排污口水体中阴沟肠杆菌的多重pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，通过阴沟肠杆菌抗体溶液制备和免疫磁珠溶液制备，将待测水样中用免疫磁珠溶液富集，得到阴沟肠杆菌富集的待检样品溶液，然后用DNA提取试剂盒提取DNA模板，再通过多对引物的PCR检测，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个目的基因片段，则水样中含有阴沟肠杆菌；该方法水样中阴沟肠杆菌富集程度高，利于检测，检测灵敏，多对引物同时检测，准确性高。
【专利说明】排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法
【技术领域】[0001]本发明涉及细菌的PCR检测技术，具体涉及排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]阴沟肠杆菌iBnterobacter cloacae)是肠杆菌属的成员之一,该菌为革兰阴性粗短杆菌，广泛存在于自然界中，在人和动物的肠道、粪便水、泥土、植物中均可检出，阴沟肠杆菌已成为医院感染越来越重要的病原菌。因此排污口水体中阴沟肠杆菌的检测就可以反应该城镇的居民感染阴沟肠杆菌的状况。多重PCR技术针对多个DNA模板或者同一模板的不同区域进行扩增的过程，可一次扩增多个靶基因或基因片段，使检测的准确性更高。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，该方法对排污口水体中的阴沟肠杆菌进行富集，并用多对引物同时检测，检测灵敏度高，准确性高。
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，其步骤如下:
a、阴沟肠杆菌抗体溶液制备:挑取阴沟肠杆菌单个菌落接种于由胰蛋白酶酶解的酪蛋白大豆液-琼脂液体培养基(TSBA)中，震荡培养过夜，7000~8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水水洗I次，再用生理盐水悬浮，加入质量百分浓度为0.5%~1%的甲醛过夜；次日7000~8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水洗3次，并用生理盐水分别配成浓度为IO7~IO9 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液和浓度为101° cfu /ml阴沟肠杆菌菌液，将浓度为IO7~IO9 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，间隔一周，用浓度为IO7~IO9 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用浓度为101° cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加强免疫，加强免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C下温育0.5h，4°C下3000转/分离心15min，得上清，该上清为阴沟肠杆菌抗体溶液；
b、免疫磁珠溶液制备:取100~200μ I羧基磁珠置于离心管中，加入500 μ L活化缓冲液，在漩涡振荡器上混合均匀，将离心管放置于磁分离架上，待纳米磁珠完全被吸附于离心管壁，移出管中液体，用活化缓冲液洗涤纳米磁珠一次，洗涤后在离心管中加入活化缓冲液500μ 1、碳二亚胺0.5mg和N-羟基琥珀酰亚胺lmg，在漩涡振荡器上混合均匀，室温下活化20 min，移出管中液体，得到活化磁珠，用偶联缓冲液洗涤活化磁珠二次，洗涤后在离心管中加入浓度为6 mg/ml的上述阴沟肠杆菌抗体溶液15 μ 1，室温下反应3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶联缓冲液洗涤免疫磁珠二次，然后加入含有质量百分浓度I %牛血清白蛋白(BSA)的偶联缓冲液500 μ I封闭免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化缓冲液为PH为6.0含有吐温-20 (Tween-20)的NaH2PO4溶液，所述偶联缓冲液为pH为7.4含有吐温-20的NaH2PO4溶液，所述活化缓冲液和所述偶联缓冲液中，NaH2PO4浓度为0.01M,吐温-20的质量百分浓度为0.05% ；
C、待测样品富集:取排污口水样2ml于试管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室温轻缓旋转振荡30min，移出试管中液体，用磷酸缓冲液洗涤免疫磁珠3~5次，洗涤后加入
0.5ml无菌水，将试管置于磁性细胞分离架上磁性分离3min，取出免疫磁珠，得到阴沟肠杆菌富集的待检样品溶液；
d、DNA模板制备:待检样品溶液用DNA提取试剂盒提取DNA，得到DNA模板，具体提取依DNA提取试剂盒说明书进行；
