专利名称：槐糖脂在制备抗生素药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及槐糖脂在制备抗生素药物中的应用，尤其涉及槐糖脂在制备抑制白色念珠菌或革兰氏阳性菌的抗生素药物中的应用。
背景技术：
近几十年来，滥用抗生素已经成为一个世界性的重大问题。滥用抗生素的危害除了造成药物不良反应和增加治疗费用之外，最主要的是让细菌的耐药性增强，我国已经进入了细菌耐药性的直线上升时期。目前的研究显示，我国的金黄色葡萄球菌耐青霉素比例已经高达90％，肺炎的病菌在社区的标本中耐药比例约20％，而在医院内的标本中这一比例可达到60％。肺炎链球菌已有45％耐青霉素，70％耐红霉素。导致肠道疾病的大肠杆菌有70％耐环丙沙星。抗生素过度的使用使得很多抗生素失去了效果。
一种新的抗生素研制的费用大约需要十几亿美金和10到15年的过程，而使用不当，3到5年病菌就会对这种药物产生耐药性，如果再不遏止这种趋势，那么很快我们将没有对抗细菌等有害微生物的有效武器，很多小病也能致命。因此，对新的抗生素研究，开发，保护是一迫切任务，具有重要意义。
槐糖脂是一种重要的生物表面活性剂，对于它的研究始于二十世纪五、六十年代，其主要是通过微生物发酵获得。与化学合成的表面活性剂相比，槐糖脂具有表面性能优良、环境友好等许多优点。
近年来，国外对于槐糖脂作为临床药物的研究已有了许多文献报道，关于槐糖脂抑菌作用的研究也有提及，但是，根据文献和专利检索，槐糖脂作为抑制白色念珠菌和革兰氏阳性菌类抗生素药物研究与开发未见报道。
发明内容
针对目前临床上滥用抗生素造成的微生物抗药性日益增强的严重问题，以及对新抗生素研究、开发的迫切需求，本发明要解决的问题是提供一种生物表面活性剂槐糖脂在制备抗生素药物中的应用，尤其是槐糖脂在制备抑制白色念珠菌或革兰氏阳性菌的抗生素药物中的应用。
本发明所述槐糖脂在制备抗生素药物中的应用。
上述的槐糖脂在制备抗生素药物中的应用中，所述槐糖脂优选在制备抑制白色念珠菌类抗生素药物中的应用。
其中，所述抗生素药物有效抑菌的终浓度是20～60mg/L，优选20～50mg/L，最优选20～40mg/L。
或者，上述的槐糖脂在制备抗生素药物中的应用中，所述槐糖脂优选在制备抑制革兰氏阳性菌类抗生素药物中的应用。
其中，所述抗生素药物有效抑菌的终浓度是20～100mg/L，优选20～80mg/L，最优选20～50mg/L。
本发明还包括以槐糖脂为有效成分的组合物在制备抗生素药物中的应用。
利用本发明所述槐糖脂加入药学上可接受的辅料或赋形剂可以制成任何一种药剂学上所说的剂型。
以本发明所述槐糖脂为有效成分加入抑菌组分和药学上可接受的辅料或赋形剂组成抑菌的药物组合物，同样也可以制成任何一种药剂学上所说的剂型。
在上述槐糖脂在制备抗生素药物中的应用中，所述槐糖脂在制备抑制白色念珠菌类抗生素药物剂型是口服制剂、栓剂、软膏剂、液体制剂之一。
其中，所述口服制剂优选胶囊、片剂、散剂、口服液、颗粒剂、水丸、滴丸之一；最优选为胶囊剂或片剂；液体制剂优选液体洗剂。
在上述槐糖脂在制备抗生素药物中的应用中，所述槐糖脂在制备抑制革兰氏阳性菌类抗生素药物剂型优选是口服制剂。
其中，所述口服制剂优选胶囊、片剂、散剂、口服液、颗粒剂、水丸、滴丸之一；最优选为胶囊剂或片剂。
上述栓剂、软膏剂、口服给药的药物制剂可以按照本行业已知的方法制备，在制备过程中使用可药用稀释剂，例如黏合剂(如预胶化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素)、填料(例如乳糖、蔗糖、甘露醇等)、润滑剂(例如硬脂酸、聚乙二醇、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素钠)或者润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)、片剂可以按照本行业已知的方法包衣。
为了更好地理解本发明的实质，下面以槐糖脂的药理实验及结果来说明槐糖脂作为抑制白色念珠菌或革兰氏阳性菌类抗生素药物的应用。
