专利名称：：一种阴沟肠杆菌及其多糖和多糖的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域，特别设计一种具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力和抗病毒等生物活性的阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及其应用。
背景技术：
：多糖在自然界分布很广，在高等植物、动物、微生物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物之一。多糖具有多方面的功能，如能量储存、结构支持、防御功能等。早在上世纪40年代，多糖就开始用作药物，1951年美国人ReihyH首次发现微生物担子菌中的多糖有抑制肿瘤的活性，到了60年代，多糖作为广泛的免疫促进剂引起人们的极大兴趣，开发多糖为保健食品与药物也倍受关注。已有研究证明饲料中添加活性多糖能显著提高动物免疫功能，改善动物生长和生产性能，降低动物死亡率。很多多糖具有免疫增强活性，表现出对宿主免疫的介导和调节作用，通过刺激免疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激素及其他生理因子的反应性。以此为基础，多糖表现出与免疫力相关的多种活性功能，如抗肿瘤、降血糖、抗衰老、促进肝脏和骨髓细胞的蛋白质和核酸的合成、抗炎及抗辐射作用等。近年来，我们通过分离、筛选和纯化，从肉灵芝中分离得到了一株高产胞外多糖的细菌菌株阴沟肠杆菌Z0206。所谓肉灵芝，在民间被称之为"太岁"，据《本草纲目》记载，肉灵芝为本草上品，它是在我国发现的一种天然珍稀物种，即被我国科学界早已认定的一种原生质生命体，确切定名应为"特大型粘菌复合体"。研究表明，菌株阴沟肠杆菌Z0206具有高产多糖的特性，这种细菌多糖以分泌的形式到达胞外，具有产量高、安全、无毒副作用等优点。阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖具有一定的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性。因此，阴沟肠杆菌Z0206细菌多糖制备在抗氧化和抗肿瘤药物及添加剂开发和应用上具有重要的意义和广阔的前景。
发明内容本发明的一种阴沟肠杆菌Z0206，已于2007年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCCNO:2279。分类命名阴沟肠杆菌Enterobactercloacae。一种阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法，依次包括以下步骤-(1)阴沟肠杆菌Z0206菌种活化取出冷冻保存的本发明的阴沟肠杆菌Z0206菌种，室温放置lh后，接种到灭菌PDA加富固体培养基上,28i:32。C培养36h48h，再次转接到PDA加富固体培养基上，28。C32。C培养36h48h，得到活化菌种；(2)将活化好的菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，28。C32。C往复振荡培养，培养时间18h20h，得到发酵罐发酵种子液，发酵罐内加入70%发酵培养基，12rC蒸汽灭菌20min，接种种子液，发酵时间48h72h，得到含有阴沟肠杆菌Z0206多糖的发酵液；(3)发酵液于6(TC70。C浓縮至原体积的1/10，再8(TC9(TC水浴lh1.5h，5000rpm离心10min15min，收集上清液，加入35倍体积预冷的95%乙醇，4。C静置12h后，5000rpm离心10min15min，沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，离心，沉淀真空干燥，即得到粗多糖粉末；(4)蛋白酶处理将步骤(3)得到的粗多糖溶解于20倍体积的热的蒸馏水中，用Na2C03调pH至7.09.0，加入0.25%1%胰蛋白酶(w/v)，55°C水解12h后，用草酸调pH至5.05.7，然后加入0.25%1%木瓜蛋白酶(w/v)，65。C70。C水解2h3h后，于100。C水浴加热56min，以终止酶反应；(5)三氯乙酸法脱蛋白取步骤(4)后得到的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7.0，加入2%4%三氯乙酸(w/v)，室温下磁力搅拌lh后，11000rpm离心1015min，取上清；(6)Sevag法脱蛋白向步骤(5)取得的上清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡，混合2030min，充分静置分层，4000rpm离心5min，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用35倍体积预冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤两次，真空干燥，得到脱蛋白多糖；(7)脱色将经步骤(6)脱蛋白后的多糖配成0.5%多糖溶液，用氨水调pH至8.0，在50卩下滴加20%的11202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7.0;自来水透析23d，再蒸馏水透析23d后，加入35倍体积预冷的95%乙醇沉淀，4。C静置12h后，5000rpm离心10min15min，沉淀真空干燥，得多糖精品。