专利名称：γ射线联合phTERT-HRP/IAA在治疗喉癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，更具体涉及Y射线在增强端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)启动子介导的基因治疗药物中的应用，Y射线在增强hTERT启动子活 性、增强下游基因表达中的作用。同时还涉及Y射线与hTERT启动子调控辣根过 氧化物酶(服P) /吲哚乙酸(IAA)系统产生协同作用破坏喉癌细胞和抑制喉癌 细胞生长制剂中的应用。
背景技术：
纵观国内外的疾病谱变化模式，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的重大 疾病。随着分子生物学的进步，基因治疗为战胜肿瘤带来了希望。各国在恶性肿 瘤基因治疗方面开展了大量研究并取得了一定成果，部分基因治疗方案已经用于 临床，从安全性考虑，可以说适于肿瘤治疗。例如，中国拥有自主知识产权的重 组人p53腺病毒注射液已获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书，用于治 疗头颈部癌症和胃癌等恶性肿瘤。
基因治疗的关键是靶向性问题，也就是把治疗效应限定在特定的耙细胞、. 靶组织或靶器官内，既达到治疗作用又不影响正常细胞和组织。外源调控在基因 治疗中尤为重要。为了能特异而有效地杀伤肿瘤细胞，需要建立一种特异性高、 活性强的启动子，来控制下游目的基因的表达。
通过肿瘤特异性启动子调控目的基因的表达被广泛地运用于肿瘤耙向基因 治疗的研究中，这种方法遇到的困难在于，1.绝大多数选择性启动子只针对特 殊的组织来源，而没有能够适用于不同组织来源的启动子；2.绝大多数选择性 启动子启动效力较弱，很难达到治疗水平的转基因表达。到目前为止，几乎没有 既有高特异性，又有高活性的肿瘤特异性启动子，这直接阻碍了基因治疗的发展。 hTERT基因启动子已被大多数学者公认为是针对恶性肿瘤普遍性最好的启动子， 是最有希望应用于肿瘤靶向基因治疗的启动子。提高基因治疗中hTERT启动子活
性，将有助于下游治疗基因的表达、提高疗效，这一点我们在治疗过程中应当重
点考虑。
端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，能够维持染色体末端的端粒长度。端粒 酶在超过85%的人类恶性肿瘤细胞中具有高活性，而在正常组织(除生殖细胞和 有高度复制潜能的体细胞)中被抑制或不表达(见参考文献ShayJW， Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J" Cancer, 1997， 33:787-791)。细胞中端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达是端粒酶活性的主要决定 因素，它在大部分肿瘤细胞中高表达(见参考文献CongYS， Wright WE， Shay J"W.. Human telomerase and its regulation. Microbiol Mol Biol Rev, 2002， 66:407-425)。 hTERT基因启动子作为肿瘤特异性启动子被运用到多种肿瘤的耙 向基因治疗方案中，但其活性较弱，下游基因表达产物往往难以实现理想的效果 (见参考文献Gu J and Fang B: Telomerase promoter-driven cancer gene therapy. Cancer Biol Ther， 2003， 2: S64_S70)。 如果能够增强hTERT基因 启动子的活性，必将推动肿瘤靶向治疗的进步，具有重要的理论和临床意义。部 分人尝试通过添加顺式作用元件c-Myc结合位点、Spl结合位点等(见专利文献 WO/2004/076668)，来修饰端粒酶逆转录酶基因启动子，增强启动子活性。由于 启动子的活性调节机制尚不明确，添加的这些反应元件在细胞内广泛存在，受多 种因素调节，所以，特异性和强度都有待检验。
放射治疗是用放射治疗设备如X线治疗机、6°钴治疗机和加速器产生的X射 线、Y射线和电子束等来照射肿瘤，使增殖的肿瘤细胞的DNA链损伤，进而丧失 增殖能力，引起细胞死亡。Y射线本质上同X射线一样，是一种光子流，不带电， 以光速运动，具有很强的穿透力，通过直接和间接作用造成DNA损伤杀灭肿瘤细 胞。因此，Y射线本质上同X射线被用于大部分肿瘤的放射治疗。
