抗体的配制品的制作方法

专利名称：抗体的配制品的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体的稳定配制品。优选的稳定配制品包括25-250mg/ml抗体，10至30mM缓冲物质，1%至15%多元醇，0. 001%至0. 05%表面活性剂以及pH从5至7. 5。本发明另外的方面特征是制备上述配制品的方法。
背景技术：
单克隆抗体(mAb)允许表征在细胞表面上表达的生理学重要的分子。“白细胞分化簇”或抗原(⑶)限定于免疫系统的细胞中(scholossman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today15(3) ;98)。在淋巴样细胞个体发育发展过程中CD在它们分化和成熟中，在细胞识别和附着的机制中，以及在免疫应答期间在活化和增殖机制中作用的定义已经导致将它们对应的mAb用于诊断和免疫治疗中，其中有前途的结果见于(Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin.Tmmun01 3:740)。 生物技术发展的最新进展以足够大量数量提供了广泛多样的生物学活性多肽用作药物。然而，由于多种物理不稳定性(包括变性以及形成可溶性或不可溶性聚集体)，以及多种化学不稳定性(例如水解、氧化、以及脱酰胺作用)，这些多肽可能失去它们潜在的生物活性。在液体药物配制品中这些多肽的稳定性可能例如受多种因素影响，例如pH、离子强度、温度、冷冻-融化重复循环、以及暴露于机械剪切力(例如在处理过程中发生的)。由于物理搅拌以及在溶液中以及在储存小瓶中液-气界面处多肽分子的相互作用，也可能发生聚集体形成和生物活性丧失。US20030190316涉及包含处于甘氨酸缓冲剂和/或组氨酸缓冲剂中抗体的稳定制剂并且还提供了用于制备包含蛋白的稳定制剂的方法，包括用一种碱性氨基酸或一种碱性氨基酸衍生物或其一种盐来调节pH。当已经配制了多种液体药物组合物以稳定包含在其中的多肽生物活性时，对于医学从业人员而言在液体配制品中多肽的降解不断地产生问题。因此，对于包括促进多肽组分稳定性的生理学相容性稳定剂的另外的药物组合物存在需要，由此保持了它们的疗效。发明目的本发明的主要目的是获得包括抗体、缓冲剂以及一种或多种药学上可接受赋形剂的配制品。本发明另一个目的是获得包括一种抗体或其片段、缓冲剂以及溶解保护剂的配制品。本发明又另一个目的是获得抗体的稳定配制品。

发明内容
相应地，本发明涉及包括抗体、缓冲剂以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的一种配制品；包括抗体或其片段、缓冲剂或溶解保护剂的一种配制品；包括a)约25mg/ml至约250mg/ml抗体，b)提供pH5至pH7. 5的缓冲剂的一种抗体的稳定配制品；包括a)约lOOmg/ml至约150mg/ml抗体，b)提供pH5至pH7. 5的缓冲剂，c)约0. 001%至约0. 05%非离子型表面活性剂的一种抗体的稳定配制品；以及包括a)约100mg/ml至约150mg/ml抗体，b)提供pH5至pH7. 5的缓冲剂，c)约0. 001%至约0. 05%非离子型表面活性剂以及(d)溶解保护剂和/或冷冻保护剂的一种抗体的稳定配制品。


