专利名称：组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2对脑卒中的治疗作用及制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域。
背景技术：
组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)是一种丝氨 酸蛋白酶。tPA具有缺血脑保护作用u，但由于丝氨酸蛋白酶结构域会增大缺血脑损伤，因 此不宜直接用作脑保护药物。我们制备了一系列含有tPA不同结构域的变体，首次发现tPA 分子中环饼结构2(Kringle2)结构域具有比tPA更强缺血脑保护作用，并将其用于急性脑 卒中的治疗。环饼结构又叫“Kringle”，包含大约90个氨基酸和3个二硫键，是广泛存在 于脊椎动物plasminogen-prothrombin家族酶中的结构域，主要作用是介导分子之间的相 互识别，如人的APOA含有38个kringle结构。tPA kringle2主要功能是与纤维蛋白、纤 溶酶及肝素上的赖氨酸或精氨酸结合，晶体结构显示62位和72位的Trp介导了这种作用 3。tPA在缺血性脑损伤中可以作为神经递质，拮抗Zn2+在局灶性脑缺血时引起的毒性作用， 参与了脑缺血神经元保护作用4。脑缺血以后，tPA能够调节微循环，提高缺血后的脑血流 5O脑缺血时tPA酶切活化latent-PDGF-CC，通过星形胶质细胞上的PDGF-R受体，调节BBB 开放。脑中tPA可同时在神经元细胞和神经胶质细胞中表达。生理条件下，tPA具有细胞 因子样作用，参与突触生长、神经元细胞迁移、轴突生长以及活化BDNF参与LTP (long-term potentiation)等作用；病理状态下，如癫痫，可作为立即早期基因被诱导6’7。用于临床的 r-tPA(alteplase)主要为单链形式(大约占70%)，tPA双链形式为一条带有氨基端的 A链(1 275残基)通过一个二硫键连接于带有羧基端的B链(276 527残基)。tPA 有5种不同的结构域，A链由锌指(F)结构域、生长因子(G)结构域和两个“环饼结构”区 (Kringlel,Kringle2)组成；B链为一个丝氨酸蛋白酶区(P)。虽然tPA有缺血脑保护作用， 但tPA不宜够直接用作脑保护药物。因为tPA得丝氨酸蛋白酶结构域(P)会增大缺血脑损 伤。早期有人使用蛋丝氨酸蛋白酶切位点突变的S478A-tPA，证实tPA脑保护作用与蛋白 水解酶活性无关2。Tsirka8的早期研究发现，tPA通过蛋白水解酶活性降解神经元细胞外 基质Iaminin-IO (α 5-β 1_ Y 1)，引起细胞损伤9’1CI。Ret印Iase只含有Kringle2和P两个 结构域，缺血后15分钟注射会产生脑保护作用。alt印Iase比ret印Iase多了一个介导脑 损伤的结构域(F，活化小胶质细胞")。缺血前注射tPA不会改变BBB的开放，可能是由于 tPA作为神经递质，在脑中被快速清除。tPA可以通过非蛋白酶活性活化小胶质细胞，降低 TNF-α的释放，发挥脑保护作用"。目前，还没有治疗缺血性脑卒中的脑保护药物获得美国 FDA批准。我们首次发现kringle2在脑卒中早期具有脑保护作用，为脑卒中的治疗提供了 新的备选药物。
发明内容
组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2多肽(kringle2)，作为用于脑卒中治疗，以及脑损伤，神经退行性病治疗的备选新药。
