专利名称：：用于预防和治疗癌症疾病的包括黄水枝提取物或从其分离的化合物的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂，其包括黄水枝(77"re/to提取物；从其分离的黄水枝酸(tiarellicacid)化合物或其药学上可接受的盐；并且涉及包括其的抗癌组合物或功能性保健食品。
背景技术：
：整联蛋白和胞外基质(ECM)之间的相互作用介导细胞黏着，并且整联蛋白介导的细胞黏着调节各种信号分子的活性和定位，并且因此调节细胞功能或行为(Thiery,J.P.Epithelial-mesenchymaltransitionsintumourprogression.NatRevCancer,2,pp.442-54,2002;Brakebusch,C.andFassler，R.，TheIntegrin-actinconnection,aneternalloveaffair.,EMBOJ,22,pp.2324-33,2003)。当整联蛋白在黏着斑上与胞外基质(ECM)细胞外相互作用时，整联蛋白亚单位的细胞内胞质尾区募集各种黏着斑分子，其包括衔接蛋白如桩蛋白和pl30Cas，以及信号分子如黏着斑激酶(FAK)禾口c-Src(DeMali，K.A.etal.,K.Integrinsignalingtotheactincytoskeleton，CurrOpinCellBiol"15,pp.572-82,2003;Carragher,N.O.andFrame,M.C,,Focaladhesionandactindynamics:aplacewherekinasesandproteasesmeettopromoteinvasion,TrendsCellBiol,14，pp.241-9，2004)。细胞内信号分子的募集导致它们的激活，这导致肌动蛋白细胞骨架的再组织，以及随后细胞形状的改变(Juliano,R.L.etal.，Integrinregulationofcellsignalingandmotility,BiochemSocTrans,32,pp.443-6，2004)。因为黏着斑上的整联蛋白通过蛋白质复合物(在其胞质尾区上)被连接到肌动蛋白纤丝上，所以黏着斑分子低效的装配或者肌动蛋白纤丝的异常再组织可引起细胞圆形化并且伴随着黏着斑的减少，这导致细胞随后与基膜分离(Hirohashi,S.andKanai，Y"Celladhesionsystemandhumancancermorphogenesis,CancerSci,94,pp.575-81,2003)。换句话说，因为正常的上皮细胞在富含ECM的基膜上形成单层，所以它们可通过有效地转导来自ECM的细胞外信号而存活。然而，黏着斑的减少导致失巢凋亡，这导致细胞与基膜分离，从而细胞死亡。由于多点突变和基因组不稳定性造成的癌细胞，通过细胞-ECM相互作用和细胞-细胞接触的异常改变，可被允许从原发肿瘤传播。在转移癌细胞的微环境中，从癌细胞或邻近的成纤维细胞、白细胞、内皮细胞分泌的生长因子和细胞因子在细胞接触、黏着、迁移和侵入中起重要的作用(Stamenkovic,I.Extracellularmatrixremodelling:theroleofmatrixmetalloproteinases,JPathol,200,pp.448-64,2003)。转移癌细胞穿过基膜和基质区域进入循环系统(内渗)，并且在循环中存活。然后，它们通过外渗离开该循环。在该事件期间，整联蛋白介导的癌细胞与ECM的黏着可关键性地影响细胞的转移潜能(Liotta,L.A.，etal.,Biochemicalinteractionsoftumorcellswiththebasementmembrane,AnnuRevBiochem,55,pp.1037-57,1986)。在传播的癌细胞之中，只有幸免于失巢凋亡的细胞可经由血液和淋巴管行进到远端部位，并且最终附着到一个部位并且作为转移肿瘤增殖(Thiery，J.P.,Epithelial-mesenchymaltransitionsintumourprogression,NatRevCancer,2,pp.442-54,2002)。因此，在筛选抗肿瘤发生或转移试剂时，发现对正常细胞没有任何作用的使肿瘤发生细胞失巢凋亡的试剂将是有用的。TM4SF5(或L6H)是肿瘤相关抗原L6的同系物，并且与L6、IL-TMP和L6D形成4-跨膜L6超家族(Wright,M.D.etal.,TheL6membraneproteins-anewfourtransmembranesuperfamily,ProteinSci,9,pp.1594-600，2000)。TM4SF5在胰腺癌、胃癌、结肠癌、乳头部癌(乳头腺癌，papillavatericarcinoma)和软组织肉瘤以及非内分泌的肺和ACTH(促肾上腺皮质激素)-阴性支气管类癌瘤中高度表达(Pascual-LeTallec,L.etal.,Identificationofgenesassociatedwiththecorticotrophphenotypeinbronchiacarcinoidtumors,JClinEndocrinolMetab,87,pp.5015-22，2002)。在目前的研究中，我们发现TM4SF5在肝癌组织中过量表达，并且TM4SF5引起肌动蛋白再组织以及上皮-间充质转换(EMT)，这导致接触抑制丧失和致癌性增生(LeeS-Aetal.，TM4SF5-mediatedtransmodulationbetweencytosolicp27KiplandRhoGTPasesandepithelial-mesenchymaltransitioncauselossofcontactinhibition,CancerCell,2007)。TM4SF5在成纤维细胞中的超表达导致肌动蛋白再组织和黏着斑转换(focaladhesionturnover)(Lee,S.Y.etal"Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)。