专利名称：白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用， 属于生物医学领域。
技术背景在蝰亚科、蝮亚科和眼镜科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白(原) 的酶,简称降纤酶，是一种既能溶解纤维蛋白原，又能溶解纤维蛋白的纤维蛋白 溶解酶。蛇毒降纤酶不存在无活性的酶原形式，而存在有活性的蛋白水解酶， 不需要激活剂激活。因此可直接作用于形成血栓的纤维蛋白，将血栓快速溶解，改善患者的临床症状；通过溶解血浆纤维蛋白原，降低血液黏度，抑制血栓形 成，防止再次梗塞。根据其结构特点，蛇毒降纤酶又可分为丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase)和 金属蛋白酶(metalloproteinase)。丝氨酸蛋白酶的降纤活性可被常见的丝氨酸蛋 白酶抑制剂如二异丙基氟磷酸酯(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制，但不被 EDTA所抑制,而金属蛋白酶的降纤活性可被EDTA所抑制。大多数降纤丝氨酸 蛋白酶优先裂解纤维蛋白原的Bp2链，而对Aa2链则只有很低的裂解活性；而 大多数降纤酶是金属蛋白酶，优先裂解纤维蛋白原的Aa2链,而对B(32链则只有 较低程度的裂解。现在临床使用的溶栓药主要是链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活物，这类药物的共同特点是间接作用，且起效慢。我们首次从我国产的白唇竹叶青蛇 的毒液中分离纯化的降纤酶与目前临床使用的t-PA(组织纤溶酶原激活剂)、尿激 酶、链激酶等溶栓制相比有许多优点白唇竹叶青蛇毒降纤酶是一种金属蛋白 酶，其活性不被血液中丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制；由于其不激活生理纤溶酶 可避免，如与生理纤溶酶形成相关的血小板活化等副作用；底物专一，半衰期 长。这些特性均显示了白唇竹叶青蛇毒降纤酶作为一种强力溶栓剂的潜在价值。 但是在目前，还没有一套从我国白竹叶青蛇毒液中提取纯化白唇竹叶青蛇毒降 纤酶行之有效的方法以及对其药效的确认。 发明内容本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有较强的水解纤维蛋 白原活性的白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用。 为了本发明的目的，本发明提供了如下技术方案唇竹叶青蛇毒降纤酶，我们从中国产的白唇竹叶青蛇的毒液中分离得到的 一种金属蛋白酶，其具有同时水解纤维蛋白原的ct链和P链的活性，金属蛋白 酶抑制剂EDTA可抑制其活性，但巯基乙醇和丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂PMSF 不能抑制其活性，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原和非还原条件 下为66300道尔顿。唇竹叶青蛇毒降纤酶的制备方法，收集白唇竹叶青蛇毒液，集中后冷冻干 燥制得粗毒冻干粉，取白唇竹叶青蛇毒粗毒冻干粉1 5g，溶于4 6mlpH7.5 8.5， 0.04 0.06 mol Tris-HCl缓冲液中，用离心机以3000 5000r/min离心8 12min，取上清液，经DEAE-Sephadex A-25离子交换层析，用浓度范围0.01 0.6 mol/L NaC11000 ml的0.04 0.06 mol Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，洗脱流速为0.20 0.30ml/min，收集所得I峰洗脱液冷冻干燥，(该I峰为 DEAE-Sephadex A-25离子交,层析图谱左边数过来第一个峰)，溶解于3ml 0.01 0.6 mol/L Tris-HCl缓冲液中；经DEAE-Sephadex G-100凝胶层析，用pH 7.5 8.5， O.01 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，速为0.11 0.17ml/min,收集 分离出的I峰洗脱液(G-100凝胶层析柱分离出的I峰为SephadexG-100层析 图谱左边数过来第一个峰)，冻干燥后，再经CM-Sephadex C-25阳离子交换层 析，用pH5 6.5 ，浓度为0.009 0.011mol/L的NaAc缓冲液洗脱，洗脱流速 为0.25ml/min，取主峰即可。