专利名称：心血管疾病的诊断和治疗方法及组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及动脉粥样硬化和心血管疾病的预防、治疗和风险评估的领域。
背景技术：
动脉粥样硬化是造成大的和中等大小动脉的最内层(内膜)增厚的慢性疾病。其 减少血流并造成受累血管供应的器官中的缺血和组织破坏。动脉粥样硬化是心血管疾病包 括心肌梗塞、中风和外周动脉疾病的主要原因。其是西方世界中死亡的主要原因并预测成 为二十年内整个世界的死亡的主导原因。该疾病由脂蛋白(主要是低密度脂蛋白(LDL))在血管的细胞外基质中的积累而 起始的。这些LDL颗粒聚集并进行氧化修饰。氧化的LDL是促炎症性的、有毒的并造成血 管损伤。动脉粥样硬化在许多方面代表对这样的损伤(包括炎症和纤维变性)的反应。1989年Palinski W等人鉴定了人类中针对氧化的LDL的循环的自身抗体(Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc Natl Acad Sci USA.1989,86 1372-6)。这个观察提示动脉粥样硬化可能是由针对氧化的脂蛋白的免疫反应造成的自身 免疫疾病。此时几个实验室开始寻找针对氧化的LDL的抗体滴度和心血管疾病之间的联系。 但是，从这些研究中浮现的图画远不清楚。存在针对氧化的LDL中的大量不同的抗原决定 簇的抗体，但是，这些抗原决定簇的结构是未知的。因此术语“氧化的LDL抗体”是指不同 特异性的抗体的混合物，而不是单一特异性的抗体。已经众所周知在动脉粥样硬化损伤中存在进行性炎症，特征为免疫活性细胞的 激活和炎性细胞因子的产生。已确定的风险因素像高血压、血脂、糖尿病和吸烟有可能 促进这种炎性反应，但是其发生的机制未被很好地鉴定并且存在不同的非相互排斥的 可能性。已经提出几个不同的可以引发这种免疫反应性的自身抗原，包括氧化的低密度 月旨蛋白(oxLDL)和热激蛋白(HSP) (Binder CJ 等人 Innate and acquiredimmunity in atheroRenesis. Nat Med. 2002,8 1218-26 ；Frostegard J. Autoimmunity, oxidized LDL and cardiovascular disease. Autoimmun Rev. 2002,1 233~7) 胃以白勺 云力J0C 样硬化中免疫反应的作用的数据指示了复杂的关系。其中一个例子是影响动脉粥样硬化 行成的动物模型中的免疫接种。当使用HSP时，动脉粥样硬化增加，但当抗原是oxLDL时， 动脉粥样硬化减少(Palinski W 等人 Immunization of lowdensity Iipoprotein(LDL) receptor-deficient rabbits with homologousmalondialdehyde-modified LDL reduces atherogenesis. Proc Natl Acad SciUSA. 1995,92 821~5 :Xu Q^A Induction of art eriosclerosisinnormocholesteroIemic rabbits by immunization with heat shock protein 65. Arterioscler Thromb. 1992,12 :789_99)。人类疾病中针对oxLDL的抗体(抗-OxLDL)的作用似乎是复杂的。在人类中，以前已经证明抗-OxLDL在健康对照中比在具有临界性高血压的人中要高，临界性高血压是早期心血管疾病的例子(Wu R等人Autoantibodies to OxLDL are decreased in individuals with borderlinehypertension. Hypertension 1999，33 :53_59)。在另一方面，几个作者已经报道了抗-OxLDL在人类心血管疾病(CVD)中特别是在
(Bergmark C等人Patients with early-onsetperipheral vascular disease have increased levels of autoantibodies againstoxidized LDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995,15 441~5 ；Salonen JT 等人 Autoantibody against oxidised LDL and progression of carotidatherosclerosis. Lancet 1992，339 :883_887)。一个例子是系统 性红斑狼疮(SLE)，一种与非常高风险的CVD关联的自身免疫疾病。