槐糖脂的制备(1)菌种选择拟威克酵母变种Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipidCGMCC No.1576；(2)斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.5～2.0％的琼脂，25～35℃条件下，静止培养24～48小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为4～14％的葡萄糖和1～8％的菜籽油的基本无机盐培养基中，25～35℃条件下，振荡培养24～48小时，制得种子液；(4)扩大培养以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于100～1000mL含有质量体积比为4～14％的葡萄糖和1～8％的菜籽油的基本无机盐培养基中，25～35℃条件下，振荡培养96～288小时；(5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以4000～7000转/分钟将所述粘稠物质离心，收集沉淀部分；即为槐糖脂粗提物；(6)分离产物将上述经离心得到的沉淀物中加入其体积量为3～10倍的乙酸乙酯，在25～37℃下，萃取2～8小时；
(7)过滤将上述乙酸乙酯萃取液在25～37℃下，用Whatman No.2滤纸过滤，收集滤渣；(8)洗涤上述步骤(3)得到的滤渣用其体积量为3～10倍的乙酸乙酯在25～37℃下，洗涤2～4次；(9)减压蒸馏洗涤完毕后收集滤渣，在温度50～70℃，压力0.2～0.8Kg/cm2，真空度为0.02～0.08Mpa的条件下进行减压蒸馏，将滤液中的乙酸乙酯蒸发去除；(10)收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在50～100℃，真空度0.02～0.08Mpa条件下，真空干燥12～24小时，制得固体槐糖脂。
白色念珠菌的菌体制备将斜面保存的白色念珠菌取一接种环转接到液体YEPD培养基中，在25～37℃下培养10～20小时，制成菌悬液。
革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌)的菌体制备将斜面保存的革兰氏阳性菌取一接种环转接到液体LB培养基中，在25～37℃下培养10～20小时，制成菌悬液。
白色念珠菌抑菌试验槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。
取槐糖脂母液加到YEPD液体培养基中，使其终浓度为20～60mg/L，取上述白色念珠菌菌悬液0.8mL接种到80mL YEPD液体培养基中，在25～37℃下培养6～24小时，于波长560～620下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。
革兰氏阳性菌抑菌试验槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。
取槐糖脂母液加到LB液体培养基中，使其终浓度为20～100mg/L，取上述革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌)菌悬液0.8mL接种到80mL液体LB培养基中，在25～37℃下培养6～24小时，于波长560～620nm下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。
其中，所述的白色念珠菌抑菌试验中，槐糖脂的终浓度优选是20～50mg/L，培养温度优选是28～32℃，培养时间优选是6～15小时，OD值测定波长为580～600nm。
其中，所述的革兰氏阳性菌抑菌试验中，槐糖脂的终浓度优选是20～80mg/L，培养温度优选是28～32℃，培养时间优选是8～18小时，OD值测定波长为580～600nm。
上述培养基配方是YEPD培养基(g/L)(用于白色念珠菌培养)酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，pH6.5。
LB培养基(g/L)(用于革兰氏阳性菌培养)蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl10，pH7.4。
结果显示极低剂量的槐糖脂在较短的作用时间(＜24小时)对白色念珠菌的生长可以达到完全抑制(见图1)，同时与目前在临床抑制白色念珠菌的效果最好的苦参碱相比，槐糖脂的用量(20mg/L)只是后者用量(20g/L)的1/1000，并且槐糖脂成本也仅是苦参碱的十几分之一。
对革兰氏阳性菌的研究表明，在槐糖脂浓度50mg/L下，槐糖脂可以完全抑制金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌的生长。(见图2，图3)本发明利用拟威克酵母变种发酵产生槐糖脂，具有工艺方法简便、成本低、纯度高的特点。
