专利名称：一种可用作疫苗的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包括病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质，以及主要的 糖和次要的糖的组合物。本发明还涉及病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质 用于制备药物组合物的用途，优选用于制备疫苗的用途。本发明进一步涉及 一种治疗或预防人体病毒相关疾病的方法。此外，本发明还涉及一种使病毒 适应于合适细胞系的方法。
本发明也可用于生产一种病毒悬浮液，它适用于制造稳定的、活/灭活 的、单价和/或多价的、液态/冻干的轮状病毒疫苗组合物，用于人体的经 口和/或鼻或任何其他合适的给药途径中。
背景技术：
轮状病毒感染是婴儿和幼儿中与腹泻相关的死亡最主要的原因。每年轮
状病毒肠胃炎引发全世界310, 000-590， OOO婴儿和幼儿的死亡。国际卫生机 构已在推动轮状病毒疫苗研制的*，作为预防与轮状病毒感染相关病的发 病和死亡的最好的方法。国际卫生组织在1997年，以及在2000年再一次， 建议所有新的轮状病毒疫苗应在亚洲和非洲测试，并且该测试应该与在美国 和欧洲实施的试验同时进行。通过这样做，在贫穷的发展中国家中，可以在 研制的早期证明该疫苗的安全性和效力，从而加快将新疫苗用于最需要它们 的儿童。
迄今为止，所有研制的轮状病毒疫苗都已经基于活的轮状病毒菌抹，这 些菌抹已经从人或动物体分离，并且在活体外再被分类和适应于细胞培养、 按配方配制成口服用药。基于动物体的单价和多价的菌株，都已经被证明有
7效力，从而可作为候选疫苗。RotaShield (Wyeth-Ayerst)获得了许可，但_是随后又被撤回。
天然人-牛重配的、天然减毒的人体轮状病毒菌抹116E被描述具有人体G9菌抹的特征，其中天然地引入了与P[11]基因片段同源的单个牛VP4基因。被描述具有G10P [ll]的特征的1321菌林主要由牛基因组成，并且仅有两个人源的基因片段VP 5和VP 7。这两个轮状病毒疫苗菌林已经各自按小批量制备成单价的口服轮状病毒疫苗液体制剂，用于在印度实施的临床试验。
按照国家过敏和易传染疾病研究所(NIAID)与国家卫生研究所(NIH)在美国Bethesda签署的材料转让协定，巴拉特(Bharat)生物技术国际有限公司(BBIL)从国家卫生研究所(NIH)获得人类轮状病毒菌株116E和1321。该两抹轮状病毒菌林完整的基因组序列已有报道。经过在原代非洲绿色猴子肾(AGMK)细胞底物中，然后在MA104细胞底物中，随后在连续传代的AGMK(SPAGMK)细胞底物中进行传代，使该原始的116E (G9[P11])和1321(G10P[11])适应在细胞培养中生长。MA104和SPAGMK细胞底物是未经国家规范管理局(NRA)批准用于商业疫苗生产的。因此，优选使116E和1321以及其他的轮状病毒疫苗菌抹适应于被批准、公认、许可和特征已完全清楚的细胞底物，如Vero细胞底物和/或人二倍体细胞，如MRC-5细胞的底物。
WO 02/11540描述了包括适合于轮状病毒疫苗口服给药的緩沖剂的轮状病毒疫苗配方。在WO 02/11540中披露的配方还包括使该疫苗组合物稳定而防止效力损失的化合物。更具体的，在WO 02/11540中披露的组合物包括糖、磷酸盐和至少一种羧酸盐。用W0 02/11540配方达到的稳定性差别很大，尤其在温度超过20摄氏度，显示出在效力上有相当大的损失。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供一种显示有优良稳定性的、其他的病毒抗原组合物，优选轮状病毒组合物。
本发明的目标是通过一种组合物来达到的，该组合物包括病毒抗原、与
所述病毒抗原不同的第一蛋白质，所述第一蛋白质选自人血清白蛋白(HSA) 和重组人血清白蛋白(rHA)、与所述病毒抗原不同的第二蛋白质，第二蛋白 质是至少部分水解的，所述第二蛋白质选自乳白蛋白。第二蛋白质比任何一 种单独的蛋白质给疫苗制剂带来更高的稳定性。
在一个实施方案中该组合物进一步包括三种不同的二糖，其中，优选所 述三种不同的二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、 蜜二糖和松二糖。在蔗糖被用作主要的糖时，次要的糖选自蔗糖、乳糖、麦 芽糖和海藻糖的联合物。特定浓度的糖的联合物进一步提高了包含蛋白质添 加剂的疫苗制剂的稳定性。术语"主要的糖"，用于此处，意味着指某种以 大于任何其他糖的量而与其他糖一起存在于组合物中的糖。这些其他的糖在 此处也可认为是"次要糖"。该"主要糖"在此处也可被认为是"主体糖"。
在一个实施方案中，所述的至少部分水解的第二蛋白质，选自乳白蛋白 水解产物、酵母水解液、胨，以及明胶水解产物。
在一个实施方案中，所述的第一蛋白质在制剂中的含量为 0. 1% (w/v) -2% (w/v)，优选0. 1% (w/v) -0. 45% (w/v),以及，所述的至少部分水 解的第二蛋白质，以至少部分水解的产物存在于制剂中，其含量为 0. 0"/o(w/v)-国w/v)。
优选所述的三种不同的二糖，或所述的主要的糖和所述的至少两种次要 的糖是以下联合物中的 一种
a) 蔗糖，乳糖和麦芽糖，
b) 蔗糖，麦芽糖和海藻糖，
c) 蔗糖，乳糖和海藻糖，
