养血清脑颗粒对脑微循环障碍的改善作用的制作方法

专利名称：养血清脑颗粒对脑微循环障碍的改善作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂的新用途，特别涉及中药养血清脑颗粒对脑微循环 障碍的改善作用。
背景技术：
世界脑血管疾病的平均发病率为140-200/10万人口，平均死亡率为1()0/K)万人口，是发病率和死亡率较高的病种。改善脑血管损伤对挽救生命和降低医疗 财政都有着重要的意义。缺血再灌注引起的脑血管损伤约占脑血管损伤原因的6()%左右。缺血再灌注后产生的过氧化物降解1-KB，活化NF-icB， NFKB的亚基 进入胞核，激活粘附分子、炎性因子和凋亡相关基因位点，促进黏附分子的表达， 炎性因子的释放和启动凋亡相关蛋白的合成。白细胞的L选择素和血管内皮的E 选择素表达增加引起白细胞沿血管壁的滚动，进而，过表达的白细胞黏附分子 CDllb/CD18与血管内皮细胞黏附分子ICAM-L的结合导致白细胞与血管内皮细胞的黏附。黏附于血管内皮的白细胞释放大量过氧化物和蛋白酶，损伤血管内皮细胞和基底膜，引起血管通透性增加和血浆白蛋白漏出，造成血管周围组织的水肿。过氧化物剌激又可引起血管周围的肥大细胞脱颗粒释放炎性因子和血管活性因子，这些因子从血管外攻击血管加重白细胞与血管内皮细胞的黏附和白蛋白的外漏。血管周围组织的水肿从血管外压迫血管，血管内皮细胞的肿胀和白细胞黏附，血小板积聚等都成为阻碍血流的因素，导致再灌注后不复灌的区域形成。缺血再灌注引起的脑血管损伤是诸多要素参与的多环节的损伤过程，以往的 研究主要集中于用抗过氧化物，抗黏附分子表达，抗血小板凝聚等作用于脑障碍 的某一环节，由于作用环节单一，不足以综合地改善脑微循环障碍，至今没有取 得良好的临床疗效。可作用于脑微循环障碍的不同病理环节的，由多成分组合的 复合制剂有可能起到综合地改善脑微循环障碍的作用。养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细 辛为主要成分构成的中药复方制剂，1996年被中国国家食品与药品监督管理局 (SFDA)作为治疗头痛，眩晕和脑血管疾病的中药复方制剂，批准在中国临床应用。已往的体外研究己经证明该中药复方制剂中芍药甙，川芎嗪，阿魏酸在体外 有抑制过氧化物产生的作用，川芎嗪体外有抑制白细胞和血管内皮黏附因子表达 的作用。但是，有关养血清脑颗粒对缺血再灌注引起的脑微循环障碍是否具有改 善作用未见报告。由于沙鼠wi ] L i s环发育不完全，结扎双侧颈动脉就可以建立全脑缺血模型。 所以本研究用蒙古沙鼠双侧颈动脉结扎建立的缺血再灌注模型，用可视化动态连 续系统观察蒙古沙鼠双侧颈动脉结扎之后脑微循环动态，包括脑血流量，血流速 度，血管径，血管内皮过氧化物产生，白细胞黏附，血管通透性的变化，并用透 射和扫描电镜观察细静脉和毛细血管超微结构的变化，探讨养血清脑颗粒对缺血 再灌注引起的脑微循环障碍的改善作用。

发明内容
本发明提供一种养血清脑颗粒的新的治疗用途，特别是用养血清脑颗粒治疗 和预防脑微循环障碍。养血清脑颗粒是一种已经上市的中成药物，其配方组成为当归、赤芍、川 芎、鸡血藤、勾藤、夏枯草等临床上用于治疗头痛、眩晕等症。本发明经过研究发现，养血清脑颗粒可以预防和治疗脑微循环障碍因而扩大 了其应用范围，为此，本发明的内容主要包括，用养血清脑颗粒制备一种治疗和 预防脑微循环障碍的药物。为证明本发明的实验效果，现将有关实验数据整列如下实验一、动物模型用2%无巴比妥钠(100mg/kg.bw)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈前去毛， 常规消毒，正中失状位切开皮肤，逐层分离，暴露双侧颈总动脉。用特殊设计的 闭合器(一根细的聚乙烯导管和一根粗的塑料管组成的套索)闭锁双侧颈总动脉 (缺血)，30分后解除闭索(再灌注)。然后依次缝合颈部肌肉和皮肤。在操作过 程中保持恒温，动物清醒后送回恒温饲养室饲养。再灌注第5天用20%乌拉坦 (2. 0g/kg. bw)经腹腔注射麻醉进行脑微循环观察或取脑做组织化学和免疫组织 化学染色。假手术组除了不闭索双侧颈总动脉，其他操作同缺血再灌注组。缺血 再灌注+养血清脑颗粒0. 4g/kg和缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组分别在再灌注3小时灌胃给与0. 4g/kg和0. 8g/kg养血清脑颗粒，此后每天灌胃一次，第 5天灌胃后90分钟麻醉进行脑微循环观察或取脑做组织化学和免疫组织化学染色。脑血流量测定用激光多普勒血流灌注成像仪(PeriScanPiM3， PERIMED， Sweden)测量蒙 古沙鼠脑血流量。头皮正中切口，暴露颅骨，去除粘在颅骨的结缔组织。计算机 控制的光学扫描器发出低能量的氦-氖激光照射在暴露的颅骨上。扫描器与颅骨 的距离是18. 5cm。扫描器的扫描区域是8X 10 mm，激光束穿透的深度是().5mm。扫描后显示器上显示一幅彩色图像代表不同区域的灌注水平。记录在缺血前，再 灌注第1， 2， 3， 4， 5天时脑血流图像。所有图像用LDPIwin软件对图像进行测 量。以缺血再灌注前的全脑灌注量为基础值，计算再灌注后各时间点脑血流量的 变化率。 脑微循环观察再灌注第5天麻醉动物，在颈部正中切开，分离气管，连接小动物呼吸机 (All:-V8)，在整，观察过程保持机械通气。暴露股静脉，插入并留置直径为5mm 的聚乙烯导管。切开脑部皮毛，用手提式颅钻在前囟点前开一3X3mm的颅窗。 将37度的人工脑脊液连续滴加在颅窗上以保持大脑表面湿润。用连接于荧光摄 像机(C7M)， HAMAMATSU， Japan)的正立生物显微镜(DMLFS， LE丄CA， Germany), 用1()倍物镜选择直径在30-50ym， 200" m长没有明显弯曲的细静脉，连续观察 并用连接于荧光摄像机刻录机(DVR-R25, Malata， China)记录微循环动态30 分钟。细动脉和细静脉红细胞流速测定用连接于生物显微镜的高速摄影机(FASTCAM-ultima APX, photron， Japan), 用1000幅/秒的摄影速度记录细动脉和细静脉的红细胞流速。在25幅/秒的速度 回放录像中用图像分析软件Image-Pro Plus 5.0 software (Med i a Cybernetic, USA)测量细动脉和细静脉的管径和细静脉红细胞流速。血管径是同一位置三次测 量的平均值。黏附于细静脉壁白细胞测定将荧光标记物Rhodamine 6G按5mg/kg. bw的使用量，经股静脉缓慢推注。用连接于生物显微镜的超敏感摄像机(Hamamatsu EB-CCD Camera C7190 Japan) 观察并纪录白细胞黏附与细静脉壁的动态。设定在细静脉壁3()秒位置没有发生 变化的白细胞为黏附白细胞。在直径30-S0nm， 200"ni长的小静脉观察并纪录 黏附与血管壁的白细胞。 细静脉壁过氧化物产生动态测定将10umol/m]浓度的过氧化物荧光探针dihydrorhodaniinc 123连续滴加在 脑观察部位的表面。当过氧化物与DHK相遇时，可以将1)HR还原成rhodaminc 123， 用连接于生物显微镜的超敏感摄像机(Ha隨matsu EB-CCD Camera C7190 .)ap;m) 观察并纪录1)HR的发光部位和强度(激发波长510nm，发射波长5:Mnm)。为了测 量血管内皮组织荧光强度的差别，用图像分析软件Image-Pro plus 5.()测量血 管内腔和血管壁的平均荧光强度。测量每一个血管内腔和血管壁的平均荧光强 度，它们的差值(D[)反应了D1(R被氧化的程度。 血浆白蛋白漏出率算定另取蒙古沙土鼠，将50mg/kg. bw的FITC标记的血浆白蛋白经股静脉缓慢推 注。用波长488nm的氦氖激光束照射在开颅部位，用共聚焦显微镜系统观察并纪 录细静脉内外FTTC标记荧光图像。用图像分析软件Image-Pro plus 5. () (Idia Cyl證U:ics lnc， USA)测定细静脉内(Iv)和血管外(Ii) F订C标记白蛋白的萤光强度。用ii/:iv的比值以判定细静脉内白蛋白向血管外漏出的情况。Tuncl染色另取沙鼠，在再灌注5天后经左心室以lOmL/分钟灌注生理盐水将血管内的 血液冲洗干净后，以3m]/分钟的速度灌注4%多聚甲醛，灌注20分钟后转入 1%多聚甲醛浸泡2小时后，把组织放入-6(TC正己烷速冻，用冰冻切片机 (CM18(X), Leka， German)进行冠状切片，厚度为6 p m。选取含有完整海马区 域的切片用Tunel试剂盒(11684795910， Roche， German)进行染色，用激光共 聚焦显微镜显微镜进行观察，细胞核和Tunel阳性的激发光波长分别是405和 488，，在海马CAi区随机选取5个视野进行Tunel阳性细胞计数。 电镜在再灌注5天，经左心室以10ml/分钟灌注生理盐水将血管内的血液冲洗干 净后，以3ml/分钟的速度灌注固定液，固定液成分为4%甲醛，2%戊二醛，().1M磷酸缓冲液。灌注40分钟后，然后迅速取下整个大脑，冠状切面切成卜加ni 厚组织片，然后转移到,，戊二醛固定液中4'C固定过夜，然后用().]M磷酸缓冲 液冲洗三次，再用1%俄酸固定液4'C固定2小时。再用系列丙酮脱水，用Epon812 树脂包埋剂包埋，6CTC孵育48小时。然后进行修块，切成60nm厚的组织片，用 醋酸铀和柠檬酸铅染色，再用JEM-1230透射电镜观察(,]EM 1230, .J亂，Jap朋)。 结果1. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑血流量的影响图l表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0.化/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0.8g/kg组蒙古沙鼠脑血流量的变化。各组间的脑 血流量在观察期间内没有明显性差异。2. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细动脉和细静脉管径的影响图2表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 4g/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑细动脉和细 静脉血管径的结果。各组间脑细动脉和静脉管径没有显著变化。3. