专利名称：一种分清五淋丸的质量标准及其检验方法
技术领域：
本发明属于中药技术领域，具体说是涉及一种分清五淋丸的质量标准及其检验方法。
背景技术：
分清五淋丸是木通、车前子、黄芩、茯苓、猪苓、黄柏、大黄、篇蓄、瞿麦、知母、泽
泻、梔子、甘草、滑石14味药组成的复方，收载于中国药典2005年版一部。原标准只收载 有显微鉴别和检査项，按照药品注册管理办法中有关仿制产品提高质量标准的要求，参照中 国药典2005年版一部相关品种项下和有关文献资料，进行各项试验摸索后，增加了大黄、 栀子、黄柏、黄芩的薄层鉴别；并对该制剂进行了重金属及砷盐的考察，其测定结果低于常 规限度，同时对处方中木通所含齐墩果酸和常春藤皂苷元进行了含量测定的试验摸索，结果 满意，大大的提高了原标准，使得产品质量更加可控，同时更利于产品工业化生产要求。
发明内容
本发明的目的是公开一种分清五淋丸的质量标准及其检验方法，对处方中木通所含齐墩 果酸和常春藤皂苷元建立了高效液相含量测定方法，同时增加了处方中大黄、梔子、黄柏、 黄芩的薄层鉴别，提高了质量标准，加强了该药的质量可控性，保证了患者服用的有效性， 通过本发明增加的质量控制，有利于本产品的工业化生产的监控。
本发明的目的是由以下技术方案实现的-
一种分清五淋丸的质量标准及其检验方法，其特点在于该方法中的鉴别方法是以下的 一种或几种
a、鉴别
显微鉴别包括下列步骤取分清五淋丸，置显微镜下观察可见车前子、黄芩、茯苓、 猪苓、黄柏、大黄、莴蓄、瞿麦、知母、泽泻、栀子、甘草的显微特征，
大黄的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸O. 5 lg，研细，加甲醇20 40ml，浸泡1 2 小吋，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 20ml使溶解，再加盐酸l 2ml，加热回流30 40分 钟，立即冷却，用乙醚分2 4次振摇提取，每次20 30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三 氯甲烷1 2ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0. 1 0.2g，同法制成对照药 材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制成每lml含1 1.5mg的溶液，作为对照品溶液。照 薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5 10y 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂 的硅胶H薄层板上，以石油醚30 6(TC-甲酸乙酉旨-甲酸(15 20 : 5 7 : 1 1.4)的上层溶液 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色 谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同 的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，阴件对照无对应斑点，
栀子的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸5 10g，研细，加40 70%甲醇50 100ml， 超声处理40 60分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取栀子对照药材l 1.5g,同法制成 对照药材溶液。再取栀子苷对照品，加乙醇制成每lml含4 6mg的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2 5til，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合
剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5 io : 5 io : 1 2 : 1 2)为展开剂，
展开，取出，晾干，喷以5 10%硫酸乙醇溶液，在ll(TC加热至斑点显色清晰，供试品色 谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，
黄柏的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸2 5g，研细，加甲醇25 50ml，加热回流30 40分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取黄柏对照药材10 20rag，加甲醇l 2ml，制成 对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每lral含0.5 lmg的溶液，作为对照 品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1 2y 1，分别点于同一以羧甲基纤维素
钠为黏合剂的硅胶r'薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 15 : 6 15 : 1 2 : 1 2)
为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供 试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，
黄芩的鉴别包括下列歩骤取分清五淋丸5 10g，研细，加乙酸乙酯-甲醇(3 6: l 2)的混合溶液50 100ml，加热回流30 40分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 10ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩对照药材1 1.5g，同法制成对照药材溶 液。再取黄芩素、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每lml各含0.5 lmg的对照品溶液。照薄 层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2 4ul及上述两种对照品溶液各1 2
p i，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸ao 15 : 3 4.5: i i. 5:
2 7.5)为展开剂，预饱和30 40分钟，展丌，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视， 供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相同的位置上，显相同颜色的暗色斑点， b含量测定
齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量测定方法包括下列步骤
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸-三 乙胺80 95 : 20 5 : 0. 02 0. 5 : 0. 01 0. 05为流动相；检测波长为210nm，理论板数按齐 墩果酸峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备；精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成每 lml各含0. 4 0. 7mg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取分清五淋丸，研细，取约10 15g，精密称定，加甲醇50 80ml， 超声处理功率250W，频率50kHz30 40分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液与洗液，回 收溶剂至干，残渣加水10 15 ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3 5次，每次20 30ml，合 并提取液，蒸干，残渣加甲醇20 30 ml、盐酸2 4ml，加热水解4 6小时，水解物加水 10 15ml，用三氯甲烷振摇提取2 4次，每次20 30ml，合并提取液，冋收溶剂至干，残 渣加甲醇溶解并转移至5 10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 20^1 ，注入液相色谱仪，测定， 即得；
分清五淋丸每lg含木通以齐墩果酸(C3。H4803)和常春藤皂苷元(C3。H4804)的总量计，不 得少于0. 20mg;
该方法中的质量标准鉴别a及含量测定b方法是以下方法的一种或几种 a鉴别
显微鉴别取分清五淋丸，置显微镜下观察不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛试液
溶化；菌丝无色或淡棕色，直径4 6um;菌丝黏结成团，大多无色；草酸钙方晶正八面体 形，直径32 60um;种皮内表皮细胞表面观类长方形，壁微波状，以数个细胞为一组，略 作镶嵌状排列；韧皮纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细；纤维束鲜黄色，周围细胞含草酸钙 方品，形成晶纤维，含晶细胞的壁木化增厚；纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤 维；草酸钙簇晶大，直径60 140wm;草酸钙针晶成束或散在，长26 110ym;纤维束周 围薄壁细胞含草酸钙簇晶，形成晶纤维，含晶细胞纵向成行；叶表皮细胞平周壁有角质线纹， 气孔不等式，副卫细胞3个；上下表皮均可见栅栏组织；薄壁细胞类圆形，有椭园形纹孔， 集成纹孔群；内皮层细胞垂周壁波状弯曲，较厚，木化，有稀疏细孔沟；种皮石细胞黄色或 淡棕色，多破碎，完整着长多角形、长方形或不规则形，壁厚，有大的圆形纹孔，胞腔棕红色；
大黄的鉴别取分清五淋丸0.5g，研细，加甲醇20ml，浸泡1小时，滤过，滤液蒸干， 残渣加水10ml使溶解，再加盐酸lml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分2次振摇提 取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲垸lml使溶解，作为供试品溶液；另取 大黄对照药材O. lg，同法制成对照药材溶液；再取大黄酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg 的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5iU,分别点于同一以 羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚30 60°C-甲酸乙酉g-甲酸15 : 5 : 1 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365rm下检视；供试品色谱中，在与 对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置 上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色；
栀子的鉴别取分清五淋丸5g，研细，加5(m甲醇50ml，超声处理40分钟，滤过，滤 液作为供试品溶液；另取栀子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加 乙醇制成每lml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各 2Pl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸
-水5 : 5 : l : i为展丌剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在iio"c加热至斑
点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的 斑点；
黄柏的鉴别取分清五淋丸2g，研细，加甲醇25ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作 为供试品溶液；另取黄柏对照药材50mg，加甲醇5ral，同法制成对照药材溶液；再取盐酸小 檗碱对照品，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸 取h述三种溶液各1 u 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙
酸乙酯-丁酮-甲酸-水io : 6 : i : i为展升剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，
晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的 位置上，显相同颜色的荧光斑点；
黄芩的鉴别取分清五淋丸5g，研细，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml，加热 回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，取上清液作为供试品溶液； 另取黄芩对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取黄芩素、汉黄芩素对照品，加甲醇制成 每lml各含0. 5mg的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2 yl及上述两种对照品溶液各分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-