d) 麦芽糖，乳糖和海藻糖。
9优选所述的三种不同的二糖在制剂中的总量为20%(w/v)-70%(w/v)。
在一个优选的实施方案中，蔗糖的量，如果含有，为40% (w/v) -55% (w/v)，优选50°/"w/v);乳糖的量，如果含有，为0. l%(w/v)-10. Oy"w/v),优选0. 5%(w/v);麦芽糖的量，如果含有，为0. "/"w/v)-10. 0%(w/v),优选0. 5%(w/v),以及海藻糖的量，如果含有，为0."/"w/v)-10.0%(w/v)，优选0. 5% (w/v)。
在一个实施方案中，所述的病毒抗原是一种活病毒，比如一种活的减毒
病毒，其中，优选所述的活病毒选自一组轮状病毒。
优选所述的活病毒是一种人体活病毒，比如人体轮状病毒。在一个特别优选的方案中，所述的人类轮状病毒是轮状病毒菌抹116E
或I 321。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括一种效价为1 04-1 07FFU/0. 5ml的活轮状病毒、0. l%(w/v)-0. 45%(w/v)的人血清白蛋白、0. 01。/。(w/v)-10。/。(w/v)的乳白蛋白水解物，以及下述a)和b)两者之任一种
a) 蔗糖的量为40。/。 (w/v)-55% (w/v),以及乳糖的量为O. 1% (w/v)-10. 0% (w/v)，以及麦芽糖的量为O. 1% (w/v)-10. 0% (w/v),
或
b) 蔗糖的量为40% (w/v) -55% (w/v),以及麦芽糖的量为0. l%(w/v)-10. 0%(w/v)，以及海藻糖的量为0.1% (w/v) -10. 0% (w/v)。
在一个实施方案中，本发明的组合物进一步包括一种緩沖溶液，用来调整所述组合物pH值至6. 8-7. 8,其中，优选所述的緩冲溶液是磷酸盐/片宁檬酸盐緩冲溶液。
在一个实施方案中，本发明的组合物在Eagles极限必需培养基中制成，
10其中，优选其緩沖于pH为6. 8-7. 8的磷酸盐/柠檬酸盐緩沖溶液中。
优选所述磷酸盐/柠檬酸盐緩冲溶液是大约310mM的磷酸盐和大约100 mM的柠檬酸盐。
在一个实施方案中，本发明的组合物是一种疫苗。 稳定的疫苗制剂的制备存在巨大的挑战。该制剂的稳定性取决于在该疫 苗组合物中合成一体的赋形剂之间的相互作用。蛋白质和糖之间的氬^T建必须 占优势而使疫苗稳定。糖和抗原蛋白质有效的接触必须有适当的比例，以保 持该疫苗的稳定。在一定的温度下，要求糖浓度有一个临界值，以具有一定 数量的蛋白质和糖之间的氬键来保持疫苗稳定一段给定的时间。糖通过替代 结构水，能够与磷脂膜和蛋白质形成氬键。本研究中提供了各种稳定剂，用 于使减毒的轮状病毒116 E和1321在2-8 °C、 25°C和37°C稳定一段长的时 间。
糖和蛋白质与緩冲成分的适当组合，可在长的存储期内保存病毒，并且 使其存活和有活性。这些添加剂对悬浮在液体中的轮状病毒给于了结构上的 支持。海藻糖在疫苗配方中优选用作稳定剂，因为它稳定病毒的蛋白质结构 并且恢复其在长期存储中的效力。蔗糖和麦芽糖的联合使糖和蛋白质(疫苗) 有效接触，从而保持疫苗稳定。在糖和疫苗蛋白的有效接触以保持疫苗的稳 定中，由乳白蛋白水解产物支持的Ajk清白蛋白起了重要的作用。
本发明的目标还通过下述技术方案来实现使用如上述定义的病毒抗 原、第一蛋白质和第二蛋白质，以及，任选如上述定义的三种不同的二糖来 制造本发明的组合物，优选用于制造一种疫苗，用来治疗或预防与病毒相关 的疾病，优选与轮状病毒相关的疾病，比如腹泻和肠胃炎。
优选所述的治疗或预防包括，将3份口服剂量为安全和有效量的本发明 组合物施给8-20周的婴儿，每次1份剂量。
优选本发明的用途是病毒感染的预防，优选人体轮状病毒感染和/或轮
ii状病毒肠胃炎的预防。
本发明的目标也通过一种治疗或预防与病毒相关的、优选与人体轮状病 毒相关的疾病的方法来实现，该方法是将有效量的本发明的组合物施给人。
优选本发明的方法包括，将3份口服剂量为安全和有效量的本发明组合 物施给8-20周的婴儿，每次1份剂量。
在一个实施方案中，本发明的方法用于病毒感染的预防，优选人体轮状 病毒感染和/或轮状病毒肠胃炎的预防。
本发明的目标通过使病毒适应于合适的细胞系，例如Vero细胞，的方 法来实现，该方法包括通过所述合适的细胞系的培养使所述病毒连续地进行 传代，每次传代发生在含有氯化钙和胰蛋白酶的培养基中。
优选所述的氯化钙含量为0. 1 mg/ml-l mg/ml，所述胰蛋白酶含量为0. 1 )Vml-30 ug/ml。
在一个实施方案中，所述的连续传代包括2-20代，优选2-5代。优选 每次传代在24小时-10天的期间内完成。
优选所述病毒是人体轮状病毒
本发明人已经发现，在药物组合物中包括选自人血清白蛋白、重组人血 清白蛋白的第一蛋白质以及至少部分水解的第二蛋白质，可提高就病毒效力 而论的组合物的稳定性。尤其在温度为25。 C和37。 C时，本发明的组合物 显示出增强的稳定性。
短语"第二蛋白质是至少部分水解的"，用于这里，意思是指一种状态， 其中该第二蛋白质已至少部分降解为其各自的氨基酸组块。因此，上述的短
语也意味着包括下述各种状态，其中，第二蛋白质不再以完整的分子存在， 而是仅作为其碎片的聚集体。上述短语意味着还包括一种状态，即其中第二 蛋白质完全水解。所有这些状态也意味着被短语"蛋白质水解产物"所包 括，比如"乳白蛋白水解产物"，它可以包括完全水解的蛋白质，即，蛋白质被分解为它各自的氨基酸；或蛋白质部分降解，这样就存在肽和氨基酸的 聚集体。这种蛋白质的水解产物可以很容易由本领域普通技术人员制备，例 如通过酸水解，或可通过商业渠道获得。
