专利名称：：顺铂联合phTERT-HRP/IAA在治疗宫颈癌细胞药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，更具体涉及顺铂在增强端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子介导的基因治疗的药物中的应用，顺铂在增强hTERT启动子活性、增强下游基因表达中的作用。同时还涉及顺铂与hTERT启动子调控辣根过氧化物酶(HRP)/卩引哚乙酸(IAA)系统产生协同作用破坏宫颈癌细胞和抑制宫颈癌细胞生长药物中的应用。
背景技术：
：纵观国内外的疾病谱变化模式，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的重大疾病。随着分子生物学的进步，基因治疗为战胜肿瘤带来了希望。各国在恶性肿瘤基因治疗方面开展了大量研究并取得了一定成果，部分基因治疗方案已经用于临床，从安全性考虑，可以说适于肿瘤治疗。例如，中国拥有自主知识产权的重组人p53腺病毒注射液已获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书，用于治疗头颈部癌症和胃癌等恶性肿瘤。基因治疗的关键是靶向性问题，也就是把治疗效应限定在特定的靶细胞、靶组织或耙器官内，既达到治疗作用又不影响正常细胞和组织。外源调控在基因治疗中尤为重要。为了能特异而有效地杀伤肿瘤细胞，需要建立一种特异性高、活性强的启动子，来控制下游目的基因的表达。通过肿瘤特异性启动子调控目的基因的表达被广泛地运用于肿瘤靶向基因治疗的研究中，这种方法遇到的困难在于，1.绝大多数选择性启动子只针对特殊的组织来源，而没有能够适用于不同组织来源的启动子；2.绝大多数选择性启动子启动效力较弱，很难达到治疗水平的转基因表达。到目前为止，几乎没有既有高特异性，又有高活性的肿瘤特异性启动子，这直接阻碍了基因治疗的发展。目前，hTERT基因启动子己被大多数学者公认为是针对恶性肿瘤普遍性最好的启动子，是最有希望应用于肿瘤靶向基因治疗的启动子。提高基因治疗中hTERT启动子活性，将有助于下游治疗基因的表达、提高疗效，这一点我们在治疗过程中应当重点考虑。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，能够维持染色体末端的端粒长度。端粒酶在超过85%的人类恶性肿瘤细胞中具有高活性，而在正常组织(除生殖细胞和有高度复制潜能的体细胞)中被抑制或不表达(见参考文献ShayJW，BacchettiS.Asurveyoftelomeraseactivityinhumancancer.EurJCancer,1997，33:787-791)。细胞中hTERT的表达是端粒酶活性的主要决定因素，它在大部分肿瘤细胞中高表达(见参考文献CongYS，WrightWE，ShayJW.Humantelomeraseanditsregulation.MicrobiolMolBiolRev，2002,66:407-425)。hTERT基因启动子作为肿瘤特异性启动子被运用到多种肿瘤的靶向基因治疗方案中，但其活性较弱，下游基因表达产物往往难以实现理想的效果(见参考文献GuJandFangB:Telomerasepromoter-drivencancergenetherapy.CancerBiolTher，2003，2:S64-S70)。如果能够增强hTERT基因启动子的活性，必将推动肿瘤靶向治疗的进步，具有重要的理论和临床意义。部分人尝试通过添加顺式作用元件c-Myc结合位点、Spl结合位点(见专利文献WO/2004/076668)等，来修饰端粒酶逆转录酶基因启动子，增强启动子活性。由于启动子的活性调节机制尚不明确，且添加的这些反应元件在细胞内广泛存在，受多种因素调节，所以，特异性和强度都有待检验。20世纪60年代，Rosenberg等(见参考文献RosenbergB，VanCampL，TroskoJE，etal.Platinumcompounds:anewclassofpotentantitumorangents.Nature,1969，222:3852-3861)偶然发现顺钼(DDP)能够抑制细胞分裂，引起了人们的强烈兴趣，由此拉开了铂类抗肿瘤药物研究的序幕。时至今曰，顺铂仍是用于癌症治疗的最常用的药物之一，它对睾丸癌、卵巢癌、喉癌、支气管癌、宫颈癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、膀胱癌以及神经母细胞瘤等有显著疗效。