目前为止，国外的3家实验室在研究中用到了射线和hTERT启动子介导的 基因治疗，取得了理想的治疗效果。
Takeuchi等(见参考文献Takeuchi， H. ， T. Kanzawa， et al. Combination of caspase transfer using the human telomerase reverse transcriptase promoter and conventional therapies for malignant glioma cells. Int J Oncol, 2004， 25: 57-63)在研究hTERT启动子调控半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-6(Caspase-6)表达的基因治疗中，联合凋亡诱导剂(Y射线、紫杉醇、卡氮芥) 和非凋亡诱导剂(替莫唑胺、Y射线)，观察对恶性胶质瘤细胞的杀伤效果。结 果发现，它们在半数抑制率(IC50)时Y射线或卡氮芥的联合使用能够降低细胞 中的端粒酶活性，导致联合杀伤作用下降。结论是hTERT/rev-caspase-6基因治 疗需要与既可以诱导凋亡，又不抑制端粒酶活性的措施联合使用治疗恶性胶质 瘤。紫杉醇是一种较好的选择。
2004年，Boyd M等(见参考文献:Boyd M et al. An efficient targeted radiother印y/gene therapy strategy utilising human telomerase promoters and radioastatine and harnessing radiation-mediated bystander effects. J Gene Med 2004: 6: 937-947.)比较不同放射性药物([(131)1]M旧G和 [(211)At]MABG)联合不同启动子(hTERT启动子、hTR启动子或RSV启动子) 调控下的去甲肾上腺素转运体(NET),评价对放射耐受的胶质瘤细胞(UVW)的杀 伤作用。结果发现[(211)At]MABG比[(131)I]M旧G作用更强。当细胞模型中5% 的细胞稳定表达RSV/NAT或hTERT/NAT时，联合放射线药物可以使细胞的存 活率降低至0.1%，说明存在旁观者效应。2007年为了验证转染子嵌合体移植瘤 (TMX)模型在评价基因治疗疗效中的作用，他们(见参考文献Mairs RJ， Ross SC， McCluskey AG, Boyd M. A transfectant mosaic xenograft model for evaluation of targeted radiotherapy in combination with gene therapy in vivo. J Nucl Med 2007; 48: 1519—1526.)研究了 hTERT/NAT禾卩hTR/NAT转 染UVW和EJ138细胞后联合[(131)IM旧G的治疗效果，证实(TMX)模型是理 想的研究模型。
2007年，Jiang等(见参考文献Jiang W et al. Role of enhanced radiosensitivity and the tumor-specific suicide gene vector in gene therapy of nasopharyngeal carcinoma. J Radiat Res (Tokyo) 2007; 48: 211-218.)构建质粒pc腿3. 1-hTERT-Survivin (pTS)、 pcD頻.1-Egr-CD (pEC)、 pcDNA3. 1-Egr-CD-hTERT-Survivin(pEC-TS)，评价联合Y射线和基因治疗对鼻咽 癌细胞(CNE-2)的杀伤作用，结果发现pEOTS联合Y射线组的杀伤效果最明显。
可以发现，在以上4项研究中，使用hTERT启动子的目的在于限制目的基 因在肿瘤细胞中特异表达。使用射线的目的不在、也没有证明它对hTERT启动子
活性的增强作用及可能的提高下游目的基因的表达量。
申请人在前期研究中发现Y射线可以增强基因治疗中hTERT启动子的活性， 增强下游基因的表达(见参考文献廖正凯,周云峰，谢丛华，熊杰，鲍洁,周福祥. Y射线增强喉癌细胞hTERT启动子活性研究.中华放射医学与防护杂志.2008 28(2) :104-107)。但是，研究中采用的Y射线剂量为6Gy，而且采用的是单次照 射，这与临床上常用的每天一次照射，每次剂量1.8 2Gy，每周5天的标准分 割放疗方案相差较远，实际应用价值有限。