TM4SF蛋白(被称为四次跨膜蛋白(tetraspanin或者tetraspan))是一组具有4个跨膜结构域的、大约25-50kDa的疏水性蛋白，并且具有具有两个胞外环和两个短的胞质尾区(Stipp,C.S.etal.,Functionaldomainsintetraspaninproteins,TrendsBiochemSci,28,pp,106-12,2003)。TM4SF通过与细胞黏着分子如整联蛋白形成复合物而形成四次跨膜蛋白网结构，以协作性地在细胞黏着禾口运动中发挥它们的作用(Berditchevski,F,Complexesoftetraspaninswithintegrins:morethanmeetstheeye,JCellSci,114,pp.4143-51,2001)。技术问题本发明的一个目标是提供失巢凋亡诱导剂，其包括黄水枝(77"w/top0/ya)提取物、从其分离的黄水枝酸(tiarellicacid)化合物或其药学上可接受的盐，其对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性。本发明的另一目标是提供用于治疗和预防癌症疾病的药物组合物以及用于预防和改善癌症疾病的功能性保健食品，其包括所述失巢凋亡诱导剂。图1显示TM4SF5-裸亲代(nullparental)SNU449细胞(下文被称为'P')、稳定对照SNU449细胞(下文被称为'Cp')、稳定TM4SF5-超表达SNU449Tp细胞(下文被称为'Tp')和SNU449T16细胞(下文被称为'T16')的TM4SF5表达；图2显示黄水枝酸(TA)处理对P、Cp、Tp和T16细胞的TM4SF5表达的影响；图3是显示SNU449Cp和SNU449Tp细胞生长的变化的显微镜照片，这取决于黄水枝酸(TA)的浓度；图4是显示SNU449Cp和SNU449Tp细胞数目的图，这取决于黄水枝酸(TA)的浓度和时间；图5显示各种细胞系中的TM4SF5表达；图6显示在黄水枝酸(TA)处理后，TM4SF5存在或不存在下不同细胞系的数目的图；图7是在黄水枝酸(TA)处理后，在TM4SF5-裸细胞(SNU638和SNU668)中黏着斑分子的表达和激活的显微镜照片；图8显示免疫印迹测定的结果，其中在用不同浓度的黄水枝酸(TA)处理的细胞系中检测了黏着斑分子的表达和激活；图9显示免疫印迹测定的结果，其中黏着斑分子的表达和激活在用黄水枝酸(TA)处理不同时间段的细胞系中进行检测；图IO显示在黄水枝酸(TA)处理后，pl30Cas磷酸化水平以及pl30Cas、FAK和桩蛋白之间的物理缔合(物理关联，physicalassociation);图11显示在黄水枝酸(TA)处理后，在SNU449细胞系中黏着斑分子的表达和激活；图12显示在黄水枝酸(TA)处理后，TM4SF5存在或不存在下不同细胞系中黏着斑分子的表达和激活；图13是在黄水枝酸(TA)处理后，通过对pY397FAK(黏着斑激酶)和pY118桩蛋白进行免疫染色分析黏着斑形成的结果；图14显示在黄水枝酸(TA)处理后，整联蛋白a5和pY397FAK之间的解离；图15显示在黄水枝酸(TA)处理后，激动蛋白应力纤维形成的降低；图16是显示在黄水枝酸(TA)处理后，在SNU449细胞系中黏着程度的图；图17显示在黄水枝酸(TA)处理不同时间段后，漂浮SNU449Cp和SNU449Tp细胞的数目的图18是在黄水枝酸(TA)处理不同时间段后，细胞存活和死亡相关的信号分子的蛋白质印迹的结果；图19是在黄水枝酸(TA)处理后，分析细胞的DNA含量的结果；图20显示通过在SNU449T16细胞中过量表达野生型FAK、桩蛋白或pl30Cas，抑制TA介导的作用的程度；图21是分析DNA含量的结果，其中黏着斑分子的超表达抑制了黄水枝酸(TA)-介导的细胞死亡；图22显示在黄水枝酸(TA)给药后，注射有TM4SF5表达细胞系的小鼠的体重和肿瘤体积上的变化；图23显示在黄水枝酸(TA)给药后，TM4SF5介导的肿瘤组织中细胞死亡的诱导；和图24显示在黄水枝酸(TA)给药后，TM4SF5介导的肿瘤组织中的胱天蛋白酶-3的激活。
发明内容—方面，本发明涉及失巢凋亡诱导剂，其包括黄水枝(77"^//"提取物、从其分离的黄水枝酸(tiarellicacid)化合物或其药学上可接受的盐，其对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性。如本文所用，黄水枝D.Don，也被称为用于治疗哮喘的医用药草，是属于虎耳草科家族的多年生草本植物。它只存在于韩国UlhmgIsland的山顶。本发明的黄水枝提取物是来自黄水枝的粗制提取物或极性溶剂可溶性提取物。粗制提取物包括在如此溶剂中可溶的提取物，所述溶剂选自包括净化水在内的水、Cl-C4低级醇和其混合物，优选地为甲醇可溶性提取物。此夕卜，极性溶剂可溶性提取物包括在如此溶剂中可溶的提取物，所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丁醇和其混合物，优选地为丁醇。本发明的黄水枝提取物可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。例如，收集黄水枝的整个植物，在暗处干燥，然后磨碎。然后，黄水枝粉末与2至20倍体积的极性溶剂混合，所述极性溶剂例如水，d-C4低级醇如甲醇、乙醇和丁醇，或其混合比大约1:0.1至1:10的混合溶剂，优选地为甲醇，并且在20至50。C的温度范围内通过热水提取、冷水提取、用冷水的回流提取或者超声提取两次至五次，优选地两次至三次，提取10小时至48天，优选地20至30小时。产物按照常规方法被过滤、浓縮并且干燥以获得粗制提取物。此外，粗制提取物在蒸馏水中悬浮，并且然后与1至100倍，优选1至5倍体积的极性溶剂混合，所述极性溶剂如水、乙醇、甲醇和丁醇，并且提取一至十次，优选一至五次，以获得极性溶剂可溶性提取物。另夕卜，可进行常规的分馏过程(HarborneJ.B.,Aguidetomoderntechniquesofplantanalysis.3,pp6-7，1998)。