e、PCR检测:30μ I的PCR反应体系为:10 XPCR缓冲液2.5 μ 1，浓度25mM的MgCl2液
1.5 μ 1，浓度IOmM的dNTP液1.5 μ 1，浓度5U/ μ I的T aq DNA聚合酶0.2 μ 1，浓度都为10 μ M 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R, Slt-F、Slt-R 各 1.0 μ 1，上述DNA模板2 μ 1，余量为双蒸水；PCR反应条件为94° C变性5 min, 94° C变性45s，55° C退火45s，72° C延伸lmin，35个循环，72° C延伸10 min ;PCR反应产物用质量百分浓度1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个目的基因片段，则排污口水体中含有阴沟肠杆菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列为:AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物 irp2_R 的核苷酸序列为:AACTCCTGAT ACAGGTGGC,所述引物FhuA-F的核苷酸序列为:CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA-R的核苷酸序列为:TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB-F的核苷酸序列为:ACCACCAGGCGTATGTCACT AA,所述引物SodB-R的核苷酸序列为:TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,所述引物SI t-F的核苷酸序列为:CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物SI t_R的核苷酸序列为:TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。
[0005]上述引物是根据阴沟肠杆菌的基因组序列，应用primer Express 3.0软件设计并筛选得到，引物由上海生工合成。
[0006]与现有技术相比，本发明的优点在于排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，通过阴沟肠杆菌抗体溶液制备和免疫磁珠溶液制备，将待测水样中用免疫磁珠溶液富集，得到阴沟肠杆菌富集的待检样品溶液，然后用DNA提取试剂盒提取DNA模板，再通过多对引物的PCR检测，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个目的基因片段，则水样中含有阴沟肠杆菌；该方法水样中阴沟肠杆菌富集程度高，利于检测，检测灵敏，多对引物同时检测，准确性高。
【具体实施方式】
[0007]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0008]实施例1
阴沟肠杆菌抗体溶液制备:挑取阴沟肠杆菌(ATCC 13047)单个菌落接种于TSBA液体培养基(购于上海生工)中震荡培养过夜，7000~8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水水洗I次，再用生理盐水悬浮，加入质量百分浓度为0.5%~1%的甲醛过夜；次日7000~8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水洗3次，并用生理盐水分别配成浓度为IO7~IO9 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液和浓度为IO7~IO9 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液，将浓度为IO7~IO9 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，间隔一周，用浓度为IO7~IO9 Cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用浓度为101°cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加强免疫，加强免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C下温育0.5h，4°C下3000转/分离心15min，得上清，该上清为阴沟肠杆菌抗体溶液待用；
