专利名称：：抗体配制品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及稳定抗体的配制品和方法。在一个实施方案中，本发明提供了稳定倾向于在铰链区发生非酶裂解(non-enzymaticcleavage)的抗体的配制品和方法。更特别地，本发明涉及含有缓冲液和冻干保护剂(lyoprotectant)的倾向于在铰链区发生非酶裂解的抗体的配制品。在另一个实施方案中，本发明提供了稳定抗VEGFR抗体的方法和配制品。
背景技术：
：液体配制品中的抗体对各种化学和物理学过程敏感，这些过程包括水解、聚集、氧化、脱酰胺和在铰链区片段化(fragmentatkm)。这种片段化是非酶解过程，可以是温度和/或pH依赖性的，并典型地在重链铰链区靠近木瓜蛋白酶裂解位点处发生。这些过程可以通过降低功能抗体的利用度和通过降低或消除它们的抗原结合特征而改变或消除治疗性抗体的临床效果。本发明满足了对单克隆抗体、特别是那些倾向于在铰链区发生非酶裂解的单克隆抗体的稳定配制品的需求，并且进一步提供了冻干这些抗体的方法和配制品。发明概述本发明涉及用于稳定抗体制备物的配制品和方法。另外，本发明还涉及用于稳定倾向于发生非酶裂解特别是在铰链区发生非酶裂解的抗体的配制品和方法。在一个实施方案中，本发明提供了稳定的配制品，其包含倾向于发生非酶裂解的抗体和缓冲液。所述配制品还可以含有一或多种稳定剂。另外，所述配制品可含有表面活性剂。在另一个实施方案中，本发明提供了能冻干的配制品并且可以含有冻干保护剂。在另一个实施方案中，本发明提供了冻干的配制品，其包含倾向于发生非酶裂解的抗体、组氨酸缓冲液和冻干保护性糖(lyoprotectingsugar)。在另一个实施方案中，本发明提供了稳定倾向于发生非酶裂解的抗体的方法，包括在组氨酸缓冲液和冻干保护性糖中进行配制。另外，配制品可含有表面活性剂。配制品可以被冻干以在加工和储存过程中稳定抗体，然后配制品可以重配以用于药物学给药。在另一个实施方案中，重配的抗体可以多剂量形式使用。在一个实施方案中，本发明提供了稳定的冻干的配制品，其包含抗VEGFR抗体、缓冲液和冻干保护剂。所述配制品还可含有一或多种稳定剂。另外，所述配制品可含有表面活性剂。在另一个实施方案中，本发明提供了稳定的冻干的配制品，其包含抗VEGFR2抗体、缓冲液和冻干保护剂。所述配制品还可含有一或多种稳定剂。另外，所述配制品可含有表面活性剂。在另一个实施方案中，本发明提供了冻干的配制品，其包含抗VEGFR2抗体、组氨酸缓冲液和冻干保护性糖。在另一个实施方案中，本发明提供了稳定抗VEGFR抗体的方法，包括冻干抗VEGFR抗体的水性配制品。所述配制品可以被冻干以在加工和储存过程中稳定抗VEGFR抗体，然后所述配制品可以重配以用于药物学给药。在另一个实施方案中，本发明提供了通过提供本发明的组合物而抑制VEGFR活性的方法。本发明还提供了抑制哺乳动物特别是人中VEGF途径的方法，包括给予本发明的组合物。本发明还提供了治疗VEGFR依赖性病症的方法，包括给予本发明的组合物。附图简述图1显示了在4(TC保温3个月后，在PBS中的IMC-1121B抗体的大小排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)的层析谱。图2显示了IMC-1121B的重链的氨基酸序列，以及非酶裂解发生的位点。图3显示了降解的IMC-1121B及其大小排阻级分的SDS-PAGE。图4显示了IMC-1121B的DSC分析的回归图。图5显示了搅拌研究(agitationstudy)的预测图谱(predictionprofiler)。图6显示了在4CTC时IMC-1121B的实时加速温度稳定性的预测图谱。图7显示了在-2(TC时IMC-1121B的实时加速温度稳定性的预测图谱。图8是在PBS和.OmM组氨酸缓冲液(pH6.0)中于4(TC和室温保温150天后IMC-1121B的SEC-HPLC层析谱。图9显示了作为在4CrC和室温的保温时间的函数，在PBS和10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-1121B单体百分比的变化。图10显示了作为在4(TC和室温的保温时间的函数，在PBS禾ll10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-1J21B聚集体百分比的变化。图11显示了作为在4(TC和室温的保温时间的函数，在PBS和10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-1121B的降解物(degradent)百分比的变化。图12是在室温和4(TC保温30和150天后IMC-1121B的IEC-HPLC层析图13显示了在室温和4(TC保温150天后在PBS和10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-1121B的还原和非还原SDS-PAGE。图14显示了在室温和4(TC保温150天后IMC-1121B的等电聚焦。图15显示了IMC-1121B冻干过程的冻干循环。图16显示了在4(TC和5(TC保温100天后，IMC-1121B冻干产物中所剩余的单体百分比。图17显示了作为在5(TC保温时间的函数，冻干和溶液配制品中所剩余的IMC-1121B单体的百分比。图18显示了作为在5CTC保温时间的函数，冻干和溶液配制品中的IMC-1121B聚集体的百分比。图19显示了作为在5(TC保温时间的函数，冻干和溶液配制品中的8IMC-1121B降解物的百分比。图20显示了作为在4(TC保温时间的函数，冻干和溶液配制品中所剩余的IMC-1121B单体的百分比。图21显示了作为在4(TC保温时间的函数，冻千和溶液配制品中的IMC-1121B聚集体的百分比。