从本发明的黄水枝提取物分离的黄水枝酸化合物[3,23-二羟基-20(29)-羽扇烯-27-酸]由下式(I)表示。如本文所用，术语"药学上可接受的盐"是指源自药学上或生理学上可接受的无机酸和有机酸和碱的那些盐。合适的酸的实例包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯硫酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。源自合适碱的盐的实例可包括碱金属如钠，和碱土金属如镁和铵。本发明的黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐特异性地影响表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞以诱导癌细胞的失巢凋亡。如本文所用，术语"肿瘤相关抗原L6或其同系物"指这样的蛋白，其形成跨膜L6超家族，诱导不受控制的细胞生长并且在各种肿瘤细胞中表达。肿瘤相关抗原L6或其同系物包括L6、TM4SF5(或L6H;跨膜4次的L6家族成员5)、IL-TMP和L6D，优选为TM4SF5。如本文所用，术语"失巢凋亡(anoikis)"指由细胞与胞外基质附着减少或者细胞与胞外基质不适当的黏着引起的特定形式的细胞凋亡。为了方便起见，失巢凋亡在本发明中可被描述为细胞死亡或细胞凋亡。在本发明的具体实施方式中，其寻找抑制由于肿瘤相关抗原L6的同系物TM4SF5诱导的细胞增殖的化合物，本发明人发现黄水枝酸(3,23-二羟基-20(29)-羽扇烯-27-酸)在表达TM4SF5的细胞系中诱导失巢凋亡。当TM4SF5-表达细胞系用黄水枝酸(TA)处理时，黏着斑分子的磷酸化被抑制，这导致细胞附着减少。因此，细胞增殖被抑制，导致失巢凋亡。此外，TA给药在裸鼠中抑制了TM4SF5-介导的肿瘤发生。这些观察表明黄水枝酸(TA)可被开发为针对TM4SF5-阳性肿瘤发生的推定治疗剂。已知表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞引起了肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼睛黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、肛门癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、恶性淋巴瘤、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、泌尿系统癌(urinarycancer)、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、或垂体腺瘤，优选为肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、乳头状癌、软组织肉瘤、非内分泌肺肿瘤、或ACTH-阴性支气管类癌瘤。另一方面，本发明提供用于预防和治疗癌症疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的失巢凋亡诱导剂，所述失巢凋亡诱导剂包含黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐，其对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性。本发明的用于预防和治疗癌症疾病的组合物，基于该组合物的总重量，包括按重量计O.l至50%的失巢凋亡诱导剂，其包含黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐。本发明的药物组合物可进一步包括在药物组合物制备中通常使用的合适的载体、赋形剂和稀释剂。按照常规方法，本发明的药物组合物可被配制成口服制剂，如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆和气溶胶；外用制剂；栓剂；或无菌可注射溶液。在组合物中包含的载体、赋形剂或稀释剂，举例来说，可为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶(acaciarubber)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯垸酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。这样的制剂可采用通常使用的稀释剂或赋形剂进行制备，如填料、补充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。用于口服给药的固体制剂的实例包括片剂、丸剂、粉末、颗粒和胶囊，并且固体制剂可通过将该化合物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶混合而制备。此外，除了赋形剂外，可以使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。用于口服给药的液体制剂的实例包括悬浮液、内服的液体、乳液和糖浆，并且除了一般的稀释剂如水和液体石蜡外，可包含各种赋形剂如湿润剂、增甜剂、香料和防腐剂。肠胃外给药的制剂的实例包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯或类似物。作为栓剂基质，可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61(tween61)、可可脂、月桂油脂(lauricbutter)、甘油明胶或类似物。本发明药物组合物的有效剂量可根据患者的健康状况和体重、疾病的严重性、药物剂型、给药途径和给药时间而确定，并且可由本领域技术人员适当地选择。