然后用高效液相色谱(HPLC)和SDS-胺凝胶平板 电泳(SDS-PAGE)鉴定其纯度，分子量测定采取SDS-胺凝胶平板电泳测定。白唇竹叶青蛇毒降纤酶作为制备治疗血栓疾病的应用。下面用发明的白唇竹叶青蛇毒降纤酶的药理实验结果来说明本发明的药效 作用和有益效果1.纤维蛋白原平板法测定白唇竹叶青蛇毒降纤酶的降纤作用 取2%琼脂溶液(用pH 7.4， 0.15 M/L NaCl, 50 mM/L Tris-HCl buffer配制)5ml，铺 板前加入1 ml含10单位凝血酶溶液，在37。C-45。C水浴中与0.4%纤维蛋白原溶 液(用pH7.4，含0.15M/LNaCl， 50M/L Tris-HCl buffer配制)5ml,混合后倒入灭菌 过的培养皿(直径卯mm)中，置室温形成凝胶后，即成"标准平板"。将标准平 板于85'C温箱中加热30min后取出即成"加热平板气按需在平板上打直径3mm 的小孔，每孔加样10ul，置37'C保温18h，取出观察结果。结果显示白唇竹叶 青蛇毒降纤酶在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白原，说明其 降纤机制是以直接纤溶为主；溶解纤维蛋白的活性明显强于同等剂量的粗毒；并且以溶圈直径对白唇竹叶青降纤组分的量双对数作图，二者存在一定的量效关系。2. SDS-胺凝胶平板电泳(SDS-PAGE)法测定白唇竹叶青蛇毒降纤酶的降纤作用取2.5 mg/ml纤维蛋白原与白唇竹叶青蛇毒降纤酶在pH7.4，含0.15 mol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCI buffer中混合，37。C水育保温，分别在保温5分钟、30 分钟、2小时取50 ul溶液，与50 ul电泳样品处理液(2% SDS， 5% P -疏基乙醇) 混匀.沸水煮5分钟。冷却后上样进行SDS-PAGE。结果显示白唇竹叶青蛇毒 纤溶组分能迅速水解纤维蛋白原的Aa链，缓慢裂解纤维蛋白原BP链，对Y链 无影响(如图1所示)其中，Marker为标准蛋白，1泳道为纤维蛋白原，2泳 道为白唇竹叶青蛇毒降纤酶水解5分钟后的纤维蛋白原，3泳道为白唇竹叶青蛇 毒降纤酶水解0.5小时后的纤维蛋白原，4泳道为白唇竹叶青蛇毒降纤酶水解2 小时后的纤维蛋白原。从上述实验结果可得出本发明白唇竹叶青蛇毒降纤酶的有益效果在于 白唇竹叶青蛇毒降纤酶具有直接水解纤维蛋白原的作用，并且可同时水解 纤维蛋白原的A。链和B P链，而从其它蛇毒来源的降纤酶一般只能水解纤维蛋 白原的一种链，要么水解Aa链，要么水解B3链，同时水解二链的蛇毒降纤酶 很少。因此，本发明白唇竹叶青蛇毒降纤酶是一种从我国特有的药用生物资源 中自己研制的具有可同时水解纤维蛋白原Aa链和B P链活性的金属蛋白酶。
图1是白唇竹叶青蛇毒降纤酶水解纤维蛋白原A a链和B P链的SDS-PAGE 图谱；图2是DEAE-SephadexA-25离子交换层析图谱； 图3是Sephadex G-100层析图谱； 图4是CM-Sephadex C-50离子交换层析图谱；具体实施方式