甲酸io : 3 : i : 2为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365腦下检
视；供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相同的位置上，显相同颜色的暗色斑点； b含量测定齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量测定
照高效液相色谱法中国药典2005年版一部附录Vi D测定，色谱条件与系统适用性试验
以卜八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺87 : 13 : o. 04 : o. 02为流动
相；检测波长为210nm;理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成每lml 各含0. 5mg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取分清五淋丸，研细，取约10g，精密称定，加甲醇50ml，超卢处 理功率250W，频率50kHz30分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液与洗液，回收溶剂至干， 残渣加水IO ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，残渣加 甲醇20 ml、盐酸2 ml，加热水解4小时，水解物加水10 ml，用三氯甲烷振摇提取2次， 每次20ml，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至 刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 pl ，注入液相色谱仪，测定， 即得。
分清五淋丸每lg含木通以齐墩果酸(C3。H4803)和常春藤皂苷元(C:,。H4804)的总量计，不 得少于0. 20mg。
本发明的有益效果本发明通过显微鉴别车前子、黄芩、茯苳、猪苓、黄柏、大黄、莴 蓄、瞿麦、知母、泽泻、栀子、甘草，采用薄层色谱法鉴别大黄、栀子、黄柏、黄芩，含量 测定采用高效液相色谱法测定木通中齐墩果酸对照品和常春藤皂苷元，是提供分清五淋丸质 量检验方法及标准，通过建立明确专属性强的鉴别及重现性、稳定性及精密度良好的含量测 定方法，能够有效控制分清五淋丸的质量，使分清五淋丸质量达到稳定、可控、高效及安全， 是对产品的投料要求及质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物 利用度，产品质量高，能保证产品疗效，更好地满足医疗的需要。
图1是本发明的分清五淋丸中大黄紫外灯下鉴别图； 图2是本发明的分清五淋丸中大黄氨蒸气熏后鉴别图； 图3是本发明的分清五淋丸中栀子鉴别图； 图4是本发明的分清五淋丸中黄柏鉴别图； 图5是本发明的分清五淋丸中黄吝鉴别图6是本发明的齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品的高效液相色谱图7是本发明的分清五淋丸中样品的高效液相色谱图8是本发明的分清五淋丸阴性对照溶液高效液相色谱具体实施例方式
实施例1:
1、 在分清五淋丸的定性鉴别的研究中，首先按中国药典2005版一部分清五淋丸标准， 保留了显微鉴别项，同时设计对处方中木通、黄苓、茯苓、黄柏、大黄、知母、栀子、甘草 进行定性鉴别，参考药典方法及文献报道方法，经反复试验摸索，结果木通、茯苳、知母、 甘草分离效果依旧很差，有的甚至无法分离，阴性样品有干扰，大黄、栀子、黄柏、黄芩分 离效果很好，阴性样品无干扰。
2、 分清五淋丸在定量分析的设计中，因原标准中没有含量测定项，对木通进行了成分
分析的实验。采用的高效液相色谱法对其中所含齐墩果酸对照品和常春藤皂苷元进行含量测 定，经过对系统适用性、线性回归、精密度、重现性、稳定性、回收率等试验考察，证明本 检验方法，重现性好，能快速准确的检验药品质量。鉴别
1、分清五淋丸的显微鉴别
取分清五淋丸研细，置显微镜下观察不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛试液溶化； 菌丝无色或淡棕色，直径4 6ixm。菌丝黏结成团，大多无色；草酸钙方晶正八面体形，直
径32 60nm。种皮内表皮细胞表面观类长方形，壁微波状，以数个细胞为一组，略作镶嵌 状排列。韧皮纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细。纤维束鲜黄色，周围细胞含草酸钙方晶， 形成晶纤维，含晶细胞的壁木化增厚。纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维。草 酸钙簇晶大，直径60 140ym。草酸钙针晶成束或散在，长26 110nrn。纤维束周围薄壁 细胞含草酸钙簇晶，形成晶纤维，含晶细胞纵向成行。叶表皮细胞平周壁有角质线纹，气孔 不等式，副卫细胞3个；上下表皮均可见栅栏组织。薄壁细胞类圆形，有椭园形纹孔，集成 纹孔群；内皮层细胞垂周壁波状弯曲，较厚，木化，有稀疏细孔沟。种皮石细胞黄色或淡棕色，多破碎，完整着长多角形、长方形或不规则形，壁厚，有大的圆形纹孔，胞腔棕红色。 2、大黄的薄层鉴别
供试品溶液的制备取分清五淋丸0.5g，研细，加甲醇20ml，浸泡1小时，滤过，滤 液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸lml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分2 次振摇提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷lml使溶解，即得。
阴性对照溶液制备取缺大黄的阴性样品0.5g，加甲醇20ml，浸泡1小时，滤过，滤 液蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸lml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分2 次振摇提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲垸lml使溶解，即得。
对照药材溶液的制备取大黄对照药材O. lg，研细，加甲醇20ml，浸泡1小时，滤过， 滤液蒸干，残渣加水iOml使溶解，再加盐酸lml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分 2次振摇提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷lml使溶解，即得。