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细动脉和细静脉红细胞流速的影响图3表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑细动脉和细 静脉红细胞流速的结果。各组间蒙古沙鼠脑细动脉和细静脉红细胞流速没有显著 性差异。4. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁黏附白细胞的影响图4表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0.化/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑蒙古沙鼠细 静脉壁黏附白细胞的结果。假手术组细静脉壁黏附白细胞少于1个/200um，缺 血再灌注组脑细静脉壁的粘附白细胞数显著增加(3. 1±0. 17)，养血清脑颗粒0. 4g/kg和0.8g/kg显著抑制了脑细静脉壁的粘附白细胞数(].3±0. 11和1. 3±0. 17)。5. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁D服荧光强度的影响图5是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0.4g/kg组， 缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组蒙古沙鼠在再灌注5天时脑细静脉壁DHR荧光强度的结果。与假手术组相比，缺血再灌注组脑细静脉壁DHR荧光强度显著 增强，养血清脑颗粒可以浓度依存性减弱脑细静脉壁DHR荧光强度的增加。 fi.养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响图6表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().4g/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑蒙古沙鼠细 静脉白蛋白漏出的结果。假手术组脑细静脉FITC标记白蛋白仅有少量的漏出。 缺血再灌注组F1TC标记白蛋白的漏出显著增加。养血清脑颗粒浓度依存性减少 脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。7. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑海马CAl区神经细胞Tuncl染色的影 响图7A是假手术组(a)，缺血再灌注组(b)，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化/kg 组(c)和缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组(d)蒙古沙鼠在再灌注5天时大 脑海马CAl区Tune]染色的图像。假手术组没有观察到Tunel阳性细胞(h)，缺血 再灌注组可以看见许多Tunel阳性细胞(b)，养血清脑颗粒给药组Ttmel阳性细胞 浓度依存性减少(c和d)。图7B是各组脑海马CAl区Timel染色的结果。与假手术 组相比，缺血再灌注组海马CAl区Tunel染色阳性细胞数显著增加，养血清脑颗粒 可以浓度依存性减少海马CA1区Tunel染色阳性细胞数。8. 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细超微结构的影响 图8是假手术组(A，D)，缺血再灌注组(B，E)和缺血再灌注+养血清脑颗粒组(C,F)蒙古沙鼠在再灌注5天时血管透射电镜的图像。假手术组可以观察到 血管内皮光滑，血管周围组织的无水肿现象(A,D)。缺血再灌注组可以观察到血 管周围组织出现明显水肿(B, E)。缺血再灌注+养血清脑颗粒组可以观察到血管周 围水肿明显减轻(C, F)。图9是假手术组(A,D)，缺血再灌注组(B，E)和缺血再灌注+养血清脑颗粒 组(C，F)蒙古沙鼠在再灌注5天时海马神经元透射电镜的图像。假手术组海马 神经元形态正常，胞膜和细胞器结构完整(A,D)。缺血再灌注组海马出现暗细胞， 神经元损伤(B，E)。缺血再灌注+养血清脑颗粒组形态较完整，损伤较轻(C，F)。 结论在结扎蒙古沙鼠双侧颈动脉引起的蒙古沙鼠全脑缺血再灌注损伤3小时 后，开始给予养血清脑颗粒5日，可以抑制脑微循环障碍和脑神经细胞的损伤，该作用可能与其抑制过氧化物产生和调亡相关。实验二、动物SD大鼠，雄性，体重27(广300g,购自北京大学医学部实验动物科学部，合 格证号SYXK (京)2002-0002。在12小时切换灯源，温度22。C，相对湿度40% 的环境下饲养，自由进食饮水。 药物养血清脑颗粒主要组成为当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍 珠母、细辛等，天津天士力制药股份有限公司生产，国药准字Z 10960082，批号 050608。实验前用生理盐水配制成().16 g/ml、 0.08 g/ml的溶液。 试剂Rh()clamine 6G，购买于美国FLUKA公司，批号83688。 F)uorosccin i sothiocyanate Conjugate Bovine A.lb咖in (FTTC-album:i n)， 由美国S1(;MA 公司生产。 模型的建立用20%乌拉坦肌肉注射麻醉大鼠(2.5 g/kg.bw)，在颈部正中切开，逐层分 离颈部右侧肌肉(胸骨舌骨肌，胸锁乳突肌)，小心分离颈总动脉及其分支，用 微动脉夹夹闭经总动脉近心端，双线结扎颈外动脉，并于中间剪断，于近心端游 离断支系一活结，分离颈内动脉致翼腭动脉(PtA)分支处，用微动脉夹夹闭颈 内动脉，用显微剪在结扎处和活结中间开一小孔，将动脉插线(3-0 prolene， Johnson&Johnson， USA)小心插入后将活结扎紧，去除颈内动脉微动脉夹，将动 脉插线插入1.8、2.2 cm，造成缺血，60 min后撤出动脉插线扎紧活结，开始再 灌注(T/iO。假手术组除了不插入动脉插线，其他操作同缺血再灌注组。给药组 在麻醉前90分钟分别灌胃给与养血清脑颗粒0. 4g/kg和0. 8g/kg。 脑微循环的观察动物麻醉后，暴露股静脉，插入并留置直径为1 mm聚乙烯导管。在颈部正 中切开，逐层分离肌肉，游离气管，连接小动物呼吸机(A1X-V8)。切开脑部皮 毛，用手提式颅钻在顶叶冠状缝后，矢状缝右，开大小约为4X6 mm的颅窗。 用细针头把硬脑膜刺破，并用显微镊、剪把硬脑膜撕剪开，暴露脑皮质。将37 °C的人工脑脊液连续滴加在颅窗上以保持大脑表面湿润。置于可视化动态正置微循 环观察系统下观察，使用连接于荧光摄像机的正立生物显微镜的io倍物镜选择 直径在20-40 um、 200 u m内没有明显弯曲和分支的细静脉。在基础观察20 分钟后，用线栓法使大脑中动脉缺血，60分钟后撤出动脉插线，再灌注开始。 将大鼠移至正置显微镜下，用连接于荧光摄像机刻录机(DVR-560I1, PHLIPS， Holland)连续观察并记录再灌注0 min， 20 min， 40 m'n， 60 min同一视野内 选定血管的微循环动态。细静脉红细胞流速的测定及管径变化率的测定用连接于生物显微镜的高速摄影机，以1024幅/秒的摄影速度，记录在缺血 前以及再灌注0min， 20min， 40 min， 60 min时同一视野内细静脉红细胞流速。在回放的高速摄像录像DVD上，用图像分析软件:[mage-Proplus 5. 0 (Media C'yht'mt、t「ics Jnc， USA)测量各时间点红细胞血流速度，并对选定血管的管径进 行三次测量，取其均值，用各时间点的均值与基础值的比表示血管径变化率。 黏附于细静脉壁白细胞的测定将荧光标记物Rhodamine 6(;按5 mg/kg. bw的使用量，在基础观察前5 min 经股静脉缓慢推注。用连接于正置生物显微镜(BX51WI， 0LYMPUS， JAPAN)的摄 像头(USS-301， l國,USA)在波长543 nm下，观察并纪录在缺血前，再灌注() min、 20 min、 40 min、 60 min的荧光图像，在回放的录像中计数200 u ni长细 静脉内停留于血管壁同一位置超过30秒以上的白细胞数。 细静脉血浆白蛋白漏出率将FITC标记的血浆白蛋白按50 mg/kg. bw的使用量，在基础观察前10 min 经股静脉缓慢推注给药。用连接于正置生物显微镜的摄像头在波长488 nm下， 观察并纪录在缺血前，以及再灌注0 min、 20 min、 40 min、 60 min时同一视野 的荧光图像。在回放的DVD上，在用图像分析软件Image-Pr叩lus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)测定细静脉内外FITC荧光强度。以I/R前的细静脉血 管外与细静脉血管内的FITC荧光强度的比值为基础值，用各时间点的比值与基 础值的比表示FITC荧光强度的变化率。 脑血流量测定另取大鼠，用激光多普勒血流灌注成像仪(Per J Scan P頂3， Pt':RIMED， Sweden)观'J定缺血前(0 min)， 缺血后5 min，再灌注0 min、 20 min、 40 min、 60 n"n
时观察和记录区域的脑血流量，用LDPIwin软件对图像进行测量。以1/R前的测
定数值为基础值，用再灌注后各时间点脑血流量与基础值的比表示脑血流量的变化率。
结果
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠脑局部血流量的影响
图l()是用激光多普勒血流量仪测得的Sham组、I/R组、C(;0.4+I/R组和 a;().8+l/R组在缺血前，缺血5分钟，再灌注后大鼠脑患侧血流量图。Sham组大 鼠各时间脑血流量无明显变化。]:/R组大鼠在缺血5分钟时，脑血流量明显降低， 再灌注后脑血流量逐渐恢复。CGO. 4+I/R组和CG(). 8+l/R组大鼠在缺血5分时的 脑血流量也显著降低，但在再灌注开始，脑血流量恢复速度比较快。
图11是各组脑血流量的统计结果，[/R组，C(;O. 4+I/R组和C(;(). 8+『/K组在 缺血5分时脑血流量显著降低，C(;O. 4+l/R组在再灌注0分和再灌注20分有一 过性的升高，CGO. 8+l/R组在再灌注20分脑血流量也有一过性的升高。 养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠脑细静脉管径变化率的影响