实施例1(1) 白唇竹叶青蛇毒的预处理 采用咬皿采毒法从白唇竹叶青蛇采集蛇毒液，收集的白唇竹叶青蛇毒液集中后冷冻干燥制得毒粗毒冻干粉，取白唇竹叶青蛇毒粗毒冻干粉lg，溶于5ml pH 8.0, 0.05 mol Tris-HCl缓冲液中，用离心机以3000r/min离心10min，取上清液待 用； '(2) DEAE-SephadexA-25离子交换层析用浓度0.05mol/L， pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡SephadexA-25柱，层析 柱2cmx60cm;将步骤(l)中制得的上清液上样，用浓度范围0.6 mol/LNaCl 1000ml的0.05molTris-HCl缓冲液线性剃度洗脱，洗脱流速为0.25ml/min，(参 看图2)将SephadexA-25柱层析分离出的I峰洗脱液冷冻干燥，溶解于3ml 0.6 mol/L Tris-HCl缓冲液中制得待用溶液；(3) DEAE-SephadexG-100凝胶层析用pH7.6， 0.01mol/LTris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephadex G-100凝胶层析 柱，将步骤(2)中最后制得的待用溶液上样，洗脱流速为0.14ml/min，(参看图 3)将DEAE-Sephadex G-100凝胶层析柱分离出的I峰洗脱液冷冻干燥分离物 待用；(4) CM-Sephadex C-25阳离子交换层析用pH5.8 ，浓度0.01mol/L的NaAc缓冲液平衡CM-Sephadex C-50层析柱， 把步骤(3)最后得到的I峰冷冻干燥分离物上样，用上述缓冲液洗脱， 一洗脱流 速为0.25ml/min。 CM-Sephadex C-50离子交换层析图谱如图4所示。实施例2(1) 白唇竹叶青蛇毒的预处理采用咬皿采毒法从白唇竹叶青蛇采集蛇毒液，收集的白唇竹叶青蛇毒液集 中后冷冻干燥制得毒粗毒冻干粉，取白唇竹叶青蛇毒粗毒冻干粉5g,溶于5ml pH 8.5， 0.06 molTris-HCl缓冲液中，用离心机以5000r/min离心12min,取上清液待 用；(2) DEAE-SephadexA-25离子交换层析用浓度0.06 mol/L， pH7.0的Tris-HCl缓冲液平衡SephadexA-25柱，层 析柱2 cm x 60 cm;将步骤(1 )中制得的上清液上样，用浓度范围O.Ol mol/LNaCl 1000ml的0.06molTris-HCl缓冲液线性剃度洗脱，洗脱流速为0.30ml/min,将 SephadexA-25柱层析分离出的I峰洗脱液冷冻干燥，溶解于3ml 0.01 mol/L Tris-HC慮冲液中制得待用溶液；(3) DEAE-SephadexG-lOO凝胶层析用pH8.5， 0.02mol/LTris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephadex G-100凝胶层析 柱，将步骤(2)中最后制得的待用溶液上样，洗脱流速为0.17ml/min，将 DEAE-Sephadex G-100凝胶层析柱分离出的I峰洗脱液冷冻干燥分离物待用；(4) CM-Sephadex C-25阳离子交换层析用pH 6.5 ，浓度0.011mol/L的NaAc缓冲液平衡CM-Sephadex C-50层析柱，把步骤(3)最后得到的I峰冷冻干燥分离物上样，用上述缓冲液洗脱，洗 脱流速为0.20ml/min。收集主峰即可。实施例3(1) 白唇竹叶青蛇毒的预处理采用咬皿采毒法从白唇竹叶青蛇采集蛇毒液，收集的白唇竹叶青蛇毒液集 中后冷冻干燥制得毒粗毒冻干粉，取白唇竹叶青蛇毒粗毒冻干粉2.5g，溶于5ml pH 7.5, 0.04 molTris-HCl缓冲液中，用离心机以4500r/min离心8min，取上清液 待用；(2) DEAE-SephadexA-25离子交换层析用浓度0.04 mol/L， pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡SephadexA-25柱，层 析柱2 cm x 60 cm;将步骤(1)中制得的上清液上样，用浓度范围0.6mol/LNaCl 1000 ml的0.04mo1 Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，洗脱流速为0.20ml/min，将 SephadexA-25柱层析分离出的I峰洗脱液冷冻干燥，溶解于3ml 0.6mol/L