对照品溶液的制备取大黄酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，即得。
试验方法照薄层色谱法试验(中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取上述四种溶 液各5nl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚(30 6(TC)-甲酸乙酉旨-甲酸(15 : 5 : 1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 (365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色 荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后， 斑点变为红色；而阴性对照溶液无斑点出现，结果不干扰黄芪的鉴别，见图l。
3、 栀子的鉴别
供试品溶液的制备取分清五淋丸5g，研细，加5Cm甲醇50ml，超声处理40分钟，滤 过，即得。
阴性对照溶液制备取缺栀子的阴性样品5g，研细，加50y。甲醇50ml，超声处理40分 钟，滤过，即得。
对照药材溶液的制备取栀子对照药材lg，加5(F。甲醇50ml，超声处理40分钟，滤过， 即得。
对照品溶液的制备取栀子苷对照品，加乙醇制成每lml含4mg的溶液，即得。 试验方法照薄层色谱法试验(中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取上述四种溶 液各2ii1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-
甲酸-水(5:5:i:i)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在iio°c
加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相 同颜色的斑点；而阴性对照溶液无斑点出现，结果不T扰栀了的鉴别，见图2。
4、 黄柏的鉴别
供试品溶液的制备取分清五淋丸2g，研细，加甲醇25ml，加热冋流30分钟，滤过， 即得。
阴性对照溶液的制备取缺黄柏的阴性样品2g，研细，加甲醇25ml，加热回流30分钟， 滤过，即得。
对照药材溶液的制备取黄柏对照药材50mg，加甲醇5ml，加热回流30分钟，滤过， 即得。
对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，即得。 试验方法照薄层色谱法试验(中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取上述四种溶 液各1 u 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(io : 6 : i : i)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展丌缸内，展丌，取出，晾干，置紫
外光灯(365nm)下检视；供试品色谱屮，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；而阴性对照溶液无斑点出现，结果不干扰黄柏的鉴别，见图3。 5、黄芩的鉴别-
供试品溶液的制备取分清五淋丸5g，研细，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml， 加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，即得。
阴性对照溶液的制备取缺黄芩的阴性样品5g，研细，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶 液50ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，即得。
对照药材溶液的制备取黄芩对照药材lg，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml， 加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，即得。
对照品溶液的制备取黄芩素、汉黄苳素对照品，加甲醇制成每lml各含0. 5mg的对照 品溶液，即得。
试验方法照薄层色谱法试验(中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取供试品溶液、 对照药材溶液各1及上述四种对照品溶液各1 y 1，分别点于问一聚酰胺薄膜上，以甲苯-
乙酸乙酯-甲醇-甲酸io : 3 : l : 2为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外
光灯365皿下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相同的位置卜.，显相 同颜色的暗色斑点；而阴性对照溶液无斑点出现，结果不干扰黄芩的鉴别，见图4。含量测定齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量测定
照高效液相色谱法中国药典2005年版一部附录VI D测定，色谱条件与系统适用性试验 以十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺87 : 13 : 0. 04 : 0. 02为流动 相；检测波长为210nm;理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成每lml 各含0. 5mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备取分清五淋丸，研细，取约10g，精密称定，加甲醇50ml，超声处 理功率250W，频率50kHz30分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液与洗液，回收溶剂至干， 残渣加水IO ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，残渣加 甲醇20 ml、盐酸2ml，加热水解4小时，水解物加水10 ml，用三氯甲垸振摇提取2次， 每次20ml，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至 刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 |_J ，注入液相色谱仪，测定，即得。
分清五淋丸每lg含木通以齐墩果酸(C3 Hw03)和常春藤皂苷元(C3。H4S04)的总量计，不 得少于0. 20mg。 含量测定
木通收载于《中国药典》2005年版一部，为木通科植物木通^ire&'a (Thunb.)
