疫苗的制作方法

专利名称：疫苗的制作方法
专利说明疫苗 本发明涉及疟疾抗原的新用途，用以赋予对疟疾的免疫性。本发明特别地涉及来自恶性疟虫(P.falciparum)的环子孢子蛋白(CS蛋白)或其片段，用以为婴幼儿赋予对虐疾的免疫性。
疟疾是全球主要的健康问题之一。在20世纪，经济和社会的发展，加之抗疟活动的开展，使得疟疾从全球大部分地区得以根除，疟疾的影响范围从全球面积的50％减少到27％。虽然如此，若考虑到人口增长，预计在2010年，世界人口的半数，大约35亿人将生存在疟疾传播的区域1。目前的估计表明，每年将会有超过100万人死于疟疾，仅仅非洲地区的经济损失就非常惊人，每年至少达到几十亿美金左右2。
这些数据表明全球疟疾危机非常严重，成为世界卫生组织亟待解决的问题。从全球出现的对现有可用的、曾经高效药物的抗药性的出现，到健康系统的削弱和机能不全导致的资源匮乏等等，此危机的原因是多种多样的。如果不能发现控制此疾病的方法，那么全球改善健康状况和提高儿童存活率、降低贫困、促进安全感、强化易感人群的努力就将功亏一篑。
本病最严重的类型之一是由原生寄生虫类恶性疟虫(Plasmodiumfalciparum)导致的，这是由疟疾导致死亡的主因。
疟虫(Plasmodium)的生命周期是复杂的，需要两个宿主，人和蚊子来完成。人类的感染是由引入叮咬的、已被感染的蚊子唾液中的子孢子(sporozoite)而启动的。子孢子转移到肝脏，并在那里感染肝细胞，在此分化和繁殖，通过细胞内的红细胞外发育期，进入裂殖子阶段，在此阶段感染红细胞(RBC)以启动无性繁殖血液阶段的循环复制。RBC内的许多裂殖子分化到有性阶段配子细胞后，被蚊子摄入，在蚊子中肠内经过一系列阶段发育成为子孢子后迁移至唾液腺，至此此循环结束。
疟虫子孢子阶段被确定为疟疾疫苗的可能靶点。采用灭活(辐射后)子孢子进行免疫，已经显示诱导了针对实验性人类疟疾的保护作用(Am.J，Trop.Med.Hyg 24297-402，1975)。但是，实际上和逻辑上，还不可能基于此方法、应用辐射后子孢子制造用于民众的疟疾疫苗。
已知子孢子主要的表面蛋白是环子孢子蛋白(CS蛋白)。认为该蛋白在子孢子从最初通过蚊子感染的部位进入到循环、由此迁移至肝脏的过程中，参与子孢子的运动性和侵袭性。
疟虫类的CS蛋白的特点是具有中心重复结构域(重复区)，侧面与非重复氨基(N端)和羧基(C端)片段相连。恶性疟虫的CS蛋白具有高度保守的中心重复区。
一些团体已经提出基于各种形式或者部分的CS蛋白的亚基疫苗。这些疫苗中的两种仅仅基于中心重复序列，20世纪80年代早期就已经经过临床检测，其中之一为合成肽，另一为重组蛋白(Ballou et al LancetJune 6(1987)1277和Herrington et al Nature 328257(1987))。这些疫苗成功激发了抗子孢子反应。但是，反应程度令人失望，有些疫苗根本不发生任何反应。此外，后续注射后并没有出现“加速”抗体水平，体外淋巴细胞繁殖实验结果表明多数志愿者的T细胞没有识别免疫显性重复序列。进而，这两种疫苗的效力非常之微，只有一名被免疫的志愿者未患上寄生虫血症。这些疫苗因此而未能继续得到开发。
WO 93/10152和WO 98/05355公开了衍生自恶性疟虫CS蛋白的疫苗，明确利用该专利所述方法朝着抗恶性疟虫的预防接种有了一些进展，类似内容也可见于Heppner et等文章(2005，Vaccine 23，2243-50.)。
对于多种柱，例如NF54株，克隆3D7，来自恶性疟虫的CS蛋白已经被克隆、表达并且测序(Caspers等，Mol.Biochem.Parasitol.35，185-190，1989)。来自株3D7的蛋白特征为具有中心免疫显性重复区域，包括四肽Asn-Ala-Asn-Pro重复40次，但有四个次要重复序列Asn-Val-Asp-Pro散布其中。其他株中，主要和次要重复区域的数量不同，其相对位置也不同。这种中心蛋白两侧N和C端蛋白由非重复性氨基酸序列构成，被称为为CS蛋白的非重复部分。
GlaxoSmithKlineBiologicals的RTS，S疟疾疫苗是基于CS蛋白的，在1987年就在开发了，目前是正被研究的最先进的疟疾疫苗候选物4。该疫苗特异性地靶向恶性疟虫的红细胞前期，并且在未感染疟疾(

)的成年志愿者中提供抵抗恶性疟虫子孢子感染的保护，并且在半免疫(semi-immune)成年人中提供抵抗天然暴露的保护，其中所述恶性疟虫子孢子是通过实验室培养的受感染的蚊子递送的5，6。
RTS，S/AS02A(RTS，S结合佐剂系统)被用于接下来的第一阶段研究，研究在冈比亚被感染的年龄在6～11和1～5岁的儿童之间展开，确定该疫苗是安全、耐受良好和具有免疫原性的7。接着，在第一阶段研究中选定儿科疫苗，针对莫桑比克1～4岁儿童进行，研究表明疫苗是安全、耐受良好和具有免疫原性的8。
专利WO 2006/029887公开了利用RTS，S治疗1到4岁儿童恶性疟疾。
世界卫生组织临床指导手册(见实用手册《恶性疟疾世卫组织管理》第二版，2002，http://mosquito.who.int/docs/hbsm.pdf)中描述了恶性疟疾(severe malaria)。根据世卫组织的针对恶性疟疾的定义分级，恶性疟疾是指儿童病情严重、高死亡风险。高风险可被认为是大约30％或更大。
在026莫桑比克1-4岁儿童临床研究中，该疫苗对抗感染的总效力为45％左右，这是通过在相关儿童血液中开始检测到寄生虫的时间的延迟而进行测量的。临床疾病保护百分比为大约35％，恶性疟疾的保护百分比为大约50％。该效力的持续时间大约18个月。(Alonso等，Lancet204，364，第1411-1420页205，和Lancet 366第2012-2018页) 在026试验中没有证据表明年龄和一般疫苗对非严重临床疟疾病的效力有联系，暗示效力并不会随着年龄的增加而显著变化。但是，进行进一步的探测研究分析以评估在年轻人群中的疫苗效力，其中所述年轻人群具有患有疟疾的风险。
有趣的是，这种辅助性分析似乎暗示在该试验中，针对恶性疟疾的效力在年轻的孩子中可能更高。通过该分析没有暗示抗感染的保护或者一般效力(general efficacy)，即推迟临床疟疾症状的产生，通常在年轻人群中会更好。
根据发明者的理解，许多原因造成了仅有一种疟疾疫苗用于不足1岁的婴幼儿，包括包含新佐剂的实验配方的潜在毒性问题和/或婴幼儿免疫系统不成熟的理论，因此所述疫苗不能提供对疟疾感染的有效保护。在疟疾配方中使用的强佐剂，如包括QS21和/或MPL一般不用于儿科疫苗。取而代之，婴幼儿疫苗通常用较老的铝盐佐剂。
但是，冈比亚进行的试验将疟疾疫苗SPf66用于6到11个月的婴幼儿。(Alonso等，Parasite Immunology，199719579-581)在坦桑尼亚疟疾肆虐的区域，SPf66对1到4岁首次感染疟疾的儿童显示了31％的保护。然而当在6到11个月婴幼儿中测试时，结果似乎说明临床疟疾在接种SPf66疫苗的儿童中的发病率高于那些接种灭活脊髓灰质炎疫苗配方的对照组婴幼儿。接种高剂量SPf66的婴幼儿其疗效最显著。
近期一项临床试验(此处称为038研究)是针对那些10周大，第一次使用疫苗的婴幼儿的，得到了一些惊人的结果(见下面的讨论)。
本发明旨在提供了衍生自恶性疟虫CS蛋白的疫苗与制药上可接受的佐剂联合在制备药物中的用途，其中所述药物用于对婴幼儿进行免疫接种抵抗疟疾。



图1为试验038研究设计的轮廓； 图1a为试验设计的轮廓； 图2a为整体反应原性(general reactogenicity)的发生率； 图2b为局部反应原性(local reactogenicity)的发生率； 图2c为疫苗接种后7天之内报告的显示预期整体症状的剂量比例； 图3为疫苗效力数据； 图4为038试验的卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)； 图5a为026试验的卡普兰-迈耶曲线(对照数据)； 图5b为026试验的卡普兰-迈耶曲线(对照数据)； 图3的表显示在RTSS或Engerix剂量3后从14天起到第6月(代表性随访)ATP组群追踪观察的VE评估。这包括那些被接种至少3剂量RTS，S或者Engerix-B，接种清除药(clearance drug)，以及在ADI中有追踪时间的个体。VE针对感染和疾病的评估均显示其中。对于ITT组群，在从第0月(第一次疫苗接种日)到第6月的时间范围内，评估疾病的方案研究终点表示为疾病3。
在图3中 PYAR发病风险的病史/人 年(Episodes/Person Years at Risk)； VE疫苗效力； CI置信区间。
