千里香叶总黄酮及其制备方法及用途的制作方法

专利名称：：千里香叶总黄酮及其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于天然药物化学研究领域。
背景技术：
：千里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]为芸香科九里香属植物，主要产自我国云南、贵州、湖南、广东、广西、福建、台湾等地。千里香与九里香属另外一种药用植物九里香[MurrayaexoticaL.]—起被中华人民共和国药典2005版一部所收载，是九里香药材的原植物之一。到目前为止有人从千里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]叶中共分得5个黄酮类化合物，分别是3，5，6，7，8，3'，4'，5'-八甲氧基黄酮(3，5，6，7，8，3'，4'，5'-octamethoxyflavone)即月桔素(Exotiein);3，5，7，8，3'，4'，5'-七甲氧基黄酮(3，5,7，8,3'，4',5'-h印tamethoxyflavone)即木槿黄素七甲醚(hibiscetinh印tamethylether);3，5，6，7，3'，4'，5'--七甲氧基黄酮(3,5，6，7,3'，4'，5'-h印tamethoxyflavone)(江苏新医学院，中药大辞典，上册，上海人民出版社，1977:44-45);5，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮(5,7，8，3'，4'，5'-hexamethoxyflavone)即版纳九里香素(ba腿murpanisin)(植物学报1984，26(2):184-186)以及5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮(5，7，3'，4'，5'-pentamethoxyflavone)(化学学报1984，42，1308-1311)。
发明内容本发明的目的是提供一种从千里香叶中得到的以新发现的黄酮类化合物为主要成分，具有生物活性的黄酮类化合物的混合物即千里香叶总黄酮，它是一种中药有效部位。其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮中的的两种或两种以上；而且其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5:六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮的含量之和大于50%或者5,7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'_四甲氧基黄酮的含量大于50%。本发明还提供了千里香叶总黄酮的制备方法，其特征在于提供如下步骤获得千里香叶总黄酮(1)千里香叶水煎煮或有机溶剂回流提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，有机溶剂提取液先回收有机溶剂，加水溶解或悬浮后过大孔吸附树脂吸附(2)碱水或低浓度有机溶剂洗脱后水洗至中性(3)有机溶剂解吸(4)洗脱液浓縮，得千里香叶提取物(5)千里香叶提取物用水溶解或悬浮后过聚酰胺柱吸附，有机溶剂洗脱，洗脱液回收溶剂，获得千里香叶总黄酮(6)将千里香叶提取物或千里香叶总黄酮进行柱层析纯化获得纯度更高的九里香叶总黄酮。其中所述的大孔吸附树脂选自AB-8、D4020、DlOl、D102、D103、860021、HP20的一种或一种以上混合物；所述的柱层析选自硅胶、氧化铝、ODS或聚酰胺柱层析的一种或一种以上；碱溶液选自碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物的水溶液。本发明还提供了上述千里香叶总黄酮在制备治疗心肌缺血药物中的用途以及千里香叶总黄酮与医学上可接受的药用辅料组成的药物组合物；其剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射剂。本发明是通过如下技术方案完成的。(1)通过对千里香叶化学成分的提取分离及结构鉴定，从千里香叶中首次发现了5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮以及3-羟基-5，7，4'-三甲氧基黄酮的存在(2)通过提取方法的研究，发明了以5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3'，4'-三甲氧基黄酮为主要成分的千里香叶总黄酮的制备工艺。本制备工艺可以获得上述黄酮类化合物的含量之和在50%至氧基黄酮、5，7，3'，4'，5:五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮的HPLC含量测定方法(4)通过动物实验发现了千里香叶总黄酮的医药用途(5)对以千里香叶总黄酮为活性成分的药物制剂进行了研究，具体如下。1、千里香叶化学成分的提取分离本发明用千里香叶购自云南，经鉴定为芸香科九里香属植物千里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]。