Decne.、三口十木通」Vire/^'a tr_i/bJists (Thunb.) Koidz.或白木通/4AeZ^'s tn'/bJists (Thunb.) Koidz.var. aystrah's(Diels.) Rehd.的干燥藤茎。具有清心火，利小便，通经下乳之功效。 用于治疗胸中烦热，喉痹咽痛，尿赤，五淋，水肿，周身挛痛，经闭乳少等症，为方中主药。 据文献报道，木通主要含有三萜皂苷类化学成分[4]。，其皂苷元齐墩果酸、常春藤皂苷元是 中.要活性成分，闲此，我们参照《中国药典》2005年版一部等文献资料，对处方中木通所含 齐墩果酸和常春藤皂苷元进行了高效液相色谱法含量测定的试验摸索，结果满意，可作为该 药内在质量控制指标。
1. 样品来源由内蒙古包头中药有限责任公司提供(批号20050408、 20050410、 20050412、 20050503、 20050510、 20050516、 20050528、 20050601、 20050602、 20050603)。
2. 仪器与试药美国Alltech高效液相色谱仪，M626输液泵，UVIS-201型检测器；齐墩果酸和常春藤皂苷元对照品由中国药品牛物制品检定所提供；甲醇为色谱纯试剂；冰醋酸， 三乙胺均为分析纯试剂；水为超纯水。
3. 色谱条件Alltech RP-C,8色谱柱(5 ,， 4. 6 mmX250 mm);流动相甲醇_水-冰醋 酸-三乙胺(87 : 13 : 0. 04 : 0.02);检测波长210 nm ;流速l.Oml/min;柱温室温。 4.试验条件的选择
丄1高效液相色谱条件的选择
4. 1. 1检测波长的选择取对照品溶液，在400^190nm波长范围内进行光谱扫描，结果 齐墩果酸、常春藤皂苷元在205nm波长处都有最大吸收，但由于205 nm处溶剂峰十扰较大， 经试验选用210 nm为测定波长，以减少溶剂对皂苷元测定的干扰。
4.1.2流动相的选择参考《中国药典》2005年版一部木通项下以甲醇-水-冰醋酸-
三乙胺(87 : 13 : 0.04 : 0.02)为流动相，其中冰醋酸可产生弱酸性环境，有利于样品中酸
性物质的分离，既可使齐墩果酸与常春藤皂苷元得到良好的分离，又能与其他成分达到基线 分离；三乙胺可良好地改善峰形，故选择该流动相。 4. 2样品提取条件的选择
分别考察了索氏提取、加热回流提取、超声提取等三种方法对含量的影响，结果见表l。
表l不同提取条件的测定结果
提取条件取样量(g)含量(mg/g)
超声提取30分钟10. 00350. 432
加热回流1小时10. 27630. 418
索氏提取4小时10.25680. 419
索氏提取4小时，超声提取0. 5小时，回流提取1小时的结果基本一致，而超声提取方法 简单易行，且提取副产物少，所以选用超声提取法。
5. 阴性对照试验
取按处方量比例以相同工艺制备的阴性对照溶液(缺木通)，同法测定。测得结果为阴
性对照溶液的HPLC色谱中在与齐墩果酸和常春藤皂苷元对照品色谱中相对应的保留时间处无 色谱峰出现。表明处方中其他组分对齐墩果酸和常春藤皂苷元的测定无T扰。对照品溶液、样
品溶液、阴性对照溶液HPLC图谱见图5-图7。
6. 含量测定
6. l对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成每 lml各含0. 5mg的混合溶液，即得。
6.2供试品溶液的制备取分清五淋丸，研细，取约10g，精密称定，加甲醇50ml，超声 处理(功率250W，频率50kHz) 30分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液与洗液，回收溶 剂至干，残渣加水IO ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并提取液，蒸干， 残渣加甲醇20 ml，盐酸2ml，加热水解4小时，水解物加水10 ml，用三氯甲烷振摇提取2 次，每次20 ml，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定量转移至5 ml量瓶中， 加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.3测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 pi ，注入液相色谱仪，测定， 即得。
7. 方法学考察
7. l线性关系考察分别精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成每lml各含lmg的混合溶液。精密吸取该溶液0. 5、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0 ml，置5ml量瓶 中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10yl分别注入液相色谱仪，测定峰面积值。结果对 照品峰面积Y与其进样量X (iig)之间早.良好的线性关系，线性范围及回归方稃见表2，回归 曲线见图8。
表2 标准曲线结果
成分 线性方程 线性范围(ug)相关系数(r)
齐墩果酸 Y=06X + 3E-92304 1. 02广10. 21 常春藤皂苷元 Y二06X+3E-90987 0.996 9.960.9992 0.9992
7.2精密度试验精密吸取供试品(批号20050601)溶液，连续进样5次，记录齐墩果 酸、常春藤皂苷元峰面积积分值。结果见表3。 表3 精密度试验结果编号12 3 45 RSD
齐墩果酸 899247894498 899302 890900897679 0.40%
常春藤皂苷元 1314273 1311855 1325533 13262471315477 0.51%
结果表明本法精密度良好。
7.3稳定性试验精密吸取供试品(批号20050601)溶液，分别于0、 4、 8、 12小时进 样，记录齐墩果酸、常春藤皂苷元峰面积积分值。结果见表4。
表4 稳定性试验结果
时间(小时)04812RSD
齐墩果酸9196689274529299849255860. 47%
常春藤皂苷元i3205381339618134278213385050. 75%
结果表明，本法在12小时内测定方法稳定。
