杏丹注射剂的质量控制方法

专利名称：杏丹注射剂的质量控制方法
技术领域：
本发明是一种杏丹注射剂的质量控制方法，属于中药的技术领域。
背景技术：
心脑血管疾病如冠心病、脑血栓、高血压、脑梗塞等均是当今世界上最常见和危害最大 的疾病之一，也是危害我国人民健康的常见病、多发病，已成为人口死亡的主要原因之一； 据报告，近年来的发病率有逐年增高趋势，而且中、青年患者不断增加。为了达到防治的目 的，北京奇源益德药物研究所曾递交了一份专利申请号为"200410022288.9"，名称为"一 种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法"的申请，它由丹参与银杏叶制作而成，制备 的注射制剂能起到改善心肌和脑组织代谢、增加冠状动脉及脑血管血流，改善心肌和脑组织 等血供的作用，对于治疗心脑血管疾病如冠心病、心绞痛、心律失常、脑血栓、老年性痴呆 等有较好的疗效，同时可以提高机体免疫力，抵抗疾病发生；但是药物制剂必须要在保证产 品质量稳定可控安全的基础之上，才能不短的更新发展，为了更好的控制该制剂的质量，保 证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质 地，需要研究、控制该注射剂质量的方法
发明内容
本发明的目的在于提供一种杏丹注射剂的质量控制方法，这种方法针对如下产品向相 关的生产、检测机构提供检测的指标、检测的手段、技术方法等，以便更好的控制该制剂的 质量，保证用药的安全性，能够更好的指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者 能全面认识产品质地，所针对的产品为1) 由银杏叶药材丹参药材=20-80: 80-20组方，分别或合并采用水或乙醇溶液提取， 然后用沉淀法、柱层析法、溶剂萃取法和超临界萃取法中的一种或几种进行适当精制、混匀 ，然后制成注射剂，包括直接用于注射给药的注射液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶 液、直接供静脉滴注的葡萄糖静脉输液和氯化钠静脉输液以及用冷冻干燥法或喷雾干燥法制 得的注射用无菌粉末和无菌块状物；2) 由银杏叶提取物丹参提取物=20-80: 80-20组方制成的注射剂，包括直接用于注射
给药的注射液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液、直接供静脉滴注的葡萄糖静脉输液 和氯化钠静脉输液以及用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得的注射用无菌粉末和无菌块状物，所 述的提取物可以来源于市售，也可以采用水或乙醇溶液提取，然后用沉淀法、柱层析法、溶 剂萃取法和超临界萃取法中的一种或几种进行适当精制之后得到。或者是专利申请号为200410022288.9，名称为"一种治疗心脑血管疾病的中药及其 制备方法"提供的制备方法制备的注射制剂。本发明是这样构成的杏丹注射剂的质量控制方法，包括以下全部或部分内容杏丹注射剂的指纹图谱测试，包括以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以 银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种。其中，指纹图谱检测方法包括如下的一种或两种a、采用液相色谱法测试以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释， 摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取适量丹参和银杏叶药材中的主要活性成分对照品，包括丹 参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、槲皮素、山奈素、异鼠李素中的一种，用水或甲醇 或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇 -O. 01mol/L 2mol/L磷酸二氢钠水溶液或0. 01mol/L 2mol/L磷酸二氢钾水溶液或0. 01mol/L 2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0. 1 % 5%冰醋酸溶液或0. 1% 5%甲酸溶液 或0.02% 5%磷酸溶液，梯度洗脱，流速为O. 5 2. 0ml/min、检测波长为190 410nm范围 内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20 6(TC范围内；(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有3 50个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部 分或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 80 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有5% 60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各 共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50%;b、采用液相色谱法测试以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹注射制剂适量，加水溶解，力叫.2% 30%盐酸溶 液，用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷萃取，合并萃取液，用0.5% 20%醋酸钠 溶液洗涤，分取醋酸钠液，用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤，合并醋酸乙酯 或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷提取液及洗液，用水洗涤，合并水洗液，用醋酸乙酯或正丁 醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤，合并醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷液，回收醋酸 乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷至干，残渣加丙酮或甲醇或乙醇使溶解，摇匀，滤过， 滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取白果内酯或银杏内酯A或银杏内酯B或银杏内酯C中的一种， 用甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为乙腈或乙腈一四 氢呋喃(5 95:95 5)或甲醇或甲醇一四氢呋喃(5 95:95 5)，流动相B为水或O. 1% 5%冰醋酸或0. 1% 5%甲酸或0. 005% 5%磷酸溶液，梯度洗脱，流速为O. 5 2. 0ml/min、检测波长为190 410nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20 6(TC范 围内；(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有3 30个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部 分或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 80 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有20% 80%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中
