量，sub-antibacterial dose )。
任何抗菌四环素化合物都可以用在本发明的方法中。抗菌四环 素化合物的一些例子包括强力霉素、二曱胺四环素、四环素、土霉 素、氯四环霉素、地美环素、赖氨四环素。优选强力霉素以它的盐 酸盐或者水合物，优选一水合物进行给药。
非抗菌四环素化合物在结构上与抗菌四环素相关，〗旦是它们的 抗菌活性通过化学改性已一皮基本上消除或者完全消除。例如，非抗菌四环素化合物的抗菌活性比强力霉素的抗菌活性低至少约两倍， 优选至少约10倍，甚至更加优选至少约二十五倍。也就是"i兌，非 抗菌四环素化合物以与强力霉素同等的浓度不能产生与强力霉素 同等的抗菌活性。
子包4舌2003年10月28日出片反并属于CollaGenex Pharmaceuticals, Inc的美国专利第6,638,922号中一4殳地或者具体披露的那些化合 物。将美国专利第6,638,922号中4皮露的四环素化合物结合于本文 作为参考。
非抗菌四环素化合物(COL)的特定实例包括4-去(二曱胺)四 环素(COL-1)、四环素腈(COL-2)、 6-去甲-6-去氧-4-去(二曱胺)四 环素(COL-3) 、 9-氨基-6- 二乙基-6-去氧-4-去二曱胺四环素 (COL-308)、 7-氯-4-去(二甲胺)四环素(COL-4)、四环素吡唾 (COL-5)、 4-羟基-4-去(二甲胺)四环素(COL-6)、 4-去(二曱胺)-12a-去氧四环素(COL-7)、 6-去氧-5a-羟基4-去(二甲胺)四环素(COL-8)、 4-去(二曱胺)-12a-去氧去水四环素(COL-9)和4-去(二曱胺)米诺环素 (COL-10)。
四环素化合物可从自然界分离，或者通过本领域已知的任何方 法进行制备。例如，尽管必须保留某些结构元素，仍可以改性天然 四环素而不丧失它们的#元菌。Mitscher已经在77ze C/zew/5 r_y o/ re rac_yc//"es, Chapter 6, Marcel Dekker, Publishers, New York (1978) 中对可以和不可以在四环素的基本结构进行的^奮饰进行了综述。据 Mitscher所述，可以小f改四环素环体系的5-9 ^立的耳又^f戈基而不会完 全失去抗生特性。但是，对于基本环体系的改变或者替换1-4位和 10-12位i 四环素。术语"药物可接受盐"是指由四环素化合物和酸或石咸制备的耐 受性良好、无毒的盐。酸可以为抗菌四环素4t合物或非抗菌四环素 化合物的无机酸或者有机酸。无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硝 酸、氲》典酸、-克酸和-粦酸。有才几酸的例子包括歡酸和^黄酸。有才几酸 的基团可以为脂肪族的或者芳香族的。有机酸的 一些例子包括甲 酸、乙酸、苯乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、葡(萄)净唐醛酸、马来 酸、糠酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、苯乙酸、扁
冲兆酸、双羟萘酸(朴酸)、曱石黄酸、乙石黄酸、泛酸(panthenoic acid )、 苯磺酸、硬脂酸、对氨基苯磺酸、褐藻酸、酒石酸、柠檬酸、葡萄 糖酸、古洛糖酸、芳石黄酸和半乳糖醛酸。合适的有积J咸可以选自， 例如N，N-二千基乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙(撑) 二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。
本说明书的全文中，通过最高量和最低量来确定参数。每个最 低量与每个最高量结合从而确定范围。
剂量
根据本发明，包含抗菌四环素化合物的非抗菌四环素剂型以低 于抗菌的量进行给药。抗菌四环素化合物的低于抗菌的量为导致(i) 对于其目的有效的，但是(ii)其不具有，或者大体没有抗菌的治 疗活性的四环素血浆或者血清浓度的任意量。在一个具体实施方式
中，该目的为抑制细菌芽孢变成感染性营养细胞。在另一个具体实 施方式中，该目的为抑制细菌芽孢的萌发。在另一个具体实施方式
中，该目的为抑制细菌芽孢的长出。
实际上不具有抗菌活性的抗菌四环素化合物的浓度为不能显 著抑制细菌生长的剂量的任何浓度。也就是说，从临床的观点看， 微生物学家不能认为细菌的生长被抑制。将四环素化合物的抗菌活性进行量化的 一 个方法是通过测量 被称为最小抑制浓度(MIC),其对于本领域技术人员是已知的。