7. 4重复性试验:取供试品(批号:20050601) 5份，分别按[含jl测定]项下方法操作并测定含量，齐墩果酸和常春藤皂苷元总含量的平均值为0. 432mg/g， RSD为1. 20%。结果见表5。
表5重复性试验结果(n=5)
编号双《 (g)齐墩果酸(mg/g)常春藤皂苷元 (mg/g)总含量 (mg/g)平均植 (mg/g)RSD (%)
1 10.00350. 1800. 2530. 433
2 10.00020. 1780. 2470. 425
3 10.00580. 1780.2530.4310. 4321.20
4 10.36000. 1850. 2530. 438
5 10.45320. 1850. 2520. 437
结果表明，本法重复性较好。
7.5回收率试验采用加样回收法，精密称取已知齐墩果酸和常春藤皂苷兀总含量的供试
品(批号20050601) 5份，分别精密加入齐墩果酸和常春藤皂苷元对照品，按[含量测定]方 法测定，计算回收率，结果见表6。
表6回收率试验结果(n=5)
取样量 (g)
成分
供试品含j (mg)
加入 (mg)
(mg)
回收率
平均 回收率(％)
RSD(%)
5.2583 齐墩果酸
0. 961
1. 811
97. 92
98. 17
0. 515. 2035 5. 2203 5. 2197 5.2884 5.2583 5,2035 5.2203 5.2197 5. 2884
常春藤皂 苷元0.9511.80197. 920.9540. 8681.80497. 920.9541.80598. 040.9661.82699. 071.3292.46698. 691.3152.742100. 431.3191. 1522.45898.871.3192.43096. 441.3362.47498. 78
98.64
1. 44
结果表明回收率均在95%~105%以内，符合方法学考察要求
7. 6样品含量测定按上述[含量测定]项下方法操作，分别精密吸取对照品溶液与供试品 溶液各IO pi ，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表7。
表7 含量测定结果(n=2)
批号
取样量(g)
含量(mg/g)
平均含量(mg/g)
10.25690.447
200506010.436
10.00280.426
2005060210.00120.425
0.436
10.30160.4472005060310.33180.446
0.437
10.00560.4282005040810.00230.436
0.434
10.11360.4332005041010.05690.454
0.441
10.13880.4292005041210.45880.464
0.445
10.00230.4272005050310.38980.414
0.413
9.92350.4122005051010.42330.453
0.453
10.35680.4542005051610.48330.447
0.438
10.00210.430
10.00050.420
200505280.421
10.00560.422
8.木通药材中齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量测定取药材粉末(过四号筛)2g，精密 称定，加甲醇50 ml，超声处理(功率250W，频率50kHz) 30分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤， 合并滤液与洗液，回收溶剂至干，残渣加水10 ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml， 合并提取液，蒸干，残渣加甲醇20ml、盐酸2ml，加热水解4小时，水解物加水10 ml，用 三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定量转 移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按含量测定方法进行测定。 结果见表8。
表8 木通药材含量测定结果取样量 (g)齐墩果酸(％)常春藤皂苷元(％)水份 (%)总含量(％)
0.32650. 240. 167.80. 40
药材木通中齐墩果酸和常春藤皂苷元总含量为0.40%，十批样品中齐墩果酸和常春藤皂苷元总 含量均高于0. 2mg/g ，转移率约为98.77%。参照《中国药典》2005年版一部"木通"项下 齐墩果酸和常春藤皂苷元的总含量限度及市售木通药材所含齐墩果酸和常春藤皂苷元的总含 量的不同，分清五淋丸含木通以齐墩果酸(C3 H18Q,)和常春藤皂苷元(C3晶A)的总量计，暂 定为每lg不得少于O. 2mg。
权利要求
1、一种分清五淋丸的质量标准及其检验方法，其特征在于该方法中的质量标准a鉴别及b含量测定方法是以下方法的一种或几种a鉴别显微鉴别取分清五淋丸，置显微镜下观察可见车前子、黄芩、茯苓、猪苓、黄柏、大黄、萹蓄、瞿麦、知母、泽泻、栀子、甘草的显微特征；大黄的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸0.5～1g，研细，加甲醇20～40ml，浸泡1～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10～20ml使溶解，再加盐酸1～2ml，加热回流30～40分钟，立即冷却，用乙醚分2～4次振摇提取，每次20～30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～2ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材0.1～0.2g，同法制成对照药材溶液；再取大黄酸对照品，加甲醇制成每1ml含1～1.