专利名称：一类谷胱甘肽衍生物及其抗肿瘤医药用途的制作方法
技术领域：
现临床上使用或正在研发的很多药物靠直接或间接地抑制DNA和/或蛋白质来达到攻击 肿瘤细胞的目的。所以，快速分裂的正常细胞，如肠的上皮和骨髓也同样受到不利的影响而 产生强烈的副作用。此技术发明描述的一种独特的小分子抗肿瘤化合物，它不依赖于细胞的 分裂与分化，而是作用于乙二酸酶系统，而引起肿瘤细胞的程序死亡，可大大降低毒副作用。
人体的糖代谢过程中不可避免地产生一种叫甲基乙二醛的有毒的化合物，它可以引起细 胞的程序死亡。人体在长期的进化过程中发展了一种叫乙二醛酶的系统，它由乙二醛酶I (glyoxalase I，简称Glxl)和乙二醛酶II (glyoxalase II，简称GlxII)组成，起到解毒甲基乙二醛的 作用。多种肿瘤细胞中Gbd高度表达，该酶的抑制剂可以抑制或延缓人的肿瘤细胞在老鼠的 生长，但没有明显的副作用。但该酶的抑制剂多为竞争性抑制剂，为了抑制小鼠肿瘤的生长， 必须高剂量长期静脉注射给药。如果开发Gkl的不可逆抑制剂，它可以使Gbd完全持续失 活，而更加有效地抑制它的活性，可大大降低动物实验的抗肿瘤所需剂量，最终可将此类抑 制剂带入临床试验和市场。
背景技术：
乙二醛酶是一种谷胱甘肽(GSH)为基质的酶系统，它的功能是，将细胞内有毒的甲基 乙二醛通过Glxl和GlxII，有序地转化成无毒性的D-乳酸.
<formula>formula see original document page 3</formula>
甲基乙二醛 硫代半縮醛S-D-乳酰谷胱甘肽 D-乳酸
甲基乙二醛是化学反应活性很高的oc-羰醛，可以共价键的形式与蛋白质和DNA起反应，而直 接影响细胞的生存。Gbd的抑制剂可以成为抗肿瘤药物的观点由来已久，因为它可以提高肿 瘤细胞内甲基乙二醛的浓度，还有，快速分裂的肿瘤细胞对外来的甲基乙二醛异常敏感 (Creighotonetal， Drugs ofthe Future, 2000， 25,385)。此敏感性的机理尚不十分清楚，有一种 可能是甲基乙二醛与叫Hsp27的蛋白质广泛地发生共价键修饰，导致细胞的分化和程序死亡 (Vince et al, J. Med. Chem., 1971, 14, 35)。
为了印证上述假说，Creightonde等人合成了一系列过度态类似物，发现此化合物是Gbd 最强的抑制剂(Murthy et al, J. Med. Chem.， 1994， 37, 2161)，抑制常数(Kis)达到了 10—8M,其 中S(N-对氯苯基-N-羟氨甲酰)谷胱甘肽(CHG)的结构式如下<formula>formula see original document page 3</formula>此过度态类似物的[甘氨酰，谷氨酰]二乙酯前提药物，可以抑制猫白血病L1210和黑素 瘤B16细胞的生长，IC5o为数微摩尔浓度。此实验结果证明了肿瘤杀伤活性起因于抑制Glxl， 而且此类过度态类似物的Ki与二乙酯前提药物的IC5Q值有很强的相关性。
表1.正常细胞与肿瘤细胞中乙二酸酶的活性比较
组织 乙二醛酶活性 (mU/mg protein) __Gkl GlxII_GlxI/GlxII
正常
脑(人)1113±19817±1561.4
肝(人)209 土56360 ±130.6
心(鼠)339 ±24280 ±471.2
肾(人)323 ± 48330 ±861.0
淋巴(小鼠)360 士 30200 ± 301.8
肿瘤
黑色素瘤B16(小鼠)419±7327 ±715.5
白血病L1210(小鼠)310±3020 士 315.5
成胶质细胞瘤(人)290 ±5653± 105.5
乳房纤维腺瘤(人)419±7327 ±715.5
膀胱HT-1107(人)542 ±388± 167.8
前列腺PC-3 (人)4206 ± 29445 ±393.4
睾丸Tl (人)4767±27594± 1251.0