MIC是体外抑制细菌特定菌株的生长的最小四环素浓度。使用 标准程序来确定MIC值。标准程序为，例如，基于稀禾奪法(肉汤或 者琼脂)，或者类似方法，使用接种物和四环素粉末的标准浓度。 例如，参见美国临床实-验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards ) 的 Pe/^ r附"wce 6V"wJ"ra(y 》r
S"/7/ /e/膨w/, NCCLS Document M100-Sll， Vol. 21， No. 1， NCCLS， Wayne, PA， January, 2001 。
为了抑制细菌菌株在体内的生长，四环素化合物所达到的血浆 或血清浓度要高于对于该菌抹的MIC值。血浆或血清浓度是指在恒 稳态取得的个体的血液样品中测量到的四环素化合物的浓度。通常 在服药后5到7个终半衰期达到恒稳态。不同四环素化合物的半衰 期在几小时到几天间变4匕。
在本发明的方法中，抗菌四环素化合物以其有效量进行给药， 如上所述，并且该量4吏血浆或者血清浓度显著^氏于普遍存在 (commonly-occuring )的纟田菌的MIC。这才羊的量4皮^人为不具有，或 者基本不具有抗菌活性。普遍存在的、对四环素每文感的细菌的例子 有大肠一干菌(例如ATCC 25922和35218 )、'淋病奈瑟氏5求菌(例如 ATCC 49226)、金黄色葡萄J求菌(例如ATCC 29213和43300 )和肺 炎链球菌(例如ATCC 49619)。
例如，在本发明中，抗菌四环素化合物以其导致血浆或者血清 浓度低于以上提到的普遍存在的细菌的MIC值的80%、 75% 、 70% 、 65%、 60%、 55%、 50%、 45%、 40%、 35%、 30%、 25%、 20%、 15%、10%、5%、 1%或者0.5%的量进行给药。普通4支术人员可以容易的确定特定的抗菌四环素化合物的量进行给药从而达到 这才羊的浓度。
例如，强力霉素以导致最小恒稳、态的大约为0.1 (ig/ml， 0.2 fig/ml，或0.3 luig/ml的血浆或者血清浓度，以及最大恒稳态的大约为 0.7 pg/ml， 0.8 pg/ml，或0.9 pg/m的血浆或者血清浓度的量进行给药。
抗菌四环素^b合物的^f氐于抗菌量还可以通过日剂量来表示。抗 菌四环素化合物的日剂量是足够产生有效的、以上所述的低于抗菌 血浆或者血清浓度的任何量。这样的剂量可以，例如，通过最低抗 菌日剂量的百分比来表示。
普通纟支术人员知道，或者能够常规J也确定抗菌四环素^匕合物的 最低抗菌日剂量。对于本发明的方法，抗菌四环素化合物的合适的
低于抗菌剂量的例子包括低于最低抗菌剂量的大约80%、 75%、 70%、 65%、 60%、 55%、 50%、 45%、 40%、 35%、 30%、 25%、 20%、 15%、10%、 5%、1%和0.5%。
抗菌四环素化合物的非抗菌口月良日剂量的一些例子包括大约 20 mg/—天两次的强力霉素；大约38 mg的米i若环素， 一天一次、 两次、三次或四次；以及大约60 mg的四环素，一天一次、两次、 三次或四次。
只要给药量能够抑制细菌芽孢变为感染性营养细胞，就没有抗 菌四环素^b合物的必需的最〗氐有凌丈量。例如，当该量表示为血浆或
者血清浓度MIC的百分比时，合适的最低血浆或者血清浓度包括血 浆或者血清浓度MIC的大约0.1%、 0.5%、 0.8%和1%。当该量 表示为最低实际血浆或者血清浓度时，合适的实际血浆或者血清浓 度包括大约0.01 pg/ml、 0.05 pg/ml、 0.1 jag/ml、 0.15 pg/ml、 0.2
17昭/ml、 0.25 (ig/ml、 0.3 |ag/ml、 0.35 |ig/ml、 0.4 pg/ml、 0.45吗/ml、 0.5 (ig/ml、 0.55 yg/ml、 0.6jag/ml、 0.65 fig/ml、 0.7 pg/ml、 0.75 )ig/ml、 0.8 (ag/ml、 0.85 pg/ml、 0.9 |ag/ml、 0.95 (ig/ml和1.0 (ig/ml。 当剂量表示为最低抗菌日剂量的百分比时，该百分比为最低抗菌剂 量的大约0.1%、 0.2%、 0.5%、 1%、 1.5%和2%。
在一个具体实施方式
中，任何形式的强力霉素(例如强力霉素 盐类，如盐酸强力霉素；和强力霉素水合物，如一水强力霉素)以， 或者相当于，每日约10毫克到约60毫克的强力霉素的量进行给药， 以保持人类血浆中的浓度低于MIC值。
在一个特别优选的具体实施方式
中，强力霉素、强力霉素盐类 或者强力霉素水合物以，或者相当于，每天两次20毫克的强力霉 素的剂量进行给药。这样的剂型(或制剂)由宾西法尼亚州的 Newtown的CollaGenex Pharmaceuticals, Inc. 以商才示Periostat⑧4肖售， 用于治疗牙周病。
非抗菌四环素ib合物不具有，或者基本不具有抗菌活性。因此， 存在降低了的无差别抑制细菌生长的风险，以及产生具有抗生素抗