免疫磁珠溶液制备:取浓度为30mg /ml纳米磁珠液100~200 μ I置于离心管中，再加入活化缓冲液500 μ I，在漩涡振荡器上混合均匀，将离心管放置于磁分离架上，待纳米磁珠完全被吸附于离心管壁，移出管中液体，用活化缓冲液洗涤纳米磁珠一次，洗涤后在离心管中加入活化缓冲液500μ 1、碳二亚胺0.5mg和N-羟基琥珀酰亚胺lmg，在漩涡振荡器上混合均匀，室温下活化20 min，移出管中液体，得到活化磁珠，用偶联缓冲液洗涤活化磁珠二次，洗涤后在离心管中加入偶联缓冲液485 μ I和浓度为6 mg/ml的上述阴沟肠杆菌抗体溶液15μ 1，室温下反应3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶联缓冲液洗涤免疫磁珠二次，然后加入含有质量百分浓度1% BSA的偶联缓冲液500 μ I封闭磁珠30min，得到免疫磁珠溶液待用；上述活化缓冲液为PH 6.0、含有质量百分浓度为0.05%的Tween-20、浓度0.01M的NaH2PO4溶液，上述偶联缓冲液为pH 7.4、含有质量百分浓度为0.05%Tween-20、浓度为
0.01M 的 NaH2PO4 溶液；
待测样品富集:取宁波市象山县象山港排污口水样2ml于试管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室温轻缓旋转振荡30min，移出试管中液体，用磷酸缓冲液洗涤免疫磁珠3~5次，洗涤后加入0.5ml无菌水，将试管置于磁性细胞分离架上磁性分离3min，取出免疫磁珠，得到阴沟肠杆菌富集的待检样品溶液；
DNA模 板制备:待检样品溶液用DNA提取试剂盒(购于上海生工)提取DNA，得到DNA模板，具体提取依DNA提取试剂盒说明书进行；
PCR检测:30μ1的PCR反应体系为:10XPCR缓冲液2.5 μ 1，浓度25mM的MgCl2液
1.5 μ 1，浓度IOmM的dNTP液1.5 μ 1，浓度5U/ μ I的T aq DNA聚合酶0.2 μ 1，浓度都为10 μ M 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R, Slt-F、Slt-R 各 1.0 μ 1，上述DNA模板2 μ 1，余量为双蒸水；PCR反应条件为94° C变性5min，94° C变性45s，55° C退火45s，72° C延伸lmin，35个循环，72° C延伸10 min ;PCR反应产物用质量百分浓度1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个基因片段，排污口水体中含有阴沟肠杆菌，引物irp2-F的核苷酸序列为:AAGGATTCGCTGTTACCGGA C，引物 irp2_R 的核苷酸序列为:AACTCCTGAT ACAGGTGGC,引物 FhuA-F 的核苷酸序列为:CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，引物FhuA-R的核苷酸序列为:TTGAGGTCGTGGCGTAATCG T，引物 SodB-F 的核苷酸序列为:ACCACCAGGC GTATGTCACT AA，引物 SodB-R的核苷酸序列为:TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,引物Slt-F的核苷酸序列为:CGCAGCCGCTACGCACAAAT，引物 Slt-R 的核苷酸序列为:TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。
[0009]实施例2
与实施例1基本相同，所不同的只是排污口水样取自于宁波市奉化江江东排污口，PCR检测后，得到816bp基因片段，排污口水体中未含有阴沟肠杆菌。
[0010]实施例3
与实施例1基本相同，所不同的只是排污口水样取自于宁波市奉化江海曙排污口，PCR检测后，得到1216bp基因片段，排污口水体中未含有阴沟肠杆菌。[0011]实施例4
与实施例1基本相同，所不同的只是排污口水样取自于宁波市甬江江东排污口，得到816bp、502bp 二个基因片段，排污口水体中未含有阴沟肠杆菌。
[0012]实施例5
与实施例1基本相同，所不同的只是排污口水样取自于定波市甬江江北排污口，得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个基因片段，排污口水体中含有阴沟肠杆菌。
[0013]实施例6:特异性和 灵敏性
与实施例1的DNA模板制备和PCR检测基本相同，所不同的只是直接用阴沟肠杆菌(ATCC 13047)，和阴沟肠杆菌接近的荧光假单胞菌(ATCC 13525)，迟缓爱德华菌(ATCC15947)、大肠杆菌(ATCC25922)进行DNA模板制备和PCR检测，只是阴沟肠杆菌得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个目的基因片段，另外3种其它细菌仍只得到1_2个基因片段，说明特异性高。阴沟肠杆菌DNA模板浓度梯度l-100ng，分别用PCR检测，检测限为(100cfu/ml,说明灵敏性强。
【权利要求】