图丄2显示Sham组，工/R组，C(;O. 4+I/R组和CGO. 8+T/R组大鼠脑细静脉管 径在整个观察过程中没有发生显著的变化。
养血清脑颗粒对]:/R后大鼠脑细静脉红细胞流速的影响
图13显示Sham组，1/R组，CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组在缺血前和再灌 注后大鼠脑细静脉红细胞流速的经时变化。Sham组大鼠脑细静脉红细胞流速在 本观察期间内没有显著的变化。17R组大鼠脑细静脉红细胞流在再灌注()时 显著下降，持续到再灌注40分。CG0.4+I/R组大鼠脑细静脉红细胞流速在再灌 注Omtn时显著也有所下降，然后逐渐恢复。CGO. 8+工/R组在再灌注Omin时显著 也有所下降，但是恢复速度比I/R组快。 养血清脑颗粒对I/R后大鼠脑细静脉壁黏附白细胞的影响
图14显示Sham组，I/R组，CG(). 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑细静脉壁 黏附白细胞数量的变化。在本观察期间内，Sham组大鼠脑细静脉壁仅有少量的 白细胞黏附，I/R组大鼠在再灌注开始后，脑细静脉白细胞黏附数量显著地增 多，并持续增多到本观察结束时。养血清脑颗粒可以浓度依存性抑制大鼠大鼠脑细静脉白细胞黏附的增加。
养血清脑颗粒对I/R后大鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响
图15显示Sham组，I/R组，CGO. 4+丄/R组和CGO. 8十I/R组大鼠脑细静脉FH'C 标记白蛋白漏出的动态。Sham组大鼠，在本观察期间内大鼠脑细静脉IMTC标记 白蛋白仅有少量的漏出。I/R组大鼠脑细静脉FTC标记白蛋白的漏出从再灌注0 分后显著地增加一直持续到再灌注60分。C(;的投予在再灌注W)分显著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠脑细静脉F [TC标记白蛋白的漏出。 结论
养血清脑颗粒的预给药可以预防大脑中动脉缺血再灌注引起的大鼠患侧大 脑皮层的微循环障碍。 实验三、 动物
蒙古沙土鼠，雄性，体重65 90g,购于首都医科大学实验动物部，合格证 号SCXK (京)2000-0012。在北京大学医学部动物中心，按北京大学医学部实 验动物处理规定，自由进食饮水，单笼饲养，温度22'C,相对湿度4(W， 12小时 切换灯源(早晨7点开灯)。 药物
养血清脑颗粒由天津天士力制药股份有限公司生产，批号Z1096(K)82。生 产过程根据严格的现代生产工艺，药物成分标准化。养血清脑颗粒的主要成分是 当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛，实验前配制成80呢AiJ 和16()mg/mJ的水溶液。 化学试剂
Dihydrorhodamine 123 (DHR)购买于美国Eugene公司，异硫氰酸荧光素标 记白蛋白(F1TC-albumin)购买于美国SIGMA公司，Rhodamine 6G perch丄orate 购买于美国FLUKA公司，乌来糖(Urethane)购买于中国上海天莲精细化工有限 公司生产。 动物模型
取20%乌拉坦，按2.0g/kg.bw的用量，经腹腔注射麻醉蒙古沙土鼠。在颈 部正中切开，分离气管，连接小动物呼吸机(ALC-V8)，在整个观察过程保持机械通气。特殊设计的闭合器(一根细的聚乙烯导管和一根粗的塑料管组成的套索) 放置在双侧颈总动脉而不影响血流'1。暴露股静脉，插入并留置直径为5mm的聚 乙烯导管。切开脑部皮毛，用手提式颅钻在前囟点前开一3X3,的颅窗。将37 度的人工脑脊液连续滴加在颅窗上以保持大脑表面湿润。用连接于荧光摄像机
(C719()， IIAM認ATSU， J即an)的正立生物显微镜(DMLFS， LF」CA， Germany), 用10倍物镜选择直径在30-50 pm， 200um长没有明显弯曲的细静脉，在监视器 上基础观察(.即8A, TCL, Huizhou， Chjna) ]O分后，闭索蒙古沙土鼠双侧颈 动脉(缺血)，30分后解除闭索(再灌注)il。连续观察并用连接于荧光摄像机刻 录机(DVR-R25， Malata， China)记录微循环动态60分钟。假手术组不闭索双 侧颈动脉，其他操作同缺血再灌注组。养血清脑颗粒0. 4g/kg +缺血再灌注组， 养血清脑颗0. 8g/kg +缺血再灌注组在缺血再灌注90分钟前,分别用灌胃管，灌 胃给予养血清脑颗粒水溶液0. 4g/kg. bw和0. 8g/kg. bw。 细静脉红细胞流速测定
用连接于生物显微镜的高速摄影机(FASTCAM-ultima APX， phoLron, Japan)， 用l()O()幅/秒的摄影速度记录细静脉的红细胞流速。在25幅/秒的速度回放录像 中用图像分析软件Image-Pro Plus 5.0 software (Med j a Cybernetic, USA)测 量在缺血前，以及再灌注开始0分、10分、20分、30分、40分、50分、分时 同一视野内细静脉红细胞流速，流速的变化率定义为再灌注各个时间点的流速与 缺血前流速的比值。 细静脉壁过氧化物产生动态测定
在基础观察前10分钟，将lOumol/ml浓度的过氧化物荧光探针 dihydrorhod柳ine 123连续滴加在脑观察部位的表面。当过氧化物与DHR相遇 时，可以将D服还原成rhodamine 123，用连接于生物显微镜的超敏感摄像机 (IJamamatsu EB-CCD Camera C7190 Japan)观察并纪录DHR的发光部位和强度 (激发波长510nm，发射波长534nm)。为了测量血管内皮组织荧光强度的差别， 用图像分析软件Image-Pro plus 5. 0测量血管内腔和血管壁的平均荧光强度。 测量每一个血管内腔和血管壁的平均荧光强度，它们的差值(Dl)反应了 DHR 被氧化的程度。测量缺血前(Ibase)，以及再灌注开始0分、L0分、2()分、30 分、犯分、50分、60分时细静脉壁和血管内荧光强度差值([x)，以缺血前的数值为基础值，用各时间的值(Ix)与基础值(Ibase)的比表示DI1R萤光强度
的变化，以判定细静脉壁过氧化物的产生动态。
黏附于细静脉壁白细胞测定
另取蒙古沙土鼠，在基础观察前()分钟，将荧光标记物l化odam]'nc W;按 5mg/kg.bw的使用量，经股静脉缓慢推注。用连接于生物显微镜的共聚焦扫描装 置(mo-lhd Radiance 2100， England )和计算机处理系统(Del 1 opt. i pi ex (;x2W), Germany)进行观察和记录。用波长5"rai的氦氖激光束照射在开颅部位 进行观察，图像经『hU A/[〕转换器数字华后，X-t扫描荧光图像 (512X512X8-bit)储存在计算机等待处理。设定3()秒扫描的30张图片中部 位没有发生变化的白细胞为黏附白细胞。在直径30-50iim， 200pm长的小静脉 观察并纪录在缺血前，以及再灌注0分、10分、30分、60分黏附与血管壁的白 细胞。
细静脉管径及血浆白蛋白漏出率测定
另取蒙古沙土鼠，在基础观察前10分钟，将50mg/kg. bw的F1TC标记的血 浆白蛋白经股静脉缓慢推注。用波长488nm的氦氖激光束照射在开颅部位，用共 聚焦显微镜系统观察并纪录在缺血前，以及再灌注开始、l()分、3()分、W)分时 同一视野内细静脉内外F1TC标记荧光图像。用图像分析软件Image-Pro plus 5.()
(Media Cybemetries Inc, USA)测定各时间点细静脉管径血管内径。血管径是 同一位置三次测量的平均值。管径的变化率是再灌注各个时间点的管径与缺血前 管径的比值。用工mage-Pro plus 5. 0测定各个时间点细静脉内(lv)和血管外
(li) 「]TC标记白蛋白的萤光强度。以缺血再灌注前的细静脉血管外的FITC萤 光强度(IU与细静脉血管内的FITC萤光强度(lv)的比值为基础值，用各时 间li/]v的比值与基础值的比表示FITC萤光强度的变化，以判定细静脉内白蛋 白向血管外漏出的动态。 脑血流量测定
一部分蒙古沙土鼠，用激光多普勒血流灌注成像仪(PeHScan PIM3， Pl':R丄,，Sweden)测量脑血流量。头皮正中切口，暴露颅骨，去除粘在颅骨的 结缔组织。计算机控制的光学扫描器发出低能量的氦-氖激光照射在暴露的颅骨 上。扫描器与颅骨的距离是18.5cm。扫描器的扫描区域是8X10 mm,激光束穿透的深度是0.5mm。扫描后显示器上显示一幅彩色图像代表不同区域的灌注水 平。记录在缺血前，再灌注开始0分、i0分、20分、30分、犯分、50分、60 分时脑血流图像。所有图像用LDPIwin软件对图像进行测量。以缺血再灌注前的 全脑灌注量为基础值，计算再灌注后各时间点脑血流量的变化率。 电镜
在再灌注60分钟后，经左心室以]Oml/分钟灌注生理盐水将血管内的血液 冲洗干净后，以3ml /分钟的速度灌注固定液，固定液成分为4%甲醛，2% 戊二醛，0. 1M磷酸缓冲液。灌注40分钟后，然后迅速取下整个大脑，冠状切面 切成1--2mm厚组织片，然后转移到3%戊二醛固定液中4'C固定过夜，然后用().1M 磷酸缓冲液冲洗三次，再用"/。俄酸固定液4。C固定2小时。再用系列丙酮脱水， 用f':pon812树脂包埋剂包埋，6(TC孵育48小时。然后进行修块，切成6()nm厚 的组织片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，再用JEM-1230透射电镜观察(.U:M 1230， ,,，Japan)。
扫描电镜标本制备，灌流后迅速取下整个大脑，切成大约几个毫米宽的小 方薄片。先用戊二醛固定2小时，用0. 1M磷酸缓冲液冲洗，再用().1M磷酸缓 冲液配置的0、(h固定2小时，用系列酒精脱水，标本移入醋酸戊酯。样品放在干 燥器样品盒，用C(),'临界点干燥法，使样品干燥而不变形。用导电胶将样品粘在 样品托上，然后在离子镀膜仪中镀金3分钟，以使样品表面导电。最后在扫描电 镜.1SM-56()0LV(,fSiVI-5600LV, JE0L, Japfcin)下观察。 开放毛细血管计数
皮质毛细血管开放数在各组的放大20倍的扫描电镜图像中计数。每组图像 的开放毛细血管数的平均值为各组沙鼠的大脑皮质的平均开放毛细血管密度，结 果在图24中。结果