图22显示了作为在4(TC保温时间的函数，冻干和溶液配制品中的IMC-1121B降解物的百分比。图23显示了在5(TC保温后冻干和溶液配制品中所剩余的IMC-1121B单体的百分比。图24显示了在5(TC保温后冻干和溶液配制品中的IMC-1121B聚集体的百分比。图25显示了在5(TC保温后冻干和溶液配制品中的IMC-1121B降解物的百分比。图26显示了在4(TC保温后冻干和溶液配制品中所剩余的IMC-1121B单体的百分比。图27显示了在4(TC保温的溶液和冻干配制品中的IMC-1121B聚集体的百分比。图28显示了在4(TC保温后冻干和溶液配制品中的IMC-1121B降解物的百分比。图29是在4CTC保温3个月后溶液和冻干配制品中的IMC-1121B的IEC-HPLC层析谱。图30显示了在室温保温后冻干和溶液配制品中所剩余的IMC-1121B单体的百分比。图31显示了在室温保温后冻干和溶液配制品中的IMC-1121B聚集体的百分比。图32显示了在室温保温后冻干和溶液配制品中的IMC-1121B降解物的百分比。200780009201.6图33是在室温保温3个月后溶液和冻干配制品中的IMC-1121B的IEC-HPLC层析谱。图34显示了在室温、4(TC和5(TC保温3个月后溶液和冻干配制品中的IMC-1121B的还原SDS-PAGE。图35显示了在室温、4(TC和5(TC保温3个月后溶液和冻干配制品中的IMC-1121B的非还原SDS-PAGE。发明的详细描述本发明提供了用于冻干倾向于非酶裂解的抗体包括其功能片段的配制品。所述配制品可包含另外的成分如稳定剂、表面活性剂、还原剂、载体、防腐剂、氨基酸和螯合剂。本发明还提供了稳定抗体组合物的方法，包括在冻干保护剂的存在下冻干抗体的水性配制品。所述配制品可以被冻干以在加工和储存过程中稳定抗体，然后可在药物学给药前重配。优选地，从生产到给药抗体基本上保留其物理学和化学稳定性和完整性。根据本发明，各种配制品组分可以适于增强稳定性，包括缓冲液、表面活性剂、糖、糖醇、糖衍生物和氨基酸。根据本发明，各种配制品性质可适于增强稳定性，包括pH和配制品组分的浓度。根据本发明，可用缓冲液维持配制品的pH。缓冲液使由于外部差异导致的pH波动最小化。本发明的配制品含有一或多种缓冲液以提供合适pH的配制品，优选地约5.5至约6.5，最优选约6.0。举例的缓冲液通常包括但非限于有机缓冲液，如组氨酸、拧檬酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐和乙酸盐。在一个实施方案中，缓冲液浓度为约5mM至约50mM。在另一个实施方案中，缓冲液浓度为约10mM。本发明的配制品可含有一或多种稳定剂，其可有助于防止抗体的聚焦和降解。合适的稳定剂包括但非限于多羟基糖、糖醇和氨基酸。优选的稳定剂包括但非限于天冬氨酸、乳糖酸、甘氨酸、海藻糖、甘露醇和蔗糖。本发明的配制品可含有一或多种表面活性剂。抗体溶液在空气-水界面有高表面张力。为了降低这个表面张力，抗体倾向于在空气-水界面聚集。表面活性剂使在空气-水界面的抗体聚集最小化，从而帮助保持溶液中抗体的生物学活性。例如，加入0.01%吐温80可降低溶液中的抗体聚集。当配制品被冻干时，表面活性剂还可降低在重配的配制品中的颗粒形成。在本发明的冻干的配制品中，表面活性剂可被加入到一或多种冻干前的配制品、冻干的配制品和重配的配制品中，但是优选加入到冻干前的配制品中。例如，可在冻干前将0.005%吐温80加入到抗体溶液中。表面活性剂包括但非限于吐温20,吐温80,Pluronic.F-68和胆汁盐。在一个实施方案中，表面活性剂浓度为大约0.001%至大约1.0%。冻干过程可产生各种应激，可导致蛋白质或多肽的变性。这些应激包括温度降低、冰晶形成、离子强度增加、pH变化、相分离、水合层除去和浓度变化。对冷冻和/或干燥过程的应激敏感的抗体可通过加入一或多种冻干保护剂而稳定化。冻干保护剂是一种保护抗冻干相关应激的化合物。因此作为一类物质的冻干保护剂包括冷冻保护剂(cryoprotectants)，其仅在冻干过程提供保护。一或多种冻干保护剂可被用于保护抗冻干相关应激，并可以是例如糖如蔗糖或海藻糖；氨基酸如谷氨酸单钠或组氨酸；甲基胺如甜菜碱；易溶(lyotropic)盐如硫酸镁；多元醇如三羟基或更高级糖醇，例如甘油(gjycerin)、赤藓糖醇、甘油(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pkironics;及其组合。优选的冻干保护剂的例子包括但非限于上述稳定剂和表面活性剂。本发明提供了稳定的配制品，其可以通过冻干过程制备。冻干是一个稳定化过程，其中物质首先被冷冻，然后先通过升华降低溶剂数量(初级干燥过程)，然后通过脱附作用降低溶剂数量(二级干燥过程)，直到溶液数量为不再支持生物学活性或化学反应的值。在冻干配制品中，与溶液相关的水解、脱酰胺、氧化和片段化反应可以被避免或显著减慢。冻干的配制品还可以避免由于运输过程中的短期温度波动导致的损害并且使得可以室温储存。本发明的配制品还可以通过本领域已知的其它方法干燥，如喷雾干燥和鼓泡干燥(bubbledrying)。除非特别指明，本发明的配制品是根据它们在冻干前配制品中测量的组分浓度进行描述。在一个实施方案中，本发明提供了稳定倾向于非酶降解的抗体的方法和配制品，所述非酶降解可发生在铰链区。可使抗体倾向于非酶裂解的因素包括氨基酸序列、构象和翻译后加工。抗体经历非酶降解的确定可通过将抗体在水溶液中保温而完成。典型地，保温在用以縮短研究时间的升高的温度下进行。例如，在4(TC或5(TC保温3个月。在保温后，降解产物可用大小排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)进行分析。本领域己知的各种分析技术可以测量重配的冻干配制品的抗体稳定性。