专利名称：一种角膜后板层及其用途的制作方法
一种角膜后板层及其用途
技术领域：
本发明涉及医学和生物工程中的医用材料领域，具体地说，是关于一种角膜后板
层及其用途。背景技术：
全世界每年约有100万以上的患者因为角膜内皮细胞功能失代偿而导致失明。穿 透性角膜移植术是目前取代病变或受损的角膜内皮细胞、恢复角膜透明性的主要治疗方 法。虽然穿透性角膜移植的成功率较高，但是仍然受到了供体材料来源严重短缺、某些病例 发生的严重排斥反应以及术后造成的医源性散光等问题的限制。近年来兴起的后板层角膜 内皮移植术克服了穿透性角膜移植术的许多不足，但是仍然存在供体角膜缺乏的限制。在 美国，只有60%的供体角膜可以用于角膜移植，剩下的40%供体由于内皮细胞密度太低而
不能使用。因此，体外扩增培养种子细胞构建组织工程角膜后板层以代替损伤的角膜内皮， 已成为当前的研究热点，并有望解决角膜内皮移植供体不足的难题。 角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层组织构成。角膜组织含有三 种构成细胞角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞。其中，前弹力层和后弹力层不含有细胞 成分。Tsai以羊膜组织为载体，选取患者健侧角膜缘上皮组织约lmmXlmm体外培养，重建 受损伤的角膜表面6例。手术后l个月角膜表面上皮层重建，角膜透明度得到改善。术后 随访l年以上，其中5例患者视力由20/112上升至20/45，另l例由于化学烧伤至角膜完全 混浊的患者，视力从数指改善至20/200。随访期间，移植区域未有新生血管再生以及炎症反 应。现有技术中有如下的文献报道将体外分离培养的兔角膜基质细胞接种到聚羟基乙酸 材料上，再回植到兔角膜基质层。术后8周，角膜逐渐恢复透明，移植的细胞-材料复合物 形成新生角膜基质样组织。异种角膜脱细胞基质为载体，在其上皮面和内皮面分别接种兔 角膜上皮细胞和内皮细胞，体外培养2周，所构建的上皮_脱细胞基质载体_内皮复合物初 具角膜的雏形结构。以上研究成果都为体外构建角膜后板层提供了理论基础和技术支持。
构建组织工程角膜后板层的一个必要条件就是要有健康的种子细胞。目前构建角 膜后板层的细胞主要来源于角膜本身。Maurice于1972年首次提出了将组织培养的角膜 内皮细胞移植到内皮细胞不健康的角膜上的设想，体外培养的角膜内皮细胞形态与活体类 似，具有分泌后弹力层样物质、合成胶原、形成基底膜的能力。此外，被尝试用于构建角膜后 板层的细胞还有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞等。Bednarz等将病毒癌基 因SV40转染到角膜内皮细胞中，建立了永生细胞系。这些基因调控的内皮细胞不但可在体 外大量增殖，同时保留了正常内皮细胞的形态、结构和功能，在体外可形成多角形的单层内 皮层，且细胞表达内皮细胞的连接标志Z01和整联蛋白Gl，尤其是角膜内皮细胞的泵功能 亦可检测到。Joo等报道了将转染了 SV40的鼠角膜内皮细胞移植到鼠角膜，观察6周后仍 有90%的角膜维持透明。 角膜内皮细胞的培养已经有40多年的历史。但是人角膜内皮细胞在体内不能增 殖，在体外多种生长因子的诱导下亦只能有限的增殖，长期培养较难实现。目前实验中所用的动物大多为鼠或兔，而鼠和兔的角膜内皮细胞本身就存在着较强的增殖能力，其实验结 果不具有代表性。胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞等异位细胞接种到角膜 上，其表型转化机制不明确，从而在功能上也不可能完全达到角膜内皮细胞的效果。通过转 染SV40而建立的永生内皮细胞系，其应用也存在着安全性的问题。由于永生细胞持续分 裂，即使在达到一定的细胞密度后仍然不会停止分裂，过多的子代细胞脱落到前房，会阻塞 小梁网，同时也存在着致瘤的危险；基因转染需要将病毒载体引入人体，目前并不清楚这些 载体是停留于局部还是遍布全身，同时也缺乏长期的观察结果。