肠HT29(人)542 ±5911 ± 149.3
这种抗肿瘤战略应用时，如表1中所列几种肿瘤细胞中，前列腺肿瘤与膀胱癌是特别适
合的靶标。除了脑细胞，前列腺肿瘤与膀胱癌细胞中GlxI的活性始终比大多数其他正常或肿 瘤细胞高8倍或以上(Creighton et al， 2000, supra)。此外，它们的肿瘤细胞中GlxII的活性 却低。高度表达Gbd的活性可以提供一种补偿解毒的机理，因为肿瘤细胞旺盛的代谢所需能 源严重依赖糖的分解，由此而产生额外的大量的甲基乙二醛。事实上，前列腺癌细胞对外源 性的甲基乙二醛的毒性特别敏感，可能是由程序死亡的结果引起。所以，前列腺肿瘤可能对 抑制乙二醛酶系统反应特别敏感。
后来，另一研究表明，Glxl的浓度在肺癌细胞里也象前列腺肿瘤细胞中一样高度表达， 而且，叫BBGC的Gbd的竞争性抑制剂有效地抑制肺癌细胞的生长，对移植DMS114的小 鼠在100mg/Kg的剂量下有显著的抑制效果，而没有明显的毒副作用。如下表2的7种肺癌 细胞中Gbd的表达水平越高，对其抑制剂也越敏感，即抑制所需的有效浓度也越低(Sakamoto etal, Clinical Cancer Research, 2001,7, 2513)。这些研究结果表明，Glxl是治疗前列腺癌、肺 癌、膀胱癌等肿瘤疾病的理想的耙标，Gbd的抑制剂有可能成为治疗这些癌症的理想的药物。表2.肺癌细胞中Glxl活性与对BBGC的敏感性
细胞株GM活性IC50 to BBGCa
(mol/min/mg蛋白质)(一)
NCI-H4600.81 ±0.0228.8 ±0.7
NCI-H2260.86 ± 0.0425.1 ±0.3
A5490.99 ± 0.0429.7 ± 1.2
NCI-H232.47 ±0.0318.9 ±0.6
DMS2732.63 ± 0.037.8 ±0.5
DMS1143.48 ±0.037.5 ±0.7
NCI-H5228.47 ±0.104.4 ± 0.2
a细胞用BBGC处理48小时.BBGC的ICso值用MTS法测得。
数值为三次不同实验的平均值±标准偏差。
发明内容
合成了一类谷胱甘肽衍生物S-(溴乙酰胺基丙氨酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)与S-(溴乙酰 胺基丁氨酰甲基)谷胱甘肽(BBSG)，测定了此类化合物对GlxI的不可逆的抑制活性，此两种 抑制剂和酶的解离常数GO分别为155和160 一。此抑制剂以共价键的形式与Gbd进行结合 而使其失活。此类抑制剂可以应用于治疗前列腺癌、肺癌、膀胱癌等各种肿瘤疾病的治疗。
具体实施方式
合成Gbd的不可逆抑制剂
S-(溴乙酰胺基丙氨酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)与S-(溴乙酰胺基丁氨酰甲基)谷胱甘肽(BBSG) 的合成途径表示如下
O
BrCH2CCl
NH2(CH2)nNH2- BrCH2C(0)NH(CH2)nNHC(0)CH2Br
(-2HBr) 二溴乙酰基(1， 3)丙二氨(11=3)
二溴乙酰基(l， 4)丁二氨(!1=4)
GS訓aOH
GSCH2C(0)NH(CH2)nNHC(0)CH2Br
BPSG, n=3 BBSG， n=4
二溴乙酰(l， 3)丙二胺
100毫升的烧瓶中放入50毫升三氯甲烷和1,3-丙二氨(13 mmol),然后放入冰浴中待冷却 后，搅拌条件下慢慢滴入溴乙酰氯(1.03g，26mmo1)，滴完后继续搅拌半个小时。溶剂用旋转 蒸发仪减压蒸干，得到浅棕色粗产物。产率卯％。 'H NMR 300 MHz (CDC13, TMS) 5 3.80 (4H, s, -C(0)CH2Br), 3.25 (4H, t， J = 6.25 Hz, -NHCH2CH2-)， 1.85 (2H， p， J = 6.25 Hz, -NHCH2CH2-). ESI MS: (M(Br79)+H+)314.93.