头颈部肿瘤在全球范围内每年的发病率为700,000例，位于常见肿瘤的第六 位。喉癌占头颈部恶性肿瘤的第三位，在中国各地统计约占7.9 35%，占全身 恶性肿瘤的1.2 1.6%。在美国，2007年喉癌患者占所有癌症患者的0.78%，因 喉癌死亡人数占全部癌症死亡人数的0.65%。喉癌患者的五年总体生存率为33 57%，而且25年来没有明显提高。放射治疗和手术是喉癌的主要治疗方式。肿 瘤细胞的不同放射敏感性是影响放疗疗效的重要因素。采用较大剂量的射线虽然 能够杀死放射敏感性低的肿瘤细胞，但同时会加重肿瘤周围正常组织的放射性损 伤。手术治疗会损害正常喉功能，严重影响了患者的生存质量。因此，迫切需要 一种既不影响喉功能，又能够根除喉癌细胞，并尽量减少对正常组织损伤的理想 治疗手段。
基因导向性酶前体药物疗法(gene—directed enzym印rodrug therapy, GDEPT)，亦称自杀基因疗法，是目前基因治疗领域研究的热点。其原理为当基因 在肿瘤细胞中表达时可将全身给药的无毒性或毒性极低的药物前体转变成毒性 代谢产物，在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞，避免全身或局部直接给药的副作用。人单 纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) /丙氧鸟苷(GCV)系统和胞嘧啶脱氨酶(CD) /5_ 氟胞嘧啶(5-FU)系统都是被广泛研究的自杀基因治疗体系。辣根过氧化物酶 (冊P) /吲哚乙酸(IAA)系统是新一代前药系统，与经典的HSV-TK/GCV系统相 比具有更加快速和高效的肿瘤细胞杀伤作用(见参考文献GrecoO， Folkes LK， Wardman P， et al. Development of a novel enzyme/prodrug combination for gene therapy of cancer: horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid. Cancer Gene Ther， 2000， 7:1414-1420)。无毒的HRP/IAA系统显示出不依赖于 细胞连接的细胞毒性和旁观者效应，在极端的肿瘤细胞缺氧条件下甚至更加高
效，.而且它能够有效地增强肿瘤细胞的放射敏感性(见参考文献Greco 0， RossiterS， Kanthou C， et al. Horseradish peroxidase-mediated gene therapy: choice of prodrugs in oxic and anoxic tumor conditions. Mol Cancer Ther， 2001， 1:151-160; Greco 0， TozerGM, Dachs GU. Oxic and anoxic enhancement of radiation-mediated toxicity by horseradish peroxidase / indole-3-acetic acid gene therapy. Int J" Radiat Biol， 2002， 78:173-81)， HRP/IAA系统是一种理想的基因治疗选择。HRP基因在肿瘤细胞中特异性表达是 服P/IAA系统发挥优势的关键。同时暗示了，将HRP/IAA系统与放疗，如Y射线 联用的诱人前景。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种Y射线在增强端粒酶逆转录酶(hTERT)基因 启动子介导的基因治疗药物中的应用，将Y射线用于肿瘤基因治疗中hTERT基因 启动子的增强剂，增强hTERT基因启动子活性及下游基因的表达量。
本发明的另一个目的是在于提供了一种Y射线联合phTERTp-HRP/IAA作为 制备治疗或预防喉癌细胞药物中的应用。此方案与单用Y射线标准的分割放疗方 案、单用phTERTp-冊P/IAA或两者疗效简单相加比较，对喉癌细胞具有更加明显 的杀伤作用。而且，hTERT基因启动子保证服P/IAA只在肿瘤细胞局部发挥杀伤 作用，具有肿瘤特异性，即增强肿瘤局部疗效的同时不增加对正常细胞的损伤。