a到第一次发病的时间(time to first episode)；存在恶性疟虫无性寄生虫血症＞0/μL b到第一次发病的时间；在不适且接受治疗的儿童中存在恶性疟虫无性寄生虫血症＞500/μL且发热≥37.5℃ c到第一次发病的时间；在不适且接受治疗的儿童中存在任何水平的恶性疟虫无性寄生虫血症且发热≥37.5℃或24小时内发热病史 d到第一次发病的时间；在不适且接受治疗的儿童中(ITT 0-6)存在恶性疟虫无性寄生虫血症＞500/μL且发热≥37.5℃ 根据地区和距离卫生中心的距离校正评估 在本说明书上下文中的疟疾是指疟疾感染(如下定义)和/或临床疟疾病症(亦如下所述)。
在一个实施方案中，本发明的接种疫苗提供了降低的疟疾感染风险。在一个方面中，接种疫苗后计算出的感染风险下降至少大约30、40、50％，例如60，诸如65％。
在一个实施方案中，本发明的接种疫苗提供了降低的疟疾临床症状的发生风险。在一个方面中，接种后临床疾病风险，例如在3个月研究周期内给予3剂量，在第3次剂量之后，可能降低至少30、40、50％，诸如60，例如大约65％。
在一个实施方案中，疟疾是非恶性疟疾。
在一个实施方案中，疫苗接种提供了降低的下列临床疾病症状的产生风险任何水平的恶性疟虫无性寄生虫血症和不低于37.5℃的发热或24小时内的发热史。
在一个方面中，在末次免疫接种后，经过3个月，测定疟疾感染降低的风险和/或产生疟疾临床症状的降低的风险。
在038研究中，婴幼儿在间隔大约一个月(或者间隔4周)的3个时间点0，1个月和2个月上给予3剂量含有儿科配方佐剂的RTS，S。后面的方案构成本发明的一个方面。
疫苗可按照适当的间隔施用1，2或3剂量，例如2，3，4或5周的间隔，诸如4周间隔。
很多这些婴幼儿很可能真正未感染过疟疾，因为事实上没有暴露于被感染的蚊子。
没有明显的安全或毒性问题出现，事实上本次研究的疟疾疫苗和塞诺菲巴斯德(Aventis Pasteur)的、包括针对至少白喉，破伤风，百日咳的抗体的常用婴幼儿疫苗TETRActHibTM表现出类似的反应原性，也类似于乙型肝炎疫苗Engerix-BTM。
此外，令人惊讶的，038研究中使用的疟疾疫苗计算出来的针对临床疟疾(通常/非严重)的效力，与对照组相比为大约65％(校正疫苗效力)(数据见表3)。该效力同026试验中针对年长儿童临床非恶性疟疾的疗效大约为30～35％的结果相比，大约高30％。后者试验的数据反映针对非恶性临床疟疾症状有效却对恶性疟疾无效，该试验是作为026试验的子分析进行的。因此本发明的免疫接种似乎可以翻译成在该研究中与对照组相比以及此外与026试验中免疫接种的年长儿童相比，非恶性临床形式疟疾感染风险的降低。
本发明临床疟疾定义为发热温度高于或等于37.5℃，其中恶性疟虫的无性寄生虫血症为每μL血500或者更多(例如具有大于90％的敏感性和特异性)。
同样令人惊讶的是038试验的抗感染保护百分比为大约65％(表3)，其中发明者相信同026试验中大约45％的结果相比，这是是史无前例且意想不到的。
两个试验(表3列出的038和026)的效力数据来自长度不同的观察期间。
本文的疟疾感染是指任何无性的恶性疟虫血症，通过感染活性探测(active detection of infection，ADI)或者隐性病例探测(passive casedetection，PCD)检测出来的。
在038试验中，3个月的监测时间点上(即末次免疫接种后3个月)不足20％，大约17％被接种疟疾疫苗的婴幼儿出现感染迹象，与此相比，施用比较剂(comparator)/对照疫苗接种的组为超过40％。
这些观察使得发明者得出结论事实上疫苗接种以提供保护抵抗疟虫感染和临床疟疾的最佳年龄组是婴幼儿。
婴幼儿在本说明书中是指小于1岁，例如大约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50周。更准确地，大约10，大约14和/或大约18周大。
在一个实施方案中，首次接种疫苗给予出生后大约6到10周的婴幼儿，例如10周。
在一个实施方案中，第二次接种疫苗给予出生后大约10到14周，例如14周的婴幼儿。
在一个实施方案中，第三次接种疫苗给予出生后大约14到18周，例如16-18周的婴幼儿。
在第一次疫苗接种后施加强化疫苗接种(boosting vaccination)。强化可在所述初级过程之后6到24个月施用。
不希望受任何理论所约束，038试验中所得证据没有暗示抗CS效价(titer)明显不同于026试验中观察到的，即使在038中由于剂量3后长达3个月的数据中所见的高GMT趋势。
因此在明显地自然暴露于疟疾感染之前，未感染婴幼儿接种疟疾抗体可能是有利的。
本说明书所说未感染(

)是指没有或者具有极低水平的可探测的抗CS蛋白抗体的婴幼儿，例如通过ELISA检测，或者年龄很小、足以合理相信其出生后没有被恶性疟虫感染过的婴幼儿。
低水平是低于相应抗CS ELISA所规定的截止水平。关于进一步的适当检测的信息，可参见例如Gorden等J.Infectious Disease 1995；1711576-1585或者Stout等J.Infectious Diseases 1998；1781139-1144。
在本发明的一个方面中，接受疫苗注射的婴幼儿中至少65％是未感染的，例如75，85，90，95或者99％。
出生后通过在家或者住宅/寝室等喷洒杀虫剂，例如DDT，或许有利于保护婴幼儿免受疟疾感染。备选的或者其他保护可以是使用床帐来提供，床帐也可以用杀虫剂处理。这些方法可帮助婴幼儿在可以施用疟疾疫苗之前不被感染。
有趣的是在038试验中似乎暗示抗体产生的水平和该接种疫苗所提供的保护之间存在关联。具有最高CS抗体水平的婴幼儿比那些较低水平的婴幼儿感染的风险降低了71％。
在一个方面中，本发明提供了免疫接种用途，用以针对CS蛋白产生恰当的抗体，例如根据本发明，其中80，85，90，95，96，97或98％的接种后的婴幼儿产生的抗CS抗体高于上述对相关ELISA限定的截止水平(例如临床试验中被GSK使用的)，大约末次免疫接种后大约1个月到大约4个月，例如此后1个月和4个月。
在一个实施方案中，抗体反应足以提供降低的疟疾感染风险和/或降低的免疫接种婴幼儿的临床疟疾风险。
在一个方面中，本发明提供了疫苗的用途，以延迟具有疟虫婴幼儿的感染和/或延迟疟疾临床症状的发展。初次疟疾感染发生或者临床疟疾的时间可以，例如通过Cox回归模型来测量。
本发明特别地关于降低由恶性疟虫导致的临床疟疾的发病率，例如其中严重的和/或轻微的形式。然而在一个方面中，本发明提供了非恶性疟疾临床症状的预防。
非恶性疟疾在此定义为非恶性疟疾的所有临床案例。
根据本发明的CS抗原可用于联合其他抗原使用，所述其他抗原选自任何表达于子孢子或者寄生虫生命周期红细胞前期阶段例如肝脏阶段的抗原，例如肝脏阶段抗原-1(LSA-1)，肝脏阶段抗原-3(LSA-3)，血小板反应蛋白相关匿名蛋白(TRAP)，裂殖子表面蛋白-1(MSP1)主要裂殖子表面蛋白，和近期被认为(除红细胞阶段之外)在肝脏阶段表达的顶裂殖子抗原-1(AMA-1)。所有这些抗原均为本领域所熟知。抗原可是完整蛋白或者是免疫原性片段。疟疾抗原的免疫原性片段是已知的，例如AMA-1的外功能区。
在一个实施方案中，恶性疟虫抗原融合于乙型肝炎抗原(HBsAg)表面。因此环子孢子蛋白(CS蛋白)抗原适用于本发明的形式为与HBsAg的融合蛋白形式。抗原可以是来自恶性疟虫的完整CS蛋白或者其部分，包括一个或复数个CS蛋白片段，这些片段可以融合在一起。
在一个实施方案中，基于CS蛋白的抗原为杂合蛋白的形式，包括基本上所有的恶性疟虫CS蛋白的C端部分，4个或者更多CS蛋白免疫显性区域的串联重复和来自乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)。在一个方面中，融合蛋白包括含有至少160个氨基酸、与CS蛋白C端部分基本同源的序列。
特别地“基本上所有”CS蛋白C端部分，包括C末端，排除疏水性锚定序列。CS蛋白C端可以排除最后的12到14(例如12)氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明所用融合蛋白是这样的蛋白质，其包括部分恶性疟虫CS蛋白，其基本上对应通过线性连接体与HBsAg的N-端符合阅读框融合的衍生自NF54株(Caspers et al，supra)的恶性疟虫3D7克隆的207-395氨基酸。连接体可以包括部分或全部HBsAg的前S2区。
本发明中所用适当的CS结构列在WO 93/10152中。特别适合的是WO 93/10152(其中称之为RTS*)和WO 98/05355中被称作RTS的杂合蛋白，在此引入两者全部内容以作参考。
特别适合的融合蛋白是被称作RTS的融合蛋白，由下列构成 ·蛋氨酸残基，被核苷酸1059到1061编码，衍生自酿酒酵母TDH3(Sacchromyes cerevisiae TDH3)基因序列。(Musti A.m.等 Gene 198325 133-143) ·3个氨基酸，Met Ala Pro，衍生自利用克隆手段构建杂合基因的核苷酸序列(1062到1070)。