所述步骤(1)和(2)中，PDA加富培养基的配方为马铃薯20%，蛋白胨0.20.5%，酵母浸膏0.3%，葡萄糖2%，琼脂粉1.6%;发酵培养基的配方为蔗糖2.5%，酵母浸膏0.5%，蛋白胨0.5°/。，K2HPO40.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。所述步骤(2)中，摇瓶发酵条件为接种量35环，往复振荡冲程410cm，振荡频率200250rpm。所述步骤(2)中，发酵罐发酵条件为接种量3%，pH为7.0，温度3(TC，通气量为0.250.75vvm，机械搅拌转速200300rpm，每12h向发酵罐补充1%3%的葡萄糖。所述步骤(6)中的Sevag试剂的配方为，氯仿和正丁醇的体积比为4:1。一种阴沟肠杆菌Z0206多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。一种阴沟肠杆菌Z0206多糖在制备抗肿瘤药物和抗病毒药物中的应用。本发明的优点(1)采用苯酚-硫酸法和凯氏定氮法测定阴沟肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量。测定结果显示粗多糖中多糖、蛋白质含量分别为68.02%、28.41%;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为99.6%和0.03%。结果表明，上述提取多糖的生产过程简单，产品产量和纯度较高。(2)阴沟肠杆菌Z0206多糖可显著提高免疫低下小鼠淋巴细胞增殖能力以及细胞因子水平，对免疫低下小鼠的免疫功能具有显著的调节作用。(3)阴沟肠杆菌Z0206多糖对由环磷酰胺所致的氧化损伤有明显的拮抗作用，可以显著提高机体抗氧化酶活性，增强机体抗氧化防御系统的功能，防止有害自由基对细胞内生物大分子的损伤。具体实施例方式以下结合具体实例对本发明的技术方案做进一步说明实施例l、阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法(1)菌种活化PDA加富培养基配方如下马铃薯20%，蛋白胨0.3%，酵母浸膏0.3%，葡萄糖2%，琼脂粉1.6%。培养用的平板及PDA加富培养基12rC灭菌20min，在无菌室倒平板，待培养基冷却凝固之后，取冷冻保存的阴沟肠杆菌Z0206菌种，用接种环接种于PDA加富培养基平板上，3(TC培养2d，重复操作一次，得到活化的阴沟肠杆菌Z0206菌种。(2)阴沟肠杆菌Z0206多糖发酵液的制备向250ml三角瓶中加入70ml上述PDA加富液体培养基，12rC灭菌20min，向培养基中接种5环活化菌种后放置于摇床中30"C振荡培养，往复振荡的冲程4-10cm，振荡频率200rpm，培养18h后得到发酵罐种子液。发酵罐内加入70%发酵培养基(发酵培养基的配方为蔗糖2.5%，酵母浸膏0.5%,蛋白胨0.5%，K2HPO40.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%)，121"C蒸汽灭菌20min，接种种子液，接种量3%，发酵条件为pH为7.0、温度30°C、通气量为0.5vvm、机械搅拌转速200rpm，每12h向发酵罐补充1%葡萄糖，发酵时间48h，得到含有阴沟肠杆菌Z0206多糖的发酵液。(3)阴沟肠杆菌Z0206多糖的分离提取a.粗多糖的提取发酵液用旋转蒸发仪，于6(TC将其浓縮为原体积的1/10，9(TC水浴lh，5000rpm离心15min,收集上清液，用磁力搅拌器边搅拌边向上清液中缓缓加入3倍体积的冷无水乙醇，放入4t:冰箱沉淀过夜，然后5000rpm离心15min，沉淀依次用预冷的丙酮和无水乙醚洗涤，离心，最后将沉淀置于真空干燥器中干燥，得到粗多糖粉末。b.蛋白酶处理取粗多糖10g溶于200mL蒸馏水中(稍加热促溶)，用Na2C03调PH值至8.0，加胰蛋白酶0.5g，55'C水解2h后，用草酸调PH值至5.5，加木瓜蛋白酶0.5g，70'C水解3h后，加热至10(TC，5min终止酶反应。7C.三氯乙酸法脱蛋白取200mL的蛋白酶处理液，用草酸调PH值至7.0，加入8g三氯乙酸，用磁力搅拌器搅拌lh，11000rpm离心10min，取上清。d.Sevag法脱蛋白取上述上清液中，加入1/3体积的Sevag试剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)，充分振荡，混合25min，充分静置分层，4000rpm离心5min，重复数次直至两相界面无变性蛋白出现为止。然后用3倍体积预冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤两次，真空干燥，得到脱蛋白多糖。e.脱色将脱蛋白后的多糖配成0.5%的多糖溶液，用氨水调PH值至8.0，在50'C下滴加20%的11202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7.0。自来水透析48h，蒸馏水透析48h后，加入3倍体积预冷得95%乙醇，4"C静置12h后，5000rpm离心10min，沉淀真空干燥，得多糖精品。实施例2、应用苯酚-硫酸法检测阴沟肠杆菌Z0206多糖中多糖含量方法如下准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，吸取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、l.Oml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml分别加水补至2.0ml，然后加入6.0%苯酚l.Oml和浓硫酸5.0ml，静置10min，摇匀，30min水浴，20min后于490nm测定光密度，以2.0ml水按同样操作为空白，横坐标x为多糖含量，纵坐标y为光密度值，绘制标准曲线。