各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50%。 优选为a、 采用液相色谱法测试以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备精密称取待测杏丹注射制剂适量，加水制成每lml含10mg的溶 液，用O. 45 y m的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备精密称取丹参素钠对照品适量，加甲醇制成每lml含15yg的 溶液，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为0.026X磷酸溶 液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至30分钟，流动相B的比例由2X升至 22%，从30分钟至60分钟，流动相B的比例由22X升至26X;流速为l. Oml/min，检测波长为 280士2nm，柱温为30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有3 30个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分 或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有10% 40%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30%;b、 采用液相色谱法测试以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹注射制剂l. 5g，加水40ml溶解，加2%盐酸溶液5滴 ，用醋酸乙酯提取4次，合并提取液，用5X醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用醋酸乙 酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液，用醋酸 乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣加丙酮适量使溶解并定量转移至 5ml量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，滤过，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取银杏内酯A对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为参 照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为甲醇一四氢呋喃 (25:10)，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相B的比例为65X，从25分钟至60分钟，流动相B的比例由65X降至35X，流速为O. 8ml/min、蒸发光散射检测 器检测，柱温30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有3 20个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部 分或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有30% 60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30%。与现有技术相比，本发明能更加完善的控制以银杏叶和丹参的药材或其提取物制成的杏 丹注射剂产品质量。该产品成分复杂，如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量，具有 一定的片面性，更无法判断其药效的指标成分，最好在专属性较强的定性、定量检测基础上 增加以银杏叶成分特征为主的指纹图谱和以丹参成分特征为主的指纹图谱来全面控制注射剂 的质量；由于杏丹注射剂中两种药材所含成分相互之间的干扰影响，导致该制剂较单独的银 杏叶制剂、丹参制剂的指纹图谱特征峰有很大的不同，采用常规的检测银杏叶或丹参的液相 色谱条件，各成分特征峰的分离效果很难满足要求，只有采用本发明的条件，选用适宜的参 数进行梯度洗脱，才能得到专属、准确、稳定、可操作性强的理想的指纹图谱。通过实验证 明，本发明质量控制方法对以银杏叶、丹参制成的中药注射剂产品的质量控制更为有效，方 法精密度、稳定性均较高。实验例l以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的制备a、实验仪器、试剂及样品对照品丹参素钠中国药品生物制品检定所 b、色谱条件与系统适应性实验1. 色谱柱的选择研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax、 Inertsil 0DS-3、 Diamonsil 0DS(均为C18， 4.6mmX200mm， 5ym)三种牌号的色谱 柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Inertsil 0DS-3色谱柱分离 效果最好，柱效最高。故最终选用Diamonsil ODS色谱柱(4. 6mmX 200mm， 5 y m)为实验研究 柱。2. 流动相的选择研究过程中分别考察了 (1)甲醇一水(10: 90) ，(2)甲醇一O. 1%冰醋酸(5: 95) ，(3)甲醇一0.05%磷酸(5: 995) (4)乙腈-O. 026%磷酸水溶液(梯度洗脱)四种流动相 系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，分离不好；流动相(2)条件下，峰形较好 ，但l小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(3)条件下，峰形较好，出峰 不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。3. 检测波长的确定研究中在乙腈-0.026%磷酸(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波 长205、 230、 254、 280、 360nm下的色谱峰情况，结果显示，在205、 230、 360nm下色谱峰较 少，205、 230nm下基线漂移严重，254、 288nm下基线良好，其中288nm下色谱峰较多，故最 终选用280nm作为检测波长。4. 仪器、色谱柱及积分参数4. l仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Agilent 1100系列高效 液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱为Diamonsil ODS (200mmX 4. 6mm， 5 y m);柱 温30。C，流速1.0ml/min。4. 2积分参数Slope Sensitivity: 1， peak width:O. 05，最小峰面积为参照物(S)峰 峰面积的5%，最小峰高为S峰峰高的5y。。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面 积占总峰面积小于0.5%)的计算，同时保证与参照物的相关性。5. 供试品溶液的制备取本品约O. lg，精密称定，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。用0.45齙的微孔滤 膜过滤，取续滤液即得。6. 参照物溶液的制备丹参素钠为丹参主要水溶性活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且相