图I :在所评估的不同配制品的研究过程中pH变率。图2 :在所评估的不同配制品的研究过程中同渗质量摩尔浓度(mosmolality)数值。图3 :归一化的荧光图显示在不同条件下孵化的不同配制品中样品的图谱和\最大值是不同的。 图4 :样品的流体动力学半径分析。图5:在40° C下孵化的样品中电荷变异体分布。图6:在40° C下孵化的样品中电荷变异体分布(组氨酸海藻糖突出显示)。图7 :用于磷酸盐和组氨酸基配制品的离子交换层析谱图的重叠显示在磷酸盐基的配制品中具有更高的酸性变异体。图8 :表示在40 ° C下孵化的样品中单体％降低的图形。图9 :在40 ° C下通过SEC (%HMWP+%LMWP )说明降解剂增加的图形。图10 :在测试的四种配制品中LMWP增加。所以四种配制品遵循相同的趋势并且数值非常相似除了该组氨酸海藻糖配制品具有比其他配制品显著地更低的断裂。图11 :在测试的四种配制品中HMWP的增加趋势。与磷酸盐样品相比较包含组氨酸的配制品显示更低的聚集作用。图12 :在不同配制品中Tlh样品的pH变率。图13 :反复冷冻-融化样品的蛋白浓度。图14 :在反复冷冻-融化之后在磷酸盐和组氨酸中Iml样品的SEC谱图。图15 :在磷酸盐和组氨酸配制品中0. 5ml样品的SEC谱图比较。图16 :在经受反复冷冻和融化的两种配制品中Iml样品的SEC数据。图17 :在经受反复冷冻和融化的两种配制品中0. 5ml样品的SEC数据。图18 lml样品的离子交换层析谱图的重叠显示在磷酸盐样品中在40min处可能的聚集体洗脱。图19 :0. 5ml样品的重叠显示在40min处在磷酸盐样品中聚集体洗脱，但是在组氨酸样品中则没有。图20 :在磷酸盐和组氨酸配制品中经历反复冷冻和融化的Iml样品的IEX数据。图11 :在磷酸盐和组氨酸配制品中经历反复冷冻和融化的0. 5ml样品的IEX数据。图22 :在冷冻状态样品中pH变率。图23 :在冷冻状态稳定性样品中的蛋白浓度。图24 :冷冻状态稳定性的SEC重叠显示磷酸盐聚集作用的显著增加。图25 :在冷冻状态稳定性样品中尺寸变异体分布的SEC数据。
图26 :冷冻状态稳定性样品的IEX层析图谱的重叠。图27 :在磷酸盐和组氨酸中冷冻状态稳定性的IEX数据。
具体实施例方式本发明涉及包括抗体、缓冲剂以及一种或多种药学上可接受赋形剂的一种配制品。
本发明涉及包括一种抗体或其片段、缓冲剂以及溶解保护剂的一种配制品。在本发明的一个实施方案中，该缓冲剂选自TRIS、磷酸盐类、琥珀酸盐类、柠檬酸盐类、乙酸盐类、咪唑类、甘氨酸、L-精氨酸、组氨酸以及它们的组合。在本发明的另一个实施方案中，该缓冲剂优选地是组氨酸。在本发明的另一个实施方案中，该溶解保护剂选自一种多元醇或糖类。在本发明的又另一个实施方案中，这些溶解保护剂在性质上是非还原性的，例如PEG、甘油、蔗糖、海藻糖以及甘露醇。在本发明的又另一个实施方案中，该配制品进一步包括冷冻保护剂类。在本发明的又另一个实施方案中，该冷冻保护剂优选地是海藻糖。在本发明的又另一个实施方案中，该配制品进一步包括表面活性剂。在本发明的又另一个实施方案中，其中表面活性剂选自包括聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80的组。在本发明的又另一个实施方案中，该配制品进一步包括填充剂(bulking agent)。在本发明的又另一个实施方案中，其中填充剂选自包括甘氨酸和甘露醇的组。本发明涉及一种抗体的稳定配制品,包括a)约25mg/ml至约250mg/ml抗体，b)提供PH5至pH7. 5的缓冲剂。本发明涉及一种抗体的稳定配制品，包括a)约100mg/ml至约150mg/ml抗体，b)提供PH5至pH7. 5的缓冲剂；c)约0. 001%至约0. 05%非离子型表面活性剂。本发明涉及一种抗体的稳定配制品,包括a)约100mg/ml至约150mg/ml抗体，b)提供PH5至pH7. 5的缓冲剂；c)约0. 001%至约0. 05%的非离子型表面活性剂；以及d)溶解保护剂和/或冷冻保护剂。