具有CVD史的SLE患 者有明显增高的抗-OxLDL 水平(Svenungsson E 等人 Riskfactors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation 2001,104:1887-93)。这些某 些程度上矛盾的结果可能是由于不同的方法和LDL氧化的阶段，从而产生抗原性的差异。 还有可能的是疾病阶段和风险因素图谱与抗体水平有关。氧化的低密度脂蛋白(OXLDL)本身具有许多促炎症反应的性质，包括T细 胞1、单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞的激活(Berliner JA等人Minimally modified low density lipoprotein stimulates monocyteendotheIial interactions. J Clin Invest. 1990,85 1260-6 ；Frostegard J 等 人 Oxidized low density lipoprotein induces differentiation and adhesion ofhuman monocytes and the monocytic cell line U937. Proc Natl Acad SciUSA. 1990,87 904~8 :Frostegard J 等人 Biologically modified LDLincreases the adhesive properties of endothelial cells. Atherosclerosis. 1991,90 :119-26)。但是应该注意的是，oxLDL还可以改善急性炎性反应，反而促进更低级别的慢性炎 症(如动脉粥样硬化中所见到的)。有趣的是注意到oxLDL的许多生物作用是由oxLDL中 血小板激活因子(PAF)样脂质引起的(Frostegard J等人Platelet-activating factor and oxidized LDLinduce immune activation by a common mechanism. Arterioscler ThrombVasc Biol. 1997,17 :963_8 ；Heery JM 等人 Oxidatively modified LDLcontains phospholipids with platelet-activating factor-like activity andstimulates the growth of smooth muscle cells. J Clin Invest. 1995,96 2322~30 ；Subbanagounder G ^ A Evidence that phospholipid oxidationproducts and/or platelet-activating factor play an important role in earlyatherogenesis :in vitro and in vivo inhibition by WEB 2086. Circ Res.1999,85 311~8)。血小板激活因子(PAF)是各种细胞包括单核细胞和内皮细胞合成的磷脂炎性调 节子。在LDL氧化的过程中，产生PAF-样脂质。因此PAF可能在病理过程中、在血管壁样动 脉粥样硬化和高血压有重要意义。在先前的报道中，描述了具有磷脂抗体综合症的个体中 PAF 抗体的存在(Barquinero J 等人 Antibodies against platelet-activating factor inpatients with antiphospholipid antibodies. Lupus 1994，3 :55_58)。Tektonidou MG 等入(Clinical importance of antibodies againstplatelet activating factor in antiphospholipid syndrome manifestations.EurJ Clin Invest. 2000，30 :646_52)报道抗PAF抗体在APS和SLE中是常见的并且包含血栓发生发 展的独立因子。
WO 00/02046描述了升高的PAF抗体浓度与临界性高血压和代谢综合症即早期心 血管疾病相关。已经显示升高的PAF抗体浓度与发生早期动脉粥样硬化的增加的风险相关 联。Wu 等 人(Antibodies to platelet-activating factor are associated withborderline hypertension, early atherosclerosis and the metabolic syndrome. T Intern Med. 1999 246 389-397)进一步提出抗PAF抗体可能反映早期血管变化，因此作 为疾病的新型标记，并且其可能还是致病性的(通过在血管壁中引发炎性反应)。WO 2005/100405描述了确定针对磷酰胆碱(PC)(其与发生缺血性心血管疾病的 升高的或降低的风险相关)的抗体(例如IgM或IgG抗体)存在或不存在的方法，并进一 步提出PC-偶联物或针对PC-偶联物的抗体在治疗或预防动脉粥样硬化中的用途。