对于因含有第一蛋白质和第二蛋白质所达到的稳定效果，可以通过含有 三种不同二糖的联合物，或含有一种主要糖和至少两种次要糖的联合物而有 选择地增强。优选联合物是蔗糖、乳糖和麦芽糖，以及嚴糖、麦芽糖和海藻 糖。本发明的组合物可作为一种疫苗用于接种疫苗来抗病毒感染和病毒相关 疾病。优选这些组合物被緩冲在一个合适的pH，通常在6-8,优选在 6.8-7.8。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物可以在Eagles极限必 需培养基中配制。优选该组合物被緩沖，例如用磷酸盐/柠檬酸盐緩冲液緩 沖。
本发明人也已经设计出一种使病毒适应于合适细胞系的方法，这种方法 可以用于，例如轮状病毒。这种方法是通过细胞培养，使病毒连续地传代而 实施的，其中传代在氯化4丐和胰蛋白酶存在的条件下发生。这样可获得一种 简单的使病毒适应于一种给定细胞系的方法，而且，能够生产出高效价的病毒。
更具体地举例来说，本发明人已经使116E和1321轮状病毒菌抹适应 Vero细胞来生产高效价的轮状病毒收获物，并且进一步表征;故适应的116E 和1321，用于制造稳定的、活的、单价的、液体轮状病毒疫苗组合物。在接 种疫苗以前，给孩子服用口服柠檬酸盐-碳酸氢盐緩沖液抗酸剂组合物，用 于緩沖孩子们胃的酸性。
到目前，所有报道的轮状病毒疫苗菌抹是天然的、活的、人牛、天然或 人工减毒轮状病毒菌抹，或是具有VP4、 VP7以及其他人或牛轮状病毒菌抹 基因的各种组合的人或牛的基因工程菌林。轮状病毒菌抹116E (G9P[11]) 和1321 (G10P[ll])是天然人-牛重配的、自然减毒的以及对婴儿和幼儿赋予
13相当高的免疫水平的菌抹。在高效价的母体抗体存在下，116E菌抹所具有的 在新生儿体内复制而不诱发疾病的能力，也使其更有希望成为活的、自然减 毒的单价轮状病毒疫苗的候选菌抹。
本发明提供用于药用组合物的病毒，优选轮状病毒，该病毒显示出高的 稳定性和长的寿命，尤其是温度在20° C以上时。本发明还提供一种使轮状 病毒，如天然人-牛重配的、天然减毒的轮状病毒菌抹116E(G9P [ll])和1321 (G10P[11])适应于合适的细胞，例如Vero细胞的方法。该方法包括在活化 和维持病毒的培养基中，胰蛋白酶(O. lpg/ml -o 3(mg/ml)和/或氯化钩 (10(mg/ml-100(^g/ml)的优化剂量，1-IO天内，在该培养基上可收获高效价 (104-108 FFU/ml)的病毒。本发明还提出了上述适应的菌林用来制造稳定的、 活的、单价的、液体轮状病毒疫苗组合物的用途。此外，本发明为病毒抗原 的应用提供了第一蛋白质、第二蛋白质以及可选择的三种不同二糖的联合物 来制造本发明的组合物，该组合物用于病毒相关疾病的治疗或预防，优选轮 状病毒相关的疾病的治疗或预防。
按照要求，本发明具体实施方案公开于此；然而，理所当然，该公开的 实施方案仅是本发明的范例，该范例可以不同的形式体现。因此，公开于此 的具体的结构和实用的细节决不能解释为限制，而是仅仅作为该权利要求的 基础，并且作为对本领域的普通技术人员进行讲授的代表性的勤出，以便在 实际中灵活地将本发明应用于任何恰当地详述的结构中。此外，这里使用的 术语和短语目的不是用于限制本发明，而是用来提供可以理解本发明的描 述。
术语"一个(种)"，使用于此，被定义为一个(种)或超过一个(种)。 术语"多个(种)"，使用于此，被定义为二个(种)或超过二个(种)。 术语"另一个(种)，，，使用于此，被定义为至少有第二个(种)或更多。 术语"包括"和/或"具有"，使用于此，被定义为包含(即，开放语言)。
14人体轮状病毒呈现一种非常窄的组织培养宿主范围。因此，不同菌抹的
分离和连续传代通常在细胞培养中进行，比如猿MA-104或原代猴子肾(AGMK) 细胞，这两者都不适合于疫苗生产。前者的细胞没有被承认为一种用于疫苗 生产的底物，而后者的细胞以他们被各种猿的微生物试剂，包括反转录病毒， 污染而出名。
许多特征已很清楚的轮状病毒已在不适合用于疫苗生产的市售实验室 细胞培养体系中被分离、连续传代和经三度噬菌斑纯化。在疫苗研制中必须 使用这些病毒的情况下，可随后将该病毒在证实为用于疫苗研制和生产的细 胞底物中传代和生物克隆。最理想是，在疫苗中使用的病毒应只在被证明是 适用于疫苗生产的组织培养细胞中被分离和传代。Vero细胞系和MRC-5细胞 系符合这个必要条件，因为它们支持轮状病毒有效地生长。