养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉管径的影响
图16表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒().4g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 血管径的连续变化。假手术组在本观察期间内没有显著地变化。缺血再灌注组 细静脉在再灌注开始时有一过性轻微扩张，持续到再灌注分。养血清脑颗粒 0.化/kK+缺血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组的脑细静脉管径在观 察期间内没有显著地变化。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉红细胞流速的影响
图i7表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.化/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 红细胞流速的连续变化。假手术组蒙古沙鼠脑细静脉红细胞流速在本观察期间内 没有显著地变化。缺血再灌注组在再灌注开始到再灌注20分期间脑细静脉红细 胞血流速度显著地降低。养血清脑颗粒0.4g/kg给药组在再灌注IO分后，显著 地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉红细胞血流速度的降低。养血清脑颗粒0. 8 组在再灌注丌始时就抑制了的脑细静脉红细胞血流速度的降低。 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑血流量的影响
图18表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑血流量 的连续变化。假手术组的脑血流量在本观察期间内没有明显的变化，缺血再灌注 组在再灌注开始后显著降低，且持续到再灌注60分。养血清脑颗粒0.1g/kg+缺 血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再灌注10分后，显著地抑制了 缺血再灌注引起的脑血流量的降低。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁黏附白细胞的影响
图J9表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠细静脉壁 黏附白细胞的连续变化。假手术组在观察结束时,黏附于脑细静脉壁的白细胞在 不到3个/200um。缺血再灌注组于蒙古沙鼠脑细静脉壁的白细胞数在再灌注开 始增加，在再灌注结束时，已经达到6个/2()0 n m。养血清脑颗粒().4g/kg+缺血再灌注组，在再灌注3()分后显著地抑制了白细胞与大脑细静脉管壁粘附。养血 清脑颗粒().8+缺血再灌注组，在再灌注IO分后就显著地抑制了白细胞与大脑细 静脉管壁粘附。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁)HR荧光强度的影响
图20是缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠在缺血再灌注甜和再灌注 6()分时脑细静脉壁D服荧光强度变化的图像。缺血再灌注蒙古沙鼠(a)和养血 清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠(c)在缺血前，没有观察到细静脉壁DHR荧光发 光部位.在再灌注60分时，可以观察到缺血再灌注蒙古沙鼠沿脑细静脉壁l)MR 荧光强度增强的部位(b)，而养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠没有观察到 脑细静脉壁l)服荧光强度的增强(d).
图21表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒().1g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒().8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 壁DIIR荧光强度的连续变化。假手术组蒙古沙鼠脑细静脉壁的l)HK荧光强度比在 本观察期间内几乎没有变化。缺血再灌注组蒙古沙鼠脑静脉壁的l)冊荧光强度比 在再灌注10分后开始增加，且持续增加。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组 和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再灌注l()分显著地抑制了缺血再灌注引起 的脑细静脉壁的1川R萤光强度的增加。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响
图22是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠脑细静脉FITC 标记白蛋白漏出的图像。在缺血再灌注前，假手术蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙 鼠和养血清脑颗粒+缺血再灌注蒙古沙鼠均没有观察到F1TC标记白蛋白漏出细
静脉外。在再灌注60分时，假手术蒙古沙鼠几乎没有观察到脑细静脉Frrc标记
白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以观察到FITC标记白蛋白的明显漏出。 养血清脑颗粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后60分时，只有少量F(TC标记 白蛋白的漏出于细静脉外。 '
图23表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 HTC标记白蛋白漏出的连续变化。假手术组在本观察期间，脑细静脉F「「C标记 白蛋白的仅有少量的漏出。缺血再灌注组从再灌注开始就可观察到F1TC标记白蛋白的漏出，并持续增加。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组在再灌注6()分
显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉Fn'c标记白蛋白的漏出。养血清脑颗
粒().8+缺血再灌注组在再灌注30分以后显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静 脉FITC标记白蛋白的漏出。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细超微结构的影响
图24-A是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒+缺血再灌注组大脑皮质 扫描电镜下毛细血管开放的图像。假手术组可见皮质中有许多毛细血管，且分布 较均匀。缺血再灌注组可以观察到开放的毛细血管显著减少，而且分布不均匀， 养血清脑颗粒+缺血再灌注组开放的毛细血管数量与假手术组相接近。图 是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒+缺血再灌注组毛细血管开放数的结 果。毛细血管开放数相对于假手术组(41.33±0.667)在缺血再灌注后明显下降
(30. 33± 1.667 )，养血清脑颗粒显著抑制了毛细血管开放数的减少
"2±0. 577)。
图25是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠再 灌注6()分后的大脑皮质毛细血管的透射电镜和扫描电镜的图象。图a， h， c是 透射电镜图像，假手术组(a)可以观察到血管内皮光滑，血管周围组织的无水 肿现象。缺血再灌注组(b)可以观察到血管周围组织出现明显水肿。养血清脑 颗粒+缺血再灌注组(c)可以观察到血管周围水肿明显减轻。图d， c，('是扫描 电镜图像，假手术组(d)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮光滑，内皮细胞间 连接紧密。缺血再灌注组(e)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮可以观察到血 管内细胞众多的隆起，内皮细胞连接处，细胞间相互嵌合的指状突起肥大，且内 皮表面出现许多突起的小泡。养血清脑颗粒+缺血再灌注组(f)蒙古沙鼠脑皮质部 细静脉血管内皮较光滑，连接处指状突起和小泡明显减少。
结论养血清脑颗粒的预给药可以抑制缺血再灌注引起的蒙古沙鼠脑皮层微 循环障碍，该作用与其抑制过氧化物，抑制白细胞与血管内皮细胞黏附，保护血 管内皮细胞，抑制血浆白蛋白外漏相关。 实验四、
动物 '
S[)大鼠，雄性，体重27(广300 g，购自北京大学医学部实验动物科学部，合格证号SYXK (京)2002-0002。在12小时切换灯源，温度22。C，相对湿度'10%
的环境下饲养，自由进食饮水。
药物
养血清脑颗粒主要组成为当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍 珠母、细辛等，天津天士力制药股份有限公司生产，国药准字Z1()96()()82，批号 050608。实验前用生理盐水配制成O. 16 g/m]、 0.08 g/ml的溶液。 试剂
Rhodfcimine 6(;，购买于美国FU」KA公司，批号83688。 Fl uor。sco i n is()thiocyanate Conjugate Bovine Albumin (FITC-albumin)， 由美国SI(;MA 公司生产。硫酸阿托品注射液(Atropine Sulfate [njecU'on)，天津金耀氨 基酸有限公司生产，批号0504121。肝素钠，江苏万邦生化医药股份有限公 司生产，批号0506117。乌拉坦，北京化学试剂公司，分析纯，批号0棚1。 SP-9()()0免疫组织化学试剂盒购买于北京中衫金桥生物技术有限公司。兔抗 l)UMA多克隆抗体购买于Cell signaling。羊抗P53多克隆抗体，小鼠抗 Caspa.se-3单克隆抗体，兔抗Bel-2多克隆抗体购买于Santa Cruz公司。 模型的建立