具体实施例方式1.仪器与材料SD (Sprague Dawley)大鼠，雄性，280 320g，南京青龙山实验动物公司。脑立 体定位仪，stoelting公司；微量注射泵，stoelting公司；流式细胞仪FACS Calibur, 美国 Becton Dicknson 公司。i式齐Ll :Epsilon-aminocaproic acid(EACA)，Sigma 公司； Alteplase, Genentech 公司；Ret印Iase (K2P)，苏兰公司(RxD Biopharma)；超微量 ATP 酶 测试盒，南京建成；Mouseanti-rat MMP-9单克隆抗体，CHEMICON公司；DAE显色试剂盒， CHEMIC0N 公司；马血清，Gbico 公司；无糖型 RPMI 1640，Gbico 公司；RPMI 1640，Gbico 公司；第一链 cDNA 合成试剂盒，shinegene 公司；Hoechst33258, Sigma 公司；propidium iodide (PI)，Sigma公司。质粒ρ ET29a和大肠杆菌表达菌株BL21购自Novagen公司； Ni-S印harosei真料购自Qiagen公司；CM±真料购白Pharmacia公司，各种工具酶购自Takara 公司。其它试剂ETI-S印harosecolumn，本实验室制备；Lysine-S印harose 4B，法玛西亚 公司；Gelatin-S印harose 4B，本实验室制备。PCR模板和引物由上海生物工程有限公司 合成。 2.环饼结构2(Kringle2)和丝氨酸蛋白酶结构域(P)多肽的纯化2mg/mL reteplase 与 2 μ g/mL plasminogen 在 digest buffer (lOOmmol/L PBS, 0. 7mol/L Arg,pH8. 0)中 37°C酶切过夜。反应混合物在室温用 2-mercaptoethanol (5mmol/ L)限制性还原2小时，然后H202 (0. Immo 1/L)室温氧化1小时，破坏kringle2结构域与P 结构域之间的二硫键。用ETI-S印harose亲和层析柱纯化P多肽，穿过液透析(lOOmmol/L NH4Ac, EDTA 5mmol/L, pH 6.4)用 lysine-S印harose 4B column 进一步纯化 Kringle2 多 肽。所得P和Kringle2多肽对IOOmM PBS透析。SDS-PAGE电泳检验蛋白纯度。如图1A， 经过酶切、限制性还原_氧化处理，SDS-PAGE电泳显示Ret印Iase被切成约30kDa和IOkDa 左右的两个多肽。经亲和层析纯化，kringle2多肽和P多肽被成功分离纯化。(图1B)
3.原核表达环饼结构2(Kringle2)PET-29a_K的构建，目的基因来自本所构建载体，上游引物5’端引物序列5’-gga attcca tat gtg cta tga ggg gaa tg_3'Τ"Sfi IiItlii^lJ 5'-ccg ctc gag gca gtc atg cac cat gc-3，.。PCR扩增出K的DNA片段，用Nde I和BamH I分别对K片段和ρ ET29a质粒 进行双酶切，经2%琼脂糖电泳后，回收得到目的基因片段(K，246bp)和载体片段(5kb).用 T4 DNA Ligase将目的基因片段与载体片段于16°C连接过夜.将连接产物(p ET29a-K)转 化DH5a感受态细胞，在含卡那霉素的LB平板上培养.挑取单菌落，用Nde I/ BamH I双 酶切鉴定筛选阳性克隆.抽提阳性克隆的质粒DNA，目的基因经测序确证.用正确基因序列 的ρ ET29a-K质粒转化BL21表达菌。(图2A)挑取表达菌单个菌落于LB培养基(卡那抗性)中，37°C振荡培养过夜。将培养 过夜的菌液按1 50接种于LB培养基，37°C培养至A600为0.8左右.加入IPTG(终浓 度0. 5mmol/L)诱导3h，离心(6000r/min, 15min)收集菌体。每克湿菌加入5mL裂解液 (20mmol/LTris-HCl,5mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl，6mol/L 盐酸胍，IOmmol/L β -巯基乙 醇及 lmmol/L PMSF, pH 7. 9)。超声破菌，离心(12000r/min，30min)，上清液过 Ni-NTA 亲 和柱。