然而，为了起到更好的功效，本发明的组合物可以日剂量0.0001至100mg/kg，优选地0.001至10mg/kg给药一次或几次。该剂量并不意欲限制本发明的范围。本发明的药物组合物可经由各种途径被施用给哺乳动物如大鼠、小鼠、家畜和人。考虑所有的给药方式，例如，给药可以口服、直肠地或者通过静脉内、肌肉内、皮下、硬脑膜内(intraepiduml)或脑室内注射而进行。在仍然另一方面，本发明涉及用于治疗和预防由表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞引起的癌症疾病的方法，所述方法包括下列步骤向患有癌症的对象施用失巢凋亡诱导剂，所述失巢凋亡诱导剂包含黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐，其对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性，或者施用包括所述失巢凋亡诱导剂的药物组合物，用于治疗和预防癌症疾病。按照本发明的癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂或药物组合物，其功效、给药方法和剂量与上述相同。在本发明的方法中，术语"对象(subject)"包括哺乳动物如人、猴子、小鼠、猪、牛和兔，但不限于此。在仍然是另一方面，本发明提供功能性保健食品，其包括作为活性成分的失巢凋亡诱导剂，所述失巢凋亡诱导剂包含黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐，其对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性。包括癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂作为活性成分的食品包括但不限于各种食品、饮料、口香糖、茶、复合维生素和健身食品(healthimprovingfood)。癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂_—其包括黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐一一基于食品的总重，可按重量计包含有0.01至15%的量，并且基于100ml保健饮料组合物，加入量可为0.02至5g，优选为0.3至1g。本发明的功能性保健食品可以为片剂、胶囊、丸剂、液体制剂或类似形式。本发明的保健饮料组合物不限于任何特定的组合物，只要它是以指出的比例包含上述化合物为基本成分的液体，象普通的饮料，并且可包含各种增甜剂或天然碳水化合物为附加成分。上述天然碳水化合物的实例可包括单糖如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述那些之外的增甜剂，可有利地使用天然增甜剂(奇甜蛋白(thaumatine)、甜叶菊提取物(如新蛇菊苷A)、甘草皂苷)，和合成增甜剂(糖精、天冬甜精)。每100ml本发明的组合物，所述天然碳水化合物的比例一般地为大约1至20g，优选地大约5至12g。除了上述之外，本发明的功能性保健食品可包含各种营养素、维生素、矿物(电解质)、香料如合成香料和天然香料、着色物质和高效增鲜味剂(奶酪、巧克力)、果胶酸和其盐、褐藻酸和其盐、有机酸、保护胶增稠剂、pH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳酸饮料应用的碳酸化试剂。此外，本发明的功能性保健食品可包含天然果汁和果浆，以提供果汁饮料和植物饮料。这些成分可单独地或组合地使用。这些添加剂的比例不是那么关键，但是每100份按重量计本发明的化合物，可一般选自按重量计0至大约20份的范围。在下文中，本发明将参考实施例和实验实施例更详细描述。然而，这些实施例和实验实施例仅是为了例证性目的，本发明没有意欲被这些实施例和实验实施例所限制。具体实施例方式实施例1.黄水枝粗制提取物的制备在韩国UlhmgIsland收集黄水枝的整个植物，并且其Ukg被干燥、粉碎并且与5L甲醇混合。混合物在室温下搅拌24小时，并且真空下过滤以回收上清液。重复该过程两次以收集上清液。然后，上清液在减压下浓縮以得到100.5g黄水枝的甲醇粗制提取物。实施例2.极性溶剂可溶性黄水枝提取物的制备将在实施例1中得到的黄水枝粗制提取物悬浮在1L蒸馏水中。1L丁醇加入其中，并且混合以分成丁醇可溶性部分和水可溶性部分，接着过滤和在减压下浓缩以去除溶剂。最后，得到80.0g丁醇可溶性黄水枝提取物，以用作下列实验中的样品。实施例3.从黄水枝提取物分离黄水枝酸3.29kg黄水枝在室温下用64L甲醇提取四次，进行7天，接着在减压下浓缩以得到3.52kg甲醇提取物。将3.52kg甲醇提取物悬浮在IOL水中，然后用30L己院重复提取三次以得到651g己垸可溶性部分。滤液用30L乙酸乙酯重复提取三次以得到510g乙酸乙酯可溶性提取物。此外，乙酸乙酯提取之后，40L剩余的悬浮液放入DiaionHP-20中，并且用80L水洗脱。水可溶性部分被冻干以得到1.4kg，然后用80L50。/。的甲醇洗脱。50%甲醇可溶性部分被冻干以得到792g。最后，DiaionHP-20柱用甲醇洗脱以得到158g甲醇可溶性部分。黄水枝提取物的各个部分经历薄层层析。结果，己烷可溶性部分被发现包含大量黄水枝酸。330g，一半量的己烷可溶性部分被加入到4kg硅胶中，然后用己烷-乙酸乙酯(10:l，13.2L;5:1,16.8L;2:1,24L)、氯仿-甲醇(9:1,36L)、氯仿-甲醇-水(7:3:0.1,20L)和12L甲醇依次进行洗脱以产生9个部分。通过进行薄层层析，黄水枝酸被发现在部分6和7中。包含黄水枝酸的两个部分被放在一起，应用到2kg硅胶中，接着用氯仿-甲醇(20:l，18.9L;7:1,9L;3:1，4L)和9L甲醇洗脱产生11个部分。其中，黄水枝酸被发现在部分4、5和6中。这些部分被应用到硅胶柱中，并且经历溶剂再结晶以得到2g黄水枝酸。