但是，顺铂具有严重的肾毒性、神经毒性、胃肠道毒性及耳毒性，从而限制了其给药剂量;此外，一些肿瘤组织对顺铂具有先天耐药性，还有些肿瘤在初次给药时对顺钼敏感，长期使用则会产生耐药性。到了20世纪七八十年代，人们以减小顺铂的毒副作用为目的，在顺铂的结构基础上，合成了大量的顺铂类似物进行抗肿瘤活性筛选，最终有28个化合物进入了临床(见参考文献:WongE，GiandomenicoCM.Currentstatusofplatinum—basedantitumordugs.ChemRev，1999，99:2451-2466)。目前应用于临床的铂类化疗药物主要包括顺铂、卡铂、环硫铂、奥沙利铂、奈达铂，它们的作用机制都是以DNA为耙作用部位，靶原子与DNA形成交联，阻断其复制和转录。目前为止，国外的4家实验室在研究中用到了DDP和hTERT启动子介导的基因治疗，取得了理想的治疗效果。2004年，Nakamura等(见参考文献Nakamura，M.，S.Kyo，etal.hTERT-promoter-basedtumor-specificexpressionofMCP-1effectivelysensitizescervicalcancercellstoalowdoseofcisplatin.CancerGeneTher，2004，11:1_7)它们发现在细胞水平和动物水平研究中，用hTERT启动子调控单核细胞趋化蛋白-l(MCP-1)在宫颈癌细胞中特异性表达，同时给予非常低浓度的DDP，能够明显抑制宫颈癌细胞的生长，研究者认为是由于MCP-1能够诱导巨噬细胞聚集杀伤肿瘤细胞，增加宫颈癌细胞对DDP的敏感性。研究者的主要目的在于证明MCP-l用于基因治疗的有效性。Takeuchi等(Takeuchi，H.，T.Kanzawa，etal.Combinationofcaspasetransferusingthehumantelomerasereversetranscriptasepromoterandconventionaltherapiesformalignantgliomacells.IntJ"Oncol，2004，25:57-63)在研究hTERT启动子调控半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-6(Caspase-6)表达的基因治疗中，联合凋亡诱导剂(顺铂、紫杉醇、卡氮芥)和非凋亡诱导剂(替莫唑胺、Y射线)，观察对恶性胶质瘤细胞的杀伤效果。结果发现，它们在半数抑制率(IC50)时顺铂或卡氮芥的联合使用能够降低细胞中的端粒酶活性，导致联合杀伤作用下降。结论是hTERT/rev-caspase-6基因治疗需要与既可以诱导凋亡，又不抑制端粒酶活性的措施联合使用治疗恶性胶质瘤。紫杉醇是一种较好的选择。Li等(Xi，B.，J.Fan,etal.Suppressionofcolorectaltumorgrowthbyregulatedsurvivintargeting.JMolMed，2006，84:1077-86)在研究米非司酮(RU486)系统时，运用hTERT启动子调控RU486实现下游survivin基因显性负性突变体在直肠细胞中的特异表达，与顺铂联用时能够明显抑制肿瘤生长。结论是这种改造的RU486调控系统适用于肿瘤耙向治疗。Toyota等(Toyota,H.，S.Kondo，etal.EnforcedexpressionofatruncatedformofBax-alpha(tBax)drivenbyhumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)promotersensitizestumorcellstochemotherapeuticagentsortumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL).AnticancerRes,2006，26:99-105)采用hTERT启动子调控tBax基因在肿瘤细胞中特异性表达，结果发现tBax能够增强肿瘤坏死因子受体高表达，导致增强细胞杀伤效果。在高表达Bel-x(L)的成骨肉瘤细胞中促凋亡基因tBax能够有效的诱导细胞死亡。结论是tBax单独使用或与包括顺铂在内的化疗药物一同使用时对高表达抑凋亡基因Bcl-x(L)的癌细胞具有较好的杀伤效果。可以发现，在以上4项研究中，使用hTERT启动子的目的在于限制目的基因在肿瘤细胞中特异表达。使用DDP的目的不在、也没有证明他对hTERT启动子活性的增强作用及可能的提高下游目的基因的表达量。