这些技术包括例如(i)使用确定主熔融温度(Tm)的差示扫描量热法(DSC)确定热稳定性；(ii)使用在室温的受控搅拌确定机械稳定性；(iii)确定在大约-2(TC、大约4。C、室温(大约23。C-27。C)、大约40。C和大约5(TC的温度下的实时等温加速温度稳定性；(iv)通过监测在大约350nm的吸光度确定溶液浊度，以及O)用SEC-HPLC确定单体、聚集体和降解物的量。稳定性可以在选定的温度选定的时间期间测量。在一个实施方案中，冻干的配制品在重配时提供了高浓度的抗体。在另一个实施方案中，稳定的冻干配制品可用液体重配以形成溶液，该溶液中抗体浓度比冻干前配制品中的抗体浓度高约l-10倍。例如，在一个实施方案中，冻干的配制品用lmL或更少的水重配以获得无颗粒的重配配制品，其抗体浓度为大约50mg/mL至大约200mg/mL。天然存在的抗体典型地具有两个相同的重链和两个相同的轻链，每一轻链通过链间二硫键与重链共价连接。多个二硫键进一步将两个重链进一步互相连接起来。各个链可以折叠成具有相似大小(110-125个氨基酸)和结构但不同功能的结构域。轻链可包含一个可变区(VJ和/或一个恒定区(QJ。重链也可包含一个可変区(Vh)和/或3或4个恒定区(Ch1、Ch2、Ch3和CH4)，这取决于抗体的类别或同种型。在人类中，同种型是IgA，IgD,IgE,IgG和IgM，其中IgA和IgG进一步分成亚类或亚型(IgAw和IgGw)。通常，可变区在一个抗体至另一个抗体间显示相当大的氨基酸序列变异性，特别是在抗原结合位点。在每一Vl和VH中发现有3个区域，称为超变区或互补决定区(CDR)，它们被称为构架可变区的变异性较低的区域支持。由Vl和VH结构域组成的抗体部分被称为Fv(可变区片段)并组成了抗原结合'位点。单链Fv(scFv)是一种抗体片段，其在一个多肽链上含有VJ吉构域和VH结构域，其中一个结构域的N末端与另一个结构域的C末端通过柔性接头连接(参见例如U.S.Pat.No.4，946，778(Ladneretal.);WO88/09344,(Hustonetal.))。WO92/01047(McCaffertyetal.)描述了在可溶的重组遗传展示包装如噬菌体的表面上展示的scFv片段。单链抗体缺失其所来源的完整抗体的一些或全部恒定区。因此，它们能克服与使用完整抗体相关的一些问题。例如，单链抗体趋向于没有某些不希望的重链恒定区与其它生物学分子之间的相互作用。另外，单链抗体显著小于完整抗体并可以具有比完整抗体更高的渗透性，使得单链抗体更有效地定位和结合耙抗原结合位点。另外，单链抗体的相对较小的大小使得它们在受体中比完整抗体更不易引起不希望的免疫应答。多个单链抗体，其中每个单链具有由第一个肽接头共价连接的一个VH和一个VL结构域，可以通过至少一个或多个肽接头共价连接以形成多价单链抗体，这些抗体可以是单特异性的或多特异性的。多价单链抗体的每条链包括可变轻链片段和可变重链片段，并且通过肽接头与至少一条其它链连接。所述肽接头由至少15个氨基酸残基组成。氨基酸残基的最大数量是约100个。两个单链抗体可以组合形成二价抗体，也已知为二价二聚体。二价抗体有两条链和两个结合位点，并且可以是单特异性的或双特异性的。二价抗体的每条链包括与VL结构域相连的VH结构域。这些结构域通过接头连接，接头足够短从而防止同一条链上的结构域配对，由此驱动不同链上的互补结构域配对以产生两个抗原结合位点。三个单链抗体可以被组合以形成三价抗体，也已知为三价三聚体。三价抗体是用V^或VH结构域的氨基末端直接与Vl或VH结构域的羧基末端融合而构建的，即无需任何接头序列。三价抗体具有三个Fv头(head)，多肽以环13状头至尾方式排列。三价抗体的一种可能构象是平面的，三个结合位点位于一个平面中，互相呈120度角。三价抗体可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的。Fab(抗原结合片段)是指由VlClVh和Ch1结构域组成的抗体片段。木瓜蛋白酶消化后产生的那些片段被简单称作Fab并且不保留重链铰链区。在胰蛋白酶消化后，产生了保留重链铰链的各种Fab。链间二硫键保持完整的那些二价片段被称作F(ab')2,而当二硫键未保留时得到了单价Fab'。F(ab')2片段具有比单价Fab片段更高的对抗原的亲合力。Fc(结晶片段)是包含配对的重链恒定区的抗体部分或片段。在IgG抗体中，例如，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc进一步包含CH4结构域。Fc与Fc受体结合、补体介导的细胞毒性的激活以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)相关。对于是多个IgG样蛋白质的复合物的抗体如IgA和IgM，复合物形成需要Fc恒定区。最后，铰链区分开了抗体的Fab和Fc部分，提供了Fab相对于彼此以及相对于Fc的活动性，并且包括多个二硫键以共价连接两个重链。因此，本发明的抗体包括但非限于天然存在的抗体、二价片段如(Fab')2、单价片段如Fab、单链抗体、单链Fv(scFv)、单域抗体、多价单链抗体、二价抗体、三价抗体等，它们特异地与抗原结合。本发明的抗体或其片段例如可以是单特异性的或双特异性的。双特异性抗体(BsAbs)是具有两种不同的抗原结合特异性或位点的抗体。当抗体具有一种以上特异性时，被识别的表位可以与单一抗原或一个以上抗原相关。因此，本发明提供了结合两种不同抗原的双特异性抗体或其片段。抗体或其平的特异性可以基于亲和性和/或亲合力确定。亲和性由抗原与抗体解离的平衡常数(K》代表，其测量抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间的结合强度的指标。亲合力与表位与抗体上的其抗原结合位点之间的亲和性相关，也与抗体效价有关，抗体效价是指特定表位的抗原结合位点数。