用15个床体积的洗涤缓冲液(25mmol/L Tris_HCl，10mmol/L咪唑，10mmol/L β0 巯基乙醇，8mol/L尿素，pH 7.9)洗去杂蛋白，再用10个床体积的洗脱缓冲液(25mmol/ L Tris-HCl，20mmol/L 或 50mmol/L 咪唑，10mmol/L β -巯基乙醇，8mol/L 尿素，pH 7.9) 洗脱目的蛋白。将20倍体积的复性液(25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA, lmmol/L GSSG, lmmol/L GSH，pH7. 9)逐滴滴入到样品蛋白溶液中，4°C静置过夜.然后对50mmol/L NaAc (pH 4.5)透析24h。透析后的样品上样到lysine-S印harose 4B column，高盐缓冲液 (50mmol/LNaAc, 500mmol/L NaCl, pH 4. 5)洗脱。SDS-PAGE 电泳。(图 2B)3.大鼠MCAO模型大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCA0)模型参照 Zea Longa等12，13于1989年报道的方法加以改进。SD (Sprague Dawley)大鼠，雄性，280 320g。颈外动脉分离完毕后，将直径0. 16mm钓鱼线从切口插入，将钓鱼线和血管轻轻用手 术线结扎，将颈外动脉于切口处剪断。打开颈总动脉及颈内动脉的动脉夹，将钓鱼线轻轻 送入颈总动脉，再回抽至颈内动脉分叉处，使颈外动脉与颈内动脉成一直线，顺势将钓鱼 线送入颈内动脉颅内段，至Willian’ s环再回抽1 2mm，钓鱼线插入深度由分叉部开始 18. 5士0. 5mm，并开始计时。扎紧颈外动脉处手术线，缝合皮肤，钓鱼线的末端留在皮肤外。 大鼠的直肠温度要保持在36. 5 37. 5°C之间。正常对照组不做任何处理，假手术组大鼠只 切开皮肤，分离暴露血管后消毒缝皮。缺血2小时后将留在皮肤外的钓鱼线从颈内动脉抽 出ο大鼠MCAO后24小时断头处死，取大鼠脑组织，除去嗅脑和小脑置_20°C冰箱冷 冻约lOmin，使用磨具作2mm冠状切片，共切成5 6片。脑切片放入2%红四氮唑(2，3， 5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)磷酸缓冲液中37°C闭光孵育15min，取出染色脑 片置于10%中性福尔马林中固定24小时13。用数码相机摄像，用Image Tool图像分析系 统进行图像分析，采用梯形公式法计算脑梗死体积。梗死体积V (mm3)=各梗死面积之和X间隔层厚度(2mm)4.环饼结构2(Kringle2)降低MCAO大鼠死亡率、脑梗死体积治疗大鼠缺血性脑卒中大鼠按体重随机分组，每组15只。大鼠被固定在脑立体定位仪上，在头顶部沿着 体中线剪开皮肤，暴露颅骨。用颅钻在颅骨打直径1. 5mm(位于距中缝1. 15mm, bregma后 0. 92mm)孔，但不要伤及硬脑膜。使用微量注射泵将药物注入侧脑室(深度4mm)，注射时间 为5分钟，5分钟后缓缓拉出注射器。接受MCAO手术的5组大鼠，分别在缺血-15分钟、15 分钟、90分钟、120分钟脑室注射5 μ 1 ret印Iase (1 μ g/ μ 1)，对照组脑室注射PBS07组MCAO大鼠，缺血后15分钟，分别脑室注射如下药物5 μ 1 PBS,3 μ 1 alteplase (1 μ g/μ 1)、5 μ 1 reteplase (1 μ g/μ 1)、5 μ 1 Kringle2 (OD280 = 0. 2), 5 μ 1 P (OD280 = 0 · 3)、5μ 1 Kringle2 (OD280 = 0 . 2) /EACA (0. 2mmol/L)、5μ 1 EACA (0. 2mmol/L)。鼠脑室注射给药，按照不同的注射时间，对大鼠脑缺血Ret印Iase表现出不同 的作用。