对较稳定，同时兼顾中间体和原料药的研究，因此选定丹参素钠作为参照物，并用水作溶剂 ，测定结果显示该方法可行。 7.指纹图谱及技术参数根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在 0. 90 1. OO之间。实验例2以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱的制备a、 实验仪器、试剂及样品对照品银杏内酯A:中国药品生物制品检定所。b、 色谱条件与系统适应性实验1. 色谱柱的选择研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax(C18， 4.6mmX200mm， 5um) 、 Inertsil ODS-3(C18， 4.6mmX200mm， 5um) 、 Platinum C18(5ym 4. 6 X 250mm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离 效果，其中Platinum C18 (5 y m 4. 6 X 250mm)色谱柱分离效果最好，柱效最高，可以达到 5000以上(以参照物银杏内酯A计算)。故最终选用Platinum C18(5ym 4. 6 X250mm)为实验 研究柱。2. 流动相的选择研究过程中分别考察了 (1)甲醇--水(20: 80) ，(2)乙腈--水(20: 80) ， (3) 乙腈一1%冰醋酸水溶液(梯度洗脱)(4) A为甲醇-四氢呋喃(25:10) ， B为水(梯度洗脱 )四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，l小时内出峰较少，仍有不少 组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖 尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被 选用。3. 检测波长的确定研究中在A为甲醇-四氢呋喃(25:10) ， B为水(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了 漂移管温度(105°C、 110。C、 115。C)及气流速度(2.4ml/min、 2. 7ml/min、 3. Oml/min)条 件下的色谱峰及基线噪音的情况，结果显示，在漂移管温度11(TC、气流速度2. 7ml/min基线 平稳，噪音较小，色谱峰分离及保留时间适中且稳定，故最终选用漂移管温度11(TC、气流 速度2. 7ml/min作为检测条件。4. 仪器、色谱柱及积分参数
4. l仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Alltech高效液相色谱仪，AlltechStation色谱工作站，Alltech ELSD 2000ES。色谱柱为Platinum C18(5ym 4.6X 250mm);柱、温3CTC ，流速O. 8ml/min。4.2积分参数Slope Sensitivity:500， peak width:0.2，最小峰面积为参照物(S) 峰峰面积的5%，最小峰高为S峰峰高的5y。。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰 面积占总峰面积小于0.5%)的计算，同时保证与参照物的相关性。5. 供试品溶液的制备精密称取本品粉末约1.5g，加水40ml溶解，加2%盐酸溶液5滴，用醋酸乙酯振摇提取4次 (15ml、 10ml、 10ml、 10ml)，合并提取液，用5X醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液， 用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液 ，用醋酸乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣加丙酮使溶解并转移至 5ml量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，即得。6. 参照物溶液的制备银杏内酯A为丹参中主要活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳 定，同时兼顾中间体和药材的研究，因此选定银杏内酯A作为参照物。7. 指纹图谱及技术参数根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在 0. 90 1. OO之间。
具体实施方式
实施例l:采用液相色谱法测定杏丹冻干粉针中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的 指纹图谱(1) 供试品溶液的制备精密称取待测杏丹冻干粉针适量，加水制成每lml含10mg的溶 液，用O. 45 y m的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备精密称取丹参素钠对照品适量，加甲醇制成每lml含15yg的 溶液，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为0.026X磷酸溶 液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至30分钟，流动相B的比例由2X升至 22%，从30分钟至60分钟，流动相B的比例由22X升至26X;流速为l. Oml/min，检测波长为 280士2nm，柱温为30。C;
(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有23个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为O. 90 1. 00。 实施例2:采用液相色谱法测定杏丹冻干粉针中以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹冻干粉针l. 5g，加水40ml溶解，加2%盐酸溶液5滴 ，用醋酸乙酯提取4次，合并提取液，用5X醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用醋酸乙 酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液，用醋酸 乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣加丙酮适量使溶解并定量转移至 5ml量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，滤过，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取银杏内酯A对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为参 照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为甲醇一四氢呋喃 (25:10)，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相B的比例为65X，从25分钟至60分钟，流动相B的比例由65X降至35X，流速为O. 8ml/min、蒸发光散射检测 器检测，柱温30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有9个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为O. 90 1. 00。 实施例3:采用液相色谱法测定杏丹注射液中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指
纹图谱(1) 供试品溶液的制备精密称取待测杏丹注射液适量，加水制成每lml含10mg的溶液 ，用O. 45 y m的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备精密称取原儿茶醛适量，加水制成每lml含15yg的溶液，作 为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为1X冰醋酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至30分钟，流动相B的比例由3X升至20X ，从30分钟至75分钟，流动相B的比例由20X升至26X;流速为l. Oml/min，检测波长为280 ±2皿，柱温为30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有21个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不超过总峰面积的5%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有10% 40%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不大于±30%。