由于肿瘤细胞的放射敏感性是决定放疗疗效的重要因素，耐放射肿瘤细胞的 存在往往导致放疗失败，为了探索临床可行的治疗方案，本发明采用不同放射敏 感性人喉癌细胞进行研究，评价2Gy/次Y射线对hTERT基因启动子活性的影响； 建立放射敏感性不同的人喉癌(H印-2和H印-2R细胞)移植瘤模型，评价Y射 线标准的分割放疗方案联合phTERTp-HRP/IAA对移植瘤生长的抑制作用。具体发 明内容如下
A. Y射线和X射线的实质是电磁波，是一种光子流，是临床放射治疗中具有代 表性的治疗手段，是目前临床使用最多的射线之一。每天一次照射，每次剂 量1.8 2Gy，每周5天是临床上常用的放疗方案。发展以Y射线为代表的光 子治疗的应用范围具有明显的可行性和实际的临床意义。
B. Y射线对hTERT启动子活性的增强作用质粒phTERTp-Luc、内参质粒pRL-TK
和对照质粒pGL3-Basic,脂质体转染H印-2和Hep-2R细胞，细胞转染后给 予2GyY射线照射，细胞继续培养24h，双荧光试剂盒(Promega公司)检测 萤火虫荧光素酶(Luc)和海肾荧光素酶(RU活性，比较启动子活性。质粒 phTERTp-HRP脂质体转染Hep-2和Hep-2R细胞后给予2Gy y射线照射，细胞 继续培养24h，以3,5'5,5'-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)为底物检测HRP过 氧化物酶活性。
C. y射线标准的分割放疗方案(每天一次照射，每次剂量2Gy，每周5天)联 合phTERTp-服P/IAA对喉癌细胞的协同杀伤作用建立放射敏感性不同的人 喉癌(H印-2和H印-2R细胞)移植瘤模型，分别分组为联合治疗组(A和Ar 组)，基因治疗组(B和BJ且)，单纯放射组(C和Cb組)和对照组(D和DR 组)。瘤内注射脂质体包裹的质粒phTERTp-服P，腹腔注射吲哚乙酸(IAA) 并联合放疗30Gy,观察对移植瘤生长的抑制作用。免疫组化评价对细胞坏死 '和凋亡，TUNEL法测肿瘤细胞的凋亡情况。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1. 本发明表明，y射线标准的分割放疗方案能增强hTERT启动子活性，增强下 游基因的表达，与未照射组相比hTERT启动子活性在H印-2和H印-2R细胞中 分别提高1. 31和1. 16倍，HRP表达产物的酶活性分别增加1. 21和1. 25倍。
2. 本发明表明，y射线标准的分割放疗方案与phTERTp—冊P/IAA联合比单纯y 射线标准的分割放疗方案、单纯phTERTp—服P/IAA或两者简单相加获得的杀 伤效果都要明显(在H印-2和H印-2R细胞中，联合治疗组中肿瘤抑制率分别 为54. 82%和52.70%，远高于其他组，P〈0. 01)。
3. hTERT启动子调控下游基因在绝大部分肿瘤细胞中表达，而在绝大部分正常 细胞中不表达，因此，hTERT启动子介导的基因治疗可以实现肿瘤耙向治疗。
4. 以y射线和X射线为代表的放射线在临床上应用于绝大部分肿瘤放射治疗， hTERT启动子介导的针对大多数肿瘤的耙向基因治疗方案有百余种，两者联 合适用于多种肿瘤的治疗，并且能够选择不同的下游基因，达到不同的治疗 目的，根据患者具体情况选择，实现个体化治疗。
5. 所述的方案作为治疗或预防肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、 子宫癌、喉癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、卵
巢癌、胶质瘤、肾癌、头颈部癌、阴道癌、黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌，以及 肉瘤等恶性肿瘤中的应用。
图1. 2Gy Y射线照射后转染phTERTp-服P的细胞中辣根过氧化物酶表达产 物的活性。纵坐标标示各组细胞相对于H印-2细胞中未照射组细胞中辣根过氧化 物酶活性的相对倍数。可见2Gy Y射线照射能够增强H印-2和H印-2R中hTERT 调控下辣根过氧化物酶的表达，这与其对hTERT启动子活性的增强作用是一致的。
图2.不同处理因素各组H印-2细胞(A)和H印-2R细胞(B)裸鼠移植瘤 的生长曲线，可见Y射线联合phTERTp-冊P/IAA对H印-2和H印-2R移植瘤的抑瘤 作用最明显。各组分别为联合治疗组(A和Ab組)，基因治疗组(B和Bk組)，单 纯放射组(C和Ck組)和对照组(D和Dk組)。
图3.移植瘤组织切片苏木精-伊红染色(光镜X50倍)可见，与其它组相 比，Y射线联合phTERTp-冊P/IAA组(联合治疗组)凋亡和坏死细胞最多。