本发明所述槐糖脂在制备抗生素药物中的应用中，价格低廉，用量少，抑菌效果显著，对人体无任何毒副作用。将其开发为临床外用洗液、软膏剂、栓剂或口服制剂等药物剂型，可以实现有效抑制在临床上极其常见的条件性致病菌白色念珠菌和一些革兰氏阳性菌的生长，甚至在某些方面可全面作为抗生素替代药物，极具诱人的应用前景。
图1槐糖脂对白色念珠菌的抑制曲线显示槐糖脂浓度在20mg/L下，能够完全抑制白色念珠菌的生长。
图2槐糖脂对金黄色葡萄球菌的抑制曲线显示槐糖脂浓度在50mg/L下，能够完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。
图3槐糖脂对蜡状芽孢杆菌的抑制曲线显示槐糖脂浓度在20mg/L下，能够完全抑制蜡状芽孢杆菌的生长。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明。
实施例1槐糖脂的制备(1)菌种选择拟威克酵母变种(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid)CGMCC No.1576(2)斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，25℃条件下，静止培养24小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20mL含有质量体积比为4％的葡萄糖和1％的菜籽油的培养基中，25℃条件下，振荡培养24小时，制得种子液；(4)扩大培养以5％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为1％的菜籽油的培养基中，25℃条件下，振荡培养96小时；(5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以5000转/分钟将上述粘稠物质离心，收集固态部分，即为槐糖脂粗提物。
(6)乙酸乙酯萃取将上述经离心得到的沉淀物中加入其体积量为5倍的乙酸乙酯，在30℃下，萃取4小时。
(7)过滤将上述乙酸乙酯萃取液在30℃下，用Whatman No.2滤纸过滤，收集滤渣。
(8)洗涤上述得到的滤渣用其体积量为5倍的乙酸乙酯在30℃下，洗涤3次。
(9)减压蒸馏洗涤完毕后收集滤渣，在温度70℃，压力0.4kg/cm2，真空度为0.04Mpa的条件下进行减压蒸馏，将滤液中的乙酸乙酯蒸发去除；(10)收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在70℃，真空度0.04Mpa条件下，真空干燥16小时；制得固体槐糖脂。
实施例2槐糖脂的制备(1)菌种选择拟威克酵母变种(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid)CGMCC No.1576(2)斜面培养将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.6％的琼脂，30℃条件下，静止培养36小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50mL含有质量体积比为8％的葡萄糖和3％的菜籽油的培养基中，30℃条件下，振荡培养36小时，制得种子液；(4)扩大培养以7％的体积比的接种量，将种子液接种于500mL含有质量体积比为3％的菜籽油的培养基中，30℃条件下，振荡培养200小时；(5)收集发酵产物将步骤(4)所得的发酵液静置，使其自然沉降，收集沉积在摇瓶底部的浅黄色粘稠液体，之后以6000转/分钟将上述粘稠物质离心，收集固态部分，为槐糖脂粗提物。
(6)分离产物将上述经离心得到的沉淀物中加入其体积量为7倍的乙酸乙酯，在37℃下，萃取6小时。
(7)过滤将上述乙酸乙酯萃取液在37℃下，用Whatman No.2滤纸过滤，收集滤渣。
(8)洗涤上述得到的滤渣用其体积量为7倍的乙酸乙酯在37℃下，洗涤3次。
(9)减压蒸馏洗涤完毕后收集滤渣，在温度70℃，压力0.8kg/cm2，真空度为0.08Mpa的条件下进行减压蒸馏，将滤液中的乙酸乙酯蒸发去除；(10)收集物干燥将上述收集的减压蒸馏残渣，在100℃，真空度0.08Mpa条件下，真空干燥24小时；制得固体槐糖脂。
实施例3槐糖脂作为抑制白色念珠菌的抗生素药物的应用白色念珠菌的菌体制备将斜面保存的白色念珠菌取一接种环转接到液体YEPD培养基中，在25℃下培养20小时，制成菌悬液。
