专利名称：：催产素的抑制剂与促进剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及催产素的抑制剂与促进剂，具体涉及CD13/APN的特异性抑制剂在制备阻断催产素降解的药物的应用和CD13/APN用于降解催产素的内源性生物药物的应用。
背景技术：
：流产是指妊娠不到28周，胎儿体重不足1000克而中止者。当自然流产连续发生3次以上时则称为"习惯性流产"。根据统计，其实人类的妊娠大约有70%是不成功的，其中50%左右的受精卵在下次月经来潮之前就发生了所谓的"临床前流产"。这种流产可能仅仅被认为是一次血量偏多的正常月经或延期月经，仅有20%左右的自然流产会被患者感觉到或被医生确诊出来。真正能够发育成熟的正常分娩者仅占人类妊娠的l/4左右，由此可见，人类流产的发生率相当高。奶牛的流产发生率一般为10%左右。根据流产的原因，流产分为传染性流产和非传染性流产两大类。大多数流产属于非传染性流产。非传染性流产根据流产的原因可分为营养性流产、中毒性流产、损伤性流产、药物性流产、症状性流产。根据流产胎儿的月龄及变化，流产一般分以下几种类型隐性流产、小产、干胎、死胎、胎儿浸溶、胎儿腐败。催产素(Oxytocin)止孕的机理主要在于诱发、促进子宫收縮。催产素与流产有关，但催产素的半衰期只有1.52分钟；催产素由于半衰期短，故不是一种比较理想的终止早孕的药物(参见文献NeuroendocrinologyinPhysiologyandMedicinebyP.MichaelConn,MarcE.Freeman;1999，Pagel79)。米非司酮和前列腺素类药物流产的机理也主要在于诱发宫縮。催产素由于其半衰期短，故不是一种比较理想的终止早孕的药物。N端氨基酶(Aminop印tidaseN，简称为APN),又称为CD13(本文以下称为CD13/APN)。主要分布于肺、肠、肾、子宫的上皮/内膜细胞、纤维母细胞及中性粒细胞(参见文献XuYetal.Antitumoractivityofactinonininvitroandinvivo.ClinCancerRes1998;4:171-176)。F23是抗CD13/APN单克隆抗体(鼠源性)，己知F23作用于CD13/APN活性点。CD13/APN主要是通过其N端酶学功能来调控某些活性信号蛋白，它可以灭活或激活某种多肽或蛋白，70y。的白血病细胞表达这种CD13/APN。曾有人用F23作为抗肿瘤剂，如用于治疗白血病等(参见文献XuY,ScheinbergDA.,Eliminationofhumanleukemiabymonoclonalantibodiesinanathymicnudemouseleukemiamodel.ClinCancerRes1995;1:1179-1187)。已有人发现，某些外源性小分子化合物也可作为CD13/APN抑制剂(参见文献XuY,WellnerD，ScheinbergDA.CrypticandregulatoryepitopesinCD13/aminop印tidaseN.ExpHematol1997;25:521-529)。这些小分子化合物包括商品名为Actinonin、Amastatin、Bestatin和Probestin等的药物。目前已知一些体内自然物质包含P物质(SubstanceP)、舒缓激肽(Bradykinin)也是CD13/APN的内源性或自然性特异性抑制剂(参见文献XuYetal.SubstancePandbradykininarenaturalinhibitorsofCD13/aminopeptidaseN.BiochemBiophyResCommun1995;208:664-674)。但未见用CD13/APN的特异性抑制剂在制备阻断催产素降解的药物和将CD13/APN用于降解催产素的内源性生物药物的报道。
发明内容本发明的目的是利用CD13/APN的特异性抑制剂对催产素降解的阻断作用，提供一类新型作用机理的动物流产促进剂；并且利用CD13/APN对催产素降解作用从而提供一类新型的动物流产抑制剂。本发明的技术方案是(1)选择可与CD13/APN特异性结合的抑制剂，从而阻断催产素降解，以产生人工流产；(2)由于体内催产素的半衰期只用1.52分钟，这样通过静脉注射CD13/APN或局部应用CD13/APN就可能很快地将催产素降解并预防催产素在血中的浓度升高，即可以预防流产的发生。所述可与CD13/APN特异性结合的抑制剂包括F23、Actinonin、Amastatin、Bestatin和Probestin等外源性小分子化合物以及SubstancePandbradykinin等内源性小分子化合物。以上所述这些药物可称之为CD13/APN特异性抑制剂。上述外源性小分子化合物的化学名称是Actinonin:(3_[[l-[(2-(Hydroxymethyl)-l-pyrrolidinyl)carbonyl]-2-methyipropyl]carbamoyl]octanohydrox柳icacid)Amastatin:((2S,3R)_3-Amino_2-hydroxy-5-methylhexanoyl-Val-Val-Asphydrochloride)Bestatin:(N-[(2S,3R)_3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutyryl]-L-leucinehydrochloride)上述内源性小分子化合物的化学名称是SubstanceP(P物质)Arg-Pro-Lys-Pro-Gin-Gin-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2Bradykinin(舒缓激肽)Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-NH2本发明进行了如下实验先将F23单抗及本发明所述的小分子化合物分别加入HL60(CD13/APN阳性人类细胞株)细胞培养液中，然后加入催产素，发现本发明提供的这些CD13/APN抑制剂能有效地保护催产素不受降解。