基因导向性酉每前体药物疗法(gene-directedenzym印rodrugtherapy,GDEPT)，亦称自杀基因疗法，是目前基因治疗领域研究的热点。其原理为当基因在肿瘤细胞中表达时可将全身给药的无毒性或毒性极低的药物前体转变成毒性代谢产物，在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞，避免全身或局部直接给药的副作用。人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统和胞嘧啶脱氨酶(CD)/5_氟胞嘧啶(5-FU)系统都是被广泛研究的自杀基因治疗体系。辣根过氧化物酶(冊P)/吲哚乙酸(IAA)系统是新一代前药系统，与经典的HSV-TK/GCV系统相比具有更加快速和高效的肿瘤细胞杀伤作用(见参考文献Greco0，FolkesLK，WardmanP，etal.Developmentofanovelenzyme/prodrugcombinationforgenetherapyofcancer:horseradishperoxidase/indole-3_aceticacid.CancerGeneTher，2000，7:1414-1420)。无毒的HRP/IAA系统显示出不依赖于细胞连接的细胞毒性和旁观者效应，在极端的肿瘤细胞缺氧条件下甚至更加高效，而且它能够有效地增强肿瘤细胞的放射敏感性(见参考文献Greco0，RossiterS，KanthouC，etal.Horseradishperoxidase-mediatedgenetherapy:choiceofprodrugsinoxicandanoxictumorconditions.MolCancerTher，2001，1:151-160;Greco0，TozerGM，DachsGU.Oxicandanoxicenhancementofradiation—mediatedtoxicitybyhorseradishperoxidase/indole-3-aceticacidgenetherapy.IntJ"RadiatBiol，2002，78:173-81)，HRP/IAA系统是一种理想的基因治疗选择。HRP基因在肿瘤细胞中特异性表达是HRP/IAA系统发挥优势的关键。同时暗示了，将朋P/IAA系统与化疗药物，如铂类联用的诱人前景。
发明内容.本发明的目的是在于提供了一种顺铂在增强端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子介导的基因治疗的药物中的应用，将顺铂用于肿瘤基因治疗中hTERT基因启动子的增强剂，增强hTERT基因启动子活性及下游基因的表达量。本发明的另一个目的是在于提供了一种顺铂联合phTERTp-服P/IAA作为制备治疗或预防宫颈癌细胞的药物中的应用。此方案与单用顺钼、单用phTERTp-HRP/IAA或两者疗效简单相加比较，对宫颈癌细胞具有更加明显的杀伤作用。而且，hTERT基因启动子保证服P/IAA只在肿瘤细胞局部发挥杀伤作用，具有肿瘤特异性，即增强肿瘤局部疗效的同时不增加对正常细胞的损伤。本发明采用人宫颈癌细胞进行研究，通过hTERT启动子调控的下游荧光素酶报告基因(Luc)的表达，评价顺铂对hTERT启动子活性的影响。并通过检测细胞增殖率、细胞凋亡率、细胞周期来评价顺铂与hTERT启动子调控HRP/IAA系统基因治疗联合使用时的协同杀伤作用和机制。具体
发明内容如下A.顺铂是铂类药物中具有代表性的一种，是目前临床使用最多的一类铂类药物。与其它铂类药物一样，顺铂主要作用靶点为DNA，与DNA链间及链内交链，形成DDPDNA复合物，从而干扰DNA复制，造成细胞死亡，属周期非特异性药。扩大以顺铂为代表的铂类药物的应用范围具有明显的可行性和实际的临床意义。B.顺铂对hTERT启动子活性的增强作用质粒phTERTp-Luc由申请人构建(见.参考文献LiaoZK，ZhouFX,LuoZG，ZhangWJ,XiongJ，BaoJ，HanG，ZhangMS，XieCH，ZhouYF.Radio-activationofhTERTpromoterinlarynxsquamouscarcinomacells:An'indirected-activator'strategyinradio-gene-therapy.OncolR印.19(2008)281-286.),内参质粒pRL-TK和对照质粒pGL3-Basic(购于PROMEGA公司)脂质体转染Hela细胞(GDC009，中国典型培养物保藏中心，CCTCC)，细胞转染后24h，分为0、0.5、1、2、5、10、20、30ug/ml终浓度顺铂组，孵育24小时，双荧光试剂盒(Promega公司)检测萤火虫荧光素酶(Uc)和海肾荧光素酶(RL)活性。