发明内容
本发明的第一方面提供了至少一个PAF衍生物、一个PAF偶联物或对PAF偶联物 具有反应性的抗体制备物(例如单克隆抗体)在制备用于免疫接种和预防、防止或治疗哺 乳动物(包括人类)抵抗心血管疾病(如动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病)的药物 中的用途。该药物旨在提供具有抵抗心血管疾病的免疫原性或治疗性性质的免疫接种。本发明的第二方面提供了免疫接种和治疗哺乳动物(包括人类)抵抗心血管疾病 (如动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病)的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含 至少一个PAF衍生物、一个PAF偶联物或对PAF偶联物具有反应性的抗体制备物(例如单 克隆抗体)的药物组合物的步骤。所述药物组合物旨在提供具有抵抗动脉粥样硬化的免疫 原性或治疗性性质的免疫接种。本发明的第三方面提供如了本发明的以上方面所定义的一个或多个PAF衍生物 和PAF偶联物在制备用于心血管疾病的防止、预防和/或治疗的免疫治疗或治疗的药物组 合物(可选地与佐剂组合)中的用途。本发明的第四方面提供了预防或治疗性处理哺乳动物(可以是人)的方法，所述 哺乳动物患有动脉粥样硬化或面临发生心血管疾病的风险，其中施用治疗上有效量的至少 一个PAF衍生物、一个PAF偶联物或对PAF偶联物具有反应性的抗体制备物(例如单克隆 抗体)。本发明的第五方面提供了使用PAF偶联物诊断与发生心血管疾病的增加的或减 少的风险相关的抗体(例如IgM、IgG或IgA抗体)存在或不存在的方法。本发明的第六方面提供了 PAF偶联物在评估患者发生或发展心血管疾病的风险 的方法中的用途，其中评估了病人的对PAF偶联物有反应性的抗体(例如IgM、IgG或IgA 抗体)的水平。
具体实施例方式本发明惊奇地发现低水平的与PAF偶联物反应的抗体与发生心血管疾病的增加 的风险相关。这与现有技术报道的相反，现有技术中提示高水平的PAF抗体与发生心血管 疾病的增加的风险相关。本发明涉及包含PAF衍生物、PAF偶联物或对PAF偶联物具有反应性的抗体制备物(例如单克隆抗体)的药物组合物，以及这些组合物在治疗、预防或防止心血管疾病(如 动脉粥样硬化)中的用途，例如在治疗、防止或减少动脉粥样硬化的进一步发展中的用途。 此外，本发明还涉及PAF衍生物、PAF偶联物或所述抗体制备物(例如单克隆抗体)在制备 药物组合物(可选具有佐剂)中的用途。此外本发明涉及诊断与发生心血管疾病的增加的或减少的风险相关的抗体(例 如IgM、IgG或IgA抗体)不存在或存在和/或水平。PAF的意思是根据以下通式的1-0-烷基-2-乙酰基-sn-甘油_3_磷酸胆碱。 优选地，烷基基团是十六烷(十六烷基)基团或油烯基(十八烷基)基团。PAF偶联物的意思是与载体连接的PAF部分(moiety)，优选通过间隔子(spacer) 连接。可以将PAF部分共价或非共价地连接至载体。PAF部分可以是PAF的衍生物。优选 地通过烷基基团将PAF部分连接至载体。PAF衍生物的例子是根据以下通式的化合物 其中Rl是C2至C25的亚烷基、亚烯基或亚炔基连接基团，R2至R5独立地选自C1 至 C6 烷基，如 WO 87/05904 和 US 5，061，626 中所述；根据下面通式的化合物 其中Rl是C2至C18烷基，优选为十五烷基，R2是H、甲基、乙基、丙基或异丙基；R3 是甲基、乙基、丙基或异丙基，如Karasawa K等人J Biochem(Tokyo) 1991，110 :683_687所 述；根据下面通式的化合物 其中Rl是C6至C18烷基，优选为己基或十二烷基，如Smal MA等人Lipids 1991， 26 1130-5 所述；根据下面通式的化合物 其中Rl是C6至C18烷基，优选为己基或十二烷基(1-酰基-PAF)，如Muzya GI等 人 Immunologiya(Moscow) 1997,6,9-11 所述。载体可以是例如蛋白、碳水化合物、聚合物、乳胶珠子或胶体金属。PAF偶联物可以是例如蛋白-PAF偶联物，如人血清白蛋白(HSA) -PAF偶联物、铁 转移蛋白-PAF偶联物、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)-PAF偶联物或牛血清白蛋白(BSA)-PAF偶联 物。