专利名称：共表达猪瘟病毒t细胞表位与猪细小病毒vp2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重 组菌及其制备方法。
背景技术：
猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)属于细小病毒禾斗、细小病毒属的 成员，是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。病毒经口、鼻等黏膜感染是其 主要感染途径，可引起怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎等临床症状。猪瘟 (classical swine fever， CSF)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传 染病，是危害养猪业的主要传染病之一。这两种疾病在世界范围内广泛分布， 危害严重，给养猪业带来重大经济损失。
但是多价、多联，可同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的 重组干酪乳杆菌及其制备方法，可作为同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳 杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒 pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。
本发明上述共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干 酪乳杆菌按以下步骤制备 一、以质粒pMdBacA-VP2-E29为模板、Pl和P2 为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290基因进行5謡HI 和双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到重组载体质粒 pPG-2-VP2-E290;三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化干酪乳杆菌； 四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病 毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳 杆菌可作为多价、多联，同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。本发明针对 病毒经黏膜感染的特点，能有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而 引起全身性系统免疫反应的疫苗。
乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，被公认为安全级(generally recognized as safe, GRAS)微生物。乳酸菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁 酸能力，而本身又具有低免疫原性。因此，本发明选用干酪乳杆菌为活载体作 为外源抗原的传递和表达系统，可刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳 杆菌依靠乳酸菌天然的抗菌、抗腹泻作用、猪瘟病毒T细胞表位E290多肽及 猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白刺激的特异性粘膜免疫作用，达到 同时预防猪细小病毒和猪瘟的目的，本发明对猪细小病毒和猪瘟的防治具有重 要意义。
本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳 杆菌pPG-2-VP2-E290/L.casei393属于乳杆菌属aacto6a"7/ws)，保藏于中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2008年 09月02日，保藏号为CCTCCM 208125。
图1是具体实施方式
八中PCR鉴定结果图，图2是具体实施方式
八重组 蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定的结果图，图3是具体实施方式
八重组蛋白诱 导表达Western-blot分析的结果图，图4是具体实施方式
八目的蛋白分泌性表 达SDS-PAGE鉴定的结果图，图5是具体实施方式
八目的蛋白分泌性表达 Western-blot分析的结果图，图6是具体实施方式
八共表达猪瘟病毒T细胞表 位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的ELISA检测结果图。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒 VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆
菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E2卯基因克隆有VP2-E290基因。
本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干 酪乳杆菌中可以同时表达猪瘟病毒T细胞优势表位E290多肽和猪细小病毒起 主要免疫保护作用的VP2蛋白。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是干酪乳杆菌 其它与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒 VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备 一、以质粒pMelBacA-VP2-E29 为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E2卯基因；二、对扩增得到的VP2-E290 基因进行5"mffl和^oI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到 重组载体质粒pPG-2-VP2-E290;三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化 干酪乳杆菌；四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到共表达猪瘟病毒T细胞表 位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使 用操作手册。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤一中引 物的基因序列为
Pl : 5，-CGATGGGGATCCTATGAAACACAAAGTTCGTAACGAAGTT ATGGTTCACTGGTTCGACGACCGCGAG-3，，
P2: 5 ，國AGCTTCTCGAGCCATGCTACCTGATTAACCGAGTAACTG-3 ，。 其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤一中扩 增VP2-E290基因的PCR反应体系为50mL: pMelBacA-VP2-E290模板1pL、 DNA聚合酶0.5pL、 10xPCR Buffer 50pL、浓度为25pmol&L的引物Pl lpL、 浓度为25pmol/pL的引物P2 lpL、 dNTP 4pL和去离子水37.5pL; PCR反应 条件:95。C预变性5 min，94。C变性lmin、58.3。C退火lmin20s、72。C延伸2 min、 30个循环，72。C延伸10min。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤三中电转化的干酪乳杆菌为Z^^"393。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤四重组 干酪乳杆菌乳糖诱导按以下步骤进行A、将重组干酪乳杆菌接种于氯霉素