C.顺铂与hTERT启动子调控服P/IAA系统基因治疗对宫颈癌细胞的协同杀伤作用Hela细胞分分为4组A对照组，B顺铂组，C基因组，D联合组；基因组和联合组转染phTERTp—HRP质粒24h后加入终浓度为0.5mmol/L的IAA，顺铂组和联合组加入终浓度为5ug/ml顺铂，孵育24小时，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各组细胞增殖率，AnnexinV-FITC/PI试剂盒比较各组细胞凋亡率，流式细胞仪分析各组细胞周期时相变化。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1.本发明表明，顺铂能增强hTERT启动子活性，增强下游基因的表达。DDP浓度为2ug/ml和5ug/ml时，hTERT启动子活性显著增强,具有统计学意义。2.本发明表明，顺铂与phTERTp-HRP/IAA联合比单纯顺铀、单纯phTERTp-冊P/IAA或两者简单相加获得的杀伤效果都要明显。联合组细胞增殖率为11.1%，明显低于其它各组，具有统计学差异(PO.Ol)。联合组细胞早期凋亡率达39.8%，明显高于其它各组，具有统计学差异(PO.Ol)。3.本发明表明，phTERTp-HRP/IAA自杀基因系统联合顺铂作用于Hela细胞比单一基因治疗或单一顺铂治疗具有更明显的生长抑制和凋亡促进作用，进一.步使阻滞于S期的细胞比例增加，具有统计学差异(P<0.05)。4.hTERT启动子调控下游基因在绝大部分肿瘤细胞中表达，而在绝大部分正常细胞中不表达，因此，hTERT启动子介导的基因治疗可以实现肿瘤靶向治疗。5.以顺铂为代表的铂类药物在临床上应用于数十种肿瘤化疗方案，hTERT启动子介导的针对大多数肿瘤的靶向基因治疗方案有百余种，两者联合适用于多种肿瘤的治疗，并且能够选择不同的hTERT启动子下游基因，达到不同的治疗目的，根据患者具体情况选择，实现个体化治疗。6.所述的药物作为制备治疗或预防肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、子宫癌、子宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌、喉癌、胰'腺癌、卵巢癌、胶质瘤、肾癌、头颈部癌、阴道癌、黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌，以及肉瘤等恶性肿瘤中的应用。图l.为不同浓度DDP作用于Hela细胞后荧光素酶的表达。DDP浓度为2ug/ml和5ug/ml时，荧光素酶的表达显著增强，具有统计学意义(PO.01)。本实验结果证明一定剂量的DDP可以提高外源性hTERT启动子活性，使下游报告基因的表达增强。图2.不同浓度DDP对Hela细胞增殖率影响。当DDP浓度《lug/ml时，细胞增殖率与未加药组无明显差异，当DDP浓度》2ug/ml时，细胞增殖率与未加药组差异有显著性，且随着DDP浓度的增加，Hela细胞的增殖率逐渐下降，在浓度为5ug/ml时细胞增殖率约50n/c)，在浓度为30ug/ml时细胞增殖率接近于0，因此申请人:选用5ug/ml浓度进行后续研究。图3.A皿exinV-FITC/PI法检测各组细胞早期凋亡率。A组空白对照组；B组顺铂治疗组；C组HRP/IAA自杀基因治疗组；D组联合治疗组。各组细胞均可分为四个区域，坏死(Dl区)，晚期凋亡(D2区)，非凋亡(D3区)，早期凋亡(D4区)。由图可见，联合治疗组能够最大程度的诱导细胞凋亡。图4.流式细胞术分析各组细胞周期分布A组空白对照组；B组顺铂组；C组HRP/IAA自杀基因治疗组；D组联合治疗组。结果显示，与A组相比，B、D组G0/G1期细胞比例显著降低(pO.Ol)，B，C，D组S期细胞比例显著升高(p<0.05)，C、D组G2/M期细胞比例亦显著降低(p<0.05);D组与B组比较，G0/G1期、S期细胞比例无统计学差异，G2/M期细胞比例百分比降低(p<0.05);D组与C组比较，G0/G1期细胞比例降低，S期细胞比例百分比升高(p<0.05)，但G2/M期细胞比例无统计学差异，见表2。提示两者的联合应用使滞留于S期的细胞比例进一步增加，推测这可能是两者联合应用能更显著抑制Hela细胞生长的又一重要原因。