性细菌的威S办。因此，包含^。上面所讨i仑的COL的非纟元菌四环素
化合物的非抗菌四环素剂型以任意有效剂量进行给药，如果有任何 副作用，其也是可接受的。
例如，以上所提到的COL的合适的最高血浆或者血清浓度包 括达到约10 jig/ml，约20 pg/ml,约30 pg/ml,甚至达到约100 |ag/ml,约200 (ig/ml和约300 ^g/ml。 COL的合适的最高曰剂量包 括约18 mg/kg/天，约40 mg/kg/天，约60 mg/kg/天和约80 mg/kg/ 天。优选的COL为6-去甲-6-去氧-4-去(二曱胺)四环素(COL-3 )。 COL-3适合以达到约200 mg/天，优选约150 mg/天，更加优选约 100 mg/天的剂量，或者以导致血浆或者血清浓度达到约50 (ag/ml、 约40昭/ml,或者约30 (ig/ml的量进行给药。例如，约10mg/天到 约20mg/天的剂量的COL-3产生的人体中的血浆或者血清浓度为约 1.0吗/ml。
没有COL的必需最低有效剂量。 一些COL的代表性的最低血 浆或者血清浓度包4舌，例如，约0.01 |ig/ml、 0.1 |ig/ml、 0.8pg/ml、 和1.0叱/ml。 一些COL的代表性的最低日剂量包括约0.05 mg/天、 约0.1 mg/天、约0.5 mg/天、约1 mg/天、约5 mg/天或者约10 mg/天。
本发明的方法中使用的非抗菌四环素剂型的 一 个优势是其以 避免与高剂量和/或长期给药四环素抗菌剂型相关的副作用的剂量 进行给药。这样的副作用的例子包括产生具抗生素抗性细菌以及真 菌和酵母菌生长过度。为了避免副作用，通常抗生素对人类给药以 约八到十二天为周期，并且通常不超过两周。
地进行给药。例如，非抗菌四环素剂型可以给药至少约三周，优选 至少约六周，更加优选至少约两个月，并且最优选至少约六个月。 最佳地，非抗菌四环素剂型可以给药达至少约一年。
光毒性
优选地，四环素化合物具有^f氏光毒性，或者以产生在光毒性可 接受的血浆水平的量来进行给药。四环素化合物的优选量产生的光 毒性不高于40 mg的总日剂量的强力霉素给药所产生的光毒性。具有j氐光毒性的四环素化合物的例子包括，4旦是不限于，具有 以下通式的四环素卩t合物
OH
OH 0 OH 0 结构K
conr
其中R7、 R8和R9—起考虑，在每种情况下，具有以下含义:
R7
R8
R9
氨基(COL-308 ) 棕榈酸酰胺(COL-311) 二曱胺 (COL-306 )和
R7 H CH3
COM*
OH 0 OH O 结构L
r7 ， p HH
OH Rg
Mi ，，H
oh o oh o
6H| conh2 w
'com-
'h o结构M
结构N
R7
R7 L:H3 、H 、
OH
CONt-fc
OH O OH O
结构O
其中R7、 R8和R9—起考虑，在每种情况下，具有以下含义:
R8
R9
乙酰胺
二曱胺乙醜胺 对宗才闾酸醜^
硝基
氨基
(COL-801 ) (COL-802 ) (COL-803 ) (COL-804 ) (COL-805 )
和
OH 0 OH "0 结构P
CONH2
其中R8和R9 —起考虑，分别是氢和硝基(COL-1002),
给药
21四环素剂型可以通过本领域已知的任〗可方法进^f于纟会药。非抗菌 四环素剂型在特定情况下的实际伊G选量才艮4居 <吏用的特定的四环素 化合物、施用的冲莫式、施用的特定位点和一皮治疗的对象(例如，年 龄、性别、体型、对药物的耐受性等)而有所不同。
非抗菌四环素剂型可以进行全身l合药。出于本i兌明书的目的， "全身用药"表示通过4吏化合物纟皮血流吸收的方法进行对人类的给药。
优选地，非抗菌四环素剂型通过本领域已知的方法进行口服给 药。例如，非抗菌四环素化合物可以以片剂、胶嚢剂、丸剂、含片
剂、酏剂、混悬剂、4唐浆剂、并需米纸嚢剂(wafer )、月交姆剂(chewing gum)等形式给药。
此外，非抗菌四环素剂型还可以通过肠内给药或者肠胃外进行 给药，例如静脉给药、肌肉给药、以注射液或悬浮液进行皮下给药、 腹膜内给药或者直肠给药。还可以鼻内》会药，例如，以鼻内喷雾的 形式；或者经皮主会药，例如，以贴片的形式。
基于上述制药的目的，本发明的方法4吏用的非抗菌四环素剂型 本身可以以所属4页域/人业者所了解的，可选i也具有合适的药物载体 (赋形物)或者赋形剂的药物剂型按配方制造。这种剂型可以根据 传统的化学方法来制造。