槐糖脂以二甲亚砜溶解制成浓度为5g/L母液，备用。
取槐糖脂母液加到YEPD液体培养基中，使其终浓度为20mg/L，取上述白色念珠菌菌悬液0.8mL接种到80mL YEPD液体培养基中，在25℃下培养24小时，于波长580下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。检测白色念珠菌试验抑菌情况。
实施例4槐糖脂作为抑制白色念珠菌的抗生素药物的应用白色念珠菌的菌体制备将斜面保存的白色念珠菌取一接种环转接到液体YEPD培养基中，在30℃下培养15小时，制成菌悬液。
槐糖脂以二甲亚砜溶解制成浓度为5g/L母液，备用。
取槐糖脂母液加到YEPD液体培养基中，使其终浓度为30mg/L，取上述白色念珠菌菌悬液0.8mL接种到80mL YEPD液体培养基中，在30℃下培养10小时，于波长590下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。检测白色念珠菌试验抑菌情况。
实施例5槐糖脂作为抑制白色念珠菌的抗生素药物的应用白色念珠菌的菌体制备将斜面保存的白色念珠菌取一接种环转接到液体YEPD培养基中，在37℃下培养10小时，制成菌悬液。
槐糖脂以二甲亚砜溶解制成浓度为5g/L母液，备用。
取槐糖脂母液加到YEPD液体培养基中，使其终浓度为50mg/L，取上述白色念珠菌菌悬液0.8mL接种到80mL YEPD液体培养基中，在32℃下培养15小时，于波长600下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。检测白色念珠菌试验抑菌情况。
上述YEPD培养基配方是酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH6.5。
实施例6槐糖脂作为抑制革兰氏阳性菌的抗生素药物的应用金黄色葡萄球菌菌体制备将斜面保存的革兰氏阳性菌取一接种环转接到液体LB培养基中，在25℃下培养20小时，制成菌悬液。
革兰氏阳性菌抑菌试验槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。
取槐糖脂母液加到LB液体培养基中，使其终浓度为20mg/L，取上述革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)菌悬液0.8mL接种到80mL液体LB培养基中，在28℃下培养20小时，于波长580nm下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。检测槐糖脂抑菌情况。
实施例7槐糖脂作为抑制革兰氏阳性菌的抗生素药物的应用蜡状芽孢杆菌菌体制备将斜面保存的革兰氏阳性菌取一接种环转接到液体LB培养基中，在29℃下培养15小时，制成菌悬液。
革兰氏阳性菌抑菌试验槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。
取槐糖脂母液加到LB液体培养基中，使其终浓度为50mg/L，取上述革兰氏阳性菌(蜡状芽孢杆菌)菌悬液0.8mL接种到80mL液体LB培养基中，在30℃下培养12小时，于波长590nm下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。检测槐糖脂抑菌情况。
实施例8槐糖脂作为抑制革兰氏阳性菌的抗生素药物的应用金黄色葡萄球菌菌体制备将斜面保存的革兰氏阳性菌取一接种环转接到液体LB培养基中，在29℃下培养15小时，制成菌悬液。
革兰氏阳性菌抑菌试验槐糖脂以二甲亚砜溶解制成母液，备用。
取槐糖脂母液加到LB液体培养基中，使其终浓度为80mg/L，取上述革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)菌悬液0.8mL接种到80mL液体LB培养基中，在32℃下培养18小时，于波长600nm下测定培养液的OD值，以OD值表示培养液中的菌数作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制抑菌曲线。检测槐糖脂抑菌情况。
上述LB培养基配方是蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.4。