图4. TUNEL细胞凋亡原位检测评价移植瘤组织中细胞凋亡。左图为各组凋 亡指数比较，右图为凋亡细胞示意图(右图背景为光镜x400倍，右上角为光镜 xlOOO倍下的图片，箭头所示同一凋亡小体)，可见Y射线联合phTERTp-朋P/IAA 组(联合治疗组)凋亡指数最高。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 2Gy Y射线增强hTERT启动子活性的作用
1 实验材料
1.1 细胞人喉癌细胞(Hep-2， CCTCC编号GDC009)购自中国典型培养 物保藏中心(CCTCC),人喉鳞状细胞癌耐放射株(Hep-2R)由申请人在
前期工作中建立(见参考文献骆志国，周福祥，周云峰，等.辐射诱导 辐射耐受鳞癌细胞株的建立及其生物学特性.中华放射肿瘤学杂志， 2005, 14: 208-212)，常规细胞培养和传代。
1.2质粒申请人在前期工作中已构建质粒phTERTp-Luc (见参考文献.-Liao ZK， Zhou FX， Luo ZG， Zhang WJ， Xiong J， Bao J， Han G， Zhang MS， XieCH， Zhou YF. Radio-activation of hTERT promoter in larynx squamous carcinoma cells: An 'indirected-activator' strategy in radio-gene-ther即y. Oncol R印.19(2008) 281-286)，内参质 粒pRL-TK和对照质粒pGL3-Basic购自PROMEGA公司。
1.3试剂脂质体METAFECTENE购于Biontex公司，双荧光检测试剂盒购 于PROMEGA公司。含10%小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco 公司。可溶型单组分TMB底物溶液(北京天为时代公司)。
1.4 仪器TD-20/20型荧光发光计(美国Turner Designs公司)，DU 530 紫外可见光分光光度计(美国BeckmanCoulter公司)。6()0)远距离治疗 机(GWXJ80型，中国成都)。
2 实验方法
2.1启动子活性检测取指数生长期的细胞，胰酶消化，以每孔4乂105接种 于6孔板，用含5XC02的37。C温箱孵育24h。实验和对照组分别共转 染质粒phTERTp-Luc或pGL3-Basic和pRL-TK各0.5 y g，具体操作按 脂质体METAFECTENE试剂盒说明书进行。细胞转染后放入含5 %C02 的37'C温箱孵育5h后更换培养基，继续培养24小时后给予Y射线2Gy 照射(射野-20cmx20cm,源皮距=80 cm，剂量率=61.22 cGy/min)，继续 培养24h后按照双荧光检测试剂盒说明书裂解细胞，使用TD-20/20型 荧光发光计检测萤火虫荧光素酶(LUC)和海肾荧光素酶(RL)活性， 记录数据。
2.2辣根过氧化物酶(HRP)活性分析取指数生长期的细胞，胰酶消化， 以每孔4X 105接种于6孔板，用含5%C02的37匸温箱孵育24h。转染 质粒phTERTp-服P l.Oiig， 5h后更换培养基，继续培养24小时后给
予y射线2Gy照射(射野-20cmx20cm，源皮距-80 cm,剂量率=61.22 cGy/min)，继续培养24小时后参考文献方法(见参考文献Greco 0, Folkes LK, Wardman P, et al. Development of a novel enzyme/prodrug combination for gene therapy of cancer: horseradish peroxidase / indole-3-acetic acid. Cancer Gene Ther, 2000， 7(11): 1414-1420)，以 3,5'5,5'-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)为底物检测过氧化物酶活性。1 个酶的活性单位=混合物652nm波长吸光度(A)值升高1个单位/ lmin， HRP活性表示为每微克细胞总蛋白中酶的活性单位数。使用 DU530型分光光度计(Beckman公司)中的酶动力程序监测吸光度(A)值 的变化。
2.3统计学处理各组数据用SPSS 13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行 统计分析，计量资料用均数土标准差表示，两组间比较采用均数t检验， PO.05表明差异有显著性。