5二溴乙酰(l， 4)丁二胺
此化合物的途径合成与二溴乙酰基(l， 3)丙二胺的大体相同。待反应结束后，溶液用旋转 蒸发仪减压蒸千，得到浅黄色粗产物。产率89%。 'H NMR 300 MHz (CDC13, TMS) S 3.81 (4H, s, -C(0)CH2Br), 1.58 (4H, p， J = 6.5 Hz, -NHCH2CH2-)， 3.25 (4H, t, J = 6.5 Hz, -NHCH2CH2-). ESI MS: (M(Br79)+H+)328.94. S-(溴乙酰胺基丙胺酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)
将二溴乙酰(l， 3)丙二胺(l.lg，3.48mmol)溶于18毫升丙酮中，慢慢滴入将谷胱甘肽(0.2g, 0.65 mmol)溶于10毫升1M浓度氢氧化纳的水溶液。此反应液室温搅拌3小时。此混合物用氯仿 洗三次(3X50ml),然后水溶液用旋转蒸发仪蒸干。粗产物用反相HPLC (Waters jxBondapak C18, 19X150mm)分离，洗脱液为水乙腈三氟乙酸(85: 15: 0.1,v/v/v). 产率15%. NMR 300 MHz (D20， ref HOD (5 4.8)) 5 3.81 (2H, s, -C(0)CH2Br), 1.86 (2H, p, J = 6.25 Hz, -NHCH2CH2-)， 3.24 (2H， t, J = 6.4 Hz, -SCH2C(0)NHCH2CH2-)， 3.21 (2H, t, J = 6.4 Hz, -BrCH2C(0)NHCH2CH2-)， 4.02 (2H, s, Gly-CH2), 3.40 (2H, s, -SCH2C(0)N)， 2.92 (1H, q, J = 14.7， 9.0 Hz, -CCHxHyS-)， 3.12 (IH， q, J = 14.7, 5.2 Hz, -CCHxHyS-)， 4.58 (1H, q, J = 14.1, 6.0 Hz, Cys-CH)， 2.14 (2H, t， J = 7.2 Hz), 2.51 (2H， t， J = 7.2 Hz), 3.78 (IH， t, J = 6.0 Hz). ESI MS: (M(Br79)+H+) 541.08.
S-(溴乙酰胺基丁胺酰甲基)谷胱甘肽(BBSG)
此化合物与BPSG大体相同的途径和方法合成。产率18%。 'H NMR 300 MHz (D20, ref HOD (5 4.8)) 5 3.82 (2H, s, -C(0)CH2Br)， 1.59 (4H, m, -NHCH2CH2-)， 3.25 (2H， t， J = 6.4 Hz， -SCH2C(0)NHCH2CH2-)， 3.22 (2H, t, J = 6.4 Hz, -BrCH2C(0)NHCH2CH2-)， 4.02 (2H, s， Gly-CH2), 3.41 (2H, s， -SCH2C(0)N), 2.93 (1H, q, J = 14.7, 9,0 Hz， -CCHxHyS-)， 3.12 (1H, q, J = 14.7, 5.2 Hz, -CCHxHyS-)， 4.59 (1H, q, J = 14.1, 6.0 Hz, Cys-CH), 2.14 (2H， t, J = 7.2 Hz), 2.51 (2H, t, J = 7.2 Hz)， 3.78 (1H， t， J = 6.0 Hz). ESI MS: (M(Br79)+H+) 555.10.