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于硅胶薄层板上，以石油醚30～60℃-甲酸乙酯-甲酸15～20∶5～7∶1～1.4的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，阴性对照无对应斑点；栀子的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸5～10g，研细，加40～70％甲醇50～100ml，超声处理40～60分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取栀子对照药材1～1.5g，同法制成对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含4～6mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水5～10∶5～10∶1～2∶1～2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～10％硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；黄柏的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸2～5g，研细，加甲醇25～50ml，加热回流30～40分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄柏对照药材10～20mg，加甲醇1～2ml，制成对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5～1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水10～15∶6～15∶1～2∶1～2为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；黄芩的鉴别包括下列步骤取分清五淋丸5～10g，研细，加乙酸乙酯-甲醇3～6∶1～2的混合溶液50～100ml，加热回流30～40分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5～10ml使溶解，取上清液作为供试品溶液；另取黄芩对照药材1～1.5g，同法制成对照药材溶液；再取黄芩素、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5～1mg的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2～4μl及上述两种对照品溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸10～15∶3～4.51～1.5∶2～7.5为展开剂，预饱和30～40分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相同的位置上，显相同颜色的暗色斑点；b含量测定齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量测定方法包括下列步骤色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺80～95∶20～5∶0.02～0.5∶0.01～0.05为流动相；检测波长为210nm，理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于2000；对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml各含0.4～0.7mg的混合溶液，即得；供试品溶液的制备取分清五淋丸，研细，取约10～15g，精密称定，加甲醇50～80ml，超声处理功率250W，频率50kHz30～40分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液与洗液，回收溶剂至干，残渣加水10～15ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3～5次，每次20～30ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇20～30ml、盐酸2～4ml，加热水解4～6小时，水解物加水10～15ml，用三氯甲烷振摇提取2～4次，每次20～30ml，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5～10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；分清五淋丸每1g含木通以齐墩果酸(C30H48O3)和常春藤皂苷元(C30H48O4)的总量计，不得少于0.20mg。
2、根据权利要求1所述一种分清五淋丸的质量检验方法，其特征在于该方法中的 a鉴别方法和b含量测定是以下方法的一种或几种a鉴别显微鉴别取分清五淋丸，置显微镜下观察不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛试液溶化；菌丝无色或淡棕色，直径4 6ym;菌丝黏结成团，大多无色；草酸钙方晶正八 面体形，直径32 60ym;种皮内表皮细胞表面观类长方形，壁微波状，以数个细胞为一组，略作镶嵌状排列；韧皮纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细；纤维束鲜黄色，周围细胞 含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞的壁木化增厚；纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶， 形成晶纤维；草酸钙簇晶大，直径60 140um;草酸钙针晶成束或散在，长26 110ym; 纤维束周围薄壁细胞含草酸钙簇晶，形成晶纤维，含晶细胞纵向成行；叶表皮细胞平周壁 有角质线纹，气孔不等式，副卫细胞3个；上下表皮均可见栅栏组织；薄壁细胞类圆形， 有椭园形纹孔，集成纹孔群；内皮层细胞垂周壁波状弯曲，较厚，木化，有稀疏细孔沟； 种皮石细胞黄色或淡棕色，多破碎，完整着长多角形、长方形或不规则形，壁厚，有大的 圆形纹孔，胞腔棕红色；大黄的鉴别取分清五淋丸O. 