抗体典型地以10-5-10—"升/mol的解离常数(K》进行结合。低于10—"升/mol的I"通常被认为表明非特异性结合。Kj直越低，抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度越强。如本文所用，"抗体"和"抗体片段"包括保留对特异抗原的特异性的修饰。这些修饰包括但非限于与效应分子如化疗剂(例如顺铂、紫杉醇、阿霉素)或细胞毒素(例如蛋白质或非蛋白质有机化疗剂)的缀合。抗体可以通过与可检测的报道物部分缀合而修饰。还包括在内的是具有影响非结合特征如半衰期的改变的抗体(例如聚乙二醇化)。蛋白质或非蛋白质物质可以通过本领域己知方法被缀合于抗体。缀合方法包括直接连接，通过共价附着的接头连接以及特异性结合配对成员(例如抗生物素蛋白-生物素)。这些方法包括例如Greenfieldetal.,CancerResearch50，6600-6607(19卯)所述关于阿霉素的缀合，以及如Arnonetal.,Adv.Exp.Med.Biol.303,79-90(1991)和Kiselevaetal.，Mol.Biol.(USSR)25,508-514(1991)所述关于铂化合物的缀合。本发明的抗体进一步包括那些结合特征已通过直接突变、亲和成熟方法、噬菌体展示或链改组而改良的抗体。亲和性和特异性可以通过突变CDR并筛选具有希望的特征的抗原结合位点而修饰或改良(参见例如Yangetal.,J.Mol.Biol.,254:392-403(1995))。CDR以各种方式被突变。一种方式是随机化各个残基或残基组合以便在相同抗原结合位点群中所有20个氨基酸在特定的位置被发现。或者，通过易错PCR方法在一系列CDR残基中诱导突变(参见例如，Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992))。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体抗原在大肠杆菌突变子(mutator)菌株中繁殖(参见例如，Lowetal.，J.Mol.Biol.,250:359-368(1996))。这些诱变方法是本领域技术人员已知的许多方法的例子。本发明的抗体的每一结构域可以是完整的免疫球蛋白结构域(例如重链或轻链可变区或恒定区)，或者其抗原是天然存在的结构域的功能等价物或突变体或衍生物，或者是例如用如WO93/11236(Griffithsetal.)所述的技术体外构建的合成结构域。例如，可以将缺失至少一个氨基酸的相应于抗体可变区的结构域连接在一起。抗体的重要区别特征是存在抗原结合位点。术语"可变重链和轻链片段"不应被解释为排除不具有对特异性的实质性作用的变体。本发明的抗体和抗体片段抗原例如得自天然存在的抗体或Fab或scFv噬菌体展示文库。应理解为了从包含Vh和VL结构域的抗体制备单域抗体，在CDR之外一些氨基酸取代可以是增强结合、表达或溶解性所希望的。例如，希望的是修饰会包埋在V『VL界面中的氨基酸残基。另外，本发明的抗体和抗体片段可以使用产生人免疫球蛋白Y重链和k轻链的转基因小鼠(例如来自Medarex,SanJose,Calif.的KM小鼠)通过标准杂交瘤技术获得(Harlow&Lane,ed.,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,211-213(1998)，其引入本文作参考)。在一个优选的实施方案中，产生人抗体的实质部分的基因组被插入到小鼠基因组中，并使得其是产生内源鼠抗体缺陷的。这种显示可以用在完全弗氏佐剂中的部分或全部靶分子皮下(s.c.)免疫。本发明还提供了治疗方法，包括给予重配的配制品。重配的配制品通过例如用lmL水重配本发明的冻干配制品而制备。重配时间优选少于l分钟。浓縮的重配配制品使得给药灵活。例如，重配配制品可以以稀释形式静脉内给药，或者其可以以更浓缩的形式注射给药。本发明的浓缩的重配配制品可以被稀释至符合特定对象和/或特定给药途径的浓度。因此，本发明提供了治疗方法，包括将治疗有效量的抗体给予哺乳动物特别是人。本文所用术语"给予"是指将本发明的抗体组合物通过可以达到所要结果的任何方法输送给哺乳动物。重配配制品可以例如静脉内或肌肉内给药，在一个实施方案中，浓缩的重配配制品通过注射给药。本发明的抗体优选是人抗体。在一个实施方案中，本发明的组合物可以用于治疗肿瘤疾病；包括实体肿瘤和非实体肿瘤，以及用于治疗过度增生疾病。治疗有效量是指本发明的抗体当被给予哺乳动物时有效产生希望的治疗效果的量，如降低或中和VEGFR活性、抑制肿瘤生长或治疗非癌过度增生疾病。给予如上所述抗体可以与给予其它抗体或任何常规治疗剂如抗肿瘤剂联合0在本发明的一个实施方案中，所述组合物可以与一或多种抗肿瘤剂联合给药。可以使用任何合适的抗肿瘤剂.如化疗剂、辐射或其组合。抗肿瘤剂可以是烷基化试剂或抗代谢物。垸基化试剂的例子包括但非限于顺铂、环磷酰胺、美法仑(melphalan)和dacarbazine。抗代谢物的例子包括但非限于阿霉素、道诺霉素、紫杉醇、irinotecan(CPT-1l)和topotecan。当抗肿瘤剂是辐射时，辐射源可以是对于被治疗患者而言外部的(外部光束辐射治疗-EBRT)或内部的(近程治疗-BT)。给予的抗肿瘤剂的剂量取决于各种因素，包括例如，药物类型、被治疗肿瘤的类型和严重性以及给药途径。但是应强调的是本发明不限于任何特定剂量。本发明的抗体可以是但非限于针对VEGFR，IGF-IR，EGFR禾口PDGFR的抗体。.在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段是特异于VEGFR的。在另一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体或其片段，其结合两种不同的抗原，其中至少一种特异性针对VEGFR。