(Cm)浓库为10pg/mL的MRS液体培养基，置于37"C环境中振荡摇床培养 过夜;B、按1 : lO的体积比将过夜培养液接种于氯霉素(Cm)浓度为10pg/mL、 乳糖质量浓度为2%、不含Glucose的MRS液体培养基中，置于37'C的环境 中诱导20士2h。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
八本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒 VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备 一、以质粒pMdBaeA-VP2-E29 为模板、P1和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对扩增得到的VP2-E290 基因进行B"mHI和J^oI双酶切，然后克隆到分泌表达型载体pPG-2中，得到 重组载体质粒pPG-2-VP2-E290;三、用重组载体质粒pPG-2-VP2-E290电转化 感受态细胞干酪乳杆菌丄.cw"393;四、重组干酪乳杆菌丄.cwe/393乳糖诱导， 即得到共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌 丄,匿/ 393;其中步骤一中引物P1的基因序列如SEQ IDNO: 1所示，引物 P2的基因序列如SEQ ID NO: 2所示；步骤一中扩增VP2-E290基因的PCR 反应体系为50nL: pMelBaeA-VP2-E290模板lpL、 DNA聚合酶0.5pL、 10xPCR Buffer 50jiL、浓度为25pmol/pL的引物P1 lpL、浓度为25pmol/nL的 引物P2 1^iL、dNTP4jaL和去离子水37.5pL;PCR反应条件95。C预变性5min， 94。C变性lmin、 58.3。C退火lmin20s、 72。C延伸2min、 30个循环，72。C延伸 10min;步骤四重组干酪乳杆菌I^o^'393乳糖诱导按以下步骤进行A、将 重组干酪乳扦菌丄.cw" 393接种于Cm浓度为10jig/mL的MRS液体培养基， 置于37r环境中振荡摇床培养过夜；B、按1 : IO的体积比将过夜培养液接种 于Cm浓度为10ng/mL、乳糖质量浓度为2%、不含Glucose的MRS液体培养 基中，置于37t:的环境中诱导20h。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得， 若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使 用操作手册。
本实施方式步骤二中经^ 附HI和双酶切的VP2-E290基因片段(约
1.8kb)与经^m ffl和&n双酶切的分泌表达型载体pPG-2片段连接；然后通 过步骤三电转化感受态细胞干酪乳杆菌393进行表达。进行阳性重组质 粒单酶切、双酶切和PCR鉴定，鉴定结果如图1所示；图1中"1"泳道标样 为DNA Marker 15000 ，" 2 "泳道标样为重组载体质粒pPG-2-VP2-E2卯经^wiffl 单酶切获得的基因片段(大小约5100bp)， "3"泳道标样为重组载体质粒 pPG-2-VP2-E290经J^oI单酶切获得的基因片段(大小约5100bp)， "4"泳道 标样为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290经^wffl和屈ol双酶切获得的基因片 段(大小分别约3300bp和1800bp)， "5"泳道标样为以重组载体质粒 pPG-2-VP2-E290为模板、Pl和P2为引物PCR扩增获得的基因片段(大小约 1800bp)——本实施方式目的基因片段，"6"泳道标样为PCR阴性对照，"7" 泳道标样为DNA Marker 2000。序列测定结果分析表明VP2-E290基因已插入 到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290中。
本实施方式以未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌作为对照，进行重组蛋白诱 导表达SDS~PAGE鉴定及Western-blot分析。重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴 定结果如图2所示，图2中"1"泳道标样为标准蛋白分子量(97kD-14kD)， "2"泳道标样为未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/丄.ca^ 393 菌体蛋白，"3"和"4"泳道标样都为本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位 与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌丄.co^/ 393菌体蛋白，图2中箭头 所示蛋白带约70 kD。 SDS-PAGE鉴定结果表明本实施方式共表达猪瘟病毒T 细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌丄.cm"' 393有约70kD的蛋 白泳带出现，证明目的蛋白获得表达。将本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表 位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌393菌体裂解物经 SDS-PAGE电泳后转印NC膜，再分别与鼠源抗PPV高免血清和羊抗鼠 IgG/HRP作用，Western-blot分析结果如图3所示；图3中"1"泳道标样为本 实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆 菌丄.c"^/ 393菌体蛋白，"2"泳道标样为未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌 pPG-2-VP2-E290/L.m^ 393菌体蛋白。本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表 位与猪细小病毒￥ 2蛋白的重组干酪乳杆菌丄.^"/ 393出现预期大小的免疫 反应带(分子量约70KD)，而未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌
pPG-2-VP2-E290/丄.cose/393未出现预期的反应带，Western-blot分析结果说明 目的蛋白获得了有效表达，表达的蛋白能被抗血清所识别。
对本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组 干酪乳杆菌393目的蛋白分泌性表达的鉴定
将本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组 千酪乳杆菌丄co^/393培养基上清液透析浓縮，透析浓縮物在质量浓度为10% 的SDS-PAGE上进行电泳分析，SDS-PAGE分析结果如图4所示；图4中"1" 泳道标样为标准蛋白分子量(97kD-14kD), "2"和"3"泳道标样都为本实 施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌 Zx似"393培养基上清液透析浓縮物，"4"和"5"泳道标样都为未经乳糖诱 导的重组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/￡.CaM/ 393培养基上清液透析浓縮物， 图4中箭头所示蛋白带约70kD。 SDS-PAGE鉴定结果表明本实施方式共表达 猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌丄.07"/ 393有 约70kD的蛋白泳带出现，证明目的蛋白获得表达和分泌。将上述SDS-PAGE 凝胶电泳中的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，再以鼠源抗PPV高免血清作为第 一抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为第二抗体，4-氯-l-萘酚底物显色溶 液中显色5min， Western-blot分析结果如图5所示；图5中"1"泳道标样为 本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳 杆菌丄.c^化z'393培养基上清液透析浓縮物，"2"泳道标样为未经乳糖诱导的重 组干酪乳杆菌pPG-2-VP2-E290/￡.awe/ 393培养基上清液透析浓縮物。本实施 方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌 丄.c"w/393出现分子量约70KD的反应带，而未经乳糖诱导的重组干酪乳杆菌 pPG-2-VP2-E290/I.c""/ 393未出现反应带，Western-blot分析结果证明目的重 组蛋白在干酪乳杆菌中获得了有效表达，且所表达的蛋白既存在于菌体中，又 可分泌到培养液中，表达的蛋白和天然蛋白一样具有良好的抗原特异性，可被 抗血清识别。