在本发明的一个实施方案中，该配制品是一种冻干的饼状物或粉末。在本发明的一个实施方案中，在用于注射的无菌水或用于注射的溶菌水(bacteriolytic water)中进一步重新构造该配制品。本发明的主要目的是提供一种稳定的液体药用组合物，包括抗体、缓冲物质、多元醇以及表面活性剂。有利地是发现根据本发明的组合物的配制品产生在储存是具有稳定性的组合物。在存储时进行稳定是指免疫球蛋白基本上不聚集也不降解并且保持可接受的体外和体内活性水平。本发明的另一个方面涉及制备抗体配制品的方法。本发明是针对包括作为治疗活性组分的抗体的液体药用组合物并且针对用于它们制备的方法。为了本发明的目的，就药用组合物或配制品而言术语“液体”旨在包括术语“水性的”。如在此使用的术语“抗体”涵盖了天然发生的(天然的)、合成的以及重组的抗体和蛋白，以及它们的生物学活性变异体(如在本文中别处限定的)。“治疗活性组分”一词是指当将该药用组合物施用到受试者体内时该抗体特异性地结合到该组合物中从而在治疗、预防、或诊断受试者体内疾病或病症方面带来希望的治疗反应。更具体地，本发明的组合物是稳定的液体药用组合物，其治疗活性组分包括在存储期间在液体药物配制品中正常地呈现聚集体形成的一种抗体。“聚集体形成”一词是指在多肽分子之间的一种物理相互作用，这导致寡聚物形成，这些寡聚体可以保持可溶性，或从溶液中沉淀的较大的可见聚集体。“存储期间”一词是指制备后的一种液体药用组合物或配制品不立即施用于受试者体内。而是，在制备之后，将它包装用于以液体形式、以冷冻状态、或以干燥形式进行存储用于以后重新组成液体形式或适合施用到受试者体内的其他形式。在液体药用组合物的存储期间由多肽形成聚集体可能不利地影响该多肽的生物活性，导致该药用组合物疗效丧失。此外，聚集体形成可能引起其他问题，例如当使用灌注系统施用包含该多肽的药用组合物时阻塞了管道、薄膜、或泵。本发明稳定的液体药用组合物进一步包括一定数量的缓冲种类。这些缓冲种类主要地包括磷酸盐或组氨酸。该配制品的缓冲种类旨在维持pH。这些磷酸盐配制品的pH设 定为7并且组氨酸配制品的pH设定为6，因为这些pH位于这些缓冲种类的缓冲范围内。添加到本发明组合物中的表面活性剂的稳定数量是足以抑制包含抗体的组合物中聚集体形成或混浊的数量。例如当长期存储、机械搅拌、冷冻和融化时，可以发生这种聚集体形成。观察到显著地抑制了聚集或混浊，并且在具有表面活性剂的包含该抗体的组合物中相比于在不包含表面活性剂的可比较的配制品中混浊/聚集体形成少至少10%，优选少至少50%、更优选少至少70%、并且最优选少至少90%。用320nm处吸光度进行小瓶和包含抗体的组合物的目测检验可以被监测用于确定聚山梨醇酯80将蛋白分子保持在溶液中的能力。在缺少聚山梨醇酯80的样品中在320nm处的吸光度(主要地由于分子在溶液中散射而产生的)是显著得多的。如在此使用的“表面活性剂”被限定为涵盖任何去污剂，该去污剂具有一个亲水性区域以及一个疏水性区域，并且包括非离子型、阳离子型、阴离子型以及两性离子型去污齐U。适当的表面活性剂包括例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(也称为聚山梨醇酯80或“吐温”80)，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(也称为聚山梨醇酯20，或“吐温”20)、或N-月桂基肌氨酸。非离子型表面活性剂优选地用于在此所述的配制品。这类非离子型表面活性剂可以选自下面表面活性剂例如聚氧单体或聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。