PAF偶联物和抗-PAF抗体的产生的例子在WO 87/05904中有描述并由 Karasawa K 等 人(Antibodies to synthetic platelet-activating factor(1-0-alkyl-2-0-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) analogues withsubstituents at the sn-2 position. J Biochem(Tokyo). 1991,110 :683_7), Macpherson JL 等 人 (Production and characterization of antibodies toplatelet-activating factor. T Lipid Mediat. 1992,5 49~59), Smal MA ^A (Synthesis of a PAF immunogen and production of PAF-specific antibodies. Lipids. 1991, 26 :1130_5),Tomii A 禾口 Masugi F. (Production ofanti-platelet-activating factor antibodies by the use of colloidal gold ascarrier. .Ton T Med Sci Biol. 1991,44 75~80),和 Wang C 和 Tai HH. (Asensitive and. specific radioimmunoassay for platelet-activating factor. Lipids. 1992,27:206-8)和US 5，061，626描述，其内容通过引用并入本文。举例说明了可以根据本发明治疗和/或防止的心血管疾病，所述心血管疾病不限 于动脉粥样硬化，急性心肌梗塞，稳定和不稳定心绞痛，中风，动脉移植、动脉支架术和球囊 血管成形术之后的再狭窄，特别是冠状动脉旁路移植术、冠状动脉支架术和冠状动脉血管 成形术之后的再狭窄。在根据本发明的第一方面的用途中，或根据本发明的第二方面的方法中，心血管 疾病可以选自动脉粥样硬化，急性心肌梗塞，稳定和不稳定心绞痛，中风，动脉移植、动脉支 架术和球囊血管成形术之后的再狭窄，特别是冠状动脉旁路移植术、冠状动脉支架术和冠 状动脉血管成形术之后的再狭窄。优选地，在根据本发明的第一方面的用途中，或根据本发明的第二方面的方法中，通过注射施用药物。本发明的第五方面可以提供确定与发生心血管疾病的增加的或减少的风险相关 的PAF偶联物有反应性的抗体(例如IgM、IgG或IgA抗体)存在或不存在的方法。通常，本发明的第五方面的方法包括向来自个体的样品暴露于PAF偶联物并检测 与PAF偶联物结合的抗体。优选地，在本发明的第五方面的方法中，个体是人类。优选地，在本发明的第五方面的方法中，样品是血清。根据本发明的第六方面的PAF偶联物的用途可以对应于根据本发明的第五方面 的使用PAF偶联物的方法。优选地，在本发明的第五或第六方面中，PAF通过间隔子连接至载体。在这个具体 实施方式中，载体通常是蛋白，优选为KLH (钥孔戚血蓝蛋白)、铁转移蛋白、人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。或者载体可以是乳胶珠子。通常，根据本发明的第五方面，通过一种检验(优选免疫检验)来测定结合至PAF 偶联物的抗体。患者的对PAF偶联物有反应性的抗体(例如IgM、IgG或IgA抗体)的水平可以使 用免疫检验来测定。下面描述了合适的免疫检验的例子，其对于本领域技术人员在任何情 况下是明显的。通常，在本发明的第五和第六个具体实施方式
中，低水平的对PAF偶联物有反应 性的抗体是发生心血管疾病的增加的风险的指征。相反，高水平的对PAF偶联物有反应性 的抗体是减少的发生心血管疾病的风险的指征。通常，在患者血浆或血清的样品中测定抗 体。在任何给定的人群中，对PAF偶联物有反应性的抗体的水平有可能变化。对于任 何给定的个体测定的对PAF偶联物有反应性的抗体的水平可以通过参考广阔人群中观察 到的范围而被分类为高或低。例如，在通过参考广阔人群而测定的特定百分比值以下的这 样的抗体的水平可以被分类为低水平。适当地，低水平可以对应于25%以下或20%、10% 或5%以下的值。高水平可以对应于例如5%、10%、20%或25%以上的值。当个体被鉴定为具有低水平的对PAF偶联物有反应性的抗体时，这个信息可以辅 助发生或发展缺血性心血管疾病的增加的风险的诊断或预后。临床医生可以考虑其它因素 以达到诊断或预后。当认为个体有发生缺血性心血管疾病的增加的风险时，可以推荐预防 性治疗和/或生活方式的改变。当个体被诊断为具有进行性缺血性心血管疾病时，他或她 的临床医生可以推荐个体化的治疗和/或生活方式的改变。