3 实验结果
3.1 2Gy y射线照射对H印-2和Hep-2R中hTERT启动子活性的增强作用 2Gy y射线对不同放射敏感性喉癌细胞中外源性hTERT启动子活性具 有增强作用。2Gy Y射线照射后，Hep-2细胞中hTERT启动子活性是 未照射组细胞的1.31 ±0.15倍，Hep-2R细胞中hTERT启动子活性是 未照射组细胞的U6±0.28倍。
3.2 2GyY射线增强hTERT启动子下游辣根过氧化物酶(HRP)的表达，导 致过氧化物酶活性增高，请见图l。
实施例2 y射线标准分割放疗方案联合phTERTp-HRP/IAA对不同放射敏感性 喉癌细胞移植瘤的杀伤作用
1 实验材料
1.1细胞同实施例l
1.2 质粒申请人在前期工作中已构建质粒phTERTp-HRP (见参考文献 Liao ZK， Zhou FX, Luo ZG， Zhang WJ"， Xiong J， Bao J"， Han G， Zhang MS, Xie CH, Zhou YF. Radio-activation of hTERT promoter in larynx squamous carcinoma cells: An 'indirected-activator， strategy in radio-gene-ther邻y. 0腦1 R印.19(2008) 281-286)，内参质 粒pRL-TK和对照质粒pGL3-Basic购自PROMEGA公司。
1.3实验动物6 8周龄BALB/ C-nu裸小鼠购于湖北省实验动物中心，每只 质量约16g，饲养于武汉大学实验动物中心独立通风系统，该环境恒温 (25-27'C)恒湿(45X-50X)，新鲜空气除尘除菌，无特殊病原体(SPF)。 动物置于有机玻璃饲养盒内，安置于层流式超净架内，每只饲养盒饲 养3只动物。无菌处理的水、饲料供动物自由摄入。
1.4动物模型的建立将70裸鼠均分为两组 一组接种Hep-2细胞，另一 组接种Hep-2R细胞，均右侧背部皮下接种细胞悬液0.2 ml( lxl07/ml)。 成瘤后，每2d用游标卡尺测量肿瘤的体积[V^(/，2)/2， /指长度，w 指宽度]，待肿瘤平均体积达30 50mt^进行试验。
1.5 采用试剂及仪器脂质体METAFECTENE购于Biontex公司。卩引哚乙 酸购于Fluka公司TUNEL凋亡试剂盒购于北京中山生物公司；HRP蛋 白抗体北京博奥森生物有限公司。脱色摇床(Rocker51702,cole-parmer Inst. Company)、切片烘片机(Leica RM 2125)、普通光学显微镜(CHS, Olypus)、图像采集系统(显微镜Nikon ECLIPSE E600,摄像仪SPOT)、 Thermo Shandon全封闭脱水机。
2 实验方法
2.1实验分组将符合实验条件接种Hep-2细胞的裸鼠取28只，随机均分为 4组联合治疗组瘤体内注入20ul脂质体包裹的质粒 phTERTp-HRP10ug和腹腔注入2mmol/lIAA100ul，并予放疗；基因治疗 组瘤体内注入20ul脂质体包裹的质粒phTERTp-HRP10ug和腹腔注入 2mmol/lIAA100ul;单纯放射组瘤体和腹腔内分别注入20ul禾口100ul的
无血清培养基液，并予放疗；对照组瘤体和腹腔内分别注入20ul和
100ul的无血清培养基液。每周注射一次。用Y射线室温下照射移植肿瘤 的部位(射野20cmx20cm，源皮距=80 cm，剂量率=1091 cGy/min)，
Dt=30Gy/200cGy/15F。
2.2 抑瘤率每2天测量肿瘤体积，计算抑瘤率(Inhibition rate, IR，抑瘤率 =(1一实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)X 100%)。三周后麻醉放 血处死裸鼠，取标本测定相关指标。
2.3 苏木精-伊红染色(HE):取瘤组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片， HE染色，光镜下观察肿瘤组织的病理变化。
2.4末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡取各组肿瘤切片按 TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒说明书操作，光镜X400倍视野观察， 以细胞核呈棕黄色者为凋亡细胞，随机选取5个视野，计算凋亡指数 (apoptosis index, AI)气凋亡细胞数/癌细胞总数)X 100% 。