5g，研细，加甲醇20ml，浸泡1小时，滤过，滤液蒸 干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸lml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分2次 振摇提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲垸lml使溶解，作为供试品溶 液；另取大黄对照药材0. lg，同法制成对照药材溶液；再取大黄酸对照品，加甲醇制成 每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5ul， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚30 6(TC-甲酸乙 酯-甲酸15 : 5 : 1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视； 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与 对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，斑点变为红色；栀子的鉴别取分清五淋丸5g，研细，加5(m甲醇50ml，超声处理40分钟，滤过， 滤液作为供试品溶液；另取栀子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取栀子苷对照 品，加乙醇制成每lml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三 种溶液各2ul，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水5:5:i:i为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在11(TC加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；黄柏的鉴别取分清五淋丸2g，研细，加甲醇25ml，加热回流30分钟，滤过，滤液 作为供试品溶液；另取黄柏对照药材50mg，加甲醇5ml，同法制成对照药材溶液；再取盐 酸小檗碱对照品，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试 验，吸取上述三种溶液各1 U 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水io : 6 : l : l为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对 照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；黄芩的鉴别取分清五淋丸5g，研细，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml，加 热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，取上清液作为供试品 溶液；另取黄芩对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取黄芩素、汉黄芩素对照品， 加甲醇制成每lml各含0.5mg的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照 药材溶液各2nl及上述两种对照品溶液各lul，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸io : 3 : i : 2为展开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相同的位置上，显 相同颜色的暗色斑点；b含量测定齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量测定照高效液相色谱法中国药典2005年版一部附录VI D测定，色谱条件与系统适用性试验以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺87 : 13 : 0. 04 : 0. 02为流动相；检测波长为210nm;理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于2000;对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品，加甲醇制成 每lml各含0.5mg的混合溶液，即得；供试品溶液的制备取分清五淋丸，研细，取约10g，精密称定，加甲醇50ml，超 声处理功率250W，频率50kHz30分钟，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液与洗液，回收 溶剂至干，残渣加水IO ml溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并提取液， 蒸干，残渣加甲醇20ml、盐酸2ml，加热水解4小时，水解物加水10 ml，用三氯甲烷 振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10pl ，注入液相色谱仪，测定， 即得；分清五淋丸每lg含木通以齐墩果酸(C3。H4803)和常春藤皂苷元(C3。H4804)的总量计， 不得少于0. 20mg。
全文摘要
本发明属于中药技术领域，具体说是一种分清五淋丸的质量标准及其检验方法，原分清五淋丸的质量标准只有显微鉴别和检查项，本发明进行各项试验摸索后，增加了大黄、栀子、黄柏、黄芩的薄层鉴别，并对该制剂进行了重金属及砷盐的考察，其测定结果低于常规限度，同时对处方中木通所含齐墩果酸和常春藤皂苷元进行了含量测定的试验摸索，对处方中木通所含齐墩果酸和常春藤皂苷元建立了高效液相含量测定方法，提高了质量标准，加强了该药的质量可控性，保证了患者服用的有效性，通过本发明增加的质量控制，结果满意，提高了原标准，使得产品质量更加可控，同时更利于产品工业化生产要求，有利于本产品的工业化生产的监控。
文档编号A61K36/8964GK101444589SQ20081013772
公开日2009年6月3日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者于得才, 朱贺年, 丽 杨, 贾金良 申请人:包头中药有限责任公司