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例l顺铂增强hTERT启动子活性的作用1实验材料1.1细胞人宫颈癌细胞(Hela，CCTCC编号GDC009)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC),常规细胞培养和传代。1.2质粒质粒phTERTp-Luc已由申请人成功构建(见参考文献LiaoZK，ZhouFX，LuoZG，ZhangWJ，XiongJ"，BaoJ"，HanG，ZhangMS,XieCH，ZhouYF.Radio-activationofhTERTpromoterinlarynxsquamouscarcinomacells:An'indirected-activator'strategyinradio-gene-therapy.OncolR印.19(2008)281—286.),内参质粒pRL-TK和对照质粒pGL3-Basic购于PROMEGA公司。1.3试剂脂质体METAFECTENE购于Biontex公司，双荧光检测试剂盒购于PROMEGA公司。DDP购于德州德药制药有限公司，含10%小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco公司。1.4仪器TD-20/20型荧光发光计(美国TurnerDesigns公司)，DU530紫外可见光分光光度计(美国BeckmanCoulter公司)。2.实验方法2.1细胞转染转染前1天，取指数生长期的细胞，胰酶消化，以每孔IX105接种于24孔板，用含5%C02的37。C温箱孵育24h。将phTERTp-Luc和pRL-TK(做为内对照)共同以脂质体METAFECTENE介导转染至Hela细胞，按DNA(ug):METAFECTENE(lU)=0.5:2转染，具体操作按脂质体METAFECTENE试剂盒说明书进行。细胞转染后放入含5%C02的37'C温箱孵育5h后，换含10%的小牛血清的RPMI-1640培养基继续培养。2.2DDP处理细胞转染后24h，分为0、0.5、1、2、5、10、20、30ug/ml终浓度顺铂组，每组6个平行孔，用含5%(:02的37'C温箱继续培养24h，按照双荧光检测试剂盒说明书裂解并收集细胞2.3检测TD-20/20型荧光发光计检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性使用荧光发光计按照双荧光检测试剂盒说明书对裂解细胞进行荧光检湖U，记录数据。2.4统计学处理各组数据用SPSS13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行方差分析和组间q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。3实验结果请见附图1。实施例2顺铂化疗与phTERTp-HRP/IAA联合对宫颈癌细胞的杀伤作用1实验材料1.1细胞细胞人宫颈癌细胞(Hela，CCTCC编号GDC009)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，常规细胞培养和传代。1.2质粒质粒phTERTp-HRP已由申请人成功构建(见参考文献LiaoZK，ZhouFX，LuoZG，ZhangWJ,XiongJ，BaoJ，HanG，ZhangMS,XieCH，ZhouYF.Radio-activationofhTERTpromoterinlarynxsquamouscarcinomacells:An'indirected-activator，strategyinradio-gene-therapy,OncolRep.19(2008)281-286)。1.3试剂脂质体METAFECTENE购于Biontex公司，双荧光检测试剂盒购于PROMEGA公司。n引哚乙酸购于Fluka公司，凋亡试剂盒A皿exinV-FITC试剂盒购于晶美生物工程有限公司，Rnase和PI购于天源生物技术公司，MTT和DMSO购于天源生物技术公司，DDP购于德州德药制药有限公司，含10%小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco公司1.4仪器DU530紫外可见光分光光度计(美国BeckmanCoulter公司)，FC500全自动流式细胞分析仪(美国BeckmanCoulter公司)，RT-6000酶标仪(北京六一仪器厂)2实验方法2.1实验分组实验分为四组A对照组，Hela细胞未经任何处理；B顺铂组，顺铂作用于Hela细胞；C基因组，phTERTp-HRP转染Hela细胞后，联合吲哚乙酸；D联合组，phTERTp-HRP转染Hela细胞后，联合吲哚乙酸和顺铂.。