·一段(a stretch of)189个氨基酸，被核苷酸1071到1637编码，代表恶性疟虫3D7株环子孢子蛋白(CSP)的氨基酸207到395。(Casperset al，supra) ·氨基酸(Gly)，被核苷酸1638到1640编码，通过用于构建杂合基因的克隆技术创造。
·4个氨基酸，Pro Val Thr Asn，被核苷酸1641到1652编码，并代表4个乙型肝炎病毒(adw血清型)前S2蛋白的羧基端残基(Nature 280815-819，1979)。
·一段226个氨基酸，被核苷酸1653到2330编码，并限定乙型肝炎病毒(adw血清型)的S蛋白。
在一个实施方案中，RTS是呈免疫原性颗粒RTS，S的形式。
RTS，S构建体可以例如包括两个同时合成的多肽RTS和S，并且自然地形成复合颗粒结构(RTS，S)。
RTS蛋白优选表达于遗传工程酵母细胞内，最优选地为酿酒酵母(S.cerevisiae)或巴氏毕赤酵母(Picha pastoris)。在这样的宿主内，RTS会被表达为脂蛋白颗粒(此处亦指免疫原性颗粒或者病毒样颗粒)。优选的受体酵母菌株已经在其基因组里带有几个整合的乙型肝炎的S表达框的拷贝。因此，所得到的菌株合成两个多肽，S和RTS，两者同时互相装配为混合(RTS，S)脂蛋白颗粒。这些颗粒，有利于在其表面呈现杂交的CSP序列。这些混合颗粒中RTS∶S的有利比例，例如为1∶4。
相信来自乙型肝炎的表面抗原的出现，和RTS，S颗粒的形成，加强了杂合蛋白CS蛋白部分的免疫原性，有助于稳定性，和/或有助于蛋白的可再生制造。
备选地，杂合蛋白可以包括来自恶性疟虫CS蛋白的N端片段。
在一个方面中，杂合蛋白可以包括一个或更多个来自恶性疟虫中心区的重复单元。例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或者更多个重复单元。
备选地，杂合蛋白可以包括来自恶性疟虫CS蛋白的C端片段。
不希望受到理论的约束，认为N和C端和中心重复片段可包括一些T和B细胞表位。
在重组细胞蛋白，通常将非天然氨基酸引入克隆程序，并在最终表达的蛋白中观察到。例如几个诸如1，2，3，4或者5个氨基酸可以被插入蛋白质的开头(N端)。如果4个氨基酸被插入到蛋白质的开端，例如可以是MMAP。附加地或者备选地，在蛋白质活性和性质，例如免疫原性不受到不利影响的情况下，1，2或者3个，例如1个氨基酸可被插入到蛋白体部/中部。
此处描述的疟疾疫苗还可以是与一种或多种其他常用于年龄小于1岁的婴幼儿的疫苗组合使用，例如对以下一种或更多种提供保护白喉，破伤风，百日咳，麻疹，口服脊髓灰质炎和/或乙型肝炎。例如这样的疫苗可在1，2，3，4，5，6，7，8或9个月的时候给予，适当地诸如6，10和14周。根据本发明的一方面，所述提供的婴幼儿疫苗是DTPw-Hib任选地联合口服脊髓灰质炎疫苗。
根据本发明的疟疾疫苗还可以同BCG疫苗联合使用，例如在本发明所提供的疫苗之前1，2或更多周提供。
疫苗，如口服脊髓灰质炎，BCG和/或乙型肝炎疫苗可在大约出生后1周或者更少的时间内使用。
当本发明所述疟疾疫苗和其他一种或多种婴幼儿疫苗结合使用，那么疫苗可同时给予或大约间隔15，20，25或更多天。后者可能避免两种或多种疫苗的任何不良相互作用。
本发明还涉及治疗方法，所述方法包括为婴幼儿施用此处所述的治疗有效量的疫苗，以保护抵抗临床疟疾的感染和/或发生。
可用于本发明的适合的接种疫苗的时间表包括使用3剂量的疫苗，间隔1个月的时间。在本发明备选的实施方式中，使用1，2，3或更多剂量，给药时间相隔1，2，3，4，5，6，7，8或者更多周。可采用同种的强化以补充上述接种疫苗的初步过程。
也可能适合地，使用常用的良好预防疟疾的方法与本文所述疟疾疫苗联合使用。最好的方法应包括例如用杀虫剂喷洒卧室等的方法和/或使用蚊帐以减少个体暴露给蚊子的机会。在038试验中，这样的方法与RTS，S的疟疾疫苗结合使用。
作为038试验中最初的终点，疟疾临床发病可例如是需要恶性疟虫无性寄生虫血症在Giemsa染色厚血片上出现超过每μL 500或超过0，且出现发热(温度≥37.5℃)。
恶性疟疾的定义可以，例如包括出现下述一种或更多严重的疟疾贫血(PCV＜15％)，大脑疟疾(布兰太尔昏迷评分(Blantyre coma score)＜2)或其他全身系统的严重疾病，可包括多脏器疾病发作(在最初24小时内两次或更多的全身性惊厥)，俯卧(定义为不能独坐)，低血糖(＜2.2mmol/dL或＜40mg/dL)，临床疑似酸中毒或者循环衰竭。这些在下面的表1中列出。
根据本发明，纯化杂合蛋白质的水溶液可被直接或与适当的佐剂或载体组合使用。作为替代地，蛋白质可在与适当的佐剂或载体混合之前事先冻干。
根据本发明，适当的疫苗剂量为每剂量1-100μg抗原例如RTS，S，诸如5到75μg抗原例如RTS，S，特别地一剂量25μg抗原例如RTS，S蛋白质，在例如250到500μl(最终液体配方)。
根据本发明，儿科配方特别地恰当抗原剂量是25μg，例如在终体积0.5ml之内。
根据本发明的一个方面，抗原与佐剂或载体相结合。
特别地存在佐剂，例如作为Th1类应答优先刺激物的佐剂。
适当的佐剂包括但不限于，任何来源的解毒脂质A和脂质A的非毒性衍生物，皂角苷和其他作为Th1细胞应答优先刺激剂的免疫刺激剂(此处也称作Th1类应答)。
广义上区分免疫反应可分为极端的两类，即体液或细胞免疫应答，传统特征为B淋巴细胞产生的抗原特异性抗体和T淋巴细胞作为抗原的特异性细胞保护效应子。TH1型应答(有助于细胞介导的效应子免疫应答)和TH2型应答(有助于抗体应答诱导作用)。
极端的TH1-型免疫应答特征可为产生抗原特异性，单倍体型限制细胞毒性T淋巴细胞，和自然杀伤细胞应答。在小鼠和那些对应IgG1型抗体的人类中，TH1-型免疫应答通常特征为产生IgG2a亚型抗体。TH2-型免疫应答通常特征为产生系列免疫球蛋白同种型，包括小鼠的IgG1。
可以考虑到这两种免疫反应后面的驱动力量是细胞因子。高水平TH1-类型细胞因子倾向于有助对特定抗体产生细胞介导的免疫应答，而高水平TH2-型细胞因子倾向于有助产生针对抗原的体液免疫应答。
TH1和TH2-型免疫应答的差别不是绝对的，可以两个极端之间的一种连续谱(continuum)的形式存在。事实上，个体能维持一种TH1为主或者TH2为主的免疫应答。但是，通常很容易想到依据Mosmann和Coffman所描述的鼠科动物CD4阳性T细胞克隆的细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1 and TH2 cellsdifferentpatterns of lymphokine secretion lead to different finctional properties.Annual Review of Immunology，7，p145-173)。传统地，TH1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ细胞因子有关。其他通常直接同TH1型免疫应答相关的细胞因子不是由T细胞产生的，例如IL-12。相应地，TH2-型应答与IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和肿瘤细胞坏子因子-β(TNF-β)的分泌有关。
已经知道特定疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或者TH2型细胞因子应答。通常在疫苗接种或者感染后免疫应答的TH1∶TH2平衡指示剂包括直接测量抗原再次激活后T淋巴细胞在体外产生TH1或者TH2细胞因子的方法，和/或抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2a比例测量法(至少用于小鼠中)。
因此，TH1型佐剂是指那种当再次在体外被抗原刺激时，刺激分离的T细胞群以产生高水平TH1型细胞因子，并诱导TH1同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答。
能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂描述于WO 94/00153和WO95/17209。
优选Th1-型免疫刺激物配制为制备适用于本发明的佐剂，包括但不限于以下情况。
很早就知道肠道菌脂多糖(LPS)是一种有效的免疫系统刺激物，但由于其毒性而较少用做助剂。Ribi等已经描述，通过去除葡萄糖胺还原端核心碳水化合物群和磷酸盐而制成LPS的一种非毒性衍生物，单磷酰基脂A(MOL)，(1986，Immunology and Immunopharmacology ofbacterial endotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY，p407-419)其含有如下结构