Tris-HCl缓冲液中制得待用溶液；(3) DEAE-SephadexG-lOO凝胶层析用pH 7.5， 0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephadex G-100凝胶层析 柱，将步骤(2)中最后制得的待用溶液上样，洗脱流速为0.11ml/min，将 DEAE-Sephadex G-100凝胶层析柱分离出的I峰洗脱液冷冻干燥分离物待用；(4) CM-Sephadex C-25阳离子交换层析用pH 5 ，浓度0.009mol/L的NaAc缓冲液平衡CM-Sephadex C-50层析柱， 把步骤(3)最后得到的I峰冷冻干燥分离物上样，用上述缓冲液洗脱，洗脱流 速为0.30ml/min。收集主峰即可。
权利要求
1. 白唇竹叶青蛇毒降纤酶，其特征是从我国白唇竹叶青蛇的毒液中分离纯化得到的一种金属蛋白酶，并具有同时降解纤维蛋白原Aα链和Bβ链的活性，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原和非还原条件下为66300道尔顿。
2、 一种白唇竹叶青蛇毒降纤酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 白唇竹叶青蛇毒的预处理收集的白唇竹叶青蛇毒液集中后冷冻干燥 制得粗毒冻干粉，取白唇竹叶青蛇毒粗毒冻干粉l 5g，溶于5ml pH 7.5 8.5， 0.04 0.06 mol Tris-HCl缓冲液中，用离心机以3000 5000r/min离心8 12min，取上清液待用；(2) DEAE-SephadexA-25离子交换层析用浓度0.04 0.06mol/L， pH7.0 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡 SephadexA-25柱；将步骤(1)中制得的上清液上样，用浓度范围0.01 0.6 mol/L NaC1 1000ml和0.04 0.06 mol Tris-HCl缓冲液线性剃度洗脱，洗脱流速为 0.20 0.30ml/min，将SephadexA-25柱层析分离出的I峰洗脱液冷冻干燥，溶解 于3ml 0.01 0.6mol/LTris-HCl缓冲液中制得待用溶液；(3)' DEAE-Sephadex G-100凝胶层析用pH 7.5 8.5， 0.01 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephadex G-100凝胶层析柱，将步骤(2)中最后制得的待用溶液上样，洗脱流速为0.11 0.17ml/min，将DEAE-Sephadex G-100凝胶层析柱分离出的I峰洗脱液冷冻干 燥分离物待用；(4) CM-SephadexC-25阳离子交换层析 用pH 5 6.5 ，浓度0.009 0.011mol/L的NaAc缓冲液平衡CM-Sephadex C-50层析柱，把步骤(3)最后得到的I冷冻干燥待用分离物上样，用上述缓冲 液洗脱，洗脱流速为0.20 0.30ml/min。
3、白唇竹叶青蛇毒降纤酶作为制备治疗血栓疾病的应用。
全文摘要
本发明白唇竹叶青蛇毒降纤酶及其制备方法和在制药中的应用，属生物医学领域。白唇竹叶青蛇毒降纤酶，是从我国产的白唇竹叶青蛇的毒液中分离纯化得到的一种金属蛋白酶，并具有同时降解纤维蛋白原Aα链和Bβ链的活性，其在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原和非还原条件下为66300道尔顿。其制备方法包括以下步骤(1)白唇竹叶青蛇毒的预处理；(2)DEAE-Sephadex A-25离子交换层析；(3)DEAE-Sephadex G-100凝胶层析；(4)CM-Sephadex C-25阳离子交换层析。白唇竹叶青蛇毒降纤酶具有较强的同时降解纤维蛋白原Aα链和Bβ链的活性，作为制备治疗血栓疾病的应用。
文档编号A61P7/00GK101280296SQ200810069758
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者余晓东, 敏 邓 申请人:重庆师范大学