2.2药物处理IAA和DDP分别溶于灭菌PBS溶液中，用0.22nm微孔滤膜过滤除菌备用，细胞转染后24h，在基因组加入终浓度为0.5mmol/L的IAA，化疗组中加入终浓度5ug/ml顺铂，在联合组加入终浓度为0.5mmol/L的IAA和终浓度5ug/ml顺铂，未加药组用等体积液体培养基替代IAA或DDP，在5XC02的37。C温箱孵育48h。2.3MTT检测细胞增殖率取指数生长期Hela细胞，胰酶消化后以每孔3X104细胞接种于％孔板(分4组，每组6个平行孔，并设一组空白培养基)，每孔总液量为200ul。用含5%<:02的37。C温箱孵育24h，将phTERTp—HRP按DNA(ug):METAFECTENE(ul)=1:6转染介导转染基因组和联合组Hela细胞。转染后24h，处理如2.2.在处理后44h加入5g/LMTT液20ul，37°C、5%C02下继续孵育至48h，弃去上清液，每孔加入DMSO150ul，振荡10min，于30min内在RT-6000酶标仪上测定每孑L492nm光的吸收值(A492)。计算各组增殖率增殖率=(实验孔A值一空白组A值)/(对照孔A值一空白组A值)X100%。2.4AnnexinV/PI凋亡检测试剂检测细胞凋亡率转染前1天，取指数生长期的细胞，胰酶消化，以每孔5X1()S接种于6孔板，用含5XC02的37t:温箱孵育24h。将phTERTp-HRP以脂质体METAFECTENE介导转染至Hela细胞，按DNA(ug):METAFECTENE(ul)=2:6转染，具体操作按脂质体METAFECTENE试剂盒说明书进行。细胞转染后放入含5%C02的37。C温箱孵育5h后，换含10%的小牛血清的RPMI-1640培养基继续培养。细胞转染后24h，处理如2.2.用去离子水按l:4稀释结合缓冲液(20ml结合缓冲液+60ml去离子水)；将每组单细胞悬液离心沉淀(2000rpm,10min)，弃去上清，用4。C预冷的PBS洗细胞两次，用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为lX10"ml;取100nl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5ulAnnexinV/FITC和10ul20ug/ml的碘化丙锭溶液；混匀后于室温(20-25°C)避光孵育15min;在反应管中加400ulPBS，流式细胞仪(FCS)分析；本实验每组设三个平行样本，重复三次。2.5流式细胞仪分析细胞周期时相变化细胞转染及处理同前；处理48h后收集细胞，将每组单细胞悬液离心沉淀(2000rpm，10min)弃去上清，用预冷的PBS洗涤两次，调整细胞浓度为1X106/1111，加入lmlPI综合染液；将加入染液的细胞悬液置于4'C冰箱，染色2030min;离心(200rpm，10min)洗去PI染液，加入0.5mlPBS，上流式细胞仪检测。本实验设三个平行样本，重复三次。2.6统计学处理各组数据用SPSS13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行方差分析和组间q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。3实验结果3.1DDP人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用本研究显示低浓度DDP(《lug/ml)对Hela细胞无明显抑制作用，当浓度^2ug/ml时，随着DDP浓度的增加，Hda细胞的增殖率逐渐下降，呈量效关系，在浓度为30ug/ml时细胞增殖率接近于0(图2);由图3和表1可见化疗组的早期凋亡率为(11.1±1.36)%,显著高于对照组；与对照组相比(图4，表2)，化疗组G0/G1期细胞比例显著降低(pO.Ol)，S期细胞比例显著升高(pO.Ol)，提示顺铂通过诱导细胞凋亡，将细胞阻滞于S期而抑制Hela细胞生长。表l.各组细胞早期凋亡率(5±s%，n=3)分组早期凋亡率(％)A组(对照组)2.7±1.10B组(顺铂组)ll.l±1.36aC组(基因组)13.5±1.90aD组(联合组)39.8±2.61a'b'e注与A组相比ap〈0.01与B组相比bp〈0.01与C组相比ep〈0.01表l.