另一种MPL的无毒形式是通过去除二糖核心3位上的酰基链而得，称为3-O-脱酰单酰基脂A(3D-MPL)。它可以通过GB2122204B中所教导的方法进行纯化和制备，其中还公开了制备二磷酰基脂A和其3-O-脱酰变体。
3D-MPL优选的形式是乳液，具有直径小于0.2μm的小粒度，其制造方法公开于WO 94/21292。包括单磷酰基脂A和表面活性剂的水制剂已经公开于WO 98/43670。
细菌脂多糖衍生的佐剂用于本发明可经过细菌源的纯化和加工，或者可选地，它可以被合成。例如，Ribi等1986(见上)描述的纯化单磷酰基脂A，GB 2220211和US 4912094中描述的来自Salmonella sp.的3-O-脱酰单磷酰基脂A或者二磷酰基脂A。其他纯化和合成的脂多糖也已经被描述过(Hilgers等，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP 0 549 074 B1)。特别优选细菌的脂多糖佐剂为3D-MPL。
相应地，可用于本发明的LPS衍生物为那些结构上类似于LPS或MPL或3D-MPL的免疫刺激物。其他可选的LPS衍生物可以是酰基化单糖，其是上述MPL结构的亚组分。
皂角苷也是本发明适当的Th1免疫刺激物。皂角苷是非常有名的佐剂，这已经被Lacaille-Dubois，M和Wagner H的文章教导过。(1996.Areview of the biological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine vol 2pp363-386).例如，Quil A(提取自南美树种QuillajaSaponaria Molina的皮)及其片段在美国专利US 5,057,540和“疫苗佐剂皂角苷”Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55和EP 0 362 279 B1中有描述。溶血性皂角苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化片段)曾经被描述为有效的系统助剂，并且其制备方法也已被公开于美国专利No.5,057,540和欧洲专利EP 0 362 279B1。QS7(一种Quil-A的非溶血性片段)作为一种有效的系统疫苗助剂，其用法也被描述于这些参考文献中。QS21的使用进一步被描述于Kensil等的文章。(1991.J.Immunology vol 146，431-437)QS21和聚山梨醇酯或者环糊精的组合物也是已知的(WO 99/10008)。特别的助剂系统包括QuilA片段，例如QS21和QS7被描述于WO 96/33739和WO96/11711。
另一种免疫刺激物为免疫刺激性低聚核苷酸，包括未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)。CpG是DNA中胞嘧啶-鸟苷二核苷酸的缩写。CpG是现有技术中已知的既用于全身，又用于粘膜途径的助剂(WO96/02555，EP 468520，Davis等，J.Immunol，1998，160(2)870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。从历史上说，曾观察到BCG的DNA片段可以发挥抗肿瘤效果。在进一步的研究中，来自BCG基因序列的合成低聚核苷酸显示出诱导免疫刺激的效果(体外和体内)。这些研究者得出结论，特定回文序列，包括中心CG基序，具有这种活性。CG基序在免疫刺激中的核心功能后来被Krieg的文章所阐述(Nature 374，p546 1995)。详细的分析显示CG基序必须呈特定上下文序列，且这样的序列在细菌DNA中是常见的，但是在脊椎动物DNA内较少。免疫刺激序列通常为嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，其中CG基序是非甲基化的，但其他已知的非甲基化的CpG序列具有免疫刺激型，可用于本发明。
在六个核苷酸的特定组成中，具有回文序列。这些基序中的一些，作为一个基序的重复片段，或者作为不同基序的组合，均可出现在同一低聚核苷酸中。一个或多个这些含有低聚核苷酸的免疫刺激物序列的存在，可以激活各种各样的免疫子集，包括自然杀伤细胞(产生干扰素γ且具有溶解细胞的活性)和巨噬细胞(Wooldrige等，Vol 89(no.8)，1977)。其他未甲基化的CpG，包括与此不相同的序列现在也证实具有免疫调节能力。
当配制入疫苗时，CpG通常被用在有游离抗原的自由溶液中(WO96/02555；McCluskie和Davis，supra)或者与抗原共价缀合(WO98/16247)，或者与载体，例如氢氧化铝((肝炎表面抗原)Davis et等supra；Brazolot-Millan等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)配制。
上述免疫刺激物连同载体配制，例如脂质体，水包油乳液，和/或金属盐类组合，包括铝盐(如氢氧化铝)。例如，3D-MPL可与氢氧化铝组合(EP 0 689 454)或水包油乳液(WO 95/17210)；QS21可方便地与含有脂质体的胆固醇(WO 96/33739)，水包油乳液(WO 95/17210)或明矾(WO 98/15287)组合；CpG可与明矾组合(Davis et al.supra；Brazolot-Millan supra)或与其他阳离子载体组合。
组合免疫刺激物也特别地优选与单磷脂酰脂A和皂角苷衍生物组合(WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)，更特别地是如WO 94/00153所描述的QS21和3D-MPL组合。作为选择地，CpG加皂角苷例如QS21的组合，也形成了本发明所用的有效的助剂。
因此，适当的助剂系统包括，例如，单磷脂酰脂A，优选3D-MPL，连同铝盐。
强化系统包括单磷脂酰脂A和皂角苷衍生物的组合，特别地是如WO 94/00153所述QS21和3D-MPL的组合，或者如WO 96/33739中公开的低致反应性成分，其中含脂质体(DQ)的胆固醇中QS21被抑制。
特别有效的助剂配方包括WO 95/17210中描述的QS21，3D-MPL和生育酚，溶于水包油乳液中，这是本发明使用的另一种优选配方。
另一种优选配方包括仅CpG低聚核苷酸或者连同QS21，3D-MPL或连同铝盐。
根据本发明的一个实施方式，提供了脱毒脂质A或者脂质A的无毒衍生物，更优选的单磷酰基脂A或者其衍生物，例如3D-MPL，与本发明所述疟疾抗原组合，用于制造预防婴幼儿疟疾病和/或感染的疫苗。
根据本发明的一个实施方式，皂角苷，例如QS21和本发明所述疟疾抗原组合，用以制造预防婴幼儿疟疾病和/或感染的疫苗，或者用其治疗婴幼儿的方法。
根据本发明的一个实施方式，提供解毒脂质A或者无毒脂质A衍生物的用法，更优选地单磷酰基脂A或其衍生物，例如3D-MPL，与皂角苷，例如QS21，和本发明所述疟疾抗体组合，用以制造预防婴幼儿疟疾病和/或感染的疫苗。本发明也扩展到利用这些方面治疗婴幼儿的方法。
在本发明的一个实施方式中，进一步使用水包油乳液(oil in wateremulsion)或者脂质体。
本发明使用的合适的助剂组合为 1.3D-MPL，QS21和水包油乳液。
2.在脂质体配方中的3D-MPL和QS21。
3.在脂质体配方中的3D-MPL，QS21和CpG。
3D-MPL的用量通常较小，但根据疫苗配方其用量可在每剂量1-1000μg之间，一般为每剂量1-500μg，例如每剂量1到100μg(每剂量10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80或90μg)。
本发明佐剂中皂角苷的用量可在每剂量1-1000μg之间。通常为每剂量1-500μg，更常见例如每剂量1-250μg，更特定地在每剂量1到100μg之间(每剂量10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80或90μg)。
本发明中佐剂或者疫苗中CpG或者免疫刺激性低聚核苷酸的量通常不大，但依据疫苗配方可以在每剂量1-1000μg之间，通常为每剂量1-500μg，更常见例如在每剂量1到100μg之间(每剂量10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80或90μg) 根据本发明的一个方面，每剂量的终体积为0.5ml。