将干燥的千里香叶2Kg粉碎后加水煎煮提取3次，加水量分别为30升，24升，20升，煎煮时间分别是2小时，1.5小时，1小时，合并三次提取液。滤液通过大孔吸附树脂柱吸附，水洗，95%的乙醇解吸，回收乙醇得到千里香叶提取物。将千里香叶提取物上Al203柱，用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，TLC检测，合并相同组分，得到A、B、C三部分。将A、B、C三部分反复进行硅胶柱层析，得到黄酮类单体化合物JA，JB，JC，JD，JE及JF六个单体化合物。2.千里香叶化学成分的结构鉴定2.1化合物JA的结构鉴定JA为白色粉末，熔点195.5-196.5°C，紫外灯下显示亮色荧光，易溶于氯仿，难溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于水。HCl—Mg反应阳性，显示淡紫红色。FeCl3反应呈阴性，提示可能不含酚羟基，A1C1:,反应阳性，紫外灯下为黄绿色荧光。上述反应提示JA可能为黄酮类化合物。"CNMR谱中共有19个信号，由135°和90°DEPT谱可知，其中Sc55.70、55.98、56.01和56.36为甲氧基碳信号。H丽R中SH3.90、3.94、3.95处的单峰为甲氧基质子信号；7.46为1H、dd峰，J=9.0Hz，1.8Hz，说明在母核的苯环上有相邻的氢，并且在这个氢的间位还有一个氢；6.58为1H、s峰，是3位质子信号；6.53、6.35各1H，均为d峰，J=2.4Hz，说明这两个氢在苯环上处于间位。由HMBC谱可知，SH6.35(1H，d，J=2.4Hz)与Cs、C7、C8、d。相关，应归属为H-6;S6.53(1H，d，J=2.4Hz)与Ce、C7、C9、d。相关，归属为H-8;S6.58(1H，s)与C2、C4、C10、d.相关，归属为H-3;SH7.26(1H，d，J=1.8Hz)与C2、Cr、C3、C4、Ce.相关，归属为H-2';SH6.92(IH，d，J=9.0Hz)与C,.、C3'、(V相关，归属为H-5';SH7.47(1H，dd，J=9.OHz，1.8Hz)与C2、C2'、。相关，归属为H-6';5H3.90(3H，s)与G相关，归属为7-0CH3;而SH3.95(3H，，s)与〔3相关，归属为3'-0CH3;SH3.94(6H，brs)与C5和。相关，是4'位和5位甲氧基共同的吸收信号。ES-MS给出分子离子峰为343(M+H)，证明JA分子量为342。根据以上分析，确定化合物JA为5，7，3'，4'，-四甲氧基黄酮(5，7，3'，4'-tetramethoxyflavone)，此化合物首次从千里香叶中分得。<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>化合物JA的结构式<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.2化合物JB的结构鉴定JB为白色粉末，熔点199-200°C，紫外灯下显示亮色荧光，易溶于氯仿，难溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于冷水。HC1—Mg反应阳性，显示淡紫红色。FeCl3反应阴性，提示可能不含有酚羟基。AlCl3反应阳性，紫外灯下为黄绿色荧光。上述反应提示JB可能为黄酮类化合物。Molish反应阴性，显示分子中不含糖。"C丽R谱中共有17个信号，其中SG153.43、103.27、56.28比正常碳信号约高2倍，表明分子中有化学环境完全相同的碳，即母核的B环上含有对称结构，且由135°和90°DEPT可知，SJ53.43为季碳信号，103.27为叔碳信号，56.28为甲氧基碳信号，60.95、56.36、55.76也为甲氧基信号。'H丽R中S3.92(3H)、3.93(3H)、3.95(6H)、3.96(3H)处的单峰均为甲氧基质子信号，7.07(s，2H)应为母核B环上非相邻对称位置上的质子信号，6.62(s，1H)为3位质子信号，6.57(1H，d，J=2.4Hz)、6.38(1H，d，J=2.4Hz)，为母核A环上的间位质子信号。通过HMBC谱可知，SH7.07(2H，s，)与C2、d.、C3.、C4.、C6.相关，归属为H-2';"6.62(1H，s，)与C2、C4、C)、C,'相关，归属为H_3;"6.38(d，J二2.4Hz)与C5、C7、C8、d。相关，归属为H_6;SH6.57(1H，d，J=2.4Hz)与"、C7、C9、d。相关，归属为H-8;SH3.96(3H，s)与Cs相关，归属为5-0CH3;SH3.93(3H，s)与"相关，归属为7_0CH3;SH3.95(6H，s)与C:,.、C5相关，归属为3'和5'-0CH3;"3.92(3H，s)与(V相关，归属为4'-0CH3。ES-MS给出分子离子峰为373(M+H)，证明JB分子量为372。根据以上分析，确定化合物JB为5，7，3V4'，5'-五甲氧基黄酮(5，7，3'，4'，5'-pentamethoxyflavone)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>难溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于水。HCl—Mg反应阳性，显示淡紫红色。FeCl3反应阴性，提示可能不含有酚羟基。