此外，330g己烷可溶性部分通过上述方法进行分离，得到2g黄水枝酸。具有下列物理性质的总共4g黄水枝酸被分离和纯化(下文被称为TA)。针状体(MeOH);mp254-256C;23D+94滩啶，c0.14);IR(KBr,cm-l):3491(OH),1689(CO),1645(C=C),1450,1388，1262,1222,1044;HRMSm/z472.3552(M+，CalcdforC30H48O4:472.3553);EIMS(rel.int.)m/z:472[M]十(61),454[M-H20]+(34),436[M-2H20]+(62),424(42),396(26),205(75),187(71),175(87),173(100);13C-NMR(150MHz,吡啶-d5):13.0(C-24),17.4(C-25),17.5(C-26),18.7(C-6),18.8(C-28),19,4(C-30)，21.3(C-ll),25.8(C-15),26.7(C-12),27.9(C-2),30,1(C-21),37,7(C-10),38.2(C-7),38.3(C-16),39.2(C-l),39.6(C-13),40.4(C-22),40.8(C-8),42.9(C-4),43.0(C-17),48.1(C-19)，49.2(C-5),51.4(C-18),51.6(C-9),60.4(C-14),68.2(C-23),73.6(C-3),110.2(C-29),150.9(C-20)，178,3(C-27);1H-NMR(600MHz,吡啶陽d5):1.05,1.71(2H,m,每个，H-l),1.82,1.91(2H,m,每个，H-2),4.02(1H,dd,J=4.7,11.6Hz,H-3),1.51(1H,dd,J=1.5,12.0Hz,H-5),1.48,1.65(2H,m,每个，H-6),1.87,2.06(2H,m，每个，H-7),2.02(1H,dd,J=1.7,12.7Hz,H-9),1,32,1.64(2H,m,每个，H-ll),1.87,2.60(2H,m，每个，H-12),1.88(1H，m,H-13),1.67，2.28(2H,m,每个，H-15),1,70,1.78(2H,m,每个，H-16),1.81(IH，m，H-18)，2.60(1H，m,H-19),1.36,1.97(2H,m，每个，H-21)，1.16,1.40(2H,m,每个，H-22),3,57,4.07(2H,d,J=10.4,每个，H-23)，1.04(3H，s，H-24),1.01(3H,s,H-25),1.21(3H,s,H-26),0.90(1H,s,H-28).4.76,4.96(2H,s,每个，H-29),1.86(3H,d,J=6.4Hz,H-30).对比实施例1.细胞培养病毒感染后，混合稳定克隆(对照SNU449Cp禾PTM4SF5-表达的SNU449Tp细胞克隆)和单细胞衍生的稳定克隆(singlecell-drivenstableclones)(TM4SF5-表达的SNU449T16)通过用具有空pLNCX和带有TM4SF5的pLNCX的反转录病毒感染SNU449肝脏细胞(韩国细胞银行(KoreanCellBank),首尔，韩国)。亲代和对照细胞(Cp)在37°C和5%(302下分别被保持在不含或含有200吗/mlG418(A.G.ScientificInc.,SanDiego,CA)的RPMI-1640/10%FBS/0.25Hg/ml庆大霉素(Calbiochem,SanDiego,CA)中。内源表达TM4SF5的细胞和内源不表达TM4SF5的细胞(韩国细胞银行)被保持在含有10%FBS的DMEM-H或RPMI-1640培养基(JBIInc.,Daegu,Korea)中。对比实施例2.细胞溶胞产物的制备和蛋白质印迹在不同实验条件下，来自细胞的全细胞溶胞产物如文献(Lee,S.Y.etal.,Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)中所述制备。例如，细胞与对照GFP、野生型黏着斑激酶(FAK)、桩蛋白、pl30CaseDNA—起经历电穿孔(950pF,250V)。电穿孔后一天，细胞用TA(20nM)处理所指出的时间。正常培养的或者用不同浓度TA处理指出时间段的细胞采用RIPA缓冲液进行收获。来自裸鼠的对照或肿瘤组织在手术后立刻用液N2冷冻。液N2中的组织用研钵和研杵匀浆，并且用含有O.P/。SDS的RIPA缓冲液进行提取。溶胞产物的标准蛋白质印迹通过利用针对二氧磷基(phosph)-Y397、Y407、Y577、Y861、Y925FAK(BioSourceInternational,Inc.,Camarillo,CA)、二氧磷基-Y楊Src、c-Src、pl51NK4B、pl61NK4A(SantaCruzBiotech.,SantaCruz,CA)、FAK、pl30Cas、桩蛋白、pY"8桩蛋白、活性胱天蛋白酶-3(Capase-3)(BDTransduct,Lab"SanJose,CA)、a-微管蛋白(Sigma,StLouis,MO)、二氧磷基-S473、或T3Q8Akt、Akt、二氧磷基-Erkl/2、Erk1/2(CellSignalingTech.,Danvers,MA)、禾PTM4SF5(自制)的抗体进行。对比实施例3.免疫荧光显微术细胞用DMSO或20TA处理24小时。然后，细胞在预包被有10昭/ml纤连蛋白的盖玻片上铺板并且在DMSO或20TA存在下温育2小时。接着，如文献(Lee,S.Y.etal.，Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)中所述，利用pY，FAK、pY118桩蛋白和肌动蛋白进行免疫荧光染色。安装好的样品通过荧光显微镜(BX51，Olympus,Japan)显现。对比实施例4.实验动物的准备4-5周龄的雌性裸鼠(BALB/cAnNCrjBgi-nu)购买自Orient.Co.Ltd.(Seongnam，韩国)。