反之，如果先将催产素加入HL60细胞株中，然后再加入F23单抗，则F23与HL60的结合率减少了9193%。本发明提示催产素与F23是同一结合点。以上实验证实1.CD13/APN是催产素降解的酶。当CD13/APN进入体内后，可降低催产素浓度，从而防止流产，可作为流产抑制剂的药物。2.小分子化合物(CD13/APN酶抑制剂)及催产素的结合点与F23是同一位点，均可结合至CD13/APN。3.F23和CD13/APN酶抑制剂都能阻断CD13/APN对催产素的降解，使催产素半衰期延长，可作为流产促进剂的药物。本发明提供的CD13/APN抑制剂能有效阻断催产素的降解，从而提高其血液及局部的浓度。本发明提供的CD13/APN可作降解催产素的酶，可为一类新型的预防或治疗流产的内源性生物药物。具体实施例方式名词介绍HL60:CD13/APN阳性人类细胞株，CD33也为阳性。CD33是一种人类细胞表面受体，分子量67000Da,分布于70%白血病细胞，在本发明实验中CD33作为CD13/APN的对照受体。5RAJI:CD13/APN阴性人类细胞株。F23:抗CD13/APN单克隆抗体(鼠源性)。M195:抗CD33单克隆抗体(鼠源性)。Actinonin:CD13/APN活性抑制剂，与F23竞争CD13/APN活性点(参见文献XuY，WellnerD，ScheinbergDA.CrypticandregulatoryepitopesinCD13/aminop印tidaseN.ExpHematol1997;25:521—9)。GAM-FITC:羊抗鼠荧光抗体，用于检测鼠抗体的含量，常用于流式细胞检测法中。实验材料来源HL60、RAJI购买于美国ATCC组织；M195、F23、CD13/APN、GAM-FITC由SCHE扁ERG赠送；催产素、CD13/APN酶抑制剂购买于美国Sigma公司。实施例1F23和Actinonin、SubstanceP、Bradykinin阻断CD13/APN阳性细胞株降解催产素1.实验方法将F23，Actinonin、SubstanceP、Bradykinin及M195分别加入HL60细胞培养液(RPMI)中3060分钟，然后加入催产素(lOOnM)，5分钟后检测催产素浓度。2.实验结果表1人类CD13/APN阳性细胞株对催产素浓度影响的实验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3.结论F23及Actinonin、SubstanceP、Bradykinin可以保护催产素免于CD13/APN降解。并可证明催产素是通过CD13/APN而调节其生理浓度的。实施例2CD13/APN酶抑制剂诱导小白鼠流产和CD13/APN酶阻断小白鼠流产的实验1.实验方法将CD13/APN酶、F23、actinonin、substanceP、bradykinin及M195分别注射入已怀孕的小白鼠静脉中3060分钟，每组10个小白鼠，然后注射催产素(因催产素的半衰期只有1.52分钟)，23天后观察小白鼠流产数。2.实验结果见下表表2CD13/APN酶抑制剂诱导小白鼠流产和CD13/APN酶阻断小白鼠流产的实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.结论CD13/APN酶可阻断或抑制流产；F23、actinonin、substanceP、bradykinin可1000/0诱导流产。实施例3催产素与CD13/APN活性点结合实验1.实验方法在46。C状态下，将催产素或空白加入HL60细胞株中3045分钟，然后再加入F23或M195单抗，继续作用4550分钟，用PBS液洗2次细胞，再加入GAM-FITC,3045分钟，再用PBS液洗2次细胞，用流式细胞仪读取HL60荧光强度。2.实验结果见下表表3催产素与CD13/APN活性点结合实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.结论从表中数据看出，催产素可以阻断F23的结合点，即CD13/ANP活性点。另外，从实验中可以看到，催产素不结合至CD33受体，即不阻断M195结合至CD33受体。这里用CD33受体作为CD13/APN的阴性对照组。从而论证催产素只结合至CD13/APN而且不结合至CD33对照受体。由此证明催产素可以直接结合至CD13/APN的活性点，也即F23的CD13/APN结合点。权利要求1.N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂在制备阻断催产素降解的药物的应用和CD13/APN用于降解催产素的内源性生物药物的应用。2.权利要求1所述的N端氨基酶CD13/APN的特异性抗体抑制剂是抗体F23。3.权利要求1所述的N端氨基酶CD13/APN的外源特异性抑制剂是Actinonin、Amastatin、Bestatin禾卩Probestin。4.权利要求1所述的N端氨基酶CD13/APN的内源特异性抑制剂是P物质、舒缓激肽。5.权利要求1所述的用于降解催产素的内源性生物药物是N端氨基酶CD13/APN。6.权利要求1所述的N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂和N端氨基酶CD13/APN在动物药物流产中和保胎治疗中的应用。全文摘要本发明利用N端氨基酶CD13/APN的特异性抑制剂对催产素降解的阻断作用，提供了一类新型作用机理的对抗催产素降解的药物，可作为流产促进剂；反之，CD13/APN用于降解催产素的内源性生物药物，可作为流产抑制剂，从而预防或治疗自然流产的发生。文档编号A61K39/395GK101612398SQ20081012716公开日2009年12月30日申请日期2008年6月23日优先权日2008年6月23日发明者曦许,洋许申请人:洋许