GM的不可ii抑制作用
此发明提供了不可逆抑制Gbd的一系列谷胱甘肽衍生物。不可逆抑制剂与Glxl的活性 中心结合后通过以共价键形式化学修改使酶永久性地失去活性。不可逆抑制剂对酶的亲和性 越高(离解常数Kd越低)，对酶的抑制作用更持久。 不可逆抑制动力学
如图2所示，S-(溴乙酰胺基丙胺酰甲基)谷胱甘肽(BPSG)和S-(溴乙酰胺基丁胺酰甲基) 谷胱甘肽(BBSG)均在含20%甘油的pH 7的25°C磷酸钠缓冲溶液中，不可逆地抑制人体Glxl 的活性。含有酶(10单位/毫升)和不同浓度不可逆抑制剂的磷酸缓冲液放入各塑料试管管中， 在25。C的水浴里温育。随时间连续采样，将各样品加到含有l.O毫升谷胱甘肽-甲基乙二醛-硫代半缩醛溶液(由谷胱甘肽和甲基乙二醛缩合而成)的比色皿中，检测反应产物在240纳米 的吸光度随时间变化的速率.从产物的起始速率，可以计算酶的催化活性.从剩余酶活性的对 数值随时间的改变的斜率，可以计算人体乙二醛酶失活表观一级速率常数(ki一).从该速率 常数随抑制剂浓度变化的曲线，可以计算抑制剂和酶的解离常数GO及k,d的最大值.
6剂CHG起保护酶失活的作 用，还有，灭活的过程显示饱和动力学。另外，失活的酶的MALDI (matrix assisted laser desorption)质谱显示，每一个肽链(蛋白质)是被一分子不可逆抑制剂以共价键的方式结合 的，且以从不可逆抑制剂中失去溴原子的方式。电脑模拟实验中，将BPSG与BBSG嵌入Gbd 的活性中心时，Cys(60)的巯基在灭活过程中正好处于易于取代BPSG与BBSG的溴原子的位 置。
权利要求
1.如结构通式I所示的谷胱甘肽衍生物用作抗肿瘤药物，结构通式I中的R1为1～6个碳的烷基中的任一种，以及H，CH2CH2Cl，CH2CH2Br，环戊烷，环己烷；结构通式I中的R2为1～6个碳的烷基中的任一种，以及H，CH2CH2Cl，CH2CH2Br，环戊烷，环己烷，R1和R2可以相同或者不同；结构通式I中的n为1～12中的任一种；结构通式I中的X为F、Cl、Br、I等卤素原子中的任一种。
2. 根据权利要求l的应用，其特征是所述的抗肿瘤药物为抗前列腺癌、肺癌、肠癌、睾 丸癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、皮肤癌、白血病等恶性肿瘤的药物。
3. 根据权利要求l的应用，其药物剂型可以是注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂。
全文摘要
本发明属医药技术领域，S-(溴乙酰胺基丙氨酰甲基)谷胱甘肽与S-(溴乙酰胺基丁氨酰甲基)谷胱甘肽用作抗肿瘤药物。此类化合物以共价键的形式与乙二醛酶I进行反应而使其不可逆地失去活性。此类化合物在治疗前列腺癌、肺癌、肠癌、睾丸癌、白血病、乳腺癌、皮肤癌等恶性肿瘤药物方面具有良好的开发应用前景。
文档编号A61K38/06GK101658666SQ20081004214
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月28日 优先权日2008年8月28日
发明者郑哲彬 申请人:上海远农医药科技发展有限公司