在本发明的第五和第六方面中，抗体的水平可以通过测定所有对PAF偶联物有反 应性的抗体，或只测定特定同种型的抗体如IgM、IgG或IgA，或测定两个或两个以上抗体同 种型的组合而鉴定。优选地，确定IgG的水平。免疫检验可以是竞争性的或非竞争性的。在典型的竞争性免疫检验中，样品中的 抗体与标记的抗体竞争性结合至PAF偶联物。然后测定结合至PAF偶联物的标记的抗体的 量。样品中的抗体浓度与检测的标记的抗体的量之间有反向的关系。在非竞争性免疫检验 中，样品中的抗体结合至PAF偶联物，然后标记的检测试剂(通常是抗免疫球蛋白抗体)结 合至该抗体。然后测定结合至该抗体的标记的检测试剂的量。与竞争性方法不同，非竞争性方法的结果将直接与抗体的浓度成比例。在非竞争性免疫检验或western印迹中，标记的检测试剂(通常是抗免疫球蛋白 抗体)被用于检测与PAF偶联物结合的抗体。合适的抗免疫球蛋白抗体必须特异性结合一 种物种(样品从该物种获得)的免疫球蛋白。其可以结合至该物种的所有免疫球蛋白同种 型或只结合同种型的一个亚型。例如，其可以只结合IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，或结合两个 或两个以上的这些同种型的组合。抗免疫球蛋白抗体可以只特异性结合任何给定的同种型 的某些亚型。人类IgA的亚型为IgAl和IgA2。抗免疫球蛋白抗体可以结合至一个或两个 这些亚型。人类IgG的亚型为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。抗免疫球蛋白可以结合至一个或 多个这些人类IgG亚型。应该理解的是不同的脊椎动物物种中有不同的同种型和亚型。在放射免疫检验中，以放射性同位素如131I或125I标记抗体或检测试剂。在酶免 疫检验中，以酶标记抗体或检测试剂。合适的酶能够使用生色底物被检测到。生色底物是 作为与酶反应的结果而产生有色产物的底物，从而有色产物可以分光光度计测量而被检测 至|J。酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和来自大肠杆菌(E.coli)的焦磷 酸酶已经被广泛地应用。还可以使用基于酶如荧光素酶的化学发光系统。其它的标记包括 荧光标记如Alexa系列的荧光基团。经常使用维生素生物素偶联抗体或检测试剂，因为这可以通过酶连接的或荧光基 团连接的亲和素或链霉亲和素的反应而容易地被检测到(生物素以强烈的特异性和亲和 力与亲和素或链酶亲和素结合)。在典型的非竞争性酶免疫检验中，将需要分析的样品与吸附在固体基质上的PAF 偶联物接触并孵育。因此可能存在于样品中的任何抗PAF偶联物的抗体被吸附在固体基质 上的PAF偶联物特异性地结合，从而产生PAF偶联物/抗PAF偶联物抗体复合物。然后通过 例如洗涤将样品从固体基质上分离以便除去非结合的物质。在该方法的下一步，向固体基 质加入能够结合任何以PAF偶联物/抗PAF偶联物抗体复合物形式存在于基质中的抗-PAF 偶联物抗体的指示剂抗体，因此产生PAF偶联物/抗PAF偶联物抗体/指示剂抗体复合物。 指示剂抗体可以是例如在非人的动物物种中产生的抗人IgG免疫球蛋白。最后，检测在固 体基质上的PAF偶联物/抗PAF偶联物抗体/指示剂抗体复合物的存在，固体基质上的所 述复合物的存在是来自个体的样品中抗PAF偶联物抗体存在的指征。通常，固体基质是微量滴定板，例如是用于进行ELISA免疫检验的常见类型的微 量滴定板。所述微量滴定板优选为聚苯乙烯板。其它适当的固体基质是乳胶颗粒、珠子和 包被的红血细胞。方便地，通过在含有固体基质的缓冲液中孵育PAF偶联物而将PAF偶联 物吸附至固体基质上。合适的缓冲液包括碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲的盐水。或者，可以 将PAF偶联物共价连接至固体基质。通常，将PAF偶联物吸附或共价连接至固体基质上之 后，以封闭试剂孵育固体基质以减少来自样品的物质与固体基质的非特异性结合。合适的 封闭试剂包括牛血清白蛋白。优选对可以结合至PAF偶联物的抗体的定量测定是通过一种或更多上述技术获得的。在典型的非竞争性检验中，假定了测量的变量(不论其是光密度或一些其它的读数) 和抗体浓度之间的线性关系。例如，如果样品A在检验中有样品B的双倍的光密度(已经 从两者中减去本底)，则认为A中的抗体浓度是B的两倍。但是，优选的是构建阳性血清样 品的库的系列稀释的标准曲线。优选地，在检验样品的同时检验这样的稀释物。通过这样做，在测定样品中抗体量的时候可以将任何来自线性关系的差异都考虑进去。希望的是测定与oxLDL或丙二醛修饰的LDL(MD-LDL)反应的抗体以及测定对PAF 偶联物有反应性的抗体例如IgM、IgG或IgA抗体。另外希望的是或还希望的是测定脂蛋 白相关的磷脂_A2(LpPLA2)、同型半胱氨酸、C-反应性蛋白(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白 (HDL)、TNF(特别是TNF a )和/或HSP60以及测定对PAF偶联物有反应性的抗体(例如 IgM、IgG或IgA抗体)的水平。对这样因子的检验可以帮助发生或发展心血管疾病的增加 的风险的诊断或预后。考虑到本文描述的任何方法或组合物可以根据本文描述的任何其它方法或组合 物实现。相似地，任何关于本发明的一个方面所讨论的具体实施方式