实施例4:采用液相色谱法测定杏丹注射液中以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹注射液l. 5g，加水40ml溶解，加5%盐酸溶液5滴， 用正丁醇提取4次，合并提取液，用2X醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用正丁醇 10ml洗涤，合并正丁醇提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液，用正丁醇 10ml洗涤，合并正丁醇液，回收正丁醇至干，残渣加甲醇适量使溶解并定量转移至5ml量瓶 中，加丙酮至刻度，摇匀，滤过，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取白果内酯对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为参 照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为乙腈一四氢呋喃 (22:13)，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至30分钟，流动相B的比例为68X ，从30分钟至60分钟，流动相B的比例由68X降至35X，流速为O. 9ml/min、蒸发光散射检测 器检测，柱温30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有ll个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不超过总峰面积的5%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有30% 60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不大于±30%。实施例5:采用液相色谱法测定杏丹葡萄糖输液剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为 主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备精密量取杏丹输液剂10ml，用0.45ym的微孔滤膜滤过，取续 滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备精密称取丹酚酸B适量，加75X甲醇制成每lml含0. lmg的溶液 ，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为0.05X磷酸溶液 ，流动相B为甲醇，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相B的比例由5X升至30X ，从25分钟至60分钟，流动相B的比例由25X升至35X;流速为l. Oml/min，检测波长为280 ±2皿，柱温为30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有20个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹输液剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测杏丹输液剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求I. 计算待测杏丹输液剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹输液剂指纹图谱中，非共有峰面积不超过总峰面积的5%。实施例6:采用液相色谱法测定杏丹注射液中以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备精密量取杏丹注射液30ml，加5%盐酸溶液5滴，用三氯甲烷提 取4次，合并提取液，用5X醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用三氯甲烷提10ml洗涤， 合并三氯甲烷提提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液，用三氯甲烷提10ml 洗涤，合并三氯甲烷提液，回收三氯甲烷提至干，残渣加乙醇适量使溶解并定量转移至5ml 量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取银杏内酯B对照品，加乙醇制成每lml含lmg的溶液，作为参 照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为甲醇一四氢呋喃 (25:10)，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相B的比例为65X，从25分钟至60分钟，流动相B的比例由65X降至35X，流速为O. 8ml/min、蒸发光散射检测 器检测，柱温30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有7个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射液中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射液的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求I. 计算待测杏丹注射液的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射液指纹图谱中，非共有峰面积不超过总峰面积的5%。
权利要求
1.一种杏丹注射剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容杏丹注射剂的指纹图谱测试，包括以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种。
2. 按照权利要求l所述的杏丹注射剂的质量控制方法，其特征在于该 方法包括如下指纹图谱中的一种或两种a、采用液相色谱法测试以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹注射制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释， 摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取适量丹参和银杏叶药材中的主要活性成分对照品，包括丹 参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、槲皮素、山奈素、异鼠李素中的一种，用水或甲醇 或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇-0. 01mol/L 2mol/L磷酸二氢钠水溶液或0. 01mol/L 2mol/L磷酸二氢钾水溶液或0. 01mol/L 2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0. 1% 5%冰醋酸溶液或0. 1% 5%甲酸溶液或0. 02% 5%磷酸溶液，梯度洗脱，流速为O. 5 2. 