各组早期凋亡率。结果显示，顺铂组、基因组、联合组细胞早期凋亡率与对照组相比较均显著增高(PO.01),联合组与顺铂组、基因组分别比较，早期凋亡率升高更显著，具有统计学差异(P<0.01)。表2.各组细胞周期改变(x±s%，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>c注与A组相比apO.Ol，bp<0.05;与B组相比Cp<0.05;与C组相比dpO.Ol表2.各组细胞周期分布。B，C，D组与A组比较，G0/G1期细胞比例显著降低，S期细胞比例显著升高，均具有统计学差异。3.2HRP/IAA系统对人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用表3结果显示，C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞增殖率明显低于A组(对照组)(pO.Ol)，可见HRP/IAA系统能抑制Hda细胞生长；C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞早期凋亡率明显高于A组(对照组)(图3，表l，p<0.01),可见HRP/IAA系统能诱导Hela细胞凋亡；图4和表2可见C组(HRP/IAA基因治疗组)比A组(对照组)G2/M期细胞比例降低，S期细胞比例显著增高(p<0.05)，表明HRP/IAA可将Hela细胞阻滞在S期，提示由HRP/IAA诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞可能是Hela细胞生长抑制的一个重要的原因。3.3phTERTp-HRP/IAA联合顺铂对人宫颈癌Hela细胞株的生长抑制作用结果显示，D组(联合治疗组)细胞增殖率分别高于B(顺铂化疗组)、C(基因治疗组)两组(表3,pO.Ol);D组细胞早期凋亡率分别高于B、C两组(图3，表l，p<0.01)，可见两者联合应用进一步诱导细胞凋亡，对肿瘤细胞的生长起到更显著的抑制作用。D组与B组比较，G2/M期细胞比例百分比降低(图4，表2，p<0.05);D组与C组比较，G0/G1期细胞比例降低，S期细胞比例百分比升高(p<0.05)。表3.各组细胞增殖率(5±s%，n=6)分组增殖率(％)A组(对照组)100B组(顺铂组)49.4±4.45aC组(基因组)73,7±3.20aD组(联合组)ll.l±3.50a'b'e注与A组相比ap〈0.01与B组相比bp〈0.01与C组相比ep〈0.01表3.各组细胞增殖率。B，C，D组的增殖率均显著低于对照组(PO.Ol)，D组与B、C组分别比较，增殖率降低更显著，具有统计学差异(PO.Ol)。根据本研究，phTERTp-HRP/IAA自杀基因系统联合DDP对Hela细胞的协同作用机制与下列因素有关1.DDP可以提高hTERT基因启动子活性，使下游自杀基因HRP的表达增强，从而增加IAA对Hela细胞的毒性作用。2.HRP/IAA系统和化疗药物DDP各自都可将Hela细胞阻滞在S期，两者的联合应用使滞留于S期的细胞比例进一步增加，具有相互增敏的作用，达到协同治疗效果。权利要求1.一种顺铂在端粒酶逆转录酶基因启动子介导的基因治疗的药物中的应用。2.—种顺铂联合phTERTp-HRP/IAA在制备治疗或预防宫颈癌细胞的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种顺铂联合phTERTp-HRP/IAA在治疗宫颈癌细胞药物中的应用，具体涉及顺铂对hTERT基因启动子活性的增强作用，顺铂与phTERTp-HRP/IAA共同用于杀伤人宫颈癌细胞的协同作用，并探讨其作用机制。本发明采用Hela细胞进行研究，通过hTERT启动子调控的下游荧光素酶报告基因的表达，评价顺铂对hTERT启动子活性的影响。并通过检测细胞增殖率、细胞凋亡率、细胞周期来评价顺铂与hTERT启动子调控HRP/IAA系统基因治疗联合使用时的协同杀伤作用和机制。结果证实，顺铂可以增强hTERT基因启动子活性，与phTERTp-HRP/IAA联用时对人宫颈癌细胞有显著的杀伤作用。文档编号A61K33/24GK101375860SQ20081019701公开日2009年3月4日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者周云峰,周福祥,廖正凯,张红艳,谢丛华申请人:武汉大学