本发明涉及一种包括病毒抗原的组合物，和涉及一种使人-牛天然重配 和自然减毒菌抹116E (G9P[11])和1321 (G10P[11])适应于Vero细胞的方 法。原始的116E和1321轮状病毒疫苗菌抹已被适应于AGMK、 MA104以及 SPAGMK细胞底物。SPAGMK是一种未经国家规范管理局(NRA)批准用于疫苗商 业化生产的细胞系。因此，优选不但要使该轮状病毒疫苗菌抹(116E， 1321) 适应食品医药管理局或国家规范管理局批准的细胞底物，如Vero细胞、人 二倍体细胞、MRC-5等，而且要在尽可能短的期限内，收获高效价病毒用于 轮状病毒的疫苗商业化生产。根据在科学文献中可用的资料，已研究过若干 用于适应的方法，但是就病毒收获量和时间周期而言，没有发现满意的方法。 新的病毒适应方法被优选用于轮状病毒疫苗菌株的大量生产，在该方法中， 我们对不同的时间周期使用了不同浓度的氯化钓和胰蛋白酶，用以病毒的活 化和维持培养基的标准化。对于口服的轮状病毒疫苗组合物，该病毒在下述 组合物中被稳定，该组合物包括选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛 血清白蛋白和猪血清白蛋白的第一蛋白质，以及至少部分水解的第二蛋白质，所述第二蛋白质选自人乳清蛋白、牛类乳清蛋白和猪乳清蛋白。优选该 组合物还可选择地包括三种不同二糖的联合物，所述的三种不同的二糖，选 自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、龙胆二糖、蜜二糖和松二糖。
更多可能被加入该组合物的成分包括明胶、明胶水解产物、酪胨、山梨 糖醇、氨基酸，比如丙氨酸，组氨酸，精氨酸，谷氨酰胺、以及抗菌素。在 该疫苗服用之前，口服一种抗酸剂化合物，例如柠檬酸盐-碳酸氢盐緩沖液， 用来緩冲胃的酸性，并保证该活性疫苗的传输。
才艮据一个实施方案，通过下述方法将^^状病毒疫苗菌4朱116E和1321适 应于Vero细胞底物(ATCC编号-CCL-81),并在十天内收获高效价病毒 在不同的收获病毒的时间间隔，采用标准化的lOOpg/ml-lOOO^/ml的氯化 钙浓度和/或0. 1Pg/ml-3(^g/ml的胰蛋白酶浓度。该病毒收获量通过酶联免 疫吸附测定方法来评定，也可通过测量溶血灶形成单位(FFU)/ml，依据病毒 在适当的细胞底物中的传染性效价来评定。
在本技术领域中，已知轮状病毒是通过胰蛋白酶将VP4分裂为VP5和VP8 (7， 8)而使其传染性增强的。VP5在该寄主细胞膜上打洞使该轮状病毒进入。
通过电泳型(图13和14)以及核苦酸序列(数据没有显示)进一步描 述适应的轮状病毒，即疫苗候选菌抹的特征。
抗轮状病毒疫苗菌抹的抗体按照用于免疫诊断和免疫治疗目的的制备 标准方案产生。
轮状病毒疫苗菌林通过反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测，其中， VP4和VP7基因和/或VP4和VP7基因有选择性地杂交的核酸通过下述方法扩 增利用VP4基因(类型pll )和/或VP7基因的正反向引物，以及在(G9P [11], G10P [ll]) VP4基因和/或VP7基因内部，或位于一相邻的基因的第二引物 进行扩增。
图1 :含有不同的稳定剂的轮状病毒液体制剂在2-8° C存储长达50 周后的稳定性数据。
图2:含有不同的稳定剂的轮状病毒液体制剂在25。 C存储后的稳定性 数据。
图3:含有不同的稳定剂的轮状病毒液体制剂在37° C存储后的稳定性数据。
图4 :样品1的轮状病毒液体制剂在2-8° C、 25° C以及37° C存储 后的稳定性数据。
图5:样品2的轮状病毒液体制剂在2-8° C、 25° C以及37° C存储后 的稳定性数据。
图6:样品3的轮状病毒液体制剂在2-8° C、 25° C以及37。 C存储后 的稳定性数据。
图7:样品4的轮状病毒液体制剂在2-8° C、 25° C以及37° C存储 后的稳定性数据。
图8:样品5的轮状病毒液体在2-8° C、 25° C以及37° C存储后的稳 定性数据。
图9:样品6的轮状病毒液体制剂在2-8° C、 25° C以及37° C存储后 的稳定性数据，以及
图10:样品7的轮状病毒液体制剂在2-8° C、 25° C以及37° C存储 后的稳定性数据。
图11:样品1-4的轮状病毒冻干制剂在2-8° C、 25° C以及37° C存 储后的稳定性数据。
图12:定量测定(免疫过氧化物酶测定)在不同的胰蛋白酶浓度下收获 的被适应的轮状病毒。图13: 116E RM在10°/ 聚丙烯酰胺凝胶上通过银染而显色的电泳型。 泳道分布
1轮状病毒116E ， SPAGMK参照 2轮状病毒116E，最后一批# 61 4004
3 [轮状病毒116E, SPAGMK参照+轮状病毒116E,最后一批# 61 4004]的混 合物
4專仑状病毒116E,最后一批# 61 4004 5轮状病毒116E, SPAGMK参照 6專仑状病毒116E,大糸匕量# 61BP4004 7轮状病毒116E,工作病毒库
图14:轮状病毒1321在10%聚丙烯酰胺凝胶上通过银染而显色的电泳型。
泳道分布
1轮状病毒1321, SPAGMK参照
2 4仑状病毒I321,最后一批# 61 4004
3 [轮状病毒I321， SPAGMK参照+轮状病毒1321,最终量# 64 4004]的混合 物
4轮状病毒I321，最后一批# 64 4004 5轮状病毒1321, SPAGMK参照 6轮状病毒I321，大批量# 64BP4004 7轮状病毒I321,工作病毒库
具体实施例方式
下面包括的实施例，仅仅用来帮助对该发明的说明和权利要求有更完整 的理解。该实施例不以任何方式限制发明权利要求的范围。
18实施例1