聚山梨醇酯80优选地用于本发明的组合物。该表面活性剂能够以按重量计0. 01%-0. 5%的浓度存在。这些免疫球蛋白亚基多肽各自包括一个恒定区和一个可变区。在大多数种类中，重链可变区(或VH结构域)和轻链可变区(或VL结构域)相结合从而形成包括“互补决定区”(或CDR)(特异性地促成针对特定表位的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的部分)的一个抗原结合域。通常地，重链和轻链各自具有三个CDR，这些CDR促使形成该免疫球蛋白的抗原结合位点。通常地但不是不变地，免疫球蛋白分子的“抗原结合域”由一个重链的可变域的至少一部分和一个轻链的可变域的至少一部分组成(通过二硫键保持在一起)。Fe区域对于抗体的效应子功能是重要的。这些效应子功能包括引发补体依赖性细胞毒性(⑶C)、引发细胞吞噬作用以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，并且通过胞吞转运作用将抗体转移穿过细胞屏障。此外，Fe区域对于保持种类IgG抗体的血清半衰期是重要的(Ward andGhetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995))。—个另外的方面，本发明提供了一种改变的抗体、或选自Fab、Fe或其一部分的功能性片段。
在一个另外的方面，本发明提供了包括本发明的一种抗体或其功能性片段连同一种药学上可接受的稀释剂或载体一起的一种药用组合物。该组合物可以包括一种或多种缓冲种类、一种或多种多元醇、以及一种或多种表面活性剂。该组合物包括多种药学上可接受的载体。药学上接受的载体包括但不限于盐水、无菌水、磷酸盐缓冲盐水等。其他缓冲剂类、分散剂类、以及适合递送到病人体内的惰性无毒性物质可以包括在本发明的组合物中。这些组合物可以是适合给药的溶液，并且典型地是无菌的以及不含有不希望的颗粒物质。本发明上下文中使用的缓冲剂优选地是磷酸盐或组氨酸。最优选地，本发明的配制品中使用的缓冲剂不限于乙酸盐、琥珀酸盐、组氨酸以及磷酸盐，它们可以如此地或组合地使用。令人希望地，该配制品溶液的pH是在5至7. 5的范围内，并且该溶液的pH优选地是在5. 5至6的范围内，如果必要的话，将最终pH调节到希望的水平。在本发明上下文中使用的多元醇是还原糖，它们起数种作用例如用于抗体的稳定齐U、一种张力改性剂并且冷冻保护剂和溶解保护剂也包括在该配制品中。最优选地，本发明配制品中使用的多元醇是非还原性糖例如蔗糖或海藻糖。本领域普通技术人员熟知的其他药学上可接受的赋形剂还可以形成受试者组合物的一部分。这包括例如多种填充剂并且其中填充剂是选自甘氨酸或甘露醇。在一个实施方案中，该配制品的糖组分(蔗糖和海藻糖)具有多种目的糖作为抗体的稳定剂起作用，保护它避免降解；它们是冷冻/溶解保护剂，在冻干过程期间(该冻干过程涉及冷冻和干燥两者)这些保护剂保护该抗体；它们也是张力改性剂，其浓度可以被调节以便提供一种等渗产物。在皮下施用的产物(例如这种产物)中张力是显著的，因为等渗产物能够显著地降低在注射位点处的刺痛。选择蔗糖和海藻糖用于评估因为它们两者都是还原糖并且已经广泛用于稳定蛋白。选择该糖的浓度从而提供用于皮下给药的等渗溶液。在本发明的另一个实施方案中，配制品筛选研究的结果表明在2-8° C下并且当经历冷冻/融化时在这些配制品之间在HMWP或LMWP中未观察到显著差异。然而，当在40° C下孵化时，与磷酸盐基的配制品相比较，在包含组氨酸的缓冲剂中抗体的物理稳定性得以改善，尤其是在聚集方面(图11)。在组氨酸海藻糖配制品中Tlh样品始终呈现最高百分比率的单体并且因此呈现所有四种测试配制品的最低降解物百分比。