小鼠被安置在可控温度和湿度下的特定无病原体的室中。所有动物程序按照SeoulNationalUniversityLaboratoryAnimalMaintenanceManual中的程序和IRB协议进行。5-6周龄的小鼠皮下注射5xio6个活的SNU449Cp或SNU449T16细胞。肿瘤体积用卡尺进行测量并且采用下列数学式1进行计算。当肿瘤体积达到200mm3时，小鼠每隔一天腹膜内注射3mg/kg或30mg/kg(体重)的黄水枝酸(TA)，进行30天。(宽度x长度2)/2宽度最小直径(mm)长度最大直径(mm)实验实施例l.对TM4SF5-表达细胞生长的抑制作用为了测量在实施例3中得到的黄水枝酸(TA)对TM4SF5-表达细胞生长的抑制作用，如文献(Lee,S.Y.etal.,Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99,2006)中所述进行下列步骤。通过对比实施例1的方法培养的TM4SF5-裸亲代SNU449(下文被称为T')、稳定对照SNU449(下文被称为'Cp')、稳定TM4SF5-超表达SNU449Tp(下文被称为Tp')和SNU449T16(下文被称为'T16')用不同浓度(0、0.1、5、20pM)的黄水枝酸(TA)处理，并且测定对细胞生长的抑制作用。结果分别显示在图l至4中。如图1禾B2所示，发现黄水枝酸(TA)对TM4SF5-表达细胞的生长呈现出抑制作用，而对TM4SF5的表达水平没有影响(参见图1和2)。此夕卜，如图3和4所示，当TM4SF5裸SNU449Cp细胞用20pM黄水枝酸(TA)处理3天时，没有观察到抑制作用。另一方面，当TM4SF5-表达SNU449Tp细胞用黄水枝酸(TA)处理3天时，在5pM的低浓度下观察到抑制作用，并且在20^M浓度下观察到降低的细胞密度和圆形的细胞(参见图3)。如图4所示，TA处理减少了TM4SF5-表达细胞的数目，这表明抑制作用是由于细胞凋亡(参见图4)。接下来，为了证实黄水枝酸(TA)对TM4SF5具有特异性，黄水枝酸(TA)的细胞毒性采用具有内源TM4SF5表达的细胞进行检测。RT-PCR采用下面表1中描述的引物组在包括94°C30秒、55。C30秒和72。C30秒的30个循环在内的条件下进行。结果显示在图5中(参见图5)。不同的细胞系采用5或20pM浓度的黄水枝酸(TA)进行处理。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果，发现包括Hek293和COS7成纤维细胞、MDA-MB-453乳腺上皮细胞、SNU638和SNU668胃上皮细胞、以及SNU398肝上皮细胞在内的TM4SF5-裸细胞随着时间而增殖。因此，可以看出，这些细胞没有受到黄水枝酸(TA)的影响。然而，具有内源TM4SF5表达的细胞在TA处理后显示出生长抑制，这导致细胞数目的最终减少(参见图6和7)。因此，可以看出，上述结果与那些异常表达TM4SF5的SNU449Tp有关。实验实施例2.黄水枝酸(TA)-介导的黏着斑分子激活的抑制为了检测哪个信号分子受到黄水枝酸(TA)影响，如文献(Lee,S.Y.etal.，Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99，2006)中所述进行下列过程。SNU449细胞系用黄水枝酸(TA)以剂量(0、1、5、20pM)和时间(0、8、16、24、36小时)依赖性方式进行处理。SNU449Cp和SNU449T16细胞系用不同浓度(0、1、5、20^M)的黄水枝酸(TA)处理24小时，然后进行免疫印迹试验。如图8所示，在用20^MTA处理的TM4SF5-表达SNU449T16细胞中，观察到降低的黏着斑激酶(FAK)和桩蛋白磷酸化以及pl30Cas蛋白水平，而在不表达TM4SF5的SNU449Cp细胞中没有观察到作用(参见图8)。同样，在用20TA处理的SNU449T16细胞中，FAK和桩蛋白的磷酸化以及pl30Cas的蛋白水平以时间依赖性方式显著下降(参见图9)。此外，可以看出，黄水枝酸(TA)处理降低了pl30Cas的磷酸化以及黏着斑激酶(FAK)、pl30Cas和桩蛋白之间的物理缔合(参见图10)。而且，黄水枝酸(TA)的TM4SF5-依赖性抑制作用在TM4SF5-表达SNU449Tp细胞系中被观察到(参见图11)。这些观察表明在TM4SF5-表达细胞中，黄水枝酸(TA)处理仅仅影响了黏着斑分子的磷酸化和复合形成(complexformation)。此外，黄水枝酸(TA)-介导的对黏着斑分子激活的作用在表达内源TM4SF5的细胞中以及裸细胞系中进行检测。有趣的是，TA处理对黏着斑分子激活的抑制作用也在内源表达但不缺少TM4SF5的细胞中观察到(参见图12)。然而，如上述结果所示(参见图11)，发现黄水枝酸(TA)处理在SNU449Cp和SNU449Tp中稍微增加了pErk1/2。因为黄水枝酸(TA)抑制黏着斑分子激活和复合形成，所以黏着斑形成将很可能受到TA处理影响。本发明人因此通过对Tyr397-磷酸化FAK(pY，FAK)或Tyrll8-磷酸化桩蛋白(pY118桩蛋白)进行免疫染色，分析在TA-处理和未处理的细胞中的黏着斑形成。尽管TA处理没有影响TM4SF5-裸细胞中黏着斑形成，但是TA处理后在TM4SF5-表达细胞中的黏着斑消失。从对pY，FAK或pY^桩蛋白的免疫染色的结果，在TM4SF5-表达细胞中观察到黏着斑分子的分解(参见图13)。TA-介导的黏着斑消失表示涉及TM4SF5-表达细胞中整联蛋白a5和pY397FAK之间的解离，这与整联蛋白介导的黏着斑分子如pY397FAK的募集相一致(Lee,S.Y.etal.,Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312，pp.2983-99,2006)(参见图14)。此夕卜，因为黏着斑经由应力纤维相互连接(Kaverina,I.etal.