本发明的疫苗可通过各种途径给予，例如经口的、局部的、皮下的、粘膜的、静脉内的、肌肉内的、鼻内的、舌下的以及皮内的给药方式。
赋予免疫力方法可以是预防性的或者治疗性的。本发明此处所述是主要地但不是专门地关于针对疟疾的预防性接种疫苗，更特别地，预防性接种疫苗以预防或者降低疟疾感染和/或疟疾病的可能。
本发明可用现有技术中所知的适当的药学上可以接受的载体或赋形剂，包括例如水或者缓冲液。疫苗制备通常描述在制药生物工艺学Vol.61疫苗设计-亚单元和佐剂方法，Powell和Newman编，PlenumPress New York，1995。疫苗的新趋势和发展，Voller等编，University ParkPress，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。在脂质体内封装描述于，例如Fullerton的U.S.Patent 4,235,877。蛋白质与高分子的结合公开于，例如，Likhite的U.S.Patent 4,372,945和Armor等U.S.Patent 4,474,757。
本发明的说明书中不特定的包括(comprising)应该解释为开放式的包含(including)。
如果合适，本发明的开放式包括特定特征的这些方面也意于延伸到封闭式或者半开半闭式的包括相关特征的所述这些方面，反之亦然。
实施例 研究设计 本研究由Centro de

em Saude de Manhica(CISM，Manhica健康研究中心)于2005年6月到2007年3月之间，在Ilha Josina和Taninga两地领导进行，两居民区距离Manhica城以北大约50km，CISM总部坐落在那儿。整个研究地区和Ilha Josina的特点在从前已有描述(Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A，Macete E，Milman J，等.Efficacy of the RTS，S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparuminfection and disease in young African childrenrandomised controlled trial.Lancet 2004 Oct 16-22；364(9443)1411-20)。Taninga是穿过IncomatiRiver河滩与Ilha Jossina正对的农村居民区。气候为亚热带气候，具有两个明显的季节从11月到4月的炎热多雨季节，其他时候为凉爽干燥季节。疟疾长期在这里传播，其有一些季节性，主要病因为恶性疟虫。不吉按蚊(Anopheles funestus)是主要带菌者。基于氨酚喹(amodiaquine)和长效磺胺-乙嘧啶(sulphadoxine-pirimethamine)的组合疗法为针对简单疟疾的一线治疗(first line treatment)，直到2006年9月，改变为使用青蒿酯(artesunate)和长效磺胺-乙胺嘧啶(sulphadoxine-pyrimethamine)的青蒿素(artemisinin)组合治疗(ACT)。从2005年以来，每年巡回的室内滞留喷雾(IRS)也被用作卫生部疟疾控制活动的一部分。在2005年12月的第一次巡回中，IRS用的是氨基甲酸盐(Carbamates)(

)，但是在2006年12月换成了DDT。作为研究活动的一部分，且根据国家推荐，给予筛选的怀孕妇女一种杀虫剂处理过的床罩(ITN)，配合使用说明书。Ilha Josina和Taninga均有基层卫生站和产科，提供基础的药品和预防处理。为了研究，升级了设备，昼夜不停地提供照顾，并为与CISM附近的Manhica地区医院运送特定对象。
研究为I/IIb双盲随机控制试验，以评价受试疟疾疫苗RTS，S/AS02D候选物的安全性，免疫原性和有效性，在10，14和18周时婴幼儿做免疫接种。草案通过莫桑比克国家生物伦理学委员会，巴塞罗那医院临床道德评论委员会和PATH人类学科保护委员会的同意。试验注册号为NCT00197028，IND码为BB-IND 10514。试验按照临床操作规范国际协调会议指导进行，通过GSK Biologicals监控。地方安全监控和数据与安全监控会议密切关注计划的进行和试验结果。
参与者 CISM在大约一半的地区，包括两个研究点，控制一个人口统计学的监控系统。孕妇在怀孕的第三个月期间，居住在研究区域、考虑要在研究区域登记其婴幼儿的居民，被要求参加知情同意过程。在第一次会晤，宣读信息表并由特别训练的工作人员向孕妇人群做解释。女性只有在经过个人口头理解测试才被认为是同意加入的个体，该测试用以发现对相关信息的理解。邀请他们在知情同意书上签名(或者如果不能写字则按手印)。许多与研究无关的社团作为公证人且在同意表上会签。那些给予知情同意书的接受指导，并做HIV(DetermineTM HIV1-2，AbbotLaboratories和UNI-GOLD HIV，Trinity Biotech PLC)和乙型肝炎(DetermineTM HBsAg，Abbot Laboratories)筛选。发现HIV阳性的女性被推荐到在Manhica地区医院的政府卫生服务机构以进行医学评估和依据国家指导方针进行管理。这些包含减少生育孩子的母亲以及为那些符合临床和社会标准的免费供应抗逆转录酶病毒疗法(anti-retro viraltherapy)。向乙型肝炎阳性的母亲提供关于生育给后代的患病风险方面的建议，且为新生儿出生时提供乙型肝炎疫苗。
接下来母亲的另一知情同意，使用如上所述的类似程序，婴幼儿在6和12周时进行筛选。这包括简要的病例，身体检查，足跟或静脉采血样做基础血液学，生物化学和免疫学检查。包含标准包括，除了别的以外，常规妊娠期间和无明显医学畸形。因为乙型肝炎和HIV阳性的母亲生出的孩子，新生即获得这些病毒的风险非常高，他们不包括在本试验中。除了其他标准之外，如果在本研究疫苗接种前至少一周尚未给予BCG，或者其他除了出生时伴随BCG给予的第一剂量OPV之外的疫苗在登记前已经接种的孩子，不能参加试验。
人员招募后不久给予个人影像身份证。这包括孩子和母亲姓名，及人口普查个人身份号码(Alonso P，Saute F，Aponte JJ.Manhica DSS，Mozambique.In；Sankoh OA，Ngom P，Nyarko P，Mwageni E，Kahn K，编，Population and health in developing countries；vol.1，population，healthand survival at INDEPTH sites.OttawaInternational development researchcenter(IDRC)；2002.p.189-95)，且在筛检随访中给予唯一的研究代码。野外活动开始于2005年6月24日。第一个婴幼儿登记于2005年8月23日，最后一个登记于2006年9月12日。双盲阶段随访活动完成于2007年5月6日，此时最后一个招募来的孩子完成了6个月的研究随访。
程序 莫桑比克EPI包括BCG疫苗和出生时的口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)，3剂量的白喉-百日咳-破伤风全细胞(DTPw)和乙型肝炎疫苗，在8，12和16周龄时用OPV，且在9月龄时用麻疹疫苗。为了研究我们在这个时间表中引入了两点变化。考虑到在越来越多的非洲国家使用Hib疫苗并迅速扩展且变成EPI的一部分，我们决定将其包含于DTPw组合，因为它能够为参加试验的儿童提供更多益处。乙型肝炎疫苗不与DTPw联用，因为已经显示RTS，S会诱导相对等滴定量的抗-HBsAg。图1a代表了试验设计和遵循的时间表。符合条件的孩子在第一次免疫接种DTPw/Hib[TETRActHibTM Aventis Pasteur]那天被召集起来。孩子们在第一次免疫接种DTPw/Hib时被随机分配，接受3剂量RTS，S/AS02D(GSK Biologicals，Rixensart.Belgium)或者乙型肝炎疫苗(Engerix-BTM，GSK Biologicals，Rixensart，Belgium)，与DTPw/Hib和OPV疫苗间隔2周，在10，14和18周龄时给予。GSK生物采用SAS软件第8版进行随机分组(1∶1比率，区组大小2)。一旦数据库已经被监控，清空和锁定的时候，随机码发放到调查者。