在以片剂口服给药的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米 淀粉，并且通常添加润滑剂，如硬脂目臾4美。对于胶嚢剂形式的口服 给药，使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。载体和赋形剂的其他实例 包括奶、糖、特定类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐类、硬脂酸4丐、 滑石、#_物脂肪或者^1物油、^f对脂和乙二醇。当水混悬剂用于口服给药时，通常添加乳化剂和/或悬浮剂。另 外，可以在口力l成分中添加甜P木剂和/或调P未剂。
对于肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内施用，可以采用非抗菌四 环素剂型的消毒溶液，并且该溶液的pH值可进4亍适当地调整和緩 冲。对于静脉内施用，可以控制溶质的总浓度，从而使该剂型等渗。
本发明的非抗菌四环素剂型还可以包含一种或多种药学可4妾 受的其它成分，如明讽、稳定剂、緩冲剂、着色剂、调味剂等等。
本非抗菌四环素剂型可以间隔一定的时间进4亍纟合药。例如，该
四环素剂型可以每天给药1-6次，优选每天1-4次，更加优选每天
两次，并且甚至更加优选每天一次，或者每隔一天一次。
在一个具体实施方式
中，含有任何抗菌四环素化合物或者非抗
菌四环素化合物，如以上l是到的如强力霉素和COL-3的任何上述剂 量的非抗菌四环素剂型可以通过在特定时间_段的控释进行给药，如 24小时的周期。如前面所讨《仑的，经过特定时间-歐的四环素4匕合物 的水平可以通过血浆或者血清浓度来测量。合适的控释剂型包括延 迟、持续和迅速(即瞬间)释放。
例如，强力霉素优选在超过24小时的时间,殳以40毫克的量进 行给药。控释40mg强力霉素，例如，可以被设计为含有30mg强 力霉素用于瞬间释放以及10mg强力霉素用于延迟释放。
药物控释的方法在所属领域中是熟知的，并且在例如转让纟会宾 西';条尼亚州的Newtown的CollaGenex Pharmaceuticals, Inc.的国际专 利申请PCT/US02/10748，以及美国专利第5,567,439;号、第6,838,094 号、第6,863,902号和第6,905,708号中进4亍了4皮露。该非抗菌四环素剂型还可以局部纟合药。所属4页域的普通才支术人 员可以容易地确定用于局部给药的非抗菌四环素剂型的合适剂量。
例如，可以在载体中以达到约25% ( w/w)的量局部纟合药COL而 对人类没有任何毒性。优选的量为约0.1%到约10%。
特定的非抗菌四环素化合物只有有限的生物分布，例如 COL-5。在这种情况下，局部施用是该〗匕合物纟会药的优选方法。
乳剂、软膏剂等等。非抗菌四环素化合物还可以结合进可以直接施 用于例如皮肤的支持基(support base )、基质、组织粘合剂等。
四环素剂型的组合乡会药或者耳关合局部乡会药(coordinated topical) 以及全身给药也在本发明的考虑之下。例如，非吸收的非抗菌四环 素化合物可以局部》合药，而能够〗艮好^皮吸收并且有效i也全身分布的 抗菌或者非抗菌四环素化合物可以进行全身给药。
在一个具体实施方式
中，非抗菌四环素剂型以包含活性组分的 药物组合物进行给药，其中活性组分实质上由抗菌四环素化合物或 者非抗菌四环素化合物以有效达到其目的但是基本没有抗菌活性 的量组成。
具体实施例方式
实施例1:蜡状芽孢杆菌ATCC 10987的萌发
蜡状芽孢杆菌ATCC 10987在CCY培养基中生长(Stewart et al., S/oc/zem. J 198:101-106, 1981)并且才艮据Clements和Moir所述制备 其芽孑包G/ SacfeWo/.， 180:6729-6735， 1998)。相一于显樣吏术显示芽孑包制 剂由折光体组成。其它的测试表明大于95%的芽孢可在7(TC耐热一 个小时。细菌芽孢具有结合营养萌发剂(如次黄苦)的"萌发受体"。 营养萌发剂结合到受体上始于芽孢的早期萌发。早期萌发不产生活
性代谢。
芽孢的萌发在存在和不存在5昭/ml COL-3的条件下进行检 测。将芽孢悬浮在10 mM Tris-HCl (pH 8.0)中达到580 nm的OD值 为1.00，并且将该悬浮液于37。C培养15分钟。
以5mM的次黄苷起始萌发，并且连续监控光密度。给出Y轴 作为580 nm的起始OD值的百分比。每15分钟取样通过相衬显微 术进4亍才企测。芽孑包的明亮期外^L ( phase bright appearance )的损失 与580 nm的OD值的损失相似。OD值的损失和芽孢的明亮期外观 的损失都表明芽孢响应加入的次黄苷而萌发。
本实-睑重复3次。获得实-验之间的一致性结果。
在本实验中，COL-3没有抑制萌发的早期阶段。对于存在和不 存在COL-3的情况下，吸光值的降低率没有显著差异。
实施例2:在存在和不存在COL-3的情况下，革兰氏染色观察
萌发