在本发明的又另一个实施方案中，在2-8° C下通过孵化抗体或在冷冻/融化下电荷变异体分布未改变。然而，在40° C下孵化该抗体在由每种配制品提供的稳定程度方面产生了差异。与磷酸盐配制品相比较，基于组氨酸的配制品又是更慢的从而积聚酸性变异体。在组氨酸配制品中，与组氨酸蔗糖相比较，组氨酸海藻糖始终呈现较低酸性的变异体，并且因此呈现更高的主峰％(图5:在40° C下孵化的样品中电荷变异体分布。图6:在40° C下孵化的样品中电荷变异体分布)。该抗体的效价/生物活性在任何配制品和/或条件中未被改变并且可与标准品比较。可以得到这个结论，因为活性/效价测定还没有发展到足以在不同配制品之间进行区别。鉴于这些基于组氨酸的配制品能够比磷酸盐组合物更好地保护抗体避免降解的事实，这可能是一个重要的考虑方面。在本发明的另一个实施方案中，如通过荧光光谱法以及DSC评估的抗体的构象稳定性在所测试的任何配制品中不经历显著改变。在荧光实验中(图3)在\最大值(该最大值可能指出该抗体3D构象的改变)中没有改变。类似地，在针对TO样品和40° C样品观察到的解链温度方面没有显著差异，这表明该抗体的不同结构域仍然以许多与研究起始相同的方式进行去折叠。在下面实例中对本发明进行进一步限定。应当理解的是这些实例，虽然指示本发明的优选实施方案，是仅通过说明的方式给出的。从上面讨论和这些实例中，本领域普通技术人员可以确定本发明的本质特征，并且不偏离其精神和范围，可以对本发明做出多种改变和变更以使它适应多种用途和条件。从下面实例可以更好地理解本发明。然而，本领域普通技术人员可以容易理解的是这些实例仅是用作本发明的说明，本发明限定于此后随附的权利要求中。 通过下面实例和图形进一步详细说明本发明。然而，这是实例不应解释成限制本发明的范围。下面的实例代表本发明的优选实施方案。
具体实施例方式A.可以用下面方式制备包含mAB的配制品。通过使用正切流动过滤(TFF)或UF/DF将纯化的抗体浓缩到希望的高浓度并且随后将缓冲剂更换成配制品缓冲剂。通过使用正切流动过滤(TFF)或UF/DF将纯化的抗体浓缩到20mg/ml至30mg/ml之间，并且随后将缓冲剂更换成配制品缓冲剂。然后使这种样品经历冷冻干燥，并且一旦冻干，在WFI的适当体积中重新组成饼状物从而实现希望的最终药品浓度。将原料药物质冻干，并且然后溶于配制品缓冲剂中至需要的浓度。使用柱层析技术(例如离子交换层析法、亲和层析法或疏水性相互作用层析法)将抗体浓缩至需要的高浓度。B.水性配制品的化学稳定性在2-8° C下孵化的样品和经受冷冻-融化应激的那些样品未显示任何变异性(通过离子交换)。仅在40° C下孵化的样品中观察到降解的差异。在40° C下孵化的样品的离子交换层析清楚地显示与磷酸盐基的配制品相比较，在组氨酸配制品中酸性变异体以较小程度增加。在组氨酸配制品中，与组氨酸蔗糖配制品相比较，包含海藻糖的配制品具有较低的酸性变异体群体。因此，组氨酸海藻糖是优异的配制品(通过离子交换层析法)。通过SEC，在2-8° C下孵化的样品以及通过冷冻-融化胁迫的那些样品显示在所评估的四种配制品中在降解模式中具有较小的或没有差异。然而，在40° C下孵化的样品在单体降低的速率方面显示差异，因此这影响了降解物(HMWP和LMWP)的积聚表明组氨酸/海藻糖配制品遵循较慢的单体降解速率，而其他三种配制品看起来降解得更快。在图中在降解物增加方面观察到相同情况。