婴幼儿随机分配到疟疾疫苗儿科配方组，接受0.5ml的RTS，S/AS02D配方，含有25μg的RTS，S和佐剂系统AS02D。RTS，S是一种杂交重组蛋白，含有恶性疟虫CS蛋白中心串联重复区和与乙型肝炎病毒(HBsAg)S抗原氨基端融合的羧基端区域。蛋白质自组装，以形成还包括非融合S抗原的颗粒。抗原和GlaxoSmithKline专有的AS02D佐剂系统在其他地方详述(Macete EV，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A，Navia MM，Milman J，等.Evaluation of two formulations of adjuvantedRTS，S malaria vaccine in children aged 3to 5years living in amalaria-endemic region of Mozambiquea Phase I/IIb randomizeddouble-blind bridging trial.Trials 2007Mar 26；811)。
DTPw/Hib通过肌肉内(IM)途径给予，注射位置在右前外侧大腿，而RTS，S/AS02D或Engerix-BTM在左前外侧大腿IM注射。RTS，S/AS02D或者Engerix-BTM疫苗接种采用双盲方式(观察者和志愿者均盲)。疫苗接种队准备疫苗，且在给为婴幼儿免疫接种的临床队提供注射器前用不透明带子遮住注射器内容物。由于研究中使用了两种外观截然不同的疫苗，免疫接种队没有被盲，且不参与到其他任何研究过程中来。
每次免疫接种后，婴幼儿观察至少1小时。训练过的户外工作者在接下来的6天内每天去孩子家随访，记录任何不良事件(AE)。这段时间预期的局部和全身不良反应时间都被记录下来。未预期的不良反应在每一剂量后持续30天内，都会通过基于发病率监督系统的卫生设施而记录。严重不良反应(SAEs)通过类似途径发现，并在研究中全程记录。详细的关于预期的和未预期的不良反应事件定义和SAEs的描述可见其他地方11。进一步的安全性评估通过血液学和生物化学评估，包括在几个如图1a所示的时间点测肾脏和肝脏功能。抗-HBsAg抗体滴度在基线和RTS，S/AS02D或Engerix-BTM的剂量3后1个月测量。抗-CS抗体滴度在基线和RTS，S/AS02D或Engerix-BTM的剂量3后的1个和3个半月测量。针对白喉和破伤风毒素的抗体和H.influenzae b型磷酸多核糖基核糖醇(PRP)在DTPw/Hib的剂量3后1个月测量。针对B.pertussis的抗体在基线和DTPw/Hib的第3剂量后1个月测量。
恶性疟虫感染的病例在研究区域的卫生设施上被感染活动检测(ADI)和隐性病例监测(PCD)所监控。ADI包括对研究志愿者按照预定时间间隔多次随访(图1a)。在每次随访中，不管有没有临床症状，都要收集血推片以诊断寄生虫血症，和记录腋下温度。阳性血推片的孩子不论有无症状都用第一线疗法治疗，并不再进行后续的ADI。在开始ADI追踪前，无症状的寄生虫血症根据推测被从所有孩子中清除，在第三和最后剂量的RTS，S/AS02D或Engerix-BTM之前2周给予氨酚喹(10mg/kg/天，连续3天)和单剂量磺胺多辛-乙胺嘧啶(sulphadoxine-pyrimethamine)(磺胺多辛25mg/kg且乙胺嘧啶1,25mg/kg)。寄生虫血症在第3剂量后2周检查，如果出现的话用

二线疗法处理。只有没有寄生虫血症的孩子开始ADI，在第3剂量RTS，S/AS02D或者Engerix-BTM 2周之后开始，每隔一周进行一次，持续12周。
基于发病监视系统的卫生设施建立在Manhica地区医院，Ilha Josina和Taninga卫生站，允许所有参与者去卫生设施进行隐性病例检测(PCD)，且探查临床疟疾症状的出现。这些监视系统已经在其他地方有所描述(Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A，Macete E，Milman J，等.Efficacy of the RTS，S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparuminfection and disease in young African childrenrandomised controlled trial.Lancet 2004Oct 16-22；364(9443)1411-20)简言之，3个设施24小时均有训练过的医疗工作人员通过个人标示卡片鉴定研究志愿者，且确保贯穿始终的标准化评论、处理和记录。所有记录有发烧症状(37.5℃或更高)或曾经有发烧病史，或脸色苍白的孩子，均取血检测寄生虫并测定红细胞压积(PCV)。符合接纳标准的孩子被指定去Manhica地区医院住院治疗。根据标准国家指导方针进行临床处置。入院或出院的有关信息均记录在统一表格中。
为了确诊存在寄生虫和恶性疟虫无性阶段的强度，Giemsa染色血推片根据其他地方描述的标准质量控制程序进行读片(Alonso PL，SacarlalJ，Aponte JJ，Leach A，Macete E，Milman J，et al.Efficacy of theRTS，S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection anddisease in young African childrenrandomised controlled trial.Lancet 2004Oct 16-22；364(9443)1411-20)。生物化学参数采用干法生化光度计VITROS DT II(Orto临床诊断，Johnson&Johnson公司，美国)。血液学测试采用Sysmex KX-21N细胞计数仪(Sysmex Corporation Kobe，日本)。PCV测试用肝磷脂毛细管，离心后采用Hawksley血球容积读数计。
抗体对CS蛋白衔接重复表位的特异性通过标准ELISA测试，采用含有序列[NVDP(NANP)15]2LR的重组抗原R32LR的平皿。序列截止点在0.5EU/ml。抗-HBsAg抗体水平用商用放射免疫测定(AUSAB，Abbott)，序列截止点在10IU/ml。抗-PRP抗体用ELISA测定，序列截止点在0.15μg/ml。抗白喉和抗破伤风抗体滴度用ELISA测定，序列截止点在0.10IU/ml。抗全细胞B，白喉抗体滴度用ELISA(Labsystems)测定，序列截止点在15EL.U/ml。
统计分析 试验的初步终点是测试的RTS，S/AS02D疫苗候选物的安全性和耐受性。所有接受至少1剂量DTPw/Hib疫苗的孩子均进行治疗意向(ITT)安全性分析。
抗CS和抗HBsAg抗体数据用几何平均数滴度(GMTs)统计，CI95％。抗-CS血清阳性确定为≥0.5EU/ml，而乙型肝炎血清保护定义为≥10IU/ml。
疫苗效力(VE)测试基于即将确定的推行于依据协议(According toProtocol，ATP)群组中的报告和分析计划(Report&Analysis Plan，RAP)的概念。ATP群组包括符合所有标准的，完成疫苗接种过程且在ADI期间完成随访时间的主体。分析包括所有第一次检测或仅仅是无性恶性疟虫感染检测，追踪期间开始于RTS，S/AS02D或Engerix-BTM剂量3后14天，终止于研究第6个月随访(大约3个月追踪)。包括在此分析中的疟疾感染通过ADI或PCD检测。
进一步的确定疫苗针对临床疟疾的效果的探测分析在ITT组群进行，从招募时到最后一个招募的婴幼儿完成ADI的跟踪(2007年3月6日)的这段时间内，包括第一次发病或唯一发病情况。此外，临床疟疾的探查性分析，采用于与新感染疗效评定相同的ATP组群和追踪期间。临床疟疾的初级病例定义为发热(腋下温度≥37.5℃)伴随恶性疟虫无性血吸虫血症每微升500或者更多。此定义具有报道的敏感性和特异性高于90％(Saute F，Aponte J，Almeda J，Ascaso C，Abellana R，Vaz N，等.Malaria in southern Mozambiquemalariometric indicators and malariacase definition in Manhica district.Trans R Soc Trop Med Hyg 2003Nov-Dec；97(6)661-6)其他探测性效果分析采用临床疟疾次要病例定义，包括发热或前24小时发热病史加之任何无性恶性疟虫寄生虫血症。患病风险的时间，报导为有患病风险的人年数(PYAR)，会根据如前所述的研究地区缺席者和抗疟药使用情况而校正(Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A，Macete E，Milman J，et al.Efficacy of theRTS，S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection anddisease in young African childrenrandomised controlled trial.Lancet 2004Oct 16-22；364(9443)1411-20)，因为这些是尚不能预计婴幼儿可配合到研究最后的一段时间。