由美国Bethesdad的NIAID、 NIH提供给巴拉特生物技术国际有限^5^司 作为疫苗起始原材料菌抹的原始轮状病毒疫苗菌抹116E (G9P[11])和1321 (G10P[11])在AGMK、 MA104和SPAGMK细胞底物上生长。为了进行该轮状 病毒疫苗的商业化生产，通过将该轮状病毒连续传代，使这些轮状病毒菌抹 适应于Vero细胞底物以^A二倍体细胞、MRC-5细胞底物。病毒在细胞底物 中的每次传代，针对轮状病毒的活化以及维持培养基在24小时到IO天的期 间收获高效价病毒，对浓度为10(mg/ml-lOOOPg/ml的氯化钙和/或浓度为 0. l|ig/ml-3(mg/ml的胰蛋白酶进行评价。通过Rotaclone酶联免疫吸附测定 试剂盒来测定细胞培养上层清液中该病毒的产量，该试剂盒用于检测预涂于 ELISA (酶联免疫吸附测定)孔的特异性抗轮状病毒抗体上的轮状病毒抗原。
轮状病毒库的传染性效价是依据溶血灶形成单位(FFU)/ ml通过免疫过 氧化物酶测定滴定测量的。简而言之，轮状病毒传染性效价的免疫过氧化物 酶测定，是通过在24孔组织培养平板中生长的MA104细胞汇合层来评价的。 该细胞然后清洗两次，并且用适当稀释(Log稀释)的活化轮状病毒感染，接 着培养12小时。在培养后，该细胞用3. 5%福尔马林固定，并且用轮状病毒 抗血清检测。对此HRPO共轭第二抗体使用AEC色原标记和染色。
在1-10天内，不同的胰蛋白酶浓度下，病毒最大的收获量可以达到106 -188FFU/ml (图12)。
实施例2
轮状病毒菌林116E和1321的特征可以用很多方法描述，这些方法在本 技术领域是已知的。这些方法包括，但是不局限于，逆转录PCR、 RNA杂交、 序列分析和属分组，即RNA电泳型分析。相比于其他的轮状病毒菌抹,轮状 病毒的菌抹116E和1321有清楚的RNA/RNA杂交电泳图谱。它们具有双链 的RM (dsRNA)基因组，包括11个分子量大约为2. 0 x 106-0. 2 x 106千
19道尔顿的片段，其中VP4蛋白质是88, OOO道尔顿，VP6是44, OOO道尔顿以 及VP7是38000道尔顿。该11个基因组片段迁移的细微差异产生了一种特 有的电泳带图镨。
轮状病毒菌抹116E和1321电泳带状图谱可通过用酚-氯仿法分离染色 体dsRNA，随后用CC41阴离子交换基质纯化来进行核对。将纯化的dsRNA
在io y。聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后用银染法将核酸染色。该ll个带状图
谱的片段可以与轮状病毒116E和I321参考标准(图13和14)对比。 实施例3
轮状病毒菌林116E和1321可以使用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR) 检测。通常，RT-PCR包括使来源于包含病毒的样品的RNA与引物接触，该 RNA有选择地与VP4基因(类型Pll)和/或VP7基因(类型G9/G10)序列杂 交，合成反转录酶聚合酶链式反应产物的第一条链。在VP4基因和/或VP7 基因内部或位于一相邻的基因的第二组引物，用作合成第二条链的引物。引 物可以替换，只要有足够的互补碱基存在用于选择性杂交。
实施例4
下列非限制性实施例，是为了更好的阐述准备用作活的、天然减毒的口 服轮状病毒疫苗(116E和/或1321)的液体制剂的稳定性。
稳定剂是加入疫苗中的普通的药用赋形剂和/或特定的化学化合物，它 们相互作用并且使生物大分子稳定，它在低温存储下使用。
在不同的温度2-8t、 25。C和37。C下，测定轮状病毒在多种稳定剂联合 物中的稳定性。
收获感染轮状病毒的Vero细胞，在稳定剂中净化和纯化，并且配制成 液体制剂。各份制剂使用同一批从被感染的Vero细胞收获的轮状病毒。该 轮状病毒疫苗的液体制剂随后在2-8°C、 25°C、 37。C培养，用于加速的稳定 性研究。对于实时的稳定性研究，该轮状病毒疫苗的液体制剂在2-8。C培养
2012个月。在上述的培养之后，用免疫过氧化物酶试验测定病毒效价。 此外，制造了一些样品来获得本发明的组合物
样品1用Eagles极限必需培养基在下述緩冲液中配制包含蔗糖-50 %, 乳糖-0.5 %,麦芽糖-0.5 %,人血清白蛋白-0.4 %以及乳白蛋白水解物 0.05%， pH为7.4的310mM磷酸盐和lOOmM柠檬酸盐緩沖液，具有10A 6°2 FFU/0. 5 ml的起始效价，并且在2-8 。C下，50周后效价没有降低。(图1 和4)
在25°C样品1稳定至14周，其后，24周后发现log效价降低0. 5。(图 2和4)
在37 ° C,样品1在3周后log效价降低0. 7， 6周后进一步降低1. 41, 8周后又降低了 1.28, IO周后再降低了 0.11。
样品2用Eagles极限必需培养基在下述緩冲液中制备包含蔗糖-50 %， 乳糖-0. 5 %，麦芽糖-O. 5 %，人血清白蛋白-0. 4 °/。以及乳白蛋白水解物0. 05 y。，pH为7.4的310mM磷酸盐和lOOmM柠檬酸盐緩冲液，起始效价为10"…" FFU /0. 5 ml,在2-8 。C下，50周后显示log效价降低0. 06。(图1和5 )
在25。 C样品2在24周后显示log效价降低0. 91。(图2和5 )
在37 。 C样品2在3周后显示log效价降低0. 94, 6周后log效价进 一步降低1. 78， 8周后log效价再降低了 3. 18,第8-第10周效价没有降低， 接着10周后log效价降低了 3. 15。(图3和5 )