AlCl3反应阳性，紫外灯下为黄绿色荧光。上述反应提示JC可能为黄酮类化合物。Molish反应阴性，显示分子中不含糖。"CNMR谱中共有18个信号，与化合物JB相比较，大部分信号的化学位移值未发生显著变化，但"由Sc96.13变为130.52，且在S^6.49处多了1个甲氧基信号，'H丽R中较化合物JB少了间位偶合质子信号，SH3.97(3H，s)为甲氧基质子信号，这表明化合物JC为六甲氧基黄酮，其多出的甲氧基应连接在6位碳上。通过匿BC谱可知，SH6.45(1H，s，)与C6、C7、C9、d。相关，归属为H-8;SH6.65(1H，s，)与C2、C4、C10、d相关，归属为H-3;SH7.19(2H，s)与G、、d'、C3.、C4.、Cr相关，归属为H-2'和H-6';"3.92(3H，s)与".相关，归属为4'-0CH3;"3.96(6H，s)与C:r、C5.相关，归属为3'和5'-0CH3;SH3.97(3H，s)与Cs相关，归属为5-0CH3;"4.00(3H，s)与Ce相关，归属为6-0CH3;SH4.02(3H，s)与(]7相关，归属为7-0CH3。ES-MS给出分子离子峰为403(M+H)，证明JC分子量为402。根据以上分析，确定化合物JC为5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮(5，6，7，3'，4'，5'-hexamethoxyflavone)。此化合物亦为首次从千里香中分得。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>化合物JC的结构式Table3The'C画RandH丽RdataforcompoundJCinCDC1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.4化合物JD的结构鉴定JD为白色粉末，熔点207-208°C，紫外灯下显示亮色荧光，易溶于氯仿，难溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于水。HCl—Mg反应阳性，显示淡紫红色。FeCls反应阳性，产生墨绿色沉淀，提示可能含有酚羟基。AlCl3反应阳性，紫外灯下为黄绿色荧光。上述反应提示JD可能为黄酮类化合物。Molish反应阴性，显示分子中不含糖。"C丽R谱中共冇18个信号，由135°DEPT谱可知，其中Sc55.87、56.07、56.19为甲氧基碳信号，其它各碳信号符合黄酮母核的结构。因135°DEPT谱显示有9个季碳，而只有三个甲氧基，说明在某一位置应带有一羟基。'H丽R中SH3.805、3.837、3.876处的单峰为甲氧基质子信号；7.46为1H、dd峰，J=9.0Hz，1.8Hz，说明在母核的苯环上有相邻的氢，并且在这个氢的间位还有一个氢；6.67为1H单峰为3位质子信号；6.37、6.57各1H，均为d峰，J=2.4Hz，说明这两个氢在苯环上处于间位。由HMBC谱可知，S6.47(1H，d，J=2.4Hz)与Cs、C7、C8、d。相关，应归属为H-6;S6.77(1H，d，J=2.4Hz)与Ce、C7、C9、d。相关，归属为H-8;"6.58(1H，s)与C2、C4、C10、d相关，归属为H-3;SH7.37(1H，d，J二1.8Hz)与C2、C3.、C4.、Qr相关，归属为H-2';SH7.05(IH，d，J二9.0Hz)与d.、C3.、Cr相关，归属为H-5';5H7.47(IH，dd，J=9.OHz，1.8Hz)与G、C,、。相关，归属为H-6';S3.80(3H，s)归属为5-0CH3，SH3.84(3H，s)归属为4'-0CH3,5H3.87(3H，s)归属为7-0CH3。ES-MS给出分子离子峰为329(M+H)，证明JD分子量为328。根据以上分析，确定化合物JD为3'-羟基-5，7，4'-三甲氧基黄酮..<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>此化合物亦为首次从千里香中分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>Table4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.5化合物JE的结构分析JE为白色粉末，熔点235-236°C，紫外灯下显示亮色荧光，易溶于氯仿，难溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，几乎不溶于冷水。HC1—Mg反应阳性，显示淡紫红色。FeCh反应阳性，产生墨绿色沉淀，提示可能含有酚羟基。AlCl3反应阳性，紫外灯下为黄绿色荧光。上述反应提示JE可能为黄酮类化合物。Molish反应阴性，显示分子中不含糖。"CNMR谱中共有18个信号，由135°DEPT谱可知，其中"55.99、55.93、55.82为甲氧基碳信号，其它各碳信号符合黄酮母核的结构。^丽R中S3.786、3.823、3.855处的单峰为甲氧基质子信号；7.58为1H、dd峰，J=9.0Hz，1.8Hz，说明在母核的苯环上有相邻的氢，并且在这个氢的间位还有一个氢；6.528、1H单峰为3位质子信号；6.47、6.77各1H，均为d峰，J二2.4Hz，说明这两个氢在苯环上处于间位。由HMBC谱可知，SH6.37(1H，d，J=2.4Hz)与Cs、C7、C8、C。