将悬浮在10 mMTris- HC1 (pH S)中的5 ml的芽孑包(大约5 x 107 CFU每ml)，置于两支试管中并且加热到37°C。在一支试管中，加 入COL-3至终浓度5 pg/ml。另外一支试管只加入等体积的二曱基 亚石风(DMSO)赋形剂(vehicle)。在时间=0时，向每支试管中加入 1.5 ml预热的脑心浸液肉汤，并且将试管涡旋震荡(vortexed)10秒 钟。然后，将试管放回3 7 °C的加热块(heating block )中。
25从时间=0开始，每隔10分钟耳又出0.5 ml并且将其》丈入0.5 ml 的5%曱醛-磷酸盐緩沖盐水中，并且在冰上保持低温。在实验结束 时，所有才羊品以10 xg离心5分4中并弃上清液。
将片剂重新悬浮到0.1 ml的磷酸盐緩沖液中。让这些样品在显 微玻片上变干，然后进行革兰氏染色。在时间-0时，两支试管中的 内容物都是芽孢的形式，因此由此步骤的染色效果差。在时间=20 分钟时，由于芽孢萌发，两支试管中的内容物保留了更多的色素。 还应注意，对照具有大得多的确定的实体(defined bodies )。
在时间=4 0分钟时，对照样品表现出营养细胞的典型杆菌形状， 而暴露于COL-3的芽孢没有表现出进一步的发展。在时间=60分钟 时，对照表现出营养细胞的分裂，但是暴露于COL-3的芽孢没有生长。
使用不同浓度的COL-3重复本实-验。抑制长出的COL-3最低 浓度为1 MgZm。
在实施例1中所描述的实验中，COL-3在萌发的起始阶段不起 作用。在存在和不存在COL-3的情况下，加入5 mM次黄苷导致芽 孢以相同的速率萌发。相衬显微术显示芽孢失去它们的明亮期外观 并且变成暗时期(phase-dark)。实施例2中描述的革兰氏染色研究的 结果还显示在存在和不存在COL-3的情况下早期萌发都发生，但是 长出成为营养细胞则被COL-3所抑制。
权利要求
1. 一种用于抑制需要细菌芽孢的哺乳动物中的细菌芽孢变成感染性营养细胞的方法，所述方法包含将有效量的非抗菌四环素剂型给药于所述哺乳动物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述非抗菌四环素剂型包含 4氐于纟元菌量的纟元菌四环素。
3. 才艮据4又利要求2所述的方法，其中所述抗菌四环素为强力霉素。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述抗菌四环素为米诺环素。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述非抗菌四环素剂型包含 非^元菌四环素。
6. 才艮据冲又利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-3。
7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-308。
8. 才艮据—又利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-311。
9. 才艮据权利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-306。
10. 根据4又利要求5所述的方法，其中所迷非抗菌四环素为COL-801。
11. 根据权利要求5所述的方法，其中所述的非抗菌四环素为 COL-802。
12. 4艮据权利要求5所述的方法，其中所迷非抗菌四环素为 COL-803。
13. 根据权利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-804。
14. 才艮据4又利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL匿805。
15. 4艮据4又利要求5所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-1002。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物具有产生与感 染性营养细胞相关的疾病或病症的风险。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌为杆菌。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌为梭菌。