样品3用Eagles极限必需培养基在下述緩冲液中配制包含蔗糖-50 %， 乳糖-0. 5 %，麦芽糖-O. 5 °/ ，海藻糖0. 95。/。，人血清白蛋白-0. 4 %以及乳白 蛋白水解物0. 05 °/ , pH为7. 4的310 mM磷酸盐和100 mM柠檬酸盐緩沖液， 拥有10A 6'22 FFU /0. 5 ml起始效价，在2-8 °C下，50周后显示效价没有降 低。(图1和6 )
在25。 C下，样品3在12周后显示效价没有降低，24周后log效价降
21低O. 88。(图2和6)
在37° C下，样品3在3周后显示log效价降低O. 87,而且6周后log 效价进一步降低0. 52， 10周后log效价再降低了 1. 27,接着12周后log 效价降低了 1. 0，此外14周后log效价又降低了 0. 3。(图3和6 )
样品4用Eagles极限必需培养基在下述緩冲液中配制包含蔗糖-50 %, 麦芽糖-0.5 °/。，乳糖-0.5 %,人血清白蛋白0.4 %, pH为7.4的310 mM磷酸 盐和100 mM柠檬酸盐的緩沖液，拥有10A 6』FFU /0. 5 ml的起始效价，并 且在2-8 °C50周后显示效价没有降低。(图1和7 )
在25 。 C下，样品4在6周后显示log效价降低0. 87,而且10周后 log效价进一步降低0. 42,接着16周后log效价降低了 0. 05，此外24周后 log效价降低了 1. 73。(图2和7 )
在37° C下，样品4在3周后显示log效价降低1. 96,并且6周后log 效价进一步降低1. 43。(图3和7 )
样品5用Eagles极限必需培养基在下述緩冲液中配制包含蔗糖-40 °/ , 麦芽糖-5 %，乳糖-0.5 °/。，乳白蛋白水解物-1. 0 %， pH为7.4的310 mM磷 酸盐以及100 mM柠檬酸盐的緩冲液，拥有l(T 6』FFU /0.5 ml起始效价， 并且在2-8 。C 16周后显示效价没有降低，50周后log效价P争低0. 15。(图 1和8)
在25 。 C下，样品5在6周后显示log效价从起始效价降低了 0. 87。 而且在10周后观察到log效价降低了 0. 62, 16周后观察到log效价再降低 了 0. 78, 24周后log效价又降低了 2. 06。(图2和8 )
在37° C下，样品5在3周后显示log效价从起始log效价降低了 1. 04， 并且6周后log效价降低了 1. 58。(图3和8 )
样品6用Eagles极限必需培养基在下述緩冲液中配制包含蔗糖-50 °/。， 麦芽糖-O. 5%，海藻糖-0.5 %，人血清白蛋白0.4 %, pH为7. 4的310 mM磷
22酸盐和IOO mM柠檬酸盐的緩沖液，拥有10A 619 FFU /0. 5 ml的起始效价， 并且在2-8 °C50周后显示效价没有降低。(图1和9 )
在25 。 C下，样品6在6周后显示log效价从起始log效价降低了 0. 32。 8周后观察log效价进一步降低了 0. 46， 16周后观察到log效价再降低了 0. 82，此外，24周后又观察到log效价降低了 1. 36。(图2和9 )
在37° C下，样品6在3周后显示log效价从起始log效价降低了 2. 17， 6周后log效价进一步降低了 1.18。(图3和9 )
样品7用Eagles极限必需培养基在下述緩沖液中配制包含蔗糖-50 %， 麦芽糖-O. 5%,海藻糖-0. 5 °/。，乳白蛋白水解物-0.05%，人血清白蛋白-O. 4 %, pH为7. 4的310mM磷酸盐和lOOmM柠檬酸盐的緩冲液，拥有10""FFU /0. 5 ml的起始效价，在2-8 °C50周后显示log效价降低0. 24。(图1和10 )
在25 。 C下，样品7在6周后显示log效价从起始log效价降低了 0. 67。 24周后观察log效价进一步降低了 3. 43。(图2和10 )
在37° C下，样品7在8周后显示log效价从起始log效价降低了 3. 24。 (图3和9)
冻干的样品1-4显示出在2-8。C、 25。Cand 37。C下，50周后效价不降 低的稳定性(图11 )。使用的稳定剂是0. 1 % -1. 0% HAS, 1% SPG (=蔗糖， 磷酸盐，谷氨酸)，1.2 % L-精氨酸，1°/。 D-山梨(糖)醇，1%明胶以及2% 海藻糖的联合物。(图11)
从图l-6可以看出，本发明的这些样品，即样品1-3 ,在高于25° C温 度下显示更长的寿命和更好的稳定性，尤其对于比较长的时段。
因此，根据本发明，特别优选的组合物包括作为第一蛋白质的Ajk清白 蛋白，作为第二蛋白质的乳白蛋白水解物，以及作为三种不同二糖的联合物 的蔗糖、麦芽糖、海藻糖，或蔗糖、麦芽糖、乳糖。
实施例5在服用口服、活的、自然减毒的轮状病毒疫苗制剂之前，必须口服緩冲 剂或酸中和试剂，用于中和胃的酸性。该緩冲剂不局限于柠檬酸盐-碳酸氢 盐緩冲液、磷酸盐緩冲液、琥珀酸、乳酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸等。酸
中和緩沖液组成(克/升)柠檬酸钠9. 6、碳酸氢钠25. 6, pH6. 5-8. 8。 酸中和緩冲液的酸中和容量(ANC)可通过USP测试来测定。 柠檬酸盐-碳酸氬盐緩冲液的酸中和容量能达到0.35 - 0.50 mEq/ml。 可以在模拟胃液(34. 8 mEq HC1作为模拟胃液)存在和缺少的条件下，
研究柠檬酸盐-碳酸氢盐緩沖液(CB)对单价轮状病毒疫苗传染性的影响。