可以用于本发明的任 何其它方面的内容中。贯穿本申请，术语“约”用于表明数值包括用于测定该数值的仪器或方法的误差的 标准偏差。当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，使用单词“一个(a) ”或 “一个(an)”可以意味着“一个(one)”，但还与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个 以上”的意思一致。在权利要求中使用术语“或”是用于表示“和/或”，除非明确地指出只表示两者之 一或两者之一是相互排斥的，虽然本公开支持提及只有两者之一和“和/或”的定义。本发明的其它目标、特征和优点将在下列详细的说明中变得显而易见。但是应该 理解的是详细的描述和特定的例子，虽然指示了本发明的特定具体实施方式
，但是其只以 举例说明的方式给出，因为根据详细的本说明书，本发明的精神和范围内的各种变化和修 改将对本领域技术人员将变得显而易见。下面公开的实施例只是为了举例说明本发明的目的，不应被认为是作为任何对随 附的权利要求书所划定的范围的任何限制。本文参考的文献通过引用并入本文。描述了测定与发生心血管疾病的增加的或减少的风险相关的PAF偶联物有反应 性的IgG抗体的不存在或存在和/或水平的方法的例子。也可以使用本领域已知的其它方法。可以使用相似的方法测定对PAF偶联物有反应性的IgM或IgA抗体的不存在或存 在和/或水平。A. PAF 偶联物在根据本发明的方法中合成并使用了下列PAF-BSA偶联物 n = 16B.泖誠PAF {臓勿能謹輸赫&禾口 /赫種诚在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中以5 ii g/ml PAF-BSA偶联物(以上所述的)包被微量滴定板。以PBS洗涤后，以BSA溶液封闭该板。血清样品在样品稀释液中稀释(1 101) 并加入板中。将板在室温孵育30分钟并洗涤。加入辣根过氧化物酶偶联的兔抗人 IgGd 1000稀释)并在室温孵育30分钟。洗涤后，通过加入3，3’，5，5，四甲基联苯胺 (TMB)底物并室温黑暗中孵育板10分钟发生显色。使用分光光度计在450nm读出吸收值。 与PAF-BSA偶联物反应的抗体的水平被计算为从测试样品获得的吸收值与从每个检验中 包括的阳性对照获得的吸收值之间的比率。C.针对PAF偶联物的抗体可以如上述制备针对PAF偶联物的抗体。参见例如WO 87/05904，Macpherson JL ^ A (Production and characterization of antibodies toplatelet-activating factor. T Lipid Mediat. 1992,5 :49-59)，禾口 Smal MA等人(Synthesis of a PAF immunogen and production of PAF-specificantibodies. Lipids. 1991,26:1130-5)。D.针对PAF偶联物的单克降抗体可以使用本领域已知的任何标准方法制备针对PAF的单克隆抗体。参见例如 Tomii A禾口Masugi F. (Production of anti-platelet-activatingfactor antibodies by the use of colloidal gold as carrier. Jpn J Med Sci Biol. 1991,44 :75_80)。可以使用本领域技术人员熟知的方法制备其它与PAF偶联物反应的抗体。例如， 可以制备与PAF偶联物反应的人免疫球蛋白制备物的亚组分，例如如下面所述，例如通过 使用PAF偶联物进行亲和纯化。静脉内免疫球蛋白制备物(例如IGIV ；Baxter和其它)是商业上可获得的高度 纯化的IgG制备物并用于治疗无抗体产生的或有非常低水平的抗体产生的患者。免疫球 蛋白制备物包括那些可以从下列生产商获得的制备物=Baxter (US)，例如Gammagard , Isiven(Antimo Naples, Italy), Omrix(Tel-Hashomer, Israel), MiIes(Biological Products Division, West Heaven, CT), Sclavo (Lucca, Italy), Sandoz (Novartis, Basel, Switzerland),例如 Sandoglobulin , Biotest Diagnostic Corporation(Deville,