VEGFR是指人VEGF受体家族，包括VEGFR-1(FLT1),VEGFR-2(KDR),VEGFR-3(FLT4)。血管内皮生长因子(VEGF)是血管发生的关键介导物。在健康人中，VEGF在发育胚胎、伤口愈合和女性生殖周期中促进血管发生。但是当其被癌基因表达、生长因子和低氧上调时VEGF介导肿瘤中的血管发生。血管发生通过营养素和氧的有限扩散对于肿瘤生长过一定大小是关键的。因此，在一个实施方案中，抗VEGFR抗体结合VEGFR并阻断配体如VEGF的结合。这一阻断可通过干扰VEGFR激活的作用而导致肿瘤生长抑制，其包括肿瘤浸润、转移、细胞修复和血管发生的抑制。在一个实施方案中，抗体是抗VEGFR-2(KDR)抗体IMC-1121B(IgGl)，其在WO03/07840(PCT/US03/06459)中揭示。IMC-1121B的VH的核苷酸和氨基酸序列分别见SEQIDNO1和2。IMC-1121B的VLJ勺核苷酸和氨基酸序列本发明的抗体或其片段的等价物也包括具有与本文提供的全长抗VEGFR抗体的可变区或超变区的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。本文定义的基本上相同的氨基酸序列是具有至少约70%、优选至少约80%、更优选至少90%同源性的序列，所述同源性由PearsonandLipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,2444-8(1988))的FASTA检索方法确定。实施例下述实施例进一步例证了本发明，但不应被解释为限制本发明范围。常规方法如蛋白质分析中采用的方法的详细描述可以得自许多出版物如CurrentProtocolsinImmunology(由JohnWiley&Sons出版)。本文提及的所有参考文献均全文引入。实施例1抗VEGFR-2抗体IMC-1121B的片段化将在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5mg/mLIMC-1121B在4(TC保温3个月。保温后，用SEC-HPLC和N末端测序分析降解产物。在PBS中的降解的IMC-1121B的SEC-HPLC层析谱示于图1。除了聚集体(级分l)和单体峰之外，降解的产物还具有两个降解物峰(级分2和3)。用级分收集器收集级分用于N末端序列分析。IMC-1121B重链的cDNA序列示于图2。信号序列、可变区和恒定区分别用下划线、双下划线和纯文字示出。降解样品和级分2和3的N末端序列分析显示重链片段化的两个位点(图2中的灰色高亮文字)。在N末端第156个残基的位点产生两个重链片段，在还原SDS-PAGE(图3)上显示为约40KD和约15KD的条带。在N末端第220个残基的铰链区中的其它片段化位点在还原SDS-PAGE上产生约33KD和约27KD的条带(图3)。实施例2缓冲液配制品的优化IMC-1121B的冻干配制品以两个阶段开发。在第一阶段，使用实验设计方法(DOE)用表1列出的分类因子模拟(fractionalfactorialmodeling)优化溶剂18缓冲液。在这一优化过程中筛选的因素是缓冲液、pH、盐、氨基酸、表面活性剂糖和糖衍生物。溶剂优化在5mg/mL的1121B浓度进行。使用在室温以300rpm的受控搅拌测试机械稳定性。热稳定性用DSC和加速温度(acceleratedtemperature)测试。用传统的单因素轮换(one-factor-at-a-time)方法学证实了DOE预测。用线性回归分析确定结果的显著性。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表1实验(DOE)矩阵设计差示扫描量热法(DSC)研究熔融或转变温度(Tm)用MicroCalVP-DSC测量。蛋白质浓度设定为5mg/mL，温度斜坡(ramping)是以扫描速度1.5°C/min从5匸至95°C。收集各种配制品(表l)中IMC-1121B的热熔融曲线。相应于主转变峰(50%分子被变性)的熔融温度拟合成线性回归模型以估计测试的变量对Tm的作用。模型是统计学有效的，p=0.0006。显著的因素(p0.05)是pH和缓冲液类型。图4示出了随缓冲液类型和pH的Tm变化的回归图。对于组氨酸、柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液，优化的pH大约是6.0，其比pH6.0的磷酸盐缓冲液优越。其它的变量对Tm不具有统计学显著作用。搅拌研究将抗体溶液在室温于平台摇床上以300rpm搅拌。在20mL玻璃瓶中的5mL浓度为5mg/mL的IMC-1121B在各种配制品中(表l)搅拌直至84小时。溶液浊度、单体百分比、聚集体百分比和降解物百分比如下确定。溶液浊度用Shimatzu1601biospec分光光度计在350nm的吸光度而测量。单体百分比、聚集体百分比和降解物百分比用SEC-HPLC测量，SEC-HPLC在Agilent1100SeriesLC上进行，使用TosophBiosepTSK3000柱，以10mM磷酸钠，0.5MCsCl,pH7.0作为流动相。测试的变量对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用通过用JMP软件(SASinstitute,NC)拟合成线性回归模型而估计。预测图的实际值(ActualbyPredictedplot)的p值是<0.002。图5示出了显著性变量pH、吐温80,NaCl和时间对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用。在4(TC的实时加速温度稳定性在各种配制品中(表l)的5mg/mL的IMC-1121B在4(TC保温直至14天。