相关，应归属为H-6;S6.57(1H，d，J=2.4Hz)与Cs、C7、C9、Cu)相关，归属为H-8;SH6.67(1H，s)与C2、C4、Clfl、d相关，归属为H-3;SH7.47(1H，d，J二1.8Hz)与C2、C3、C4.、Ce相关，归属为H-2';SH7.09(1H，d，J=9.0Hz)与d'、C3、C,'相关，归属为H-5';SH7.58(IH，dd，J=9.OHz，1.8Hz)与C2、C2、。相关，归属为H-6';SH3.79(3H，s)归属为5-0CH3，S3.82(3H，s)归属为4'-OCH3,SH3.86(3H，s)归属为3'-OCH3。ES-MS亦给出分子离子峰为329(M+H)，证明JE分子量为328。根据以上分析，确定化合物JE为7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮。此化合物亦为首次从千里香叶中分得。化合物JE的结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>"3C化学位移口J互换2.6化合物JF的结构鉴定JF为白色粉末，紫外灯下显示亮色荧光，易溶于氯仿，难溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于冷水。HCl—Mg反应阳性，显示淡紫红色。FeCl3反应阴性.，提示可能不含有酚羟基。A1CL反应阳性，紫外灯下为黄绿色荧光。上述反应提示JB可能为黄酮类化合物。Molish反应阴性，显示分子中不含糖。13CNMR谱中共有17个信号，由135。和90°DEPT可知，61.47，56.53，56.25，56.03，55.90为甲氧基信号。窗R中SH3.964(6H)、3.977(3H)、3.996(3H)、4.015(3H)处的单峰均为甲氧基质子信号。通过HMBC谱可知，6.444(s，1H)与Cfi、C7、U相关，归属为8位质子信号；6.621(s，1H)与C2、d。、C2相关，归属为3位质子信号，7.424(1H，d，J=1.8Hz)与C2、Gr、C4、Cr相关，归属为2'位质子信号，7.597(1H，dd，J=8.4，J二1.8Hz)与"、C2、<:4相关归属为6'位质子信号，7.002(1H，dd，J=8.4)与d.、C3.、C4-相关，归属为5'位质子信号。SH4.015(3H，s)与Cs相关，归属为5-0CH3;SH3.996(3H，s)与。7相关，归属为7-0CH3;SH3.964(6H，s)与Cfi、CV相关，归属6和4'-0CH3;5H3.977(3H，s)与C3.相关，归属为3'-OCH3。根据以上分析，确定化合物JF为5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮(5，6，7，3'，4'-pentamethoxyflavone)。此化合物亦为首次从千里香叶中分得。化合物JF的结构式<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>化合物JA、JB、JC、JD、JE、JF的'H-丽R、"C-NMR、DEPT、'H」HC0SY、HMQC以及HMBC等光谱图如图l一36所示。3、千里香叶总黄酮制备工艺研究为了从千里香叶得到黄酮含量高杂质含量低的总黄酮，本发明经反复研究最终完成了如下制备工艺。千里香叶中的黄酮类化合物可以通过水煎煮或有机溶剂回流等方法进行提取。由于千里香叶中的黄酮类化合物均是低极性化合物，水煎煮提取效果不好，提取次数多达7-8次才能提取完全，因此最好是采用有机溶剂回流提取方法进行提取，具体可用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等回流提取。因为乙醇毒性小，价格便宜，因此最好用乙醇回流提取。研究发现千里香叶中的黄酮类化合物可以被大孔吸附树脂吸附，因此采用大孔吸附树脂吸附法进行初步纯化，将提取液中的黄酮类成分与蛋白、多糖、叶绿素等杂质分离。水提取液可以直接过大孔吸附树脂吸附，而有机溶剂提取液则回收溶剂至一定体积后加水稀释，然后过大孔吸附树脂吸附。吸附完毕后先用低浓度有机溶剂或碱溶液洗脱，目的是把被大孔吸附树脂吸附的部分杂质洗脱下来。碱水洗脱完毕后用水洗至中性，然后用有机溶剂解吸，把黄酮类成分洗脱下来，洗脱液经减压或常压浓縮，得千里香叶提取物。其中除了黄S类成分外还含有香豆素及生物碱类成分，黄酮类成分的含量低于50%，不能直接用来研制开发中药新药。上述制备工艺中所述的大孔吸附树脂可选用AB-8、D4020、DlOl、D102、D103、860021、HP20的一种或一种以上混合物或具有相同或相似功能的其他厂商牌号的吸附树脂；所述的柱层析可选用硅胶、氧化铝、ODS或聚酰胺柱层析的一种或一种以上。除杂质或洗脱用有机溶剂可以使用甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、正丁醇等极性较大的有机溶剂或它们与水的混合溶液，最好是使用乙醇的水溶液。利用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱除杂质时所谓的低浓度是以不把黄酮类化合物洗脱下来为上限，一般不高于20%。