2.5统计学处理统计学分析实验数据用士s表示，应用方差分析进行F 检验和q检验，采用SPSS13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行统计 学分析，以PO.05为有统计学意义。
3 实验结果
3. 1 对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用 裸鼠接种成功率为88-90%， l周左右见皮下肿瘤形成，约二周左右肿瘤体积达 30 50mm:'，剔除体积大于和小于条件的裸鼠6只。
(1) 从图2移植瘤的生长曲线看，治疗第l周各组的生长速度相似，后对照组 的裸鼠生长迅速，以Hep-2R为甚；而联合治疗组最慢，体积最小。
(2) 计算各点的裸鼠移植瘤体积，比较发现试验第l周各组间无统计学差异 (户〉ft05)，第9天开始联合治疗组与对照组间最先出现差异(尸<0.05)，且随
着放疗的进程，差别增大。试验结束时测肿瘤体积如表l，联合治疗组的体积最 小(M0"。在Hep-2组放射能显著縮小肿瘤体积(尸<0.05)，而单纯瘤内注 射质粒则不能(尸>0.05^ ，但在Hep-2R组得出相反的结果。相同处理方法仅放 射组间有差异$=4.64， /^0.045)。
(3) 试验结束后，称肿瘤重量(如表l)，可见联合治疗能够最大程度抑制不 同放射敏感性喉癌移植瘤生长。
3. 2 服染色
如图3所示，对照组肿瘤细胞生长良好，肿瘤细胞形状不规则，可见病理性 分裂相，无明显的坏死区；其他组均出现均一红染的坏死区，基因治疗组呈岛状， 而单纯放射组和联合治疗组片状，以后者为甚。 3.3 细胞凋亡
TUNEL法测凋亡，计算凋亡指数，绘制图4。比较接种相同细胞各组，均有联 合治疗组的AI最高(P<0.01);基因治疗组AI大于单纯放射组，以H印-2R组为甚 (P<0.05)。相同处理方法比较，H印-2单纯放射组高于Hep-2R组而H印-2基因治 疗组低于H印-2R (P<0. 05)。
表l.各组裸鼠移植瘤的平均体积、抑制率及重量
分组肿瘤体积(mm3)抑瘤率(％)肿瘤重量(mg)
Piep-2A(联合治疗组)201,93士93,14"54.82231.31±91.44**
B(基因治疗组:i401.75±71.0010.12469.52±82.50
c(单纯放射组)304.52±78,46*31.87379.41±99.00*
D(对照组)446.98±86.14505.10±69.14
Hep-2RAR(联合治疗组)232.85±画.65**52.70260.90士106.9广
BR(基因治疗组)370.42士43.66'24.76440.35±57.63
CR(单纯放射组)408.62±85.2317.00496.64±101.64
Dr(対照組)492.33±72.71516.24±66.05
备注第21天瘤体体积比较Hep-2组内F= 11.11; Hep-2R组内F= 11.44。 瘤体重量比较Hep-2组内:F=14.21; Hep-2R组内:FU4。 *指与接种相 同细胞的对照组比较尸<0.05,"指与接种相同细胞的对照组比较户<0.07。
权利要求
1.一种γ射线在端粒酶逆转录酶基因启动子介导的基因治疗的药物中的应用。
2. —种Y射线联合phTERTp-HRP/IAA在制备治疗或预防喉癌细胞的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种γ射线联合phTERTp-HRP/IAA在治疗喉癌细胞药物中的应用，具体涉及γ射线对hTERT基因启动子活性的增强作用，γ射线与phTERTp-HRP/IAA共同用于杀伤人喉癌细胞的协同作用。本发明采用不同放射敏感性喉癌细胞在细胞和动物水平进行研究，检测启动子活性、下游基因表达产物的酶活性、移植瘤体积、重量、抑瘤率、瘤组织HE染色、细胞凋亡来评价γ射线与hTERT启动子调控HRP/IAA系统基因治疗联合使用时的协同杀伤作用。结果证实，γ射线与phTERTp-HRP/IAA联用时对人喉癌细胞有显著的杀伤作用。
文档编号A61K48/00GK101366950SQ20081019701
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月18日 优先权日2008年9月18日
发明者周云峰, 周福祥, 廖正凯, 谢丛华, 黄成虎 申请人:武汉大学