轮状病毒疫苗制剂与柠檬酸盐-碳酸氢盐緩冲液一起，在作为模拟胃液
的34. 8mEqHCl存在的条件下，在两小时内log轮状病毒效价降低0. 1-0.2。 实施例6
为制备冻干的轮状病毒疫苗制剂，按照实施例4所举的例子，使该轮状 病毒在本发明稳定化的组合物中稳定。为了冻干，该轮状病毒主体大部分被 透析到稳定剂中，以将组织培养基全部去除，或者该轮状病毒主体在稳定剂 中被稀释8-15倍。研究结果已显示出该制剂具有优良的稳定性。
在上述说明书中，已经描述了本发明具体的实施方案。然而，本领域的 普通技术人员会意识到，在不偏离下面权利要求所述的本发明范围的前提 下，可以作各种修改和变更。因此，该说明书和附图可认为是一种说明而不 是限制的意思，而且所有这样的修改都包括在本发明的范围内。利益、好处、 问题的解决，以及任何可以使利益、好处、问题的解决发生或者趋于明确的 因素，都不能被解释为任何或所有权利要求重要的、必须的、或基本的特征 和元素。结果，发明仅由附加的权利要求来确定，其中包括本申请审理过程 中的一些修改和这些权利要求的所有等效物。
在说明书、权利要求和/或在附图中公开的本发明的特征，无论分别地， 和按其任何组合，对于以其不同的形式来实现本发明，都可能是重要的。
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2权利要求
1. 一种组合物，包括病毒抗原，不同于所述病毒抗原的第一蛋白质，该第一蛋白质选自人血清白蛋白，以及不同于所述病毒抗原的第二蛋白质，这种第二蛋白质至少是部分水解的，所述的第二蛋白质选自乳白蛋白水解产物、酵母水解液、胨、明胶水解产物，以及卵蛋白质水解产物。
2. 根据权利要求1所述的组合物，进一步包括三种不同的二糖。
3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述的三种不同的二糖选自蔗 糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、蜜二糖和+>二糖。
4. 根据权利要求1所述的组合物，进一步包括一种主要的糖和至少两 种次要的糖，其中该主要和次要的糖是各自独立地选自蔗糖、海藻糖、麦芽 糖、乳糖、龙胆二糖、蜜二糖、纤维二糖和松二糖。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其中主要的糖是蔗糖，以及次要的 糖中至少之一是乳糖。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中主要的糖是蔗糖，其含量大约 为4 0% (w/v) -55% (w/v)，更优选为5 0% (w/v)。
7. 根据权利要求4-6之任意一项所述的组合物，其中次要的糖中至少 之一是麦芽糖，其含量大约为0. 1% (w/v)-10. 0% (w/v),优选为0. 5°/ (w/v)。
8. 根据权利要求2-7之任意一项所述的组合物，其中根据权利要求2-3 之任意一项所述的三种不同的二糖，或根据权利要求4-7之任意一项所述的 该主要的糖和至少两种次要的糖，选自下面的联合物a)蔗糖，乳糖和麦芽糖，b)蔗糖，麦芽糖和海藻糖，C)蔗糖，乳糖和海藻糖，d)麦芽糖，乳糖和海藻糖。
9. 根据权利要求1-8之任意一项所述的组合物，其中糖或二糖的合并浓度大约为20%- 75°/o(w/v)。
10. 根据权利要求1-9之任意一项所述的组合物，其中的糖，如果包含在组合物中，其各自的浓度如下蔗糖大约40%-55%(w/v),优选50°/ (w/v);乳糖大约O. 1%-10. 0%(w/v),优选O. 5%(w/v);麦芽糖大约0. 1%-10% (w/v),优选0. 5% (w/v);海藻糖大约0. 1%-10. 0% (w/v)，优选0. 5% (w/v)。
11. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，其中所述的第一蛋白质在该制剂中的含量为0.1% (w/v)-0. 45% (w/v)，所述的至少部分水解的第二蛋白质作为至少部分的水解产物存在于该制剂中，其含量为0.01%(w/v)-10% (w/v)。
12. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，进一步包括一种緩沖液用来调节所述组合物的pH,优选调节至6. 8-7. 8的pH值范围。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述的緩冲液是一种磷酸盐緩冲液。
14. 根据权利要求求13所述的组合物，其中磷酸盐的浓度为310 mM- 400mM。
15. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述的緩冲液是一种柠檬酸盐緩沖液。
16. 根据权利要求15所述的组合物，其中柠檬酸盐的浓度为25 mM- 150
17. 根据权利要求12-16之任意一项所述的组合物，其中的緩冲液是一种磷酸盐-柠檬酸盐緩冲液，pH大约为6.8-7.8,其中优选磷酸盐浓度大约是310mM,以及柠檬酸盐的浓度大约是IOO mM。
18. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述的緩沖液是一种柠檬酸盐 /碳酸盐緩冲液，pH为6. 8-7. 8。