碱溶液洗脱除杂质时可以使用的碱溶液有碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物的溶液或其他无机或有机碱的溶液，最好是氢氧化钠水溶液，浓度以千分之一为宜。将千里香叶提取物用水溶解或悬浮后过聚酰胺柱吸附，有机溶剂洗脱，洗脱液回收溶剂，即可以获得千里香叶总黄酮，其中除了黄酮类成分外还含有香豆素类成分但黄酮类成分的含量大于50%。将上述方法所得千里香叶提取物，加水溶解或悬浮后用有机溶剂萃取，萃取液减压浓縮，干燥，也可以获得千里香叶总黄酮，这样得到的千里香叶总黄酮，其中黄酮类成分的含量有所提高，杂质含量有所降低。用来萃取的有机溶剂可以是氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等与水不相混溶的溶剂，最好是氯仿或乙酸乙酯。最后将上述方法获得的千里香叶提取物或千里香叶总黄酮进一步进行柱层析纯化可以获得纯度更高的精制千里香叶总黄酮，经薄层色谱及高效液相色谱检测，其中主要成分是化合物JA、JB、JC、JD、JF，它们的含量之和在50%至100%之间，而且可以得到除了黄酮类成分外不含其他成分的总黄酮，其中包括只含有化合物JA、JB、JC、JD、JE、JF的千里香叶总黄酮。所述柱层析可选用硅胶、氧化铝、0DS、聚酰胺柱层析的一种或一种以上。4、千里香叶总黄酮中黄酮类化合物的含量测定方法研究利用分光光度法可以测定黄酮类化合物的总含量，但其结果没有HPLC法准确，故建立了HPLC含量测定方法。(1)仪器、试剂、对照品Agilent1100Series高效液相色谱仪ZORBAXExtend—C184.6X250,0DS，5um色谱柱VWD可变波长自外检测器色谱甲醇、二次蒸馏水将前述分离得到的JA、JB、JC、JD、JF单体通过重结晶或ODS纯化获得含量测定用对照品。按本方法色谱条件，归一化测得纯度均超过98%，符合相关要求。(2)色谱条件色谱柱用ZorbaxExtend,4.6X250mm，5um，0DS;柱温为25。C;流动相为甲醇水=58:42;流速为1.2mL/min;检测波长为337nm;进样量为20y1。(3)样品溶液的制备取干燥的九里香茎叶粉末(过60目筛)lg,加甲醇78'C水浴回流提取3次，每次加甲醇15ml，回流时间分别是2h、1.5h、lh，合并提取液，蒸干溶剂后甲醇定容至50.00ml，过滤，取滤液2.0ml至10ml容量瓶中，定容，即得。(4)测定方法分别精密吸对照品液与供试品溶液各20y1，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，利用外标一点法进行含量计算。具体实施例方式实施例1取千里香叶2公斤，加水煎煮提取7次，每次加水量为24升，煎煮时间为l小时，滤过，合并提取液，过AB-8大孔吸附树脂吸附，用水冲净后用50升千分之一氢氧化钠的水溶液冲洗，用水洗至中性后用85%乙醇溶液洗脱至薄层层析检测不到JA为止。洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶提取物153克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为23。/。。将此千里香叶提取物用水加热溶解后过聚酰胺柱吸附，用水冲净后用85%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶总黄酮74克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为51%，TLC表明其中还含有香豆素类成分。取此千里香叶总黄酮进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂，得精制千里香叶总黄酮35克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为75%，其中JA、JB、JC的含量之和为53%，不含香豆素等其他别的成分。实施例2取千里香叶2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分别为10、8、6倍，回流时间为45分钟，滤过，合并提取液，减压浓縮至无乙醇味，加水稀释，过860021大孔吸附树脂吸附，用40升10%乙醇水溶液冲洗后用甲醇洗脱至薄层层析检测不到JA为止，洗脱液减压回收甲醇，得千里香叶提取物132克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为28%。将此千里香叶提取物用水加热溶解后过聚酰胺柱吸附，用水冲净后用80%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶总黄酮83克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为55%，TLC检测表明含有香豆素。最后取此千里香叶总黄酮进行氧化铝柱层析，用乙酸乙酯和甲醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂，得精制千里香叶总黄酮38克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为84%，其中JA、JB的含量之和为59%,不含香豆素类成分。