用20°/。乌拉坦肌肉注射麻醉大鼠(2.5 g/kg.bw)，在颈部正中切开，遂层分 离颈部右侧肌肉(胸骨舌骨肌，胸锁乳突肌)，小心分离颈总动脉及其分支，用 微动脉夹夹闭经总动脉近心端，双线结扎颈外动脉，并于中间剪断，于近心端游 离断支系一活结，分离颈内动脉致翼腭动脉(PtA)分支处，用微动脉夹夹闭颈 内动脉，用显微剪在结扎处和活结中间开一小孔，将动脉插线(3-0 prolcne， Johnson&Johnson， USA)小心插入后将活结扎紧，去除颈内动脉微动脉夹，将动 脉插线插入1.8 2.2 cm，造成缺血，60 min后撤出动脉插线扎紧活结，开始再 灌注(I/R)。假手术组除了不插入动脉插线，其他操作同缺血再灌注组。给药组 在麻醉前90分钟分别灌胃给与养血清脑颗粒0. 4g/kg和().8g/kg。 脑微循环的观察
动物麻醉后，暴露股静脉，插入并留置直径为1 mm聚乙烯导管。在颈部正 中切开，逐层分离肌肉，游离气管，连接小动物呼吸机(ALC-V8)。切开脑部皮 毛，用手提式颅钻在顶叶冠状缝后，矢状缝右，开大小约为4X6 mm的颅窗。用细针头把硬脑膜刺破，并用显微镊、剪把硬脑膜撕剪开，暴露脑皮质。将37 °C 的人工脑脊液连续滴加在颅窗上以保持大脑表面湿润。置于可视化动态正置微循 环观察系统下观察，使用连接于荧光摄像机的正立生物显微镜的K)倍物镜选择 直径在20-40 ym、 200 um内没有明显弯曲和分支的细静脉。在基础观察20 分钟后，用线栓法使大脑中动脉缺血，60分钟后撤出动脉插线，再灌注开始。 将大鼠移至正置显微镜下，用连接于荧光摄像机刻录机(DVR-5柳1， PIIL1PS， Holland)连续观察并记录再灌注0 min， 20 min， 40 min， 60 min同一视野内 选定血管的微循环动态。
细静脉红细胞流速的测定及管径变化率的测定
用连接于生物显微镜的高速摄影机，以1024幅/秒的摄影速度，记录在缺血 前以及再灌注()min， 20min， 40min， 60 min时同一视野内细静脉红细胞流速。
在回放的高速摄像录像[)VD上，用图像分析软件mage-Proplus 5. 0 (Mc)dia Cyhenic、trics Inc, USA)测量各时间点红细胞血流速度，并对选定血管的管径进 行三次测量，取其均值，用各时间点的均值与基础值的比表示血管径变化率。 黏附于细静脉壁白细胞的测定
将荧光标记物Rh()dainine 6(;按5 mg/kg. bw的使用量，在基础观察前5 min 经股静脉缓慢推注。用连接于正置生物显微镜(BX51WI， ()LYMPUS， JAPAN)的摄 像头(險3(H，嗎，USA)在波长543 nm下，观察并纪录在缺血前，再灌注() min、 20 min、 40 min、 60 min的荧光图像，在回放的录像中计数200 ii m长细 静脉内停留于血管壁同一位置超过30秒以上的白细胞数。 细静脉血浆白蛋白漏出率
将FTC标记的血浆白蛋白按50 mg/kg. bw的使用量，在基础观察前10 mi n 经股静脉缓慢推注给药。用连接于正置生物显微镜的摄像头在波长488 nm下， 观察并纪录在缺血前，以及再灌注0 min、 20 min、 40 min、 60 min时同一视野 的荧光图像。在回放的DVD上，在用图像分析软件Image-Pr叩]us 5.0 (Media Cybemetrics :Lnc， USA)测定细静脉内外FITC荧光强度。以1/lr前的细静脉血 管外与细静脉血管内的FITC荧光强度的比值为基础值，用各时间点的比值与基 础值的比表示FITC荧光强度的变化率。 脑血流量测定另取大鼠，用激光多普勒血流灌注成像仪(PeriScan P1M3， P[':KIMf':D， Svvc'don) 须(j定缺血前(()min)， 缺血后5 min， ■再灌注0 min、 20 min、 '") min、 W) min 时观察和记录区域的脑血流量，用LDPlwin软件对图像进行测量。以1/ir前的测 定数值为基础值，用再灌注后各时间点脑血流量与基础值的比表示脑血流量的变 化率。
活体脑片钙离子染色
另取大鼠，A 1小时后，麻醉后取脑，将脑放入pH为7./)的人工脑脊液 中(ACS";将脑组织倒放在脑片槽中，用切片刀做冠状切片，厚度约为1 mm， 选择的观察面位于距离Interaural Line (耳间线)约6. 4 mm、距离Bregma (前 卤点)约2. 6 mm的切面。将脑冠状切片放入冷ACSF中，通入纯氧稳定5分钟； 然后将稳定后的脑片移至含有30 uM的FLuo-3/AM和2 ul/ml Pluroriic 卩-127(18%(w/v))的室温ACSF中，通纯氧负载45分钟；后以不含荧光探针的ACSF 洗潘2 — 3次，转入含有2 ug/mL的Hoechst33342的ACSF中，室温下通纯氧染 核5分钟；再以不含荧光探针的ACSF洗涤2 — 3次，移入通有纯氧的ACSF中稳 定20分钟。即可平铺在塑料皿内观察。用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)，设激 发波长分别为405 nm (核)、488隨(Fluo-:0，用63倍物镜对脑片皮层位置l化 至Partl区域接近表面的层面钙离子浓度进行观察和记录。不同区域取五个视 野，计数钙超载神经元和神经元总数，计算钙超载神经元占总计数神经元总数的 比为钙超载神经元阳性细胞率。 氯化三苯四氮唑(TTC)染色
另取大鼠，再灌注24小时麻醉后，剪下头部置于脑定位仪沿视交叉往后平 均切成5片，用含2%TTC的磷酸盐缓冲液在37'C染色30min，然后再用4%多聚甲 醛固定并拍照。用Image-Pro-Plus软件测量梗死比率(即梗死区体积占同侧大脑 半球的百分比)。
光镜脑组织切片制备及Nissl染色
另取大鼠，再灌注24小时麻醉后，经左心室插管灌注。在相应的时间点将 每组大鼠快速用生理盐水250ml (室温)灌注，再用4%多聚甲醛150ml (fC) 缓慢灌注，持续60min左右，迅速取脑，在脑定位模具中沿视交叉冠状位切取脑 组织，将其置于4%多聚甲醛溶液中后固定6 811后入30%的蔗糖中，待脑组织沉底后冰冻切片，制成20to厚的切片，每隔5张切片取5张分别行常规Nissl
染色，脱水封片后于光镜下观察。
免疫组织化学染色
切片入().()1ir.ol/L PBS摇洗3次后，入Triton X-IO()液3()mi n (37°C)，入 3X过氧化氢2()min (避光)，血清封闭lh (室温)，分别滴加1: K)()抗l)53、抗 P隠、抗lk卜2、抗Ca叩ase-3抗体5()W.于各组不同的切片上，置于室温下lh， 入rc冰箱过夜。第二天复温lh后入滴加ABC试剂盒中B、 C液于对应的 切片上，室温下各孵育lh，各步骤之间均入0. 01mol/L PBS摇洗3次，l)八B显色， 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。每组各5张切片， 每张切片随机取5个视野计数阳性细胞数，并作统计分析。 透射电镜
另取大鼠，缺血再灌注24小时后，麻醉下经左心室以i0 ml/分钟灌注生理 盐水将血管内的血液冲洗干净后，以3 nil /分钟的速度灌注固定液12() ml， 固定液成分为4%甲醛，2%戊二醛，0. 1M磷酸缓冲液。然后迅速取下整个大 脑，冠状切面切成卜2 mm厚组织片，然后转移到3%戊二醛固定液中固定过夜， 然后用冲洗液洗三次，再用W俄酸固定液固定2小时。再用系列丙酮脱水，用 Kpon812树脂包埋剂包埋，6(TC孵育48小时。然后进行修块，切成60 nm厚的 组织片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，分别于缺血区，半影区和半影对侧镜像区用 JI:M-1230透射电镜观察大脑超微结构的变化。 结果
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠脑局部血流量的影响
图26是用激光多普勒血流量仪测得的Sham组、I/R组、CG(). 4+1/1 组和 C(;0.8+l/R组在缺血前，缺血5分钟，再灌注后大鼠脑患侧血流量图。Sham组大 鼠各时间脑血流量无明显变化。I/R组大鼠在缺血5分钟时，脑血流量明显降低， 再灌注后脑血流量逐渐恢复。CG0. 4+I/R组和CG(). 8十I/R组大鼠在缺血5分时的 脑血流量也显著降低，但在再灌注开始，脑血流量恢复速度比较快。
图27是各组脑血流量的统计结果，I/R组，CG0. 4+I/R组和C(;(). 8十1/K组在 缺血5分时脑血流量显著降低，CG0. 4+I/R组在再灌注0分和再灌注20分有一 过性的升高，CG(). 8+I/R组在再灌注20分脑血流量也有一过性的升高。养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠脑细静脉管径变化率的影响
图28显示Sham组，T/R组，CGO. 4+I/R组和C(;O. 8+T/R组大鼠脑细静脉管 径在整个观察过程中没有发生显著的变化。 养血清脑颗粒对T/R后大鼠脑细静脉红细胞流速的影响
图29显示Sh柳组，I/R组，C(;O. 4十I/R组和CGO. 8+/R组在缺血前和再灌 注后大鼠脑细静脉红细胞流速的经时变化。Sham组大鼠脑细静脉红细胞流速在 本观察期间内没有显著的变化。1/K组大鼠脑细静脉红细胞流在再灌注()min时 显著下降，持续到再灌注4()分。CG0.4+I7R组大鼠脑细静脉红细胞流速在再灌 注()min时显著也有所下降，然后逐渐恢复。CG(). 8+I/R组在再灌注(kin时显著 也有所下降，但是恢复速度比]/R组快。 养血清脑颗粒对1/R后大鼠脑细静脉壁黏附白细胞的影响
图30显示Sham组，1/R组，CGO. 4+I/R组和C(;(). 8+T/R组大鼠脑细静脉壁 黏附白细胞数量的变化。在本观察期间内，Sham组大鼠脑细静脉壁仅有少量的 白细胞黏附，17R组大鼠在再灌注开始后，脑细静脉白细胞黏附数量显著地增 多，并持续增多到本观察结束时。养血清脑颗粒可以浓度依存性抑制大鼠大鼠脑 细静脉白细胞黏附的增加。
养血清脑颗粒对I/K后大鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响