HMWP (高分子量蛋白)和LMWP (低分子量蛋白)增加的更紧密观察显示在所有配制品中(图)LMWP的增加模式遵循类似趋势，并且在HMWP的积聚中，组氨酸配制品使它们自身与基于磷酸盐的配制品分开(图)。在5. 5周结束时，包含组氨酸/海藻糖的配制品具有最高的剩余的单体以及最低％降解物。图14-17中的SEC结果表明在反复冷冻融化(FT) (-80° C)下在四周的期间在磷酸盐/NaCl样品中聚集体增加了并且在四周的期间在His/Tre配制品中没有可观察到的聚集体增加。在0. 5ml填充体积样品中聚集的聚集体增加量是约I. 75%，以及在Iml填充样品中是I. 41%。在图18-21中弱阳离子交换层析表明当在磷酸盐/NaCl以及组氨酸海藻糖配制品中在四周研究期间内将mAb反复冷冻(-80° C)和融合时电荷变异体分布未显著改变。然而，在Phos/Nacl样品中，增加数量的蛋白在40分钟处与缓冲剂峰一起共洗脱。 其他参数例如pH，浓度未表明一种配制品高于另一种配制品的优异性(如在图12-13中指示的)。在图24-27中冷冻状态稳定性研究表明在电荷变异体图谱中未观察到差异，但是表明在Phos/Nacl配制品中聚集显著增加，并且在His/Tre配制品中则没有。其他参数例如pH、浓度未表明一种配制品高于另一种配制品的优异性(如在图22-23中指示的)。
权利要求
1.一种配制品，包括抗体、缓冲剂以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
2.一种配制品，包括抗体或其片段、缓冲剂以及溶解保护剂。
3.如权利要求I或2所述的配制品，其中该缓冲剂选自TRIS、磷酸盐类、琥珀酸盐类、柠檬酸盐类、乙酸盐类、咪唑类、甘氨酸、L-精氨酸、组氨酸以及它们的组合。
4.如权利要求I或2所述的配制品，其中缓冲剂优选地是组氨酸。
5.如权利要求2所述的配制品，其中该溶解保护剂选自多元醇或糖类。
6.如权利要求5所述的配制品，其中该溶解保护剂性质上是非还原性的例如PEG、甘油、蔗糖、海藻糖以及甘露醇。
7.如权利要求I或2所述的配制品，其中该配制品进一步包括冷冻保护剂类。
8.如权利要求7所述的配制品，其中该冷冻保护剂优选地是海藻糖。
9.如权利要求I或2所述的配制品，该配制品进一步包括表面活性剂类。
10.如权利要求9所述的配制品，其中该表面活性剂是选自包括聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80的组。
11.如权利要求I或2所述的配制品，其中该配制品进一步包括填充剂类。
12.如权利要求11所述的配制品，其中该填充剂选自包括甘氨酸和甘露醇的组。
13.—种抗体的稳定配制品，包括a)约25mg/ml至约250mg/ml抗体，b)提供pH5至PH7. 5的缓冲剂。
14.一种抗体的稳定配制品,包括a)约50mg/ml至约250mg/ml的抗体，b)提供pH 5至pH 7. 5的缓冲剂以及c)约0. 001%至约0. 05%的非离子型表面活性剂。
15.—种抗体的稳定配制品,包括a)约100mg/ml至约250mg/ml的抗体，b)提供pH5至PH7. 5的缓冲剂；c)约0. 001%至约0. 05%的非离子型表面活性剂；以及c)溶解保护剂和/或冷冻保护剂。
16.如权利要求15所述的配制品，其中所述配制品是一种冻干的饼状物或粉末。
17.如权利要求15所述的配制品，其中在用于注射的无菌水或用于注射的溶菌水中进一步重新构建所述配制品。
全文摘要
一种包含抗体、缓冲剂、非离子型表面活性剂、以及溶解保护剂/冷冻保护剂的稳定的药物配制品。还披露了用于制备、存储、以及使用这类配制品的相关方法。
文档编号A61K39/395GK102770157SQ201080060508
公开日2012年11月7日 申请日期2010年11月19日 优先权日2009年11月20日
发明者卡尔蒂克·拉马尼, 苏查里塔·亚卡尔 申请人:分子免疫中心, 拜康有限公司