实施例9槐糖脂作为治疗白色念珠菌感染的抗生素药物栓剂的制备取实施例1制取的槐糖脂40g，以每粒栓剂含槐糖脂50mg的混合量，直接溶解于已加热熔化的棕榈油酸甘油酯中，混匀，然后加入预先用肥皂、甘油各1份与90％乙醇5份制成的润滑剂润滑后的栓剂模孔中成形，即得槐糖脂栓剂。每粒栓剂含槐糖脂50mg。
实施例10槐糖脂作为治疗白色念珠菌感染的抗生素药物软膏剂的制备取实施例1制取的槐糖脂40g加入液状石蜡125g加热至80℃，另取甘油50g，羟苯乙酯1g，加蒸馏水至835g，也加热至80℃，然后将油相加入水相中，边加边搅拌至冷，装入塑料软管，每管装入量为25g，即得槐糖脂软膏剂。
实施例11槐糖脂作为治疗白色念珠菌感染的抗生素药物液体洗剂制备取实施例1制取的槐糖脂40g，加入二甲亚砜至1000g，使槐糖脂溶解，装入100mL塑料瓶中，即得。
实施例12槐糖脂作为治疗革兰氏阳性菌感染的抗生素药物口服胶囊剂的制备以重量份(公斤)计，称取槐糖脂7份、赋形剂(淀粉)13份。将槐糖脂与赋形剂按所述重量份混合，干燥，制备成粉状，过筛得细粉，装入明胶硬胶囊，每粒胶囊装入量是0.143g。其中每粒胶囊含槐糖脂0.05g、赋形剂(淀粉)0.093g。
上述胶囊剂服用方法每次2～3粒，每日三次。
实施例13以槐糖脂为有效成分的组合物作为抗生素药物栓剂的制备取实施例1制取的槐糖脂40g和苦参碱100g，以每粒栓剂含槐糖脂50mg，含苦参碱125mg的混合量，直接溶解于己加热熔化的棕榈油酸甘油酯中，混匀。随后加入预先用肥皂、甘油各1份与90％乙醇5份制成的润滑剂润滑后的栓剂模孔中成形，即得栓剂。每粒栓剂含槐糖脂50mg，含苦参碱125mg。
实施例14槐糖脂所作的动物实验取实施例11中制取的作为治疗白色念珠菌感染的槐糖脂抗生素药物液体洗剂用于动物实验。
取小鼠60只，在每只鼠右前肢腋下切开小的创口，接种白色念珠。24h后从伤口处取样进行显微观察，发现有45只小鼠已感染有白色念珠菌。将小鼠分为9组，5组作为处理组，用上述槐糖脂液体制剂每日分三次进行涂擦，另外4组作为阴性对照组，用生理盐水进行相同次数的涂擦。连续给药10天。观察处理组和对照组伤口愈合情况，并分别从处理组和对照组伤口处取样，用培养酵母的YEPD平板进行培养。
从实验结果看，处理组在24h内无菌落出现，在24h到48h之间，5组处理组的平板均只有零星菌落出现，平均菌落数为3。对照组在24h内有大量菌落出现，无法计数。
权利要求
1.槐糖脂在制备抗生素药物中的应用。
2.如权利要求1所述的槐糖脂在制备抗生素药物中的应用，其特征在于，所述槐糖脂在制备抑制白色念珠菌类抗生素药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗生素药物浓度为20～60mg/L。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗生素药物剂型是口服制剂、栓剂、软膏剂、液体制剂之一。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂或片剂。
6.如权利要求1所述的槐糖脂在制备抗生素药物中的应用，其特征在于，所述槐糖脂在制备抑制革兰氏阳性菌类抗生素药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗生素药物浓度为20～100mg/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗生素药物剂型是口服制剂。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂或片剂。
10.以槐糖脂为有效成分的组合物在制备抗生素药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种槐糖脂或以槐糖脂为有效成分的组合物在制备抗生素药物中的应用，特别涉及其在制备抑制白色念珠菌或革兰氏阳性菌类抗生素药物中的应用。本发明利用拟威克酵母变种发酵制备槐糖脂，具有工艺方法简便、成本低、纯度高的特点，并且涉及的槐糖脂或以槐糖脂为有效成分的组合物抑菌效果显著，对人体无任何毒副作用。将其开发为临床外用洗液、软膏剂、栓剂或口服制剂等药物剂型，可以实现有效抑制在临床上极其常见的条件性致病菌白色念珠菌和一些革兰氏阳性菌的生长，甚至在某些方面可全面作为抗生素替代药物，极具诱人的应用前景。
文档编号A61K9/08GK101019875SQ200710013200
公开日2007年8月22日 申请日期2007年1月29日 优先权日2007年1月29日
发明者宋欣, 曲音波, 邵凌健 申请人:山东大学