19. 根据权利要求12所述的组合物，其中所述的緩冲液是一种蔗糖/磷 酸盐/谷氨酸盐緩冲液，pH为6. 8-7. 8。
20. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，进一步包括至少一种 选自组织培养的培养基、生理盐水、磷酸盐緩冲盐水和水的稀释剂。
21. 根据权利要求20所述的组合物，其中的稀释剂是Eagle极限必需培 养基。
22. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，其中所述的病毒抗原 是活病毒，比如活的天然减毒的病毒。
23. 根据权利要求22所述的组合物，其中所述的活病毒选自轮状病毒。
24. 根据权利要求22-23之任意一项所述的组合物，其中所述的活病毒 是人体活病毒，比如人轮状病毒、牛轮状病毒、猪轮状病毒和人-牛重配株。
25. 根据权利要求24所述的组合物，其中所述的人轮状病毒是天然人-牛重配林，优选轮状病毒菌林116E或I 321。
26. 根据权利要求22-25之任意一项所述的组合物，该组合物包括效价 为104 - 107 FFU/0. 5 ml的活轮状病毒。
27. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，该组合物是一种疫苗。
28. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，该组合物是一种液体 疫苗。
29. 根据权利要求28所述的组合物，其中所述的组合物在下面至少其中 之一的条件下是稳定的在37。C下3周、在25。C下6个月、在2。C-8。C下一 年。
30. 根据上述权利要求之任意一项所述的组合物，该组合物是一种冻干4的疫苗。
31. 根据权利要求30所述的组合物，包括一种如在权利要求l - 30之 任意一项中所定义的病毒抗原、人血清白蛋白、明胶、至少一种二糖，如麦 芽糖，海藻糖，蔗糖，乳糖、至少一种氨基酸，如L-谷氨酰胺，L-精氨酸、 至少一种糖-醇，如D-甘露糖醇或D-山梨糖醇，其中上述的每种成分在药用 载体緩冲溶液中的浓度为0. 1%-10%。
32. 根据权利要求30-31之任意一项所述的冻干组合物，其中所述的组 合物在2。C-8。C、 25°C、 37。C下稳定超过50周。
33. 如权利要求1-32之任意一项中所定义的每种病毒抗原、第一蛋白质 和第二蛋白质，以及，如权利要求2-32之任意一项中所定义可任选的三种 不同的二糖的下述用途用于制造根据权利要求1-32之任意一项所述的组 合物，优选用于制造治疗或预防与病毒相关疾病的疫苗，其中优选与轮状病 毒相关的疾病，比如腹泻和肠胃炎。
34. 根据权利要求33所述的用途，其中所述的治疗或预防包括对8-20 周的婴儿施给不超过三份剂量为安全、有效量的组合物，每次1份剂量。
35. 根据权利要求33-34之任意一项所述的用途，用于预防病毒感染， 优选用于预防人体轮状病毒感染和/或轮状病毒肠胃炎。
36. —种治疗或预防与病毒相关的疾病，优选与人体轮状病毒相关疾病 的方法，该方法对人施给有效量的根据权利要求1-32之任意一项所述的组 合物。
37. 根据权利要求36所述的方法，该方法包括对8-20周的婴儿施给不 超过三份剂量为安全、有效量的组合物，每次1份剂量。
38. 根据权利要求36-37之任意一项所述的方法，用于预防病毒感染， 优选用于预防人体轮状病毒感染和/或轮状病毒肠胃炎。
39. —种使病毒适应于合适的细胞系，比如Vero细胞的方法，该方法包括将所述的病毒通过所述适当的细胞系的培养连续地传代，每次传代发生在 含有氯化钩和胰蛋白酶的培养基中。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述的氯化钧的含量是0. 1 mg/ml -1 mg/ml，以及所述的胰蛋白酶含量是0. 1 Pg/ml - 30 Pg/ml。
41. 根据权利要求39-40之任意一项所述的方法，其中所述的连续传代 包括2-20代，优选2-5代。
42. 根据权利要求39-41之任意一项所述的方法，其中每次传代发生在 24小时-10天的期间。
43. 根据权利要求39-42之任意一项所述的方法，其中所述的病毒是轮 状病毒。
全文摘要
本发明涉及一种包括病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质的组合物。该组合物也可以有选择地包括三种不同的二糖，或者，可选择该组合物包括一种主要的糖和至少一种，优选两种，次要的糖。本发明还涉及病毒抗原、第一蛋白质和第二蛋白质用于制备药物组合物的用途，优选用于制备疫苗的用途。本发明进一步涉及治疗或预防人体病毒相关疾病的方法。此外，本发明还涉及一种使病毒适应于合适细胞系的方法。本发明也可用于生产一种病毒悬浮液，它适用于制造稳定的、活/灭活的、单价和/或多价的、液态/冻干的轮状病毒疫苗组合物，用于人体的经口和/或鼻或任何其他合适的给药途径中。
文档编号A61K39/15GK101489587SQ200780026055
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月11日 优先权日2006年5月12日
发明者克修拉·莫汉·威德麦都, 克修拉·莫西·埃拉, 斯密塔·辛哈尼亚, 维克托·杰露莎·奥古斯塔斯·哈什瓦德翰·戈特拉 申请人:伯哈拉特生物技术国际有限公司