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述杆菌为炭疽芽胞杆菌 或蜡状芽孢杆菌。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述梭菌为肉毒梭菌、产 气荚膜梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌或溶组织梭菌。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中在被怀疑暴露于细菌芽孢之后进行所述非抗菌四环素剂型的给药。
23. 根据权利要求1所述的方法，其中在得知感染了细菌芽孢之后 进行所述非抗菌四环素剂型的给药。
24. 根据权利要求1所述的方法，其中在可能暴露于细菌芽孢之前 进行所述非抗菌四环素剂型的纟会药。
25. —种用于抑制需要细菌芽孢的哺乳动物中的细菌芽孢长出的 方法，所迷方法包含将有效量的非抗菌四环素剂型给药于所述 哺乳动物。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述非抗菌四环素剂型包 含^氐于抗菌量的抗菌四环素。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述抗菌四环素为强力霉素。
28. 根据权利要求26所述的方法，其中所述抗菌四环素为米诺环素。
29. 根据权利要求25所述的方法，其中所述非抗菌四环素剂型包 含非:阮菌四环素。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-3。
31. 才艮据权利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-308。
32. 根据权利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-311。
33. 才艮据片又利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-306。
34. 根据权利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-801。
35. 才艮据^L利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-802。
36. 才艮据^f又利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-803。
37. 4艮据—又利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-804。
38. 才艮据4又利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-805。
39. 根据权利要求29所述的方法，其中所述非抗菌四环素为 COL-1002。
40. 根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
41. 根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物具有产生与 感染性营养细胞相关的疾病或病症的风险。
42. 根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌为杆菌。
43. 根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌为梭菌。
44. 根据权利要求42所述的方法，其中所述杆菌为炭疽芽胞杆菌 或蜡状芽孢杆菌。
45. 根据权利要求43所述的方法，其中所述梭菌为肉毒梭菌、产 气荚膜梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌或溶组织梭菌。
46. 根据权利要求25所述的方法，其中在被怀疑暴露于细菌芽孢 之后进行所述非抗菌四环素剂型的给药。
47. 根据权利要求25所述的方法，其中在得知感染了细菌芽孢之 后进行所述非抗菌四环素剂型的给药。
48. 根据权利要求25所述的方法，其中在可能暴露于细菌芽孢之 前进4于所述非抗菌四环素剂型的纟合药。
全文摘要
本发明涉及一种用于抑制需要细菌芽孢的哺乳动物中的细菌芽孢变成具有感染性营养细胞的方法。在另一个实施例中，本发明涉及一种用于抑制需要细菌芽孢的哺乳动物中的细菌芽孢长出的方法。该方法包含将有效量的非抗菌四环素剂型给药于哺乳动物。在一个实施例中，非抗菌四环素剂型包含低于抗菌量的抗菌四环素。在另一个实施例中，非抗菌四环素剂型包含非抗菌四环素。
文档编号A61K31/65GK101460177SQ200680025610
公开日2009年6月17日 申请日期2006年7月14日 优先权日2005年7月15日
发明者史蒂芬·G·沃克, 桑福德·R·西蒙, 洛恩·M·戈卢布 申请人:纽约州州立大学研究基金会