1.排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，其特征在于步骤如下：a、阴沟肠杆菌抗体溶液制备：挑取阴沟肠杆菌单个菌落接种于由胰蛋白酶酶解的酪蛋 白大豆液_琼脂液体培养基中，震荡培养过夜，7000?8000转/分下离心5分钟，沉淀用 生理盐水水洗1次，再用生理盐水悬浮，加入质量百分浓度为0. 5%?1%的甲醛过夜；次日 7000?8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水洗3次，并用生理盐水分别配成浓度为 107?109 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液和浓度为101Q cfu /ml阴沟肠杆菌菌液，将浓度为107? 109 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，间隔一周，用浓度为107? 109 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用浓度为1(T cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加强免疫，加强免疫后第四天，摘除小鼠眼 球取血，血液置于37°C下温育0. 5h，4°C下3000转/分离心15min，得上清，该上清为阴沟 肠杆菌抗体溶液；b、免疫磁珠溶液制备：取100?200yl羧基磁珠置于离心管中，加入500 u L活化缓 冲液，在漩涡振荡器上混合均匀，将离心管放置于磁分离架上，待纳米磁珠完全被吸附于离 心管壁，移出管中液体，用活化缓冲液洗涤纳米磁珠一次，洗涤后在离心管中加入活化缓冲 液500ia、碳二亚胺0. 5mg和N-羟基琥珀酰亚胺lmg，在漩涡振荡器上混合均匀，室温下活 化20 min，移出管中液体，得到活化磁珠，用偶联缓冲液洗涤活化磁珠二次，洗涤后在离心 管中加入浓度为6 mg/ml的上述阴沟肠杆菌抗体溶液15 yl，室温下反应3 h，抽掉上清液， 得到免疫磁珠，用偶联缓冲液洗涤免疫磁珠二次，然后加入含有质量百分浓度1 %牛血清白 蛋白的偶联缓冲液500 u 1封闭免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化缓冲液为pH 为6. 0含有吐温-20的NaH2P04溶液，所述偶联缓冲液为pH为7. 4含有吐温_20的NaH2P04 溶液，所述活化缓冲液和所述偶联缓冲液中，NaH2P04浓度为0. 01M，吐温-20的质量百分浓 度为0. 05% ；c、待测样品富集：取排污口水样2ml于试管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室温 轻缓旋转振荡30min，移出试管中液体，用磷酸缓冲液洗涤免疫磁珠3?5次，洗涤后加入，0.5ml无菌水，将试管置于磁性细胞分离架上磁性分离3min，取出免疫磁珠，得到阴沟肠杆 菌富集的待检样品溶液；d、DNA模板制备：待检样品溶液用DNA提取试剂盒提取DNA，得到DNA模板，具体提取依 DNA提取试剂盒说明书进行；e、PCR检测：30iil的PCR反应体系为：10XPCR缓冲液2.5 yl，浓度25mM的MgCl2液，1.5u 1，浓度10mM的dNTP液1. 5 y 1，浓度5U/ yl的T aq DNA聚合酶0. 2 y 1，浓度都为 10 uM 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R、Slt_F、Slt-R 各 1. 0 y 1， 上述DNA模板2 iil，余量为双蒸水；PCR反应条件为94° C变性5 min,94° C变性45s， 55° C退火45s，72° C延伸lmin，35个循环，72° C延伸，10 min ;PCR反应产物用质量百 分浓度1. 4%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和，1216bp 四个目的基因片段，则排污口水体中含有阴沟肠杆菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列为： AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物 irp2_R 的核苷酸序列为：AACTCCTGAT ACAGGTGGC, 所述引物FhuA-F的核苷酸序列为：CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA-R的核 苷酸序列为：TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB_F的核苷酸序列为：ACCACCAGGC GTATGTCACT AA,所述引物SodB-R的核苷酸序列为：TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,所述引物SI t-F的核苷酸序列为:CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物SI t_R的核苷酸序列为:TCGGTTACAT CGC TACCCAT CA。
【文档编号】C12Q1/68GK103540666SQ201310496295
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】苏秀榕, 周君, 张春丹, 李晔, 王中华, 李春丽, 张迪骏, 何伟娜 申请人:宁波大学