吸取样品液1.0ml(相当于40吗左右的多糖)，按上述步骤操作，测定光密度，以标准曲线计算多糖含量。实施例3、应用凯氏定氮法测定阴沟肠杆菌Z0206多糖中蛋白质含量。采用国家标准规定的凯氏定氮法(GB/T5009.5-1985)测定阴沟肠杆菌Z0206多糖中蛋白质含量。实施例2和实施例3:采用苯酚-硫酸法和凯氏定氮法测定阴沟肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量。测定结果显示粗多糖中多糖、蛋白质含量糖精品中多糖、蛋白质含量分别为99.6%和0.03%。结果表明，上述提取多糖的生产过程简单，产品产量和纯度较高。实施例4、阴沟肠杆菌Z0206多糖免疫调节活性及抗氧化活性研究。取ICR小鼠40只(雌雄各半)，随机分为对照组(I)、环磷酰胺组UI)、环磷酰胺+多糖组(III)和多糖组(IV)，I、1I组每天灌胃生理盐水0.4mL，III、IV组每天灌胃多糖0.4mL(400mg/kg体重)，II、11I组在第12d腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg体重)诱导免疫低下，试验期14d，在试验的第10天，所有的试验鼠腹腔注射0.2mL10n/。的SRBC进行免疫。于最后一次给药后12小时，颈椎脱臼处死小鼠，取样进行以下指标分析。1、采集脾脏，MTT法进行脾脏淋巴细胞增殖试验，测定T/B淋巴细胞增殖效果试验结束后，处死小鼠，用75%酒精浸泡5min，取脾脏(无菌操作)，置于Hank，S液中于200目网中研磨，无菌制备成单细胞悬液，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2xl06/ml，96孔细胞培养板每孔分别加入不同处理的小鼠脾细胞悬液90pL，50昭/mL的ConA液10pL或100jig/mL的LPS液10pL，对照孔加入90pL的脾细胞悬液和lOpLRPMI-1640培养液，置5%C02，37°C细胞培养箱静置培养，于培养第68h，取出培养板，每孔加入MTT(0.4%)10pL,继续培养4h后每孔加入10(^LDMSO，用平板摇床摇匀，紫色结晶完全溶解后用酶联免疫检测仪(BIO-RAD)于570nm处测OD值。2、采集血样制备血清，采用ELISA方法试剂盒测定血清中细胞因子IL-2和TNF-a含量。采集肝脏样本，制备10%肝脏匀浆，采用试剂盒测定肝脏中SOD和GSH-Px活性。试验结果如下表所示表1为阴沟肠杆菌Z0206多糖对ICR小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响；表2为阴沟肠杆菌Z0206多糖对ICR小鼠血清细胞因子IL-2和TNF-a含量的影响；表3为阴沟肠杆菌Z0206多糖对ICR小鼠肝脏中SOD和GSH-Px活性的影响。9表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注同列上标字母不同表示差异显著(p<0.05).与对照组相比，小鼠腹腔注射环磷酰胺后，ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖率和LPS诱导的B淋巴细胞增殖率分别降低32.16%(/<0.05)和43.37%(;^0.05);与环磷酰胺单独作用组相比，小鼠经400mg/kg多糖预防性灌胃再腹腔注射环磷酰胺，ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖率和LPS诱导的B淋巴细胞增殖率分别提高10.14%(p<0.05)和22.68%(/<0.05)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注同列上标字母不同表示差异显著(p<0.05).与对照组相比，小鼠腹腔注射环磷酰胺后，血清中IL-2和TNF-a水平分别降低40.04%(p<0.05)和47.41%(pO.05);与环磷酰胺作用组相比，小鼠经400mg/kg多糖预防性灌胃再腹腔注射环磷酰胺，血清中TNF-a水平提高34.30%(;<0.05);与对照相比，单独灌胃400mg/kg的多糖组血清中TNF-a水平提高7.84%，但差异不显著(p>0.05)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注同列上标字母不同表示差异显著(pO.05).与对照组相比，小鼠腹腔注射环磷酰胺后，肝脏中SOD和GSH-Px活性分别降低7.14%(;<0.05)和18.64%(/K0.05);与环磷酰胺作用组相比，小鼠经400mg/kg多糖预防性灌胃再腹腔注射环磷酰胺，肝脏中SOD和GSH-Px活性分别提高6.61%(p<0,05)和22.38%(;O.05);与对照相比，单独灌胃400mg/kg的多糖组肝脏SOD活性提高7.49%(/<0.05)。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。权利要求1、一种阴沟肠杆菌，其特征在于该阴沟肠杆菌为阴沟肠杆菌Z0206CGMCCNO2279。