发明内容
本发明的目的是，提供一种角膜后板层。 本发明的再一的目的是，提供一种角膜后板层的用途。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种角膜后板层，所述的角膜后板层 由下列方法制得 (a)、猫角膜内皮前体细胞的分离和培养，得到角膜内皮前体细胞；
(b)、猪角膜脱细胞基质的制备，得到脱细胞基质；
(C)、角膜后板层的构建。 所述的步骤(c)是将步骤(a)中的角膜内皮前体细胞制成5X 106/ml浓度的细胞 悬液，接种100 iU到步骤(b)中脱细胞基质的表面，构建角膜后板层。
所述的步骤(c)还包括将角膜后板层于37°C 5% C02饱和湿度培养箱中静置2h， 再加入400 ii 1培养液，继续培养。 所述的步骤(a)中用内皮细胞的Descemet膜与0. 2%复合胶原酶混合，内皮细胞 的Descemet膜与O. 2%复合胶原酶的体积比为1 : 5。 所述的步骤(a)中将角膜内皮细胞以lX10Vml的低浓度接种，经克隆培养而得 到的。 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是角膜后板层作为供体用于角 膜移植。 本发明优点在于本发明主要是从猫的角膜内皮细胞中分离并体外培养出前体细 胞，以角膜内皮前体细胞作为种子细胞接种到异种角膜脱细胞基质载体上，体外构建组织 工程角膜后板层。猫的角膜内皮细胞在体内不能增殖，提供了与人相似的生物学模型。角膜 内皮前体细胞作为角膜内皮细胞的未完全分化状态，具有较强的增殖能力、自我更新能力 以及多向分化能力。以角膜内皮前体细胞构建的组织工程角膜后板层，其结构与正常的角 膜后板层结果近似。以角膜内皮前体细胞作为种子细胞构建角膜后板层，可以提供充足的 细胞来源，克服角膜内皮细胞增殖能力低的难题，同时又不存在细胞转化以及安全性的问 题，可以为角膜内皮移植提供大量的供体。所构建的组织工程角膜后板层可用于模拟生理 性角膜进行生理、病理和药理学的基础研究，同时也可作为供体直接用于治疗性角膜移植。
图1 :细胞接种后第3天形成克隆，即其中含有角膜内皮前体细胞。
图2 :克隆体积不断增大，至第10天左右达至稳态。
图3 :传代后细胞形成的克隆。 图4 :免疫荧光化学染色表明角膜内皮前体细胞表达nestin。 图5 :角膜脱细胞基质透明，维持一定的曲率。 图6 :HE染色显示角膜脱细胞基质结构致密。 图7 :扫描电镜下见角膜脱细胞基质表面平滑。 图8 :透射电镜观察角膜脱细胞基质的纵切面，见胶原纤维排列整齐。 图9 :HE染色显示分化的单层角膜内皮前体细胞连续贴附于角膜脱细胞基质。 图10 :透射电镜观察显示分化的角膜内皮前体细胞贴附在角膜脱细胞基质上，细
胞器丰富。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的一种角膜后板层及其用途的具体实施方式