NJ)。免疫球蛋白制备物的例子有 GammagardS/D , GammarlV , Gaimnar-PIV , Gammimune N , Iveegam , Panglobulin , Polygam S/D , Sandoglobulin , Venoglobulin 。免疫球蛋白制备物通常包含一些IgM以及igG。在Gammagard 中存在 痕量的IgM。Pentaglobin(Biotest)是浓缩的已经用于SARS治疗的IgM制备物。对PAF 偶联物有反应性的亚组分可以同时包含IgG和IgM，或可以被选择而主要包含IgG(例如通 过以富含IgG的制备物如Gammagard 起始和/或通过选择IgG)；或主要包含IgM(例如 通过以富含IgM的制备物如Pentaglobin起始和/或选择IgM)。E.主动免疫因此本发明的一个具体实施方式
是使用PAF衍生物或PAF偶联物用于制备药物组 合物，所述药物组合物用于治疗、预防或防止心血管疾病，如动脉粥样硬化、急性心肌梗塞、 稳定和不稳定心绞 痛、中风，动脉移植后再狭窄、动脉支架术和球囊血管成形术，特别是冠 状动脉旁路移植术后的再狭窄、冠状动脉支架术和冠状动脉血管成形术。所述偶联物可以 是与药学上可以接受的蛋白、碳水化合物或聚合物连接的PAF或PAF衍生物。优选通过注射施用药物组合物。提出的主动免疫的方法将调节抗体的滴度，其转而将对心血管疾病的发生有积极 的作用。F.被动免疫本发明的另一个具体实施方式
是使用抗体制备物例如单克隆抗体，其识别用于制 备治疗、预防或防止心血管疾病的药物组合物的PAF偶联物，所述心血管疾病如动脉粥样 硬化，急性心肌梗塞，稳定和不稳定心绞痛，中风，动脉移植、动脉支架术和球囊血管成形术 之后的再狭窄，特别是冠状动脉旁路移植术、冠状动脉支架术和冠状动脉血管成形术之后 的再狭窄。单克隆可以使用本领域已知的方法制备。G.诊断和风险评估本发明的进一步具体实施方式
提供了使用PAF偶联物诊断对PAF偶联物有反应性 的抗体(例如IgA、IgM或IgG抗体)的不存在、存在和/或水平的方法，所述PAF偶联物与 发生心血管疾病的增加的或减少的风险相关。优选的方法是免疫检验。该方法可以用于评 估患者的发生或发展心血管疾病的风险。实施例1包括了下列实施例以证明本发明的优选的具体实施方式
。本领域技术人员应该理 解的是遵循本发明人发现的代表技术的实施例中公开的技术在实现本发明时可以很好地 发挥作用，因此可以被认为构成了其实施的优选模式。但是，考虑到本发明，本领域技术人 员应该理解的是在公开的特定具体实施方式
中可以做出许多改变，并且不背离本发明的精 神和范围而仍然获得同样的或相似的结果。A.受试者在Malm6(theMalmdDiet and Cancer Study)的观测性研究中，募集来自群体 的约30000个受试者中的约6000个以进行深入的心血管疾病研究，包括通过颈动脉的超声 测定非侵入性地评估亚临床动脉粥样硬化。总共有137个CVD病例(主要是心肌梗塞(Ml) 和缺血性中风)和384个年龄和性别匹配的对照。抗PAF-BSA的截止水平为307 (10%的抗 PAF水平)。抗PAF-BSA IgG的截止水平为60. 8 (25%的水平)。总共有58个CVD病例具 有25%以下的抗PAF-BSA IgG水平(42% )，和79个对照(21 % )，这对应于3. 19的相对风 险(95% CI 2. 04-4. 99)(表 1)。结果显示低的抗PAF-BSA水平是健康受试者中出现心血管疾病的预测物，可以作 为心血管疾病的标记。B.试剂Maxisorp 锁定孔板、C96、微量滴定板购自 Nunc (RoskildeDenmark)，PAF-BSA 由 IsoSep, Uppsala (Sweden)合成禾口提供。与兔抗人IgG ( Y _特异的)偶联的辣根过氧化物酶购自DakoCytomation， Stockholm (Sweden) 。 TMB ^^ 自 Phadia, Freiburg (Germany)。C.针对PAF偶联物的抗体的测定通过酶联免疫吸附检验(ELISA)测定PAF-BSA的IgG抗体。产生0. 5-0. 70D吸收 值的一个血清被用作内部标准并在每个板上测试。抗原浓度为g/ml时达到抗体结合 的稳定水平。因此以PBS中的PAF-BSA(5 u g/ml)包被C96微量滴定maxsorp板(100 u g/孔)并在4°C孵育过夜。吸取包被溶液后，以BSA-PBS在室温封闭板2小时。吸取封闭 溶液，加入0. 2% BSA-PBS中1 101稀释的血清样品(100 μ 1/孔)。于室温孵育板30分 钟，如上所述，并以洗涤缓冲液(Phadia，Freiburg, Germany)洗涤三次。每孔加入100 μ 1 辣根偶联的兔抗人IgG(稀释1 1000)并在室温孵育30分钟。洗涤三次后，如上所述， 通过加入TMB底物(100 μ 1/孔)而显色。黑暗中在室温孵育10分钟以后，通过加入0.5Μ H2SO4 (50 μ 1/孔)终止反应。在450nm在ELISADigiScan分光光度计中读板。以两次重复 测定所有的样品，所有样品的差异系数在15%以下。P.结果表1 ******************根据本公开，无需花费过量实验即可得到并实施本文公开的和要求保护的所有组 合物和/或方法。虽然已经根据优选的具体实施方式