0ml/min、检测波长为190 410nm范围内的一个或 几个或蒸发光检测器检测，柱温在20 6(TC范围内；(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有3 50个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 80 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有5% 60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50%;b、采用液相色谱法测试以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备取待测杏丹注射制剂适量，加水溶解，力叫.2% 30%盐酸溶 液，用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷萃取，合并萃取液，用0.5% 20%醋酸钠 溶液洗涤，分取醋酸钠液，用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤，合并醋酸乙酯 或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷提取液及洗液，用水洗涤，合并水洗液，用醋酸乙酯或正丁 醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤，合并醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷液，回收醋酸 乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷至干，残渣加丙酮或甲醇或乙醇使溶解，摇匀，滤过， 滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取白果内酯或银杏内酯A或银杏内酯B或银杏内酯C中的一种 ，用甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为乙腈或乙腈一 四氢呋喃(5 95:95 5)或甲醇或甲醇一四氢呋喃(5 95:95 5)，流动相B为水或O. 1% 5%冰醋酸或0. 1% 5%甲酸或0. 005% 5%磷酸溶液，梯度洗脱，流速为O. 5 2.0ml/min、检测波长为190 410nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在 20 60。C范围内；(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有3 30个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部 分或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 80 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10%; III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有20% 80%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±50%。
3. 按照权利要求2所述的杏丹注射剂的质量控制方法，其特征在于该 方法包括如下指纹图谱中的一种或两种a、 采用液相色谱法测试以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱(1) 供试品溶液的制备精密称取待测杏丹注射制剂适量，加水制成每lml含10mg的 溶液，用O. 45 y m的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备精密称取丹参素钠对照品适量，加甲醇制成每lml含15yg的 溶液，作为参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为0.026X磷酸溶 液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至30分钟，流动相B的比例由2X升至 22%，从30分钟至60分钟，流动相B的比例由22X升至26X;流速为l. Oml/min，检测波长为 280士2nm，柱温为30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主 的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以 确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指 纹图谱中，共有峰有3 30个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征 为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分 或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有10% 40%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30%;b、 采用液相色谱法测试以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测杏丹注射制剂l. 5g，加水40ml溶解，加2%盐酸溶液5 滴，用醋酸乙酯提取4次，合并提取液，用5X醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用醋酸 乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并水洗液，用醋 酸乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣加丙酮适量使溶解并定量转移 至5ml量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，滤过，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2) 参照物溶液的制备取银杏内酯A对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为 参照物溶液；(3) 色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相A为甲醇一四氢呋 喃(25:10)，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至25分钟，流动相B的比例为 65%，从25分钟至60分钟，流动相B的比例由65X降至35X，流速为O. 8ml/min、蒸发光散射 检测器检测，柱温30。C;(4) 标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的 指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确 定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹 图谱中，共有峰有3 20个；(5) 以(1) (3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为 主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6) 将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部 分或全部I. 计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为O. 90 1. 00;II. 待测杏丹注射剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5%;III. 待测杏丹注射剂指纹图谱中有30% 60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中 各共有峰面积的比值比较，其差值不得大于±30%。
全文摘要
本发明提供了一种杏丹注射剂的质量控制方法，该方法包括杏丹注射剂的指纹图谱测试；银杏叶药材、银杏叶提取物、银杏叶总黄酮醇苷、银杏叶总萜类内酯等成分的鉴别测试；丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮II_A、槲皮素、山奈素等成分的含量测试；与现有技术相比，本发明质量控制方法对以银杏叶和丹参或其提取物制成的中药注射剂产品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性均较高。
文档编号A61K36/537GK101156894SQ20071020188
公开日2008年4月9日 申请日期2006年1月24日 优先权日2005年2月7日
发明者于文勇 申请人:贵阳云岩西创药物科技开发有限公司