，Regulationofsubstrateadhesiondynamicsduringcellmotility,IntJBiochemCellBiol,34，pp.746-61,2002)，所以本发明人也对TA-处理和未处理的细胞中的肌动蛋白染色。如图15所示，发现TM4SF5-表达细胞在TA处理后显示出带有少量(insignificant)应力纤维的异常肌动蛋白组构，而TM4SF5-裸细胞没有(参见图15)。在TA处理的TM4SF5-表达细胞中，黏着斑和肌动蛋白应力纤维形成的损失可有助于TA处理后圆形细胞数目的增加。实验实施例3.黄水枝酸(TA)-介导的TM4SF5-表达细胞的失巢凋亡诱导TA处理导致黏着斑分子的失活和分解，可能有助于圆形形态。因此，可以认为TA处理诱导TM4SF5-表达细胞的失巢凋亡。为了检测TA处理是否影响了细胞黏着，在TA介导的细胞死亡分析之前进行下列过程，如文献(Yang,X.etal.,Palmitoylationsupportsassemblyandfunctionofintegrin-tetraspanincomplexes,JCellBiol,167，pp.1231-40,2004)中所述。细胞用20(iMTA处理24小时，漂浮细胞被收集并且被重新接种在预包被有纤连蛋白的盘中1小时，然后测定黏着程度。如图16所示，TM4SF5-裸细胞(SNU449P、SNU449Cp)的黏着没有受到TA处理的影响，而用TA预处理的TM4SF5-表达细胞(SNU449Tp、SNU449T16)显示出明显降低的黏着(参见图16)。接着，当漂浮细胞在TA或DMSO处理后进行分析时，发现TA处理增加了漂浮的表达TM4SF5的SNU449Tp细胞的数量，但是没有影响不表达TM4SF5的SNU449Cp细胞(参见图17)。按照该结果，TM4SF5-表达SNU449T16细胞的TA处理还导致Akt失活以及胱天蛋白酶-3激活(参见图18)。此外，20pMTA处理24小时后，细胞DNA含量的分析产生大量的表达TM4SF5的SNU449Tp和SNU449T16的sub-Gl群体，但不表达TM4SF5的SNU449Cp细胞的群体则没有(参见图19)。因此，这些观察表明TA只引起TM4SF5-表达细胞的失巢凋亡。实验实施例4.黄水枝酸(TA)-介导的对黏着斑分子超表达的作用为了评测黏着斑分子如黏着斑激酶(FAK)、桩蛋白和pl30Cas的超表达是否将抑制TA处理的作用，如文献(Lee,S.Y.etal.，Focaladhesionandactinorganizationbyacross-talkofTM4SF5withintegrina2areregulatedbyserumtreatment,ExpCellRes,312,pp.2983-99，2006)中所述进行下列过程。为了研究这一点，各个cDNA经由电穿孔引入到SNU449T16细胞中。l天后，细胞用20^MTA处理24小时以获得溶胞产物。用引入有对照质粒(对于GFP)的SNU449T16细胞的TA处理表明黏着斑分子的时间依赖性失活和胱天蛋白酶-3的激活，这支持了TA-介导的细胞凋亡。然而，引入有野生型黏着斑激酶(FAK)、桩蛋白或pl30Cas的SNU449T16细胞导致一定程度的抑制TA介导的作用(参见图20)。此外，黏着斑分子的过量表达也抑制了TA介导的sub-Gl群体的增加(参见图21)。因此，TA-介导的对TM4SF5-表达细胞的作用可通过黏着斑分子的过量表达被削弱至一定程度。另一方面，在各个实验条件下没有观察到Erid/2激活的变化，由此了解在这种实验系统中TA-介导的对信号转导的作用。实验实施例5.黄水枝酸(TA)对裸鼠中TM4SF5-介导的肿瘤形成的作用为了评测黄水枝酸(TA)给药是否可干扰裸鼠中TM4SF5介导的肿瘤形成，如文献(LeeS-Aetal.,TM4SF5-mediatedtransmodulationbetweencytosolicp27KiplandRhoGTPasesandepithelial-mesenchymaltransitioncauselossofcontactinhibition,CancerCell,200乃中所述进行下列实验。如前所报道，注射有TM4SF5-表达SNU449T16细胞的裸鼠形成了明显的肿瘤，而注射TM4SF5-裸SNU449Cp细胞没有形成肿瘤。当黄水枝酸(TA)每隔一天腹膜内给予己有肿瘤(200mm3的计算肿瘤体积)的小鼠30天时，TM4SF5-介导的肿瘤形成被减少。如图22所示，黄水枝酸(TA)以3或30mg/kg体重给药分别将肿瘤体积减少至46.0%或22.1%，而体重正常增加，这表明没有显著的毒副作用(参见图22)。利用注射有SNU449Cp细胞的斑点周围的对照组织和注射SNU449Tp的小鼠的肿瘤组织的蛋白质印迹分析揭示TM4SF5-介导的肿瘤组织呈现出Akt激活以及胱天蛋白酶-3失活，这表明肿瘤形成的信号活动。然而，TA给药降低了Akt激活，增加了pl5INK4B或pl6INK4ACKI(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)水平，并且提高了胱天蛋白酶-3激活，这表明TA导致TM4SF5-介导的肿瘤的生长抑制和细胞凋亡(参见图23)。活性胱天蛋白酶-3的免疫组织化学染色在从己经用TA处理的小鼠中获得的TM4SF5-介导的肿瘤组织中为阳性(参见图24)。因此，TA特异性地干扰了裸鼠中TM4SF5-介导的肿瘤形成，这大概是通过提高细胞凋亡进行的。这些结果表明TA可进一步被开发为TM4SF5-阳性肿瘤潜在的治疗试剂。包括本发明的提取物或化合物的药物制剂的实施例将被描述。然而，这些实施例仅是为了例证性目的，并且本发明没有意欲被这些实施例限制。制备实施例1.粉末的制备黄水枝粗制提取物300mg乳糖100mg滑石10mg这些成分被混合并填充入气密性囊中以制备粉末试剂。制备实施例2.片剂的制备黄水枝酸50mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸镁2mg这些成分的混合物采用一般的压片方法被制备成片剂。制备实施例3.