如上所述确定溶液浊度、单体、聚集体和降解物百分比。测试的变量对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用通过将其用JMP软件拟合成线性回归模型而估计。预测图的实际值的p值是<0.001。图6示出了显著性变量对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用。最佳缓冲液是pH6.0的组氨酸。盐减少了单体并增加了聚集。但是不影响降解。甘氨酸对单体、聚集体或降解物无作用。在-20。C的实时冷冻温度稳定性在各种配制品中(表l)的5mg/mL的IMC-1121B抗体在-2(TC保温直至16天。如上所述确定溶液浊度、单体、聚集体和降解物百分比。测试的变量对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用通过将其用JMP软件拟合成线性回归模型而确定。预测图的实际值的p值是<0.001。图7示出了显著性变量对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用。最佳pH是6.0。天冬氨酸增加了单体并降低了聚集，对降解的作用可忽略。NaCl和甘氨酸对浊度、单体、聚集体和降解物百分比的作用可忽略。实施例3在PBS禾口10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)配制品中IMC-1121B稳定性的对比DOE筛选研究预测IMC-1121B抗体在10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)配制品中比在PBS中有显著更好的稳定性。在这一研究中，通过各种技术检查了以5mg/mL浓度在10mM组氨酸pH6.0和PBS中的IMC-U21B的稳定性以证实DOE预测。差示扫描量热法(DSC)研究IMC-1121B在PBS和10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)配制品中的热稳定性根据上述方法中描述的程序检查。在PBS和10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-1121B的主转变熔融温度(meltingtemperaturesformaintransition):5)"另ll是70.0禾口76.6°C。在40。C和室温的实时加速温度稳定性5mg/mL的IMC-1121B在PBS和10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)配制品中在4(TC和室温(RT)保温直至150天。保温后，样品如下所述用SEC-HPLC，IEC-HPLC,SDS-PAGE和IEF分析。SEC-HPLC分析在4(TC和室温保温150天后的在PBS或10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-1121B的SEC-HPLC分析根据上述程序进行。HPLC层析谱如图8所示。在对照、RT和4(TC样品中的总聚集体百分比对于PBS分别是0.90,1.49禾Q3.90，对于10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)分别是0.80,0.82禾卩0.75。在对照、RT和4(TC样品中的总降解物百分比对于PBS分别是1.32,2.56和12.54，对于10mM组氨酸缓冲液pH6.0配制品分别是1.23，2.09和9.00。图9、10和11分别示出了作为保温时间的函数的单体百分比、聚集体百分比和降解物百分比中的变化。在PBS配制品中单体百分比以比在10mM组氨酸(pH6.0)中更快的速度降低，聚集体百分比和降解物百分比以比在10mM组氨酸(pH6.0)中的更快速度增加。10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)提供了用于维持IMC-1121B抗体的优越环境。IEC-HPLC分析在4(TC和室温保温30天和150天后的IMC-1121B的21离子交换层析在Agilent1100SeriesLC上使用DionexProPacWCX-10分析柱进行。样品在32分钟中用从10mM磷酸盐(pH7.0),20mMNaCl至10mM磷酸盐(pH7.0),100mMNaCl的线性梯度洗脱。IEC-HPLC层析谱示于图12.在室温和40°C保温导致在两种配制品中峰向更低的保留时间(即向酸性pH)偏移。但是，偏移在PBS配制品中比在10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)配制品中显著更大。SDS-PAGE分析在PBS或10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)的IMC-1121B抗体(5mg/mL)在室温或40。C保温150天，之后根据标准方案进行还原和非还原SDS-PAGE(4-20%tds-甘氨酸梯度凝胶)。通过条带密度测量，在PBS中保温的样品比在10mM组氨酸(pH6.0)中保温的样品具有更大量的降解产物(图13)。等电聚焦(IEF)分析在RT和4(TC保温150天后的以5mg/mL在PBS和10mM组氨酸(pH6.0)配制品中的IMC-1121B用IEF分析(pH范围6.0-10.5)。等电聚焦分析在IsoGd(R)琼脂糖IEF平板上进行，pH范围6.0-10.5。所得条带在PBS和组氨酸配制品中向酸性pH迁移。但是PBS配制品的偏移比10mM组氨酸(pH6.0)配制品的偏移更大(图14)。