实施例3取千里香叶2公斤，甲醇回流提取3次，甲醇量分别为IO、8、6倍，回流时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓縮至干，加水加热溶解，过D4020大孔吸附树脂吸附，用水冲净后用50升千分之一氢氧化钾水溶液冲洗，用水洗至中性后用丙酮洗脱至薄层层析检测不到JA为止，洗脱液减压回收丙酮，得千里香叶提取物149克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为21%。将此千里香叶提取物用水加热溶解后过聚酰胺柱吸附，用水冲净后用80%甲醇洗脱，洗脱液减压回收甲醇，得千里香叶总黄酮89克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为58%，TLC检测含有香豆素类成分。最后取此千里香叶总黄酮进行聚酰胺柱层析，用氯仿和甲醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂，得精制千里香叶总黄酮41克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量为65。/。，另含有少量香豆素类成分。实施例4取千里香叶2公斤，丙酮回流提取3次，丙酮量分别为IO、8、6倍，回流时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓縮至干，加水加热溶解，过D101大孔吸附树脂吸附，用水冲净后75%异丙醇洗脱至薄层层析检测不到JA为止，洗脱液减压回收异丙醇，得千里香叶提取物146克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为19%。将此千里香叶提取物用水加热溶解后过聚酰胺柱吸附，用水冲净后用80%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶总黄酮68克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为54%，TLC检测含有香豆素。最后取此千里香叶总黄酮7克乙醇和水的混合溶液为流动相进行ODS柱层析，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂，得精制千里香叶总黄酮2.9克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为83。/。，不含香豆素。实施例5取千里香叶2公斤，乙醇回流提取3次，乙醇量分别为IO、8、6倍，回流时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓縮至干，加水加热溶解，过HP20大孔吸附树脂吸附，用水冲净后用50升千分之一氢氧化钙水溶液冲洗，用水洗至中性后用正丁醇洗脱至薄层层析检测不到JA为止，洗脱液减压回收正丁醇，得千里香叶提取物172克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量为18%。将此千里香叶提取物用水加热溶解后用氯仿萃取，氯仿层回收溶剂，得千里香叶总黄酮93克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为50.5%，TLC检测含有香豆素。最后取此千里香叶总黄酮用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液为流动相进行硅胶柱层析，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂，得精制千里香叶总黄酮39克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为85%，不含香豆素。实施例6取千里香叶2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分别为10、8、6倍，回流时间为45分钟，滤过，合并提取液，减压浓縮至无乙醇味，加水稀释，过860021大孔吸附树脂吸附，用60升10%乙醇水溶液冲洗后用甲醇洗脱至薄层层析检测不到JA为止，洗脱液减压回收甲醇，得千里香叶提取物132克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为3P/。。将此千里香叶提取物用水加热溶解后过聚酰胺柱吸附，用水冲净后用80%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶总黄酮83克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为58%，TLC检测表明含有香豆素。最后取此千里香叶总黄酮进行氧化铝柱层析，用乙酸乙酯和甲醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂后在进行硅胶柱层析纯化，得精制千里香叶总黄酮30克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、，的含量之和为94%，其中JA的含量之和为51%，不含香豆素类成分。实施例7取千里香叶2公斤，加水煎煮提取7次，每次加水量为30升，煎煮时间为l小时，滤过，合并提取液，过AB-8大孔吸附树脂吸附，用水冲净后用70升千分之一氢氧化钠的水溶液冲洗，用水洗至中性后用85%乙醇溶液洗脱至薄层层析检测不到JA为止。洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶提取物143克。经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为27。/。。将此千里香叶提取物用水加热溶解后过聚酰胺柱吸附，用水冲净后用85%乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，得千里香叶总黄酮74克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为61%，TLC表明其中还含有香豆素类成分。取此千里香叶总黄酮进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集黄酮部分，回收溶剂，得精制千里香叶总黄酮35克，将此精制千里香叶总黄酮用甲醇重结晶，得千里香叶总黄酮26克，经HPLC检测，其中JA、JB、JC、JD、JF的含量之和为95%，其中JA的含量之和为53%，不含香豆素等其他别的成分。实施例8取精制千里香叶总黄酮10克，加淀粉适量，制粒，装入胶囊，制成1000粒，得千里香叶总黄酮胶囊。实施例9取千里香叶总黄酮10克，加预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠适量，制粒，压片，制成1000粒，得千里香叶总黄酮片。实施例10取精制千里香叶总黄酮10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，搅拌溶解，过滤，灭菌，罐装，每支2ml，得千里香叶总黄酮注射液。实施例11取千里香叶总黄酮5克，加吐温80适量，加10升加热溶解，高温灭菌，分装成100瓶，得千里香叶总黄酮口服液。实验实施例1千里香叶总黄酮对实验性心肌缺血的保护作用研究1材料和方法1.1.实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重240260g，合格证号为医动字第10-5112，由长春高新医学动物研究中心供给。1.2.药品与试剂1.千里香叶总黄酮(QLXYZHT)2.肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)试剂为进口试剂。1.3.实验方法1.实验分组将100只Wistar大鼠随机分为5组，每组20只，分组如下(1)假手术组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠5ml/kg.dX3d(2)梗死模型组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠5ml/kg.dX3d(3)小剂量组灌胃千里香叶总黄酮25mg/kg.dX3d(4)中剂量组灌胃千里香叶总黄酮50mg/kg.dX3d(5)大剂量组灌胃千里香叶总黄酮100mg/kg.dX3d2.实验方法及观测指标于末次给药后30min将Wistar大鼠乙醚麻醉，仰位固定于手术台上，测定大鼠II导联正常心电图后，正中剃毛，以10号线做荷包缝合，以手术刀正中切开，用止血钳剥离肋间肌肉，自左侧34肋间开胸，暴露心脏，在肺动脉圆锥及左心耳间找出左冠状动脉前降支，于左心耳下23皿处用0号线立即结扎之，将心脏送回胸腔，迅速挤出胸腔内气体，拉紧荷包缝合线结扎以关闭胸腔，整个开胸时间不超过30秒，假手术组不结扎而只置手术线。结扎冠脉24h后，以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔静脉麻醉，每组一半动物腹主动脉插管取血，用COBAS-FARA自动生化分析仪测血清CK、AST及LDH活性。取血后剖取大鼠心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称重，将左心室心肌横切45片，然后浸入N-BT磷酸缓冲液中，置37。C恒温水浴，待染色完全后取出，正常组织染色，缺血组织不染色。切下缺血心肌称重，用缺血心肌与左心室湿重的百分比计算心肌梗死面积(MIS)。3.统计方法实验数据用SPSS10.0统计软件处理，以均数土标准差0^^)表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。2结果2.1.千里香叶总黄酮对急性心肌梗死大鼠MIS，血清CK、AST及LDH活性的影响与假手术组相比，梗死模型组MIS，血清CK、AST及LDH活性均明显增加(P〈0.05P〈0.001)，表明急性心肌梗死模型建成。与梗死模型组相比，千里香叶总黄酮25、50、100mg/kg组均能明显縮小MIS，降低血清CK、AST及LDH活性(P〈0.05或P〈0.01)，100mg/kg组对上述指标无明显影响(P〉0.05)，见表1。Tab.1EffectsofQLXYZHTonMTSandserumCK，ASTandLDHactivitiesinacutemyocardialinfarctrats(x±s，n=10)GroupMIS(%)AST(u/L)CK(u/L)LDH(u/L)Sham3.31±0.68wModel31.24±5.66QLXYZHT25mg/kg28.74±5.5750mg/kg24.37±5.24"lOOmg/kg21.14±4.38"738.5±87.5**633.4±164.