VE被定义为1减去比率。疫苗效力根据与卫生设备的距离进行校正，根据以前描述的方法计算(Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A，Macete E，Milman J，et al.Efficacy of the RTS，S/AS02A vaccine againstPlasmodium falciparum infection and disease in young African childrenrandomised controlled trial.Lancet 2004Oct 16-22；364(9443)1411-20)，以及根据居民社区情况校正。校正后的疫苗效力，用Cox回归模型评价，除了另有描述外，在整个文本中均进行报道。疟疾感染风险的抗-CS抗体滴度的疗效在接种RTS，S/AS02D中的人群中进行评价，通过具有最低应答端粒的婴幼儿相对那些具有最高应答端粒的婴幼儿的危害比(HR)进行比较，同时用Cox回归模型评价每双倍抗-CS抗体滴度的HR。最后，采用维尔科克松秩和检验(Wilcoxon Rank Sum test)进行那些至少有过一次疟疾感染的孩子们相对于那些没有疟疾感染记录的孩子们的几何平均数滴度比较。
样本数根据疫苗安全性的评估来决定。如果Engerix-BTM组的事件频率为10％或更多的话，每组100名个体的试验的统计把握度为80％，检测不良事件比例的差异为26％或更大。如果在整个监视期内对照组发病率为75％或更多的话，如此大样本的试验也有90％的统计把握度，以检测针对疟疾感染的疗效为45％或者会更大。用的统计方法是SAS和STATA。
资金来源 GSK和CISM均受到来自PATH疟疾疫苗倡议组织(PATH MalariaVaccine Initiative，MVI)的资金支持去进行在本文所述的工作，涉及到研究设计和解释(例如每个作者身份指导房展)等各个方面。MVI基金通过来自比尔及梅林达·盖茨基金会(Bill&Melinda Foundation)的专用拨款来运作。CISM核心基金通过西班牙国际合作署(AECI)提供。
结论 图1显示试验规划。446名孕妇中326名满足合格标准，生下329名新生儿。其中251名婴幼儿被筛选，被筛选的孩子中214名(85％)被招募参加试验，接种第一剂量的DTPw/Hib疫苗。在RTS，S/AS02D组中93名(86％)孩子和Engerix-BTM组中92名(85％)进入到ADI追踪。在追踪中，RTS，S/AS02D组中7名儿童和Engerix-BTM组中8名儿童撤回同意书。在RTS，S/AS02D或Engerix-BTM每组中3名儿童在剂量2时接受了错误的疫苗。他们不能被包括在ATP分析之中。两组的基本特征见表1。
图2c显示记录有预期症状的，所有给药剂量的比例。数字代表4组，由于DTPw/Hib和OPV的数据通过随机分配而分离。出现疼痛的孩子的比例较高，且各组相似。在每次注射RTS，S/AS02D后症状的相对比例类似且量值相当(数据未显示)。在RTS，S/AS02D组没有3级预期症状记录在案，每组中发生率都非常低(数据未显示)。在随访的ITT组群，直到2007年3月6日跟踪结束，在RTS，S/AS02D有31个SAE，在Engerix-BTM组有30个SAE。其中没有被报道与疫苗接种有关的。在同样的跟踪期间4例死亡；全部在研究第6个月ADI期完成之后(RTSS/AS02D组2名，Engerix-BTM组2名)。死亡均发生在家中。验尸报告表明RTS，S/AS02D组1例是由于败血病休克，剩下3例是由于胃肠炎和严重脱水。剂量1和剂量3后异常的血液学和生化学值的异常值和比例在两组中相似，不增加任何安全性信号(数据未显示)。
对于招募进此试验的214名个体(107RTS，S/AS02D，107Engerix-BTM)，在剂量3后有151名的EPI抗原反应数据可用(RTS，S/AS02D组76，对照组75)。两组个体的血清阴性/血清阳性和滴度值没有差异(Aide et al，manuscript in preparation)。除了3名儿重外，所有儿童针对所有EPI抗体达到血清阳性标准。这3名应答失败的儿童将会被用抗原再次免疫。
相对CS和H BsAg的抗-CS和抗-HBsAg抗体水平用测量结果见表2.在筛选时RTS，S/AS02D和Engerix-BTM组分别有24/76(32％)和26/77(34％)的婴幼儿具有低的可检测的抗-CS抗体滴度。剂量3后1个月3，99％(70/71)接受RTS，S/AS02D的婴幼儿有可检测的抗-CS抗体，而接受Engerix-BTM的婴幼儿中，此数字为4％(3/68)。剂量3后3个半月(研究的第6月)，在RTS，S/AS02D组抗-CS阳性比例仍高(98％)，但GMT已经下降。即使可检测抗体的增加到20％(12/61)，在Engerix-BTM组抗-CS GMT仍保持低位。乙型肝炎应答在两组中均好(表2)。
图4显示RTS，S/AS02D或Engerix-BTM组剂量3后在14天到研究第6个月的ADI追踪期间，至少有过疟疾感染发病的儿童的比例。在追踪期间，总共68名新感染的记录在案，RTS，S/AS02D组22名，Engerix-BTM组46名。在3个月的追踪期间，粗略的疫苗效力(VE)评估为62.2％(95％CI 37.1％；77.3％，p＝0.0002)。根据卫生中心和居民区之间的距离校正后，VE为65.9％(95％CI 42.6％；79.8％，p＜0.0001)(表3)。在研究第6月，感染流行点数两组类似(RTS，S/AS02D组5％，对照组8％，p＝0.536)，平均寄生虫密度差异不大(RTS，S/AS02D组2082(SD 5604)寄生虫/微升，而对照组2579(SD 6088)，p＝0.85) RAP探测终点包括临床疟疾有效性评估，采用不同组群和病例定义。基于ITT组群第0月到第6月的有效性，采用疟疾的初级病例定义(第一或者仅一个阶段发热伴随大于500寄生虫/微升)，通过ADI和PCD检测，大约35.5％(95％CI-7.5％；61.3％，p＝0.093)。在ATP组群中进一步的临床疟疾有效性评估开始于RTS，S/AS02D或Engerix-BTM的剂量3后14天到6个月随访，与感染初级VE评估相同的追踪期间，如表3所示。表4给出剂量3后12个月内进一步追踪的细节，例如从3-14月。
抗-CS抗体滴度与疟疾风险的关系通过很多方法测定。第一，在第3剂量的RTS，S/AS02D或Engerix-BTM后，比较那些在追踪期间没有疟疾感染记录在案的婴幼儿和那些至少过感染发病的婴幼儿的抗-CS抗体滴度。平均抗-CS抗体滴度在前一组较高(208vs.132，p＝0.026)。其次，在抗体分布较高端粒的婴幼儿比那些较低端粒的风险比例低71％(95％CI 8.4％；90.7％，p＝0.035)。最后，我们测了与抗体滴度增加相关的疟疾感染的风险。双倍抗体滴度，相应地新感染的风险降低6.4％(95％CI 10.8；1.8)p＝0.007)。抗-CS滴度增加10倍，相应新感染的风险降低19.8％(95％CI 31.6；5.9)。
基于上述结果分析疫苗针对新感染的疗效，在完成免疫接种后的3个月追踪期间内为65％。这种疗效评估高于曾报导过的、前人在1到4岁年长儿童中的试验(026试验)中45％的减少，后者的试验在本实验相同的区域采用类似的ADI系统进行追踪。(Alonso PL，Sacarlal J，Aponte JJ，Leach A，Macete E，Milman J，等.Efficacy of theRTS，S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection anddisease in young African childrenrandomised controlled trial.Lancet 2004Oct 16-22；364(9443)1411-20)本试验追踪时间和026试验不一致，对婴幼儿的时间略短于年长儿童。其次，两者置信区间重叠。
表1基础特征
数据为均数(SD)或儿童数量(％)



参考文献
1.Hay SI，Guerra CA，Tatem AJ，Noor AM，Snow RW.The globaldistribution and population at risk of malariapast，present，and future.TheLancet Infectious Diseases 2004；4(6)327-336.