图31显示Sht加组，I/R组，CGO. 4+I/R组和CGO. 8+] /R组大鼠脑细静脉FITC 标记白蛋白漏出的动态。Sham组大鼠，在本观察期间内大鼠脑细静脉l'TrC标记 白蛋白仅有少量的漏出。I/R组大鼠脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出从再灌注() 分后显著地增加一直持续到再灌注60分。CG的投予在再灌注60分显著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。 养血清脑颗粒对1/R大鼠脑皮层钙超载神经元的影响
图32A显示的是Sham组，I/R组和CG+I/R组大鼠脑皮层活体钙染色图片。 图中蓝染者为神经元，绿染者为钙离子。Sham组大鼠神经元内偶见绿染的钙离 子。1/l 组大鼠神经元内绿染的钙离子明显增多，CG+I/R组大鼠较1/R组大鼠神 经元内的绿染钙离子明显减少。
图32B比较了 Sham组，I/R组和CG+I/R组大鼠脑皮层钙超载神经元的阳性 细胞率。Sham大鼠脑皮层钙超载细胞为17. 9%。
I/R组大鼠脑皮层钙超载细胞的上升至65.6%。、 C(;+T/R组大鼠脑皮层钙超载神经细胞比降到38.5%，显著地 低于1/K组。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑梗死区域的影响
图W显示TTC染色结果，白色区域代表缺血梗死区。假手术组未见梗死苍 白区，1/R组脑切片中缺血侧脑皮质及皮质下基底核都有明显的白色梗死灶。养 血清脑颗粒预防给药后梗死区域均有所减小。
图vi是梗死体积统计学分析的结果，与假手术组相比，iA组梗死率明显
升高，养血清脑颗粒预给药浓度依存性降低了大鼠缺血再灌注后的梗死率。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑NissL染色的影响
图35是Sham组(A1-A3)， I/R组(B1-B3) ，CG(). 4+l/R组(C卜C3)和C(;O. 8+l/K 组(l)l-l):O大鼠脑组织Ni.ssl染色的结果。Sham组镜下可见正常大脑皮质各层细 胞排列整齐、规则，神经元结构完整，神经基质无水肿。基底神经节区神经元结 构也lH常，神经纤维无损坏；皮质神经元胞体体积较大，胞浆淡染，内含大而圆 的泡状核，胞核规整，核仁明显，染色质分布均匀，细胞质内可见尼氏体(A1 -A:O。 1/K组神经细胞排列紊乱，胞体肿胀，结构模糊。可见核固缩、核溶解。部分神 经细胞皱縮，变形呈三角形，尼氏小体减少或消失，呈现光镜下的淡染区(B1H )。 C:(;(). 4 + l/R组仍然存在部分细胞排列紊乱的情况。但是皮质神经细胞结构较清晰， 胞体肿胀、核固縮、核溶解程度较1/R组明显减轻,淡染区面积减小，病变范围 明显缩小(Cl-C3) 。 CGO. 8+I/R组神经元数量较多，但层次紊乱，细胞大而圆，尼氏 体深染(DJ-D3)。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑免疫组织化学染色的影响
图36是Sham组(Al， M，Ci,Dl)， 1/R组(A2， B2，C2， D2)， C(U+1/K组 (A3， B3，C3， D3)和CG0. 8+l/R组(A4， B4, C4， D4)大鼠脑Qaspasc-3、 P5:〗、1糧、 Bc卜2免疫组织化学染色的图像。Sham组Caspase-3、 P53、 PUM、 Bc卜2均未见 明显表达(Al， B1，C1,D1)。 1/R组观察半影区皮质可见P5:KB2)、 PUMA(C2)的表 达增强，胞核胞浆均有表达，部分皱縮细胞则呈现均匀一致性表达。CaspascKKA2) 和Bd-2 (D2)的表达较Sham组增强，阳性细胞呈棕黄色，阳性颗粒主要位于神 经元胞浆中。C(;(). 4+I/R组Caspase-3 (A3) 、 PUMA(C3)的表达量较I/K组明显减 少，而P53(B3)的阳性细胞减少了，同时Bcl-2(D3)阳性细胞数较1/R组明显增多。8+I/R组R53(M)、 P暖(C4)、 Caspase-3 (A4)的表达量较1/R组明显减 少，而Ik卜2(IM)阳性细胞数与I/R组接近。
统计结果如图37所示，Sham组Caspase-3、 P53、 PUM八、13cl-2均未见明显 表达，与Sham组相比，I/R组阳性细胞的数量显著增加，C(;0.4+l/l 组 C:u叩hso-3 、 PUMA的表达量较I/R组明显减少，而P53表达未见显著性差异， 同时1〗cl-2阳性细胞数较[/R组明显增多。C(;O. 8+:〖/R组P5:〗、P隠、Ca叩as(广:〗 的表达量较组明显减少，而Bel-2阳性细胞数较组未见明显差异。 养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠超微结构的影响
图38显示的是Sham组(Al-A3)， I/R组(B1-B3)和CG+I/R组(C卜C3)大鼠 脑皮层缺血区透射电镜的图像。Sham组大鼠脑血管周围未见水肿，内皮光滑 (八2)，神经元形态正常，胞膜和细胞器结构完整(A3)。 1/K组在缺血再灌注区可 见血管周围出现严重水肿，压迫管腔，血管内皮不光滑，出现指状突起肥大(l")， 脑皮层神经元大量皱縮，细胞器降解难辨，出现暗细胞和坏死神经元(B3) 。CX+I/K
组血管周围水肿减轻，但是管腔仍狭窄(C2)，神经元结构相对完整(c:0。
图39显示的是1/R组(A， B, C)和CG+T/R组(D， E， F)大鼠脑皮层半影区透射电 镜的图像。1/K组可见血管周围出现严重水肿，但是血管内皮相对光滑，有小泡 突出管腔(B)，仍可见暗细胞(C)。 CG十1/R组组血管周围水肿明显减轻(l':)，神 经元受损较轻(F)。
图40显示的是I/R组(A, B, C)和CG+I/R组(D， E, F)大鼠脑皮层半影对侧镜像 区透射电镜的图像。T/R组血管周围仍可见轻微水肿(B)， CG+I/R组血管周围水
肿消失(i':)。 二者神经元形态正常(c和F)。


图i表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0.化/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0.8g/kg组蒙古沙鼠脑血流量的变化。各组间的脑 血流量在观察期间内没有明显性差异。
图2表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑细动脉和细 静脉血管径的结果。各组间脑细动脉和静脉管径没有显著变化。
图3表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().4g/kg组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑细动脉和细 静脉红细胞流速的结果。各组间蒙古沙鼠脑细动脉和细静脉红细胞流速没有显著
性差异。
图4表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化/kg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑蒙古沙鼠细 静脉壁黏附白细胞的结果。假手术组细静脉壁黏附白细胞少于1个/加()inn，缺 血再灌注组脑细静脉壁的粘附白细胞数显著增加(3. 1±0. 17)，养血清脑颗粒
0. .1g/kg和().8g/kg显著抑制了脑细静脉壁的粘附白细胞数(IJ土O. 11和
1. 3±(). 17)。
图5是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化/kg组， 缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组蒙古沙鼠在再灌注5天时脑细静脉壁图R 荧光强度的结果。与假手术组相比，缺血再灌注组脑细静脉壁DIIR荧光强度显著 增强，养血清脑颗粒可以浓度依存性减弱脑细静脉壁l)HR荧光强度的增加。
图6表示的是假手术组，缺血再灌注组，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化Vkg 组，缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组在再灌注5天蒙古沙鼠脑蒙古沙鼠细 静脉白蛋白漏出的结果。假手术组脑细静脉1;[TC标记白蛋白仅有少量的漏出。 缺血再灌注组F]TC标记白蛋白的漏出显著增加。养血清脑颗粒浓度依存性减少 脑细静脉F1TC标记白蛋白的漏出。
图7A是假手术组(a)，缺血再灌注组(b)，缺血再灌注+养血清脑颗粒().化/kg 组(c)和缺血再灌注+养血清脑颗粒0. 8g/kg组(d)蒙古沙鼠在再灌注5天时大 脑海马CAl区Tunel染色的图像。假手术组没有观察到Tunel阳性细胞(a)，缺血 再灌注组可以看见许多Tunel阳性细胞(b)，养血清脑颗粒给药组Tunel阳性细胞 浓度依存性减少(c和d)。图7B是各组脑海马CAl区Tunel染色的结果。与假手术 组相比，缺血再灌注组海马CAl区Tunel染色阳性细胞数显著增加，养血清脑颗粒 可以浓度依存性减少海马CAl区Tunel染色阳性细胞数。
图8是假手术组(A,D)，缺血再灌注组(B，E)和缺血再灌注+养血清脑颗粒 组(C，F)蒙古沙鼠在再灌注5天时血管透射电镜的图像。假手术组可以观察到 血管内皮光滑，血管周围组织的无水肿现象(A，D)。缺血再灌注组可以观察到血 管周围组织出现明显水肿(B， E)。缺血再灌注+养血清脑颗粒组可以观察到血管周围水肿明显减轻(C，F)。
图9是假手术组(A，d)，缺血再灌注组(b,E)和缺血再灌注+养血清脑颗粒 组(C，F)蒙古沙鼠在再灌注5天时海马神经元透射电镜的图像。假手术组海马 神经元形态正常，胞膜和细胞器结构完整(A， d)。缺血再灌注组海马出现暗细胞，
神经元损伤(b,io。缺血再灌注+养血清脑颗粒组形态较完整，损伤较轻(c，n。
图10是用激光多普勒血流量仪测得的Sham组、17r组、C(;(H+I/K组和
c(;(). +i/k组在缺血前，缺血5分钟，再灌注后大鼠脑患侧血流量图。sh，组大
鼠各时间脑血流量无明显变化。1/R组大鼠在缺血5分钟时，脑血流量明显降低， 再灌注后脑血流量逐渐恢复。C(;O. 4+I/R组和CGO. 8+[/R组大鼠在缺血5分时的 脑血流量也显著降低，但在再灌注开始，脑血流量恢复速度比较快。