胶囊的制备黄水枝粗制提取物50mg玉米淀粉lOOmg乳糖100mg硬脂酸镁2mg这些成分的混合物按照一般方法被填充到明胶胶囊中，以便得到胶囊剂。制备实施例4.可注射制剂的制备黄水枝酸50mg无菌蒸馏水适量pH调节剂适量按照一般方法，包含上述成分的可注射制剂被制备成(2ml)安瓿。制备实施例5.液体制剂的制备黄水枝粗制提取物100mg高果糖浆10g甘露糖醇5g净化水适量按照一般方法，将每种成分溶解在净化水中。向上述成分中加入适量的柠檬香料，并且混合。然后，加入净化水至100ml的体积，填充入棕色瓶中，并且灭菌以制备液体制剂。制备实施例6.保健食品的制备黄水枝酸1000mg维生素混合物适量醋酸维生素A70吗维生素E1.0mg维生素0.13mg维生素B20.15mg维生素B60.5mg维生素B120.2吗维生素c10mg生物素10吗烟酰胺1.7mg叶酸50昭泛酸钙0.5mg矿质混合物适量硫酸铁1.75mg氧化锌0.82mg碳酸镁25.3mg磷酸二氢钾15mg磷酸氢二钾55mg柠酸酸钾90mg碳酸钓100mg氯化镁24.8mg维生素和矿质混合物的组合物按照各个合适成分的优选组合，但是任选地，可以被改变。上述成分按照常规保健食品生产方法进行混合以制备进一步用作保健食品组合物的颗粒。制备实施例7.保健饮料的制备黄水枝粗制提取物1000mg柠檬酸1000mg寡糖100g李子浓缩物(pulmconcentrate)2g牛磺酸1g净化水被填充至900ml上述成分按照常规保健饮料生产方法进行混合，并且混合物在85。C下伴随搅拌加热一小时。溶液被过滤并且储存在密封且无菌的2L容器中。容器然后被储存在冰箱中，以进一步被用作保健饮料组合物。饮料组合物按照各个成分的优选组合，但不总限于此，并且可考虑到需求阶级、需求国家、使用目的、地方和国家的优选等进行改变。工业实用性本发明的黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐呈现出降低癌细胞增殖和诱导细胞死亡的作用，由此被用作用于预防和治疗癌症疾病的药物组合物和功能性保健食品。权利要求1.失巢凋亡诱导剂，其包括黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐，所述失巢凋亡诱导剂对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性。2.根据权利要求l所述的失巢凋亡诱导剂，其中所述提取物是粗制提取物或极性溶剂可溶性提取物。3.根据权利要求2所述的失巢凋亡诱导剂，其中所述粗制提取物是在包括净化水在内的水、Cl-C4低级醇或其混合物中可溶的提取物。4.根据权利要求2所述的失巢凋亡诱导剂，其中所述极性溶剂可溶性提取物是在选自水、甲醇、乙醇、丁醇和其混合物的溶剂中可溶的提取物。5.根据权利要求l所述的失巢凋亡诱导剂，其中所述肿瘤相关抗原L6或其同系物是L6、TM4SF5、IL-TMP或L6D。6.根据权利要求l所述的失巢凋亡诱导剂，其中所述癌细胞是选自下列的任何一种肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼睛黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、肛门癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、恶性淋巴瘤、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、泌尿系统癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。7.用于治疗和预防癌症疾病的药物组合物，其包括权利要求l的癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂。8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中基于所述组合物的总重量，所述癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂按重量计被包含的量为O.l~50%。9.用于预防和改善癌症疾病的功能性保健食品，其包括权利要求l的癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂作为活性成分。10.根据权利要求9所述的功能性保健食品，其中所述功能性保健食品是片剂、胶囊、丸剂或液体。11.治疗癌症疾病的方法，其通过将权利要求l的癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂施用给患有癌症的哺乳动物进行。12.权利要求l的癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂在制备癌症疾病治疗试剂中的应用。13.权利要求l的癌细胞特异的失巢凋亡诱导剂在癌症疾病治疗中的应用。全文摘要本发明涉及失巢凋亡诱导剂，其包括黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐，所述失巢凋亡诱导剂对表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞具有特异性。本发明的黄水枝提取物、从其分离的黄水枝酸化合物或其药学上可接受的盐导致细胞附着减少以降低癌细胞增生，并且在表达肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌细胞中呈现出诱导细胞死亡的作用，因此被用于治疗和预防由于肿瘤相关抗原L6或其同系物的癌症。文档编号A61P35/00GK101678058SQ200780053134公开日2010年3月24日申请日期2007年11月30日优先权日2007年5月26日发明者吴世湸,安境燮,崔洙龙,崔順子,李昊宰,李正源,李炯圭,李相龟,李重求,金斗英,金正姬,金秀贤,金银娥申请人:韩国生命工学研究院