广1506.5±542.7"987.8±287.51097.5±368.72356.3±574.4873.4±134.8906.5±177.52192.3±407.8821.2±171.2*785.4±134.9"1869.7±504.5*743.1±127.1"717.6±125.7"1774.6±414.3**补〈0.05，林FKO.01,嫩P〈0.001comparedwithmodel.实验结果表明，千里香叶总黄酮具有治疗急性心肌梗死的作用。附图l化合物JA的'H-NMR附图2化合物JA的^C-丽R附图3化合物JA的DEPT谱附图4化合物JA的'H」HCOSY附图5化合物JA的醒QC附图6化合物JA的HMBC附图7化合物JB的'H-NMR附图8化合物JB的"C-NMR附图9化合物JB的DEPT谱附图10化合物JB的力」HCOSY附图ll化合物JB的匿QC附图12化合物JB的HMBC附图13化合物JC的力-NMR附图14化合物JC的"ONMR附图15化合物JC的DEPT谱附图16化合物JC的力」HCOSY附图17化合物JC的HMQC附图18化合物JC的HMBC附图19化合物JD的^-NMR附图20化合物JD的130NMR附图21化合物JD的DEPT谱附图22化合物JD的力」HCOSY附图23化合物JD的HMQC附图24化合物JD的訓BC附图25化合物JE的'H-NMR附图26化合物JE的"C-丽R附图27化合物JE的DEPT谱附图28化合物JE的^」HCOSY附图29化合物JE的HMQC附图30化合物JE的HMBC附图31化合物JF的力-NMR附图32化合物JF的"C-丽R附图33化合物JF的DEPT谱附图34化合物JF的力」HCOSY附图35化合物JF的HMQC附图36化合物JF的HMBC。权利要求1、一种千里香叶总黄酮，其特征在于其中至少含有5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。2、权利要求1所述的千里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮的含量之和大于50%。3、权利要求1所述的千里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3、4'，5'-六甲氧基黄酮的含量之和大于50%。4、权利要求1所述的千里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮和5，7，3'，4'，5'_五甲氧基黄酮的含量之和大于50%。5、权利要求1所述的千里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮的含量大于50%。6、权利要求1所述的千里香叶总黄酮，其特征在于其中不含有香豆素类成分。7、权利要求1所述的千里香叶总黄酮的制备方法，其特征在于通过如下步骤得到相应的千里香叶总黄酮(1)千里香叶水煎煮或有机溶剂回流提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，有机溶剂提取液先回收有机溶剂，加水溶解或悬浮后过大孔吸附树脂吸附(2)碱水或低浓度有机溶剂洗脱，水洗至中性(3)有机溶剂解吸(4)洗脱液浓縮，得千里香叶提取物(5)千里香叶提取物用水溶解或悬浮后过聚酰胺柱吸附，有机溶剂洗脱，洗脱液回收溶剂，获得千里香叶总黄酮(6)将千里香叶提取物或千里香叶总黄酮进行柱层析纯化获得纯度更高的九里香叶总黄酮。8、权利要求7所述的千里香叶总黄酮的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂选自AB-8、D4020、DlOl、D102、D103、860021、HP20的一种或使用它们的混合物。9、权利要求7所述的千里香叶总黄酮的制备方法，其特征在于所述的柱层析选自硅胶、氧化铝、ODS或聚酰胺柱层析的一种或一种以上。10、权利要求7所述的千里香叶总黄酮的制备方法，其特征在于所述的碱溶液选自碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物的水溶液。11、权利要求1所述的千里香叶总黄酮在制备预防和治疗心肌缺血药物中的用途。12、权利要求1所述的千里香叶总黄酮与医学上可接受的药用辅料组成的药物组合物。13、权利要求12所述的药物组合物，其特征在于其剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射剂。全文摘要本发明提供千里香叶总黄酮及其制备方法及用途。千里香叶总黄酮是从中药千里香的叶中提取分离的以黄酮类化合物为主要成分的有效部位，其中主要含有5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮以及7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮。本发明的千里香叶总黄酮对急性心肌梗死具有治疗作用。文档编号A61K9/10GK101380379SQ20071014735公开日2009年3月11日申请日期2007年9月5日优先权日2007年9月5日发明者李绪文,杨瑞杰,桂明玉,王晓中,金永日,马彦冬申请人:金永日