图11是各组脑血流量的统计结果，I/R组，CGO. 4+l/R组和C(;O. 8+l/K组在 缺血5分时脑血流量显著降低，CGO. 4+f/R组在再灌注()分和再灌注2()分有一 过性的升高，CG(). 8+I/R组在再灌注20分脑血流量也有一过性的升高。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠脑细静脉管径变化率的影响
图12显示Sham组，L/R组，C(;(). 4+I/R组和C(;(). 8+1/R组大鼠脑细静脉管 径在整个观察过程中没有发生显著的变化。
养血清脑颗粒对I/R后大鼠脑细静脉红细胞流速的影响
图13显示Sham组，I/R组，C(;O. 4+I/R组和CGO. 8+T/R组在缺血前和再灌 注后大鼠脑细静脉红细胞流速的经时变化。Sham组大鼠脑细静脉红细胞流速在 本观察期间内没有显著的变化。1:/R组大鼠脑细静脉红细胞流在再灌注()min时 显著下降，持续到再灌注40分。CG0.4+I/R组大鼠脑细静脉红细胞流速在再灌 注()min时显著也有所下降，然后逐渐恢复。CGO. 8+I/R组在再灌注()mi n时显著 也有所下降，但是恢复速度比1/R组快。
图14显示Sham组，I/R组，CGO. 4+I/R组和CGO. 8+l/R组大鼠脑细静脉壁 黏附白细胞数量的变化。在本观察期间内，Sham组大鼠脑细静脉壁仅有少量的 白细胞黏附，I/R组大鼠在再灌注开始后，脑细静脉白细胞黏附数量显著地增 多，并持续增多到本观察结束时。养血清脑颗粒可以浓度依存性抑制大鼠大鼠脑 细静脉白细胞黏附的增加。
图15显示Sham组，I/R组，C(;O. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑细静脉1'TI'C 标记白蛋白漏出的动态。Sham组大鼠，在本观察期间内大鼠脑细静脉FiTC标记白蛋白仅有少量的漏出。l:/R组大鼠脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出从再灌注0 分后显著地增加一直持续到再灌注60分。CG的投予在再灌注60分显著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠脑细静脉F[TC标记白蛋白的漏出。
图16表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒().化/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 血管径的连续变化。假手术组在本观察期间内没有显著地变化。缺血再灌注组 细静脉在再灌注开始时有一过性轻微扩张，持续到再灌注60分。养血清脑颗粒 ().化/kg+缺血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组的脑细静脉管径在观 察期间内没有显著地变化。
图17表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.化Zkg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 红细胞流速的连续变化。假手术组蒙古沙鼠脑细静脉红细胞流速在本观察期间内 没有显著地变化。缺血再灌注组在再灌注开始到再灌注20分期间脑细静脉红细 胞血流速度显著地降低。养血清脑颗粒0.4g/kg给药组在再灌注l()分后，显著 地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉红细胞血流速度的降低。养血清脑颗粒().《 组在再灌注开始时就抑制了的脑细静脉红细胞血流速度的降低。
图18表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.化/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑血流量 的连续变化。假手术组的脑血流量在本观察期间内没有明显的变化，缺血再灌注 组在再灌注开始后显著降低，且持续到再灌注60分。养血清脑颗粒().4g/kg+缺 血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再灌注10分后，显著地抑制了 缺血再灌注弓I起的脑血流量的降低。
图19表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠细静脉壁 黏附白细胞的连续变化。假手术组在观察结束时，黏附于脑细静脉壁的白细胞在 不到:]个/200y m。缺血再灌注组于蒙古沙鼠脑细静脉壁的白细胞数在再灌注开 始增加，在再灌注结束时，已经达到6个/20() u m。养血清脑颗粒().4g/kg+缺血 再灌注组，在再灌注30分后显著地抑制了白细胞与大脑细静脉管壁粘附。养血 清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组，在再灌注10分后就显著地抑制了白细胞与大脑细静脉管壁粘附。
图20是缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠在缺血再灌注前和再灌注 6()分时脑细静脉壁DHR荧光强度变化的图像。缺血再灌注蒙古沙鼠(a)和养血 清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠(c)在缺血前，没有观察到细静脉壁DI1R荧光发 光部位.在再灌注60分时，可以观察到缺血再灌注蒙古沙鼠沿脑细静脉壁l)HR 荧光强度增强的部位(b)，而养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠没有观察到 脑细静脉壁D冊荧光强度的增强(d).
图2]表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 壁DHR荧光强度的连续变化。假手术组蒙古沙鼠脑细静脉壁的DHR荧光强度比在 本观察期间内几乎没有变化。缺血再灌注组蒙古沙鼠脑静脉壁的DHR荧光强度比 在再灌注10分后开始增加，且持续增加。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组 和养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在再灌注10分显著地抑制了缺血再灌注引起 的脑细静脉壁的DHR萤光强度的增加。
图22是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠脑细静脉F1TC 标记白蛋白漏出的图像。在缺血再灌注前，假手术蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙 鼠和养血清脑颗粒+缺血再灌注蒙古沙鼠均没有观察到FITC标记白蛋白漏出细 静脉外。在再灌注60分时，假手术蒙古沙鼠几乎没有观察到脑细静脉F:[TC标记 白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以观察到FITC标记白蛋白的明显漏出。 养血清脑颗粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后6()分时，只有少量FITC标记 白蛋白的漏出于细静脉外。
图23表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0. 4g/kg十缺血再灌 注组，养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉 [nTC标记白蛋白漏出的连续变化。假手术组在本观察期间，脑细静脉FITC标记 白蛋白的仅有少量的漏出。缺血再灌注组从再灌注开始就可观察到F:ITC标记白 蛋白的漏出，并持续增加。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组在再灌注60分 显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。养血清脑颗 粒().8+缺血再灌注组在再灌注30分以后显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静 脉FITC标记白蛋白的漏出。图24-A是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒+缺血再灌注组大脑皮质 扫描电镜下毛细血管开放的图像。假手术组可见皮质中有许多毛细血管，且分布 较均匀。缺血再灌注组可以观察到开放的毛细血管显著减少，而且分布不均匀， 养血清脑颗粒+缺血再灌注组开放的毛细血管数量与假手术组相接近。图24-15 是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒+缺血再灌注组毛细血管开放数的结 果。毛细血管开放数相对于假手术组(41.33±0.667)在缺血再灌注后明显下降
(30. 33 士 1. 667 )，养血清脑颗粒显著抑制了毛细血管开放数的减少
(42±0. 577)。
图25是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠再 灌注60分后的大脑皮质毛细血管的透射电镜和扫描电镜的图象。图a， h， c是 透射电镜图像，假手术组(a)可以观察到血管内皮光滑，血管周围组织的无水 肿现象。缺血再灌注组(b)可以观察到血管周围组织出现明显水肿。养血清脑 颗粒+缺血再灌注组(c)可以观察到血管周围水肿明显减轻。图d， c， f是扫描 电镜图像，假手术组(d)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮光滑，内皮细胞间 连接紧密。缺血再灌注组(e)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮可以观察到血 管内细胞众多的隆起，内皮细胞连接处，细胞间相互嵌合的指状突起肥大，且内 皮表面出现许多突起的小泡。养血清脑颗粒+缺血再灌注组(f)蒙古沙鼠脑皮质部 细静脉血管内皮较光滑，连接处指状突起和小泡明显减少。
图26是用激光多普勒血流量仪测得的Sham组、I/R组、CGO. 4+T/R组和 CGO. 8+I/R组在缺血前，缺血5分钟，再灌注后大鼠脑患侧血流量图。Sham组大 鼠各时间脑血流量无明显变化。I/R组大鼠在缺血5分钟时，脑血流量明显降低， 再灌注后脑血流量逐渐恢复。CGO. 4+]/R组和CGO. 8+I/R组大鼠在缺血5分时的 脑血流量也显著降低，但在再灌注开始，脑血流量恢复速度比较快。