做详细 说明。 实施例 —、猫角膜内皮前体细胞的分离和培养 将猫眼球经PBS清洗后放入消毒盘内。仔细分离结膜组织，小心刮除上皮，沿角 膜缘外lmm剪下角膜组织，置于匿EM/F12(1 : l)培养液中。用刀片轻轻刮除角膜上皮细 胞，用眼科镊小心揭取含有内皮细胞的Descemet膜。将Descemet膜反复剪碎，加入0. 2% 复合胶原酶(Descemet膜组织块与胶原酶的体积比约为1 : 5，组织块与胶原酶的体积比 为1 : 5，可以达到既不浪费胶原酶，对细胞损伤小，又可以有效地消化Descemet膜，縮短 操作时间的优点。组织块与胶原酶的体积比低于l : 5，则胶原酶量相对较多，造成不必要 的浪费，同时损伤内皮细胞的活性，死细胞数目增加；高于l : 5，则胶原酶量相对较少，所 需消化时间长，增加了细胞污染的机率，对细胞活性也有影响；)，37t:消化约40min。再加 入O. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA，用吸管轻轻吹打2min。用含有10%胎牛血清的DMEM/ F12(1 : 1)细胞培养液终止消化。1500r/min离心5min。弃去上清，用细胞培养液(DMEM/ F12(1 : l)培养液，含有EGF 10ng/ml，bFGF 20ng/ml)重悬，制成单个细胞悬液，以1 X 104/ ml的低浓度接种于24孔板(以lX10Vml的低浓度接种，经充分吹打后，可以制成单个 细胞悬液，细胞贴壁后形成多细胞克隆的几率较小)。以十字方向轻轻晃动培养皿，使细 胞分散均匀。将培养皿移入培养箱，在371:、5% (A及饱和湿度的环境下静止培养2 3周。3天后第一次换液，以后隔日换液。当克隆数量与体积不再增长时，用0.25%胰蛋 白酶-0.02XEDTA将形成克隆的细胞消化下来，离心后弃上清。细胞计数，用细胞培养液 (DMEM/F12(1 : l)培养液，含有EGF 10ng/ml，bFGF 20ng/ml)重悬，以1 X 104/ml的浓度接 种，继续克隆培养。置37t:、5XC02饱和湿度培养箱中培养。第二天换液，以后隔日换液。
细胞培养至第3天即可见有细胞呈集落样生长，形成克隆(图1)，即角膜内皮前体 细胞。克隆数目逐渐增多，克隆体积也不断增大，至第IO天左右生长速度减慢。此后克隆 的形态相对稳定，可维持数天(图2)。克隆传代培养的细胞在接种3天后有克隆形成，克隆 大小与原代克隆相似(图3)。用免疫荧光化学法检测形成克隆的细胞nestin的表达，可见 胞浆发出绿色的荧光，表明结果为阳性(图4)。
二、猪角膜脱细胞基质的制备
5
将猪眼球置于75%乙醇中浸泡30min，无菌条件下剪取角膜，用PBS漂洗。将角膜 浸于含1 % Triton X-100溶液的离心管中，于4。C条件下振荡24h， PBS反复漂洗；用刀片 沿平行板层方向将角膜分为4份；再将角膜浸于含1% Triton X-100溶液的离心管中，于 4t:条件下振荡24h，PBS反复漂洗；将每个角膜片再分为2份；再将角膜浸于含1% Triton X-100溶液的离心管中，于4t:条件下振荡24h， PBS反复漂洗直至液体无泡沫。角膜片放 在24孔培养板中，置于超净台内， 一边紫外消毒， 一边过夜通风干燥。干燥后的角膜片置于 DMEM/F12(1 : l)细胞培养液中，备用。 制备的脱细胞基质在超净台内通风干燥后变薄，呈透明玻璃纸样，但是有韧性，不 易撕裂。复水后脱细胞基质仍然透明，维持角膜的自然曲率(图5)。 HE染色见角膜脱细胞 基质中没有蓝色的细胞核，表明细胞成分被完全脱净。通风干燥的脱细胞基质板层结构致 密，胶原纤维平行排列(图6)。扫描电镜下见角膜脱细胞基质表面光滑平整，无细胞残留 (图7)。透射电镜下见角膜脱细胞基质纵切面胶原纤维排列整齐，较致密，无细胞成分(图 8)。 