2、一种阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法，其特征依次包括以下步骤(1)阴沟肠杆菌Z0206菌种活化取出冷冻保存的如权利要求1所述阴沟肠杆菌Z0206菌种，室温放置lh后，接种到灭菌PDA加富固体培养基上，28。C32。C培养36h48h，再次转接到PDA加富固体培养基上，28。C32。C培养36h48h，得到活化菌种；(2)将活化好的菌种，接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，28'C32'C往复振荡培养，培养时间18h20h，得到发酵罐发酵种子液，发酵罐内加入70%发酵培养基，12rC蒸汽灭菌20min，接种种子液，发酵时间48h72h，得到含有阴沟肠杆菌Z0206多糖的发酵液；(3)发酵液于60。C7(TC浓缩至原体积的1/10，再80。C9(TC水浴lh1.5h，5000rpm离心10min15min，收集上清液，加入35倍体积预冷的95%乙醇，4。C静置12h后，5000rpm离心10min15min，沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，离心，沉淀真空干燥，即得到粗多糖粉末；(4)蛋白酶处理将步骤(3)得到的粗多糖溶解于20倍体积的热的蒸馏水中，用Na2C03调pH至7.09.0，加入0.25%1%胰蛋白酶(w/v)，55'C水解l2h后，用草酸调pH至5.05.7，然后加入0.25%1%木瓜蛋白酶(w/v)，65。C70。C水解2h3h后，于100。C水浴加热56min，以终止酶反应；(5)三氯乙酸法脱蛋白取步骤(4)后得到的蛋白酶处理液，用草酸调pH值至7.0，加入2%4%三氯乙酸(w/v)，室温下磁力搅拌lh后，11000rpm离心1015min，取上清；(6)Sevag法脱蛋白向步骤(5)取得的上清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡，混合2030min，充分静置分层，4000rpm离心5min，重复操作数次至两相界面不再出现蛋白沉淀；然后用35倍体积预冷的95%乙醇醇析，所得的沉淀再依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤两次，真空干燥，得到脱蛋白多糖。(7)脱色将经步骤(6)脱蛋白后的多糖配成0.5%多糖溶液，用氨水调pH至8.0,在5(TC下滴加20。/。的H202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7.0;自来水透析23d，再蒸馏水透析23d后，加入35倍体积预冷的95%乙醇，4。C静置12h后，5000rpm离心10min15min，沉淀真空干燥，得多糖精品。3、根据权利要求2所述的阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法，其特征在于所述步骤(1)和(2)中，PDA加富培养基的配方为马铃薯20%，蛋白胨0.20.5%，酵母浸膏0.3%，葡萄糖2%，琼脂粉1.6%;发酵培养基的配方为蔗糖2.5%，酵母浸膏0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.2°/。，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。4、根据权利要求2所述的阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，摇瓶发酵条件为接种量3%，往复振荡冲程410cm，振荡频率200250rpm。5、根据权利要求2所述的阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，发酵罐发酵条件为接种量3%，pH为7.0，温度3(TC，通气量为0.250.75vvm，机械搅拌转速200300rpm，每12h向发酵罐补充1%3%的葡萄糖。6、根据权利要求2所述的阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法，其特征在于所述步骤(6)中的Sevag试剂的配方为，氯仿和正丁醇的体积比为4:1。7、一种如权利要求2所述阴沟肠杆菌Z0206多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。8、一种如权利要求2所述阴沟肠杆菌Z0206多糖在制备抗肿瘤药物和抗病毒药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种阴沟肠杆菌Z0206，已于2007年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO2279；还公开了一种阴沟肠杆菌Z0206多糖的制备方法和多糖的应用。本发明的优点本发明提取多糖的生产过程简单，产品产量和纯度较高；阴沟肠杆菌Z0206多糖可显著提高免疫低下小鼠淋巴细胞增殖能力以及细胞因子水平，对免疫低下小鼠的免疫功能具有显著的调节作用；阴沟肠杆菌Z0206多糖对由环磷酰胺所致的氧化损伤有明显的拮抗作用，可以显著提高机体抗氧化酶活性，增强机体抗氧化防御系统的功能，防止有害自由基对细胞内生物大分子的损伤。文档编号A61P31/00GK101440355SQ20081012131公开日2009年5月27日申请日期2008年10月6日优先权日2008年10月6日发明者徐春兰,汪以真,羊雪芹,靳明亮申请人:浙江大学