图27是各组脑血流量的统计结果，I/R组，CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/K组在 缺血5分时脑血流量显著降低，CGO. 4+I/R组在再灌注0分和再灌注20分有一 过性的升高，CGO. 8+I/R组在再灌注20分脑血流量也有一过性的升高。
图28显示Sham组，I/R组，CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑细静脉管 径在整个观察过程中没有发生显著的变化。
图29显示Sham组，I/R组，CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组在缺血前和再灌注后大鼠脑细静脉红细胞流速的经时变化。Sham组大鼠脑细静脉红细胞流速在 本观察期间内没有显著的变化。I/R组大鼠脑细静脉红细胞流在再灌注()min时 显著下降，持续到再灌注40分。CG0.4+I/R组大鼠脑细静脉红细胞流速在再灌 注()min时显著也有所下降，然后逐渐恢复。CGO. 8+I/R组在再灌注()min时显著 也有所下降，但是恢复速度比T/R组快。
图30显示Sham组，I/R组，CGO. 4+I/R组和C(;(). 8+I/R组大鼠脑细静脉壁 黏附白细胞数量的变化。在本观察期间内，Sham组大鼠脑细静脉壁仅有少量的 白细胞黏附，I/R组大鼠在再灌注开始后，脑细静脉白细胞黏附数量显著地增 多，并持续增多到本观察结束时。养血清脑颗粒可以浓度依存性抑制大鼠大鼠脑 细静脉白细胞黏附的增加。
图31显示Sham组，I/R组，CGO. 4+:L/R组和CGO. 8+T/R组大鼠脑细静脉FITC 标记白蛋白漏出的动态。Sham组大鼠，在本观察期间内大鼠脑细静脉F1TC标记 白蛋白仅有少量的漏出。I/R组大鼠脑细静脉FH'C标记白蛋白的漏出从再灌注() 分后显著地增加一直持续到再灌注60分。CG的投予在再灌注60分显著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。
图:32A显示的是Sham组，I/R组和CG+T/R组大鼠脑皮层活体钙染色图片。 图中蓝染者为神经元，绿染者为钙离子。Sham组大鼠神经元内偶见绿染的f丐离 子。1/R组大鼠神经元内绿染的钙离子明显增多，C(;+]:/R组大鼠较17R组大鼠神 经元内的绿染钙离子明显减少。
图32B比较了 Sham组，I/R组和CG+I/R组大鼠脑皮层钙超载神经元的阳性 细胞率。Sham大鼠脑皮层钙超载细胞为17.9%。
I/R组大鼠脑皮层钙超载细胞 的上升至65.6%。、 CG+I/K组大鼠脑皮层钙超载神经细胞比降到38. 5%，显著地 低于1/R组。
图33显示TTC染色结果，白色区域代表缺血梗死区。假手术组未见梗死苍 白区，IZR组脑切片中缺血侧脑皮质及皮质下基底核都有明显的白色梗死灶。养 血清脑颗粒预防给药后梗死区域均有所减小。
图34是梗死体积统计学分析的结果，与假手术组相比，I/R组梗死率明显 升高，养血清脑颗粒预给药浓度依存性降低了大鼠缺血再灌注后的梗死率。
图35是Sham组(A1-A3), I/R组(B1-B3) ，CG(). 4+I/R组(C1-C3)和C(;(). 8+1/R组(1〕卜D3)大鼠脑组织Nissl染色的结果。Sham组镜下可见正常大脑皮质各层细 胞排列整齐、规则，神经元结构完整，神经基质无水肿。基底神经节区神经元结 构也正常，神经纤维无损坏；皮质神经元胞体体积较大，胞浆淡染，内含大而圆 的泡状核，胞核规整，核仁明显，染色质分布均匀，细胞质内可见尼氏体(A1-A3)。 1/R组神经细胞排列紊乱，胞体肿胀，结构模糊。可见核固縮、核溶解。部分神 经细胞皱縮，变形呈三角形,尼氏小体减少或消失，呈现光镜下的淡染区(Bl-B3)。 C(;(). 4+l/R组仍然存在部分细胞排列紊乱的情况。但是皮质神经细胞结构较清晰, 胞体肿胀、核固縮、核溶解程度较/R组明显减轻，淡染区面积减小，病变范围 明显缩小(C1-C3) 。 CGO. 8+I/R组神经元数量较多，但层次紊乱，细胞大而圆，尼氏 体深染(D1-D3)。
图36是Sham组(Al， Bl， Cl， Dl)， I/R组(A2， B2, C2， D2) ， CG(). 4+T/R组(A3， B3，C:U)3)和C(;0. 8+T/R组(A4， B4， C4, D4)大鼠脑Caspase-3、〖)53、 PUMA、 Bc卜2 免疫组织化学染色的图像。Sham组Caspase-3、 P53、 PUMA、 Bel-2均未见明显 表达(AL， B1，C1,D1)。 1/R组观察半影区皮质可见P53(B2)、 PUMA(C2)的表达增 强，胞核胞浆均有表达，部分皱缩细胞则呈现均匀一致性表达。Ca叩&sc-:K八2) 和Bc卜2 (D2)的表达较Sham组增强，阳性细胞呈棕黄色，阳性颗粒主要位于神 经元胞浆中。CGO. 4+I/R组Caspase-3 (A3) 、 P腿(C3)的表达量较T/R组明显减 少，而P53(B3)的阳性细胞减少了，同时Bel-2(D3)阳性细胞数较1/R组明显增 多。C(;(). 8+I/R组P53(B4) 、 PUMA(C4) 、 Caspase-3 (A4)的表达量较I/R组明显减 少，而Bel-2 (D4)阳性细胞数与I/R组接近。
统计结果如图37所示，Sham组Caspase-3、 P53、 PUMA、 Bc]-2均未见明显 表达，与Sham组相比，I/R组阳性细胞的数量显著增加，C(;O. 4+l/R组 Caspase-3 、 PUMA的表达量较I/R组明显减少，而P53表达未见显著性差异， 同时Bc丄-2阳性细胞数较I/R组明显增多。C(;O. 8+I/R组P53、 PL謹、Caspase-3 的表达量较T/R组明显减少，而Bel-2阳性细胞数较I/R组未见明显差异。
图38显示的是Sham组(A1-A3)， I/R组(B1-B3)和CG+I/R组(C1-C3)大鼠 脑皮层缺血区透射电镜的图像。Sham组大鼠脑血管周围未见水肿，内皮光滑 (A2)，神经元形态正常，胞膜和细胞器结构完整(A3)。 1/R组在缺血再灌注区可 见血管周围出现严重水肿，压迫管腔，血管内皮不光滑，出现指状突起肥大(B2)，脑皮层神经元大量皱缩，细胞器降解难辨，出现暗细胞和坏死神经元(B3) 。C(;+l/K 组血管周围水肿减轻，但是管腔仍狭窄(C2)，神经元结构相对完整(C3)。
图39显示的是I/R组(A， B， C)和CG+I/R组(D， E， F)大鼠脑皮层半影区透射电 镜的图像。1/K组可见血管周围出现严重水肿，但是血管内皮相对光滑，有小泡 突出管腔(B)，仍可见暗细胞(C)。 CG+1/R组组血管周围水肿明显减轻(l':)，神 经元受损较轻(F)。
图40显示的是I/R组(A， B, C)和CG+I/R组(D, E， F)大鼠脑皮层半影对侧镜像 区透射电镜的图像。17R组血管周围仍可见轻微水肿(B)， CG+I/R组血管周围水 肿消失(H) 。 二者神经元形态正常(C和F)。
具体实施例方式
以下实施例用于进一步说明本发明但不作为对本发明的限制。 实施例1
养血清脑颗粒，由如下重量份的原料药制成当归250- 420;川芎280^00; 赤芍200-380;熟地黄200-400;钩藤580-750;鸡血藤550-780;夏枯草600-720; 决明子500-750;珍珠母560-750;延胡索200-420;细辛30-100。上述配方以 克为单位，其颗粒的制备可采用制剂学常规技术制备成lO()()g颗粒剂。
权利要求
1. 养血清脑颗粒在制备一种治疗脑微循环障碍的药物应用。
2. 权利要求l的应用，其特征在于，所述养血清脑颗粒是由当归25()-化0份; 川芎280-400份；白芍200-380份；熟地黄200-400份；钩藤580-750份； 鸡血藤550-780份；夏枯草600-720份；决明子500-750份；珍珠母560-750 份；延胡索200-420份；细辛30-100份为主要成分制成的中药复方制剂。
3. 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒可以抑制脑微循 环障碍和脑神经细胞的损伤，该作用与其抑制过氧化物产生和调亡相关。
4. 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒抑制了脑细静脉 壁的粘附白细胞数。
5. 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒的预给药可以抑 制缺血再灌注引起的脑皮层微循环障碍。
6. 权利要求5的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒的预给药可以抑 制缺血再灌注引起的脑皮层微循环障碍，该作用与其抑制过氧化物，抑制白 细胞与血管内皮细胞黏附，保护血管内皮细胞，抑制血浆白蛋白外漏相关。
7. 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒可以浓度依存性 减弱脑细静脉壁DHR荧光强度的增加。
8. 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒浓度依存性减少 脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。
9.权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒可以浓度依存性 减少染色阳性细胞数。
10. 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是养血清脑颗粒在再灌注开始时 就抑制了的脑细静脉红细胞血流速度的降低。
全文摘要
本发明涉及一种中药制剂的新用途，特别涉及中药养血清脑颗粒对脑微循环障碍的改善作用，本发明的实验数据表明，养血清脑颗粒可以抑制脑微循环障碍和脑神经细胞的损伤，该作用与其抑制过氧化物产生和凋亡相关。
文档编号A61P9/10GK101530498SQ20081005242
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者安丽华, 昕 常, 徐想顺, 芳 王, 胡白和, 赵新荣, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司