三、角膜后板层的构建 将培养的角膜内皮前体细胞制成5X 106/ml浓度的细胞悬液，接种100 y 1到脱细 胞基质的表面，构建角膜后板层。于37t: 5% (A饱和湿度培养箱中静置2h。再加入400iU 培养液，继续培养，隔日换液。用该方法接种的细胞最终浓度为1Xl()6/ml，是最佳接种浓 度。但是若一次性加入500 iU的细胞悬液，则薄薄的角膜脱细胞基质片会浮起，不能紧贴 于培养皿底部，大部分细胞会沉积于培养皿底部，而不是脱细胞载体上。用5X106/ml浓度 的角膜内皮前体细胞悬液，接种100 iil到脱细胞基质的表面，100iU的液体量不会使脱细 胞基质漂浮，静置2h后细胞大部分已经贴壁于载体上，此时再加入400 ii 1培养液，既提供 了细胞生长所需的营养，又不会减少载体上的细胞数。 HE染色显示构建的角膜后板层由脱细胞基质载体和已分化的角膜内皮前体细胞 构成。角膜脱细胞基质载体胶原纤维排列整齐，板层致密，脱细胞基质上覆盖一层已分化的 角膜内皮前体细胞，细胞层较为连续，细胞与载体贴附紧密，与正常的角膜后板层结构近似 (图9)。通过透射电镜对构建的角膜后板层进行超微结构的观察，可见由角膜内皮前体细 胞分化而来的内皮细胞为扁平形，形态饱满，细胞内含有丰富的细胞器，角膜内皮细胞紧密
贴附在脱细胞基质载体上(图io)，表明应用角膜内皮前体细胞成功地构建了角膜后板层。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种角膜后板层，其特征在于，所述的角膜后板层由下列方法制得(a)、猫角膜内皮前体细胞的分离和培养，得到角膜内皮前体细胞；(b)、猪角膜脱细胞基质的制备，得到脱细胞基质；(c)、角膜后板层的构建。
2. 根据权利要求l所述的角膜后板层，其特征在于，所述的步骤(c)是将步骤(a)中的 角膜内皮前体细胞制成5X107ml浓度的细胞悬液，接种100ia到步骤(b)中脱细胞基质 的表面，构建角膜后板层。
3. 根据权利要求2所述的角膜后板层，其特征在于，步骤(c)还包括将角膜后板层于 37°C 5% C02饱和湿度培养箱中静置2h，再加入400 y 1培养液，继续培养。
4. 根据权利要求l所述的角膜后板层，其特征在于，步骤(a)中用内皮细胞的 Descemet膜与0. 2%复合胶原酶混合，内皮细胞的Descemet膜与0. 2%复合胶原酶的体积 比为1 : 5。
5. 根据权利要求l所述的角膜后板层，其特征在于，步骤(a)中培养的角膜内皮前体细 胞是将角膜内皮细胞以lX10Vml的低浓度接种，经克隆培养而得到的。
6. 根据权利要求1-5任一所述的角膜后板层作为供体用于角膜移植。
全文摘要
本发明涉及一种角膜后板层。所述的角膜后板层由下列方法制得(a)猫角膜内皮前体细胞的分离和培养，得到角膜内皮前体细胞；(b)猪角膜脱细胞基质的制备，得到脱细胞基质；(c)角膜后板层的构建。本发明还提供角膜后板层作为供体用于角膜移植。以角膜内皮前体细胞构建的组织工程角膜后板层，其结构与正常的角膜后板层结构近似。以角膜内皮前体细胞作为种子细胞构建角膜后板层，可以提供充足的细胞来源，克服角膜内皮细胞增殖能力低的难题，同时又不存在细胞转化以及安全性的问题。
文档编号A61L27/38GK101745152SQ200810204228
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者傅瑶, 范先群, 陆雯娟 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院