描述了本发明的组合物和方法，但是 对于本领域技术人员显而易见的是可以不背离本发明的概念、精神和范围而对本文描述的 组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序适用某些变化。更特别地，显而易见的是同 时在化学上和生理上相关的某些试剂可以替代本文描述的试剂而获得相同或相似的结果。 所有这样的对本领域技术人员是显而易见的相似替换和修改被认为是落在如随附的权利 要求书所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
权利要求
至少一个PAF衍生物、一个PAF偶联物或对PAF偶联物有反应性的抗体制备物例如单克隆抗体在制备用于免疫接种和预防、防止或治疗哺乳动物包括人类以抵抗心血管疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中心血管疾病选自动脉粥样硬化，急性心肌梗塞，稳 定和不稳定心绞痛，中风，动脉移植、动脉支架术和球囊血管成形术之后的再狭窄，特别是 冠状动脉旁路移植术、冠状动脉支架术和冠状动脉血管成形术之后的再狭窄。
3.一种用于免疫接种和预防、防止和治疗哺乳动物包括人类以抵抗心血管疾病的方 法，所述方法包括向哺乳动物施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含至少一个PAF 衍生物、一个PAF偶联物或对PAF偶联物有反应性的抗体制备物例如单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中心血管疾病选自动脉粥样硬化，急性心肌梗塞，稳 定和不稳定心绞痛，中风，动脉移植、动脉支架术和球囊血管成形术之后的再狭窄，特别是 冠状动脉旁路移植术、冠状动脉支架术和冠状动脉血管成形术之后的再狭窄。
5.根据权利要求1或2所述的用途，或根据权利要求3或4所述的方法，其中通过注射 施用药物或通过注射施用组合物。
6.如前述权利要求中任一项定义的一个或更多的PAF衍生物或PAF偶联物在制备用于 预防、防止或治疗心血管疾病的药物组合物中的用途，所述药物组合物可选地与佐剂组合。
7.一种预防或治疗性处理患有动脉粥样硬化或面临发生心血管疾病风险的哺乳动物 例如人类的方法，其中施用治疗上有效量的至少一个PAF衍生物、一个PAF偶联物或对PAF 偶联物有反应性的抗体制备物例如单克隆抗体。
8.一种使用PAF偶联物诊断与发生缺血性心血管疾病的增加的或减少的风险相关的 IgM、IgG或IgA抗体存在或不存在的方法。
9.根据权利要求8所述的方法，包括暴露来自个体的样品的PAF偶联物并检测结合至 PAF偶联物的抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中个体是人类。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中样品是血清。
12.根据权利要求8-11任一项所述的方法，其中通过间隔子将PAF连接至载体。
13.根据权利要求9-12任一项所述的方法，其中载体是蛋白。
14.根据权利要求10所述的方法，其中蛋白是KLH(钥孔戚血蓝蛋白、铁转移蛋白、人血 清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。
15.根据权利要求12所述的方法，其中载体是胶体珠子。
16.根据权利要求8-15任一项所述的方法，其中通过一种检验优选免疫检验测定结合 至PAF偶联物的抗体。
17.PAF偶联物在评估患者发生或发展缺血性心血管疾病的方法中的用途，其中评估患 者的与PAF偶联物反应的IgM、IgG或IgA抗体的水平。
全文摘要
低水平的与PAF偶联物反应的抗体与发生心血管疾病的增加的风险相关。因此，提供了诊断和治疗心血管疾病的组合物和方法。
文档编号A61P9/10GK101842119SQ200880113553
公开日2010年9月22日 申请日期2008年10月29日 优先权日2007年10月30日
发明者H·格伦隆德, I·达尔布姆, J·弗罗斯特盖德 申请人:阿瑟拉生物技术公司