实施例4冻干配制品筛选在优化的第二阶段，在固定抗体浓度即在IOmM组氨酸缓冲液(pH6.0)中20mg/mL优化填充剂和冷冻保护剂和冻干保护剂。测试的添加剂是甘露醇、甘氨酸、蔗糖和海藻糖，如实验矩阵的设计所示(表2)。作为对照，分析在具有PBS缓冲液(pH6.0)或10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)的溶液配制品(不冻干)中的5mg/mLIMC-1121B抗体。表2用于冻干配制品筛选的DOE矩阵<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>冻干过程产物用LyostarII冻干仪冻干。冻干盘在室温加样。产物在-50°〇浸透2小时。初次干燥在-3(TC进行10小时，接着在2(TC进行二次干燥10小时。冷却和加热速度为0.5'C/分钟。在初次和二次干燥时的腔压力是50mT。一旦冻干完成，将样品腔用氮气回填并加帽。冻干过程在约24小时完成。图15示出了作为运行时间的函数的搁板设定温度(shelfsettemperature)和产物温度。当产物温度达至lj(或跨过(crossed))搁板设定温度则认为冻干过程完成。加速温度稳定性冻干抗体配制品在4(TC或5(TC保温100天。在保温期后，用10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)重配产物至5mg/mL。重配时间少于1分钟。保温后保留的单体百分比示于图16。具有4%蔗糖或4%海藻糖的冻干配制品在40。C或5(TC保温100天后保留最高单体百分比。冻干和溶液配制品之间加速温度稳定性比较冻干配制品(1)20mg/mLIMC-1121B，4%蔗糖，10mM组氨酸缓冲液(pH6.0),禾口(2)20mg/mLIMC-1121B,4%海藻糖，10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)与溶液配制品(1)5mg/mLIMC-1121B于PBS(pH7.2)中禾口(2)5mg/mLIMC-1121B于10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中进行比较。样品在40。C或50。C保温直至100天。保温后，冻干产物用10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)重配至5mg/mL。重配的冻干样品和溶液样品经SEC-HPLC分析。作为在40。C或5(TC保温时间的函数的单体、聚集体和降解物百分比的变化在图17至23中给出。在溶液配制品中降解百分比随时间增加但是在冻干配制品中保持不变(图19和22)。实施例5用于高浓度抗体的冻干配制品前面的结果证实所测试的化合物中，4%蔗糖或4%海藻糖提供了浓度为20mg/mL的IMC-1121B抗体的冻干配制品的最高稳定性。在这一研究中我们将IMC-1121B浓度从20mg/mL升高至50mg/mL并将蔗糖浓度从4%变为8%，以配制浓度为50mg/mL的IMC-1121B。作为对照，还冻干了在4%蔗糖存在下的20mg/mL的IMC-1121B。冻干的产物和对照溶液配制品在室温、4(TC和5(TC保温直至3个月。对照溶液配制品由优化的目前推荐的IMC-1121B抗体的溶液配制品(5mg/mL于10mM组氨酸，133mM甘氨酸,75mMNaCl，0.01%吐温80中)组成。在保温后，冻干的产物用10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)重配至5mg/mL，然后用SEC-HPLC,IEC-HPLC,和还原和非还原SDS-PAGE分析。冻干和溶液配制的IMC-1121B在5(TC保温后的SEC-HPLC分析在冻干之前和之后及在1个月和3个月在5(TC保温后在样品上进行SEC-HPLC。保温后，冻干的产物用10mM组氨酸(pH6.0)重配。单体、聚集体和降解物百分比的变化分别示于图23、24和25。对于8%蔗糖样品单体的百分比最大，聚集体最小。冻干的样品比溶液配制的样品含有显著更少的降解物。冻干的和溶液配制的IMC-1121B在室温和40'C保温后的SEC-HPLC和IEC-HPLC分析在冻干之前和之后及在1个月和3个月在室温和4(TC保温后在样品上进行SEC-HPLC和IEC-HPLC。保温后，冻干的产物用10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)重配。对于在4(TC保温的样品单体、聚集体和降解物百分比的变化分别示于图26,27和28，对于在室温保温的样品所述变化示于图30，31和32中。冻干的样品比溶液配制的样品含有显著更少的降解物。在溶液或含有8%蔗糖的冻干品中保温3个月的IMC-1121B的IEC-HPLC层析谱示于图29(4(TC保温)和图33(室温保温)。参考IMC-1121B样品包括用于比较。冻干样品的层析谱类似于参考IMC-1121B，但溶液配制的IMC-1121B的层析谱24向酸性pH偏移。保温3个月后冻干和溶液配制的IMC-1121B的SDS-PAGE分析冻干的产物重配进10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中。在3个月保温后保持在溶液中的IMC-1121B和在10mM组氨酸缓冲液(pH6.0)中的IMC-112IB重配的冻干的样品用4-20。/。还原SDS-PAGE(图34)和4-20%非还原SDS-PAGE(图35)分析。与非冻干配制品比较，冻干的配制品，具有4%蔗糖的20mg/ml抗体和具有8%蔗糖的50mg/ml抗体展示显著降低的重链降解。权利要求1.一种稳定的配制品，其包含抗体和缓冲液，其中抗体的非酶解片段化被显著(substantially)降低。2.