间接ELISA方法
以本实施方式共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组 干酪乳杆菌393培养基上清液作为抗原包被ELISA反应板，分别以鼠
源抗PPV高免血清和兔抗猪瘟血清为一抗，相应HRP标记的羊抗鼠IgG和羊 抗兔IgG为二抗，ELISA检测结果如图6所示；图6中"A"柱形代表兔抗猪 瘟血清在490nrn的吸光度值，"B"柱形代表兔阴性血清在490nm的吸光度值， "C"柱形代表鼠源抗PPV高免血清在490nm的吸光度值，"D"柱形代表鼠 阴性血清在490nm的吸光度值。结果表明，本实施方式共表达猪瘟病毒T细 胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌厶cma' 393培养基上清液中 均检测到了猪瘟病毒T细胞优势表位E290多肽和猪细小病毒起主要免疫保护 作用的VP2蛋白的表达。
动物实验证明按约5Xl()ScfWkg活菌剂量服用(或投喂)本实施方式共表 达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的猪对猪细 小病毒和猪瘟病毒具有免疫效果。
序列表
〈110〉东北农业大学
〈120〉共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法
〈160〉 2
〈210> 1 〈211〉 67 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
〈223> PCR扩增VP2-E290基因用引物P1。 〈400〉 1
cgatggggat cctatgaaac acaaagttcg taacgaagtt atggttcact ggttcgacga 60 ccgcgag 67 *
〈210〉 2 . <211> 39 <212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉 '
〈223〉 PCR扩增VP2-E290基因用引物P2。 〈400〉 2
agcttctcga gccatgctac ctgattaacc gagtaactg 39
权利要求
1.共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌，其特征在于共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌；其中重组载体质粒pPG-2-VP2-E290基因克隆有VP2-E290基因。
2、 根据权利要求1所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2 蛋白的重组干酪乳杆菌，其特征在于干酪乳杆菌为393。
3、 如权利要求1所述共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白 的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细 小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌按以下步骤制备 一、以质粒 pMelBacA-VP2-E29为模板、Pl和P2为引物PCR扩增VP2-E290基因；二、对 扩增得到的VP2-E290基因进行BawHI和屈ol双酶切，然后克隆到分泌表达 型载体pPG-2中，得到重组载体质粒pPG-2-VP2-E290;三、用重组载体质粒 pPG-2-VP2，E290电转化干酪乳杆菌；四、重组干酪乳杆菌乳糖诱导，即得到 共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌。
4、 根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2 蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤一中引物的基因序列为Pl : 5，-CGATGGGGATCCTATGAAACACAAAGTTCGTAACGAAGTT ATGGTTC ACTGGTTCGACGACCGCGAG-3'，P2: 5，画AGCTTCTCGAGCCATGCTACCTGATTAACCGAGTAACTG画3，。
5、 根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2 蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤一中扩增VP2-E290基因 的PCR反应体系为50^L:pMelBaeA-VP2-E290模板lpL、r"《DNA聚合酶0.5pL、 10xPCRBuffer 50pL、浓度为25pmol/^iL的引物Pl lpL、浓度为25pmol/|iL的 引物P2 1)nL、dNTP4^iL和去离子水37.5^iL;PCR反应条件95。C预变性5min， 94。C变性lmin、 58.3。C退火lmin20s、 72。C延伸2 min、 30个循环，72。C延伸 10 min。
6、 根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2 蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤三中电转化的干酪乳杆菌 为丄.cose/ 393。
7、根据权利要求3所述的共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2 蛋白的重组干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于步骤四重组干酪乳杆菌乳糖诱 导按以下步骤进行A、将重组干酪乳杆菌接种于Cm浓度为10pg/mL的MRS 液体培养基，置于37t:环境中振荡摇床培养过夜；B、按l : IO的体积比将过 夜培养液接种于Cm浓度为10|ng/mL、乳糖质量浓度为2%、不含Glucose的 MRS液体培养基中，置于37'C的环境中诱导20士2h。
全文摘要
共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法，它涉及一种共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组菌及其制备方法。共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌为重组载体质粒pPG-2-VP2-E290转化的干酪乳杆菌。制备方法一、PCR扩增VP2-E290基因；二、得到重组载体质粒；三、电转化干酪乳杆菌；四、诱导。本发明共表达猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌可作为多价、多联，同时防治猪细小病毒和猪瘟的口服疫苗。本发明针对病毒经黏膜感染的特点，能有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进而引起全身性系统免疫反应的疫苗。
文档编号A61K39/187GK101368167SQ20081013727
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者唐丽杰, 徐义刚, 李一经, 葛俊伟 申请人:东北农业大学