2.Breman JG，Alilio MS，Mills A.The intolerable burden of malariawhat′s new，what′s needed.Am J Trop Med Hyg 2004；71(2_suppl)0-i-.
3.Klausner R，Alonso P.An attack on all fronts.Nature2004；430(7002)930-1.
4.Graves P，Gelband H.Vaccines for preventing malaria(pre-erythrocytic).Cochrane Database of Systematic Reviews 2006，Issue 4.Art.No.CD006198
or
Ballou WR，Arevalo-Herrera M，Carucci D，Richie TL，Corradin G，Diggs C，et al.Update on the clinical development of candidate malariavaccines.Am J Trop Med Hyg 2004；71(2_suppl)239-247.
5.Stoute J，Slaoui M，Heppner D，Momin P，Kester K，Desmons P，etal.A preliminary evaluation of a recombinant circumsporozoite proteinvaccine against Plasmodium falciparum malaria.RTS，S Malaria VaccineEvaluation Group.N Engl J Med 1997；336(2)86-91.
6.Bojang KA，Milligan PJM，Pinder M，Vigneron L，Alloueche A，Kester KE，et al.Efficacy of RTS，S/AS02malaria vaccine againstPlasmodium falciparum infection in semi-immune adult men in TheGambiaa randomised trial.The Lancet 2001；358(9297)1927-1934.
7.Bojang KA，，Olodude F，Pinder M，Ofori-Anyinam O，Vigneron L，Fitzpatrick S，Njie F，Kassanga A，Leach A，Milman J，Rabinovich R，McAdam KPWJ，Kester KE，Heppner DG，Cohen JD，Tornieporth N，andMilligan PJM.Safety and immunogenicity of RTS，S/AS02A candidatemalaria vaccine in Gambian children.Vaccine published.
8.Macete E，Aponte JJ，Guinovart C，Sacarlal J，Mandomando I，Espasa M，et al.Safety，reactogenicity and immunogenicty of theRTS，S/AS02A candidate malaria vaccine in children aged 1 to 4years inMozambique.V accine published.
9.Alonso P，SaúteF，Aponte J，G6mez-OlivéF，Nhacolo A，ThomsonR，et al.Manhica DSS，Mozambique.InINDEPTH，ed.Population andHealth in Developing Countries.OttawaInternational DevelopmentResearch Centre，2001189-195.
10.Dame JB，Williams JL，McCutchan TF，Weber JL，Wirtz RA，Hockmeyer WT，Maloy WL，Haynes JD，Schneider I，Roberts D，et al.Structure of the gene encoding the immunodominant surface antigen on thesporozoite of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.Science.1984；225593-9.
11.Young JF，Hockmeyer WT，Gross M，Ballou WR，Wirtz RA，Trosper JH，Beaudoin RL，Hollingdale MR，Miller LH，Diggs CL，et al.Expression of Plasmodium falciparum circumsporozoite proteins inEscherichia coli for potential use in a human malaria vaccine.Science1985；228958-62.
12.Doherty J，Pinder M，Tornieporth N，Carton C，Vigneron L，Milligan P，et al.A phase I safety and immunogenicity trial with thecandidate malaria vaccine RTS，S/SBAS2in semi-immune adults in TheGambia.Am J Trop Med Hyg 1999；61(6)865-868.
13.Loscertales MP，Roca A，Ventura P，Abascassamo F，Dos Santos F，Sitaube M，et al.Epidemiology and clinical presentation of respiratorysyncytial virus infection in a rural area of southern Mozambique.PediatrInfect Dis J 2002；21148-155.
14.Alonso P，Smith T，Schellenberg J，Masanja H，Mwankusye S，Urassa H，et al.Randomised trial of efficacy of SPf66 vaccine againstPlasmodium falciparum malaria in children in southern Tanzania.TheLancet 1994；3441175-81.
15.Saúte F，Aponte J，Almeda J，Ascaso C，Abellana R，Vaz N，et al.Malaria in southern Mozambiquemalariometric indicators and malariacase definition in Manhica district.in press.
16.World Health Organization.Management of severe malaria，apractical handbook.Second edition，2000.http://mosquito.who.int/docs/hbsm.pdf
17.Therneau TM，Grambsch PM.Modeling Survival DataExtendingthe Cox Model.New YorkSpringer，2000.
18.Hess KR.Graphical methods for assessing violations of theproportional hazards assumption in Cox regression.Stat Med1995；14(15)1707-23.
19.Cytel Software Corporation.StatXact PROCs for SAS Users(version 6).Cambridge，MA，USA.
20.SAS Institue Inc.SAS software(version 8).Cary，NC，USA.
21.Stata Corporation.Stata Statistical Software(Release 8.0).CollegeStation，TX，USA 2003.
22.Sun P，Schwenk R，White K，Stoute JA，Cohen J，Ballou WR，VoSsG，Kester KE，Heppner DG，Krzych U.Protective immunity induced withmalaria vaccine，RTS，S，is linked to Plasmodium falciparumcircumsporozoite protein-specific CD4(+)and CD8(+)T cells producingIFN-gamma.J Immunol.2003Dec 15；171(12)6961-7.
23.Stoute，JA，Kester KE，Krzych U，Wellde BT，Hall T，White K，Glenn G，Ockenhouse CF，Garcon N，Schwenk R，Lanar DE，Momin P，Golenda C，Slaoui M，Wortmann G，Cohen J，Ballou WR.Long TermEfficacy and Immune Responses Following Immunization with the RTS，SMalaria Vaccine.J Infect Dis 1781139-44，1998.
权利要求
1.衍生自恶性疟虫的环子孢子蛋白(CS蛋白)的抗原与药学上可接受的佐剂联合在制备药物中的用途，其中所述环子孢子蛋白被表达于疟疾感染的红细胞前期，所述药物用于为婴幼儿预防接种抵抗疟疾。
2.如权利要求1或2所述的用途，其中目标人群为年龄大约1周到大约50周的婴幼儿。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗原与佐剂的配方进一步包括选自下列的抗原CS、LSA-1、LSA-3、AMA-1、MSP-1、TRAP、Exp-1或者它们的免疫原性片段。
4.如权利要求1到4中任意一项所述的用途，其中所述CS抗原被融合于来自乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述CS蛋白或片段是呈杂合蛋白的形式，所述杂合蛋白包括基本上所有疟虫CS蛋白的C-端部分、4个或者更多个CS蛋白免疫显性区域的串联重复和来自乙型肝炎的表面抗原(HBsAg)。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述杂合蛋白包括恶性疟虫CS蛋白的序列，该序列基本上对应通过线性连接体与HBsAg的N-端符合阅读框融合的恶性疟虫NF54株3D7克隆CS蛋白的氨基酸207-395。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述杂合蛋白包括恶性疟虫CS蛋白的序列，该序列基本上对应通过线性连接体与HBsAg的N-端符合阅读框融合的恶性疟虫NF54株3D7克隆CS蛋白的氨基酸207-395。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述杂合蛋白为RTS。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述RTS为RTS，S的混合颗粒形式。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述RTS，S的量为每剂量25μg。
11.如权利要求1到10中任意一项所述的用途，其中所述佐剂为Th1细胞应答的优先激活剂。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述佐剂包括3D-MPL，QS21或3D-MPL和QS21的组合。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述佐剂进一步包括水包油乳液。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述佐剂进一步包括脂质体。
15.如权利要求1到14中任意一项所述的用途，其中所述佐剂被配制为儿科剂量。
全文摘要
本发明涉及衍生自恶性疟虫的环子孢子蛋白(CS蛋白)的抗原与药学上可接受的佐剂联合在制备药物中的用途，其中所述环子孢子蛋白被表达于疟疾感染的红细胞前期，所述药物用于为婴幼儿预防接种抵抗疟疾。
文档编号A61K39/015GK101820901SQ200880111313
公开日2010年9月1日 申请日期2008年8月11日 优先权日2007年8月13日
发明者W·R·巴罗, J·D·科亨 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司