权利要求l的配制品，其中所述抗体是抗VEGFR抗体。3.权利要求l的配制品，其中所述抗体是抗VEGFR2抗体。4.权利要求3的配制品，其中VEGFR2抗体是IMC-1121B。5.权利要求1的配制品，其中所述抗体浓度为大约50至大约200mg/ml。6.权利要求l的配制品，其中所述缓冲液包含组氨酸缓冲液。7.权利要求6的配制品，其中所述组氨酸缓冲液浓度为大约5mM至大约50mM。8.权利要求6的配制品，其中所述组氨酸缓冲液浓度为大约l.OmM。9.权利要求6的配制品，其中所述组氨酸缓冲液pH是大约5.5至大约6.5。10.权利要求6的配制品，其中所述组氨酸缓冲液pH是大约6.0。11.权利要求l的配制品，其中所述缓冲液包含拧檬酸盐缓冲液。12.权利要求ll的配制品，其中所述柠檬酸盐缓冲液pH是大约5.5至大约6.5。13.权利要求ll的配制品，其中所述柠檬酸盐缓冲液pH是大约6.0。14.权利要求l的配制品，其中所述缓冲液包含乙酸盐缓冲液。15.权利要求14的配制品，其中所述乙酸盐缓冲液pH是大约5.5至大约6.5。16.权利要求14的配制品，其中所述乙酸盐缓冲液pH是大约6.0。17.—种稳定的冻干配制品，包含抗体缓冲液，以及冻干保护剂其中抗体的非酶解片段化被显著降低。18.权利要求17的配制品，其中所述抗体是抗VEGFR抗体。19.权利要求17的配制品，其中所述抗体是抗VEGFR2抗体。20.权利要求17的配制品，其中VEGFR2抗体是IMC-U21B。21.权利要求17的配制品，其中所述抗体浓度为大约50至大约200mg/ml。22.权利要求17的配制品，其中所述缓冲液包含组氨酸缓冲液。23.权利要求22的配制品，其中所述组氨酸缓冲液浓度为大约5mM至大约50mM。24.权利要求22的配制品，其中所述组氨酸缓冲液浓度为大约10mM。25.权利要求22的配制品，其中所述组氨酸缓冲液pH是大约5.5至大约6.5.26.权利要求22的配制品，其中所述组氨酸缓冲液pH是大约6.0。27.权利要求17的配制品，其中所述缓冲液包含柠檬酸盐缓冲液。28.权利要求27的配制品，其中所述柠檬酸盐缓冲液pH是大约5.5至29.权利要求27的配制品，其中所述柠檬酸盐缓冲液pH是大约6.0。30.权利要求27的配制品，其中所述缓冲液包含乙酸盐缓冲液。31.权利要求30的配制品，其中所述乙酸盐缓冲液pH是大约5.5至大约6.5.32.权利要求30的配制品，其中所述乙酸盐缓冲液pH是大约6.0。33.权利要求17的配制品，其中所述冻干保护剂是糖。34.权利要求33的配制品，其中所述冻干保护剂是蔗糖。35.权利要求33的配制品，其中所述冻干保护剂是海藻糖。36.权利要求17的配制品，其还包括表面活性剂。37.权利要求36的配制品，其中所述表面活性剂是吐温80。38.权利要求17的配制品，其还包括稳定剂。39.权利要求38的配制品，其中所述稳定剂是天冬氨酸。40.冻干的配制品，其包含:抗VEGFR抗体，缓冲液，以及冻干保护剂。41.权利要求40的配制42.权利要求41的配制43.权利要求42的配制44.权利要求40的配制45.权利要求44的配制大约50mM。46.权利要求44的配制47.权利要求44的配制l品l品l品l品I品I叩I品约6.5。l品48.权利要求44的配伟49.权利要求40的配制50.权利要求40的配制51.权利要求40的配制52.权利要求51的配制53.权利要求51的配制54.权利要求40的配制55.权利要求54的配制56.权利要求40的配制57.权利要求56的配制58.冻干的配制品，其包含抗VEGFR2抗体，组氨酸缓冲液，以及冻干保护性糖。l品l品l品l品l品|品l品l品|品其中所述抗体是抗VEGFR2抗体。其中VEGFR2抗体是IMC-1121B。其中所述抗体浓度为大约5至大约50mg/ml。其中所述缓冲液包含组氨酸缓冲液。其中所述组氨酸缓冲液浓度为大约5mM至其中所述组氨酸缓冲液浓度为大约10mM。其中所述组氨酸缓冲液pH是大约5.5至大其中所述组氨酸缓冲液pH是大约6.0。其中所述缓冲液包含柠檬酸盐缓冲液。其中所述缓冲液包含乙酸盐缓冲液。其中所述冻干保护剂是糖。其中所述冻干保护剂是蔗糖。其中所述冻干保护剂是海藻糖。其还包括表面活性剂。其中所述表面活性剂是吐温80。其还包括稳定剂。其中所述稳定剂是天冬氨酸。约6.559.权利要求58的配制品，其中所述VEGFR2抗体是IMC-1121B。60.权利要求58的配制品，其中所述组氨酸缓冲液pH是大约5.5至61.权利要求58的配制品，其中所述组氨酸缓冲液pH是大约6.0。62.权利要求58的配制品，其中所述冻干保护剂是蔗糖。63.权利要求58的配制品，其中所述冻干保护剂是海藻糖。64.权利要求58的配制品，其还包括表面活性剂。65.权利要求64的配制品，其中所述表面活性剂是吐温80。66.权利要求58的配制品，其还包括稳定剂。67.权利要求66的配制品，其中所述稳定剂是天冬氨酸。68.一种治疗方法，包括给予重配的配制品，所述重配的配制品包含抗VEGFR抗体，缓冲液，及冻干保护剂。全文摘要本发明提供了用于稳定抗体的配制品和方法。在一个实施方案中，本发明提供了倾向于在铰链区非酶解片段化的抗体的稳定配制品。在另一个实施方案中，本发明提供了稳定抗体的方法，包括冻干抗体的水性配制品。所述配制品能够被冻干以在加工和储存过程中稳定抗体，然后所述配制品可以被重配用于药物学给药。在一个实施方案中，本发明提供了稳定抗VEGFR抗体的方法，包括冻干抗VEGFR抗体的水性配制品。所述配制品可以被冻干以在加工和储存过程中稳定抗VEGFR抗体，然后所述配制品可以被重配以用于药物学给药。文档编号A61K39/00GK101495136SQ200780009201公开日2009年7月29日申请日期2007年2月15日优先权日2006年2月15日发明者A·斯里瓦斯塔瓦,J·戈尔德施泰因申请人:英克隆系统公司