缺血前15分钟、缺血后15分钟、90分钟、120分钟四个时间点分别脑室注射 Reteplase0缺血后15分钟给予reteplase具有缺血脑保护作用，明显降低大鼠的死亡率、 脑梗死体积，大鼠死亡率由PBS对照组30 %降至10 %，脑梗死体积由PBS对照340 士 34mm3， 降至150士33mm3(P < 0. 01)。但是这种缺血脑保护作用随大鼠缺血时间延长而消失。120 分钟给药轻度提高大鼠死亡率至40 %，大鼠脑梗死体积，与PBS对照组相比略有升高，至 345士50mm3 (P > 0. 05)。缺血前15分钟和缺血后90分钟给药，大鼠死亡率和梗死体积与 PBS对照组相比，没有显著差异(P>0.05)。实验结果表明，ret印Iase缺血脑保护作用具 有严格的时间限制，缺血时间大于90分钟，缺血脑保护作用消失，脑缺血前给药也没有缺 血脑保护作用。(图3，A，B)我们采用tPA的一系列缺失变体在脑缺血后立即注射到局灶性缺血大鼠的脑室 中，包括 alteplase、reteplase、kringle2 禾口 P 结构域。alteplase、reteplase、kringle2 都具有脑保护作用，可以显著降低大鼠的梗死体积(分别是225士47mm3，197士30mm3， 125士68mm3，P < 0.01)，和死亡率(分别是20%，10%，10% )。但P没有显著降低大鼠的 脑梗死体积(298士45mm3 P > 0. 05)，提高了局灶性脑缺血大鼠的死亡率至57%。实验结 果表明，tPA的缺血脑保护作用与kringle2结构域有关，脑室注射P结构域会增大脑损伤。 (图3，C-E)EACA。与Kringle2单独使用不同，联合使用Kringle2和EACA(赖氨酸类似化 合物)并没有显著降低大鼠脑梗死体积(286. 9士89mm3，P > 0. 05)及死亡率(29% )。单 独使用EACA对MCAO大鼠脑损伤没有明显影响。表明kringle2的缺血脑保护作用与其赖 氨酸结合活性有关。(图3，C-E)5.血脑屏障通透性血脑屏障完整性采用依文氏蓝染色荧光检测法测定14。在脑缺血后两个时间点测 定急性期血脑屏障开放，大鼠脑缺血后20分钟，尾静脉注射依文氏蓝(2%，溶于生理盐 水，4mL/kg)，3小时后取脑；亚急性期血脑屏障开放，大鼠脑缺血后21小时尾静脉注射依文 氏蓝，3小时后取脑。依文氏蓝注射后3小时，大鼠心室灌注含有50IU/mL肝素的0. 9%生 理盐水250mL，压力保持在IlOmmHg,同时剪开右心房。取脑称重，在50%三氯乙酸中勻浆， 13000Xg离心20分钟，取上层液体加入4倍体积乙醇。酶标仪测定荧光(激发光620nm， 发射光680nm)。制作标准曲线时，使用100到500ng/mL依文氏蓝，加入到脑勻浆液中制备
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OReteplase提高脑缺血以后急性期(脑缺血后3小时)BBB的通透性，但脑缺血亚急性期(脑缺血后24小时)，reteplase对BBB通透性的影响具有注射时间依赖性，15分 钟注射并不会提高BBB的通透性。脑缺血以后3小时，15分钟(23. 03士5. 02 μ g/g)、90分 钟、120分钟注射组，与PBS注射组(11. 94士 1.2 μ g/g)相比较都可以提高BBB的通透性(P < 0. 01)。但脑缺血亚急性期(24小时)大鼠BBB通透性，15分钟注射组(6. 73士 1. 32 μ g/ g)与PBS注射组相比没有明显改变(ρ > 0. 05) ；90分钟、120分钟(18. 96士 1. 5 μ g/g)注 射组ret印Iase大鼠BBB通透性依然保持高的水平(P < 0. 01)。缺血前注射Ret印Iase对 BBB开放没有明显的作用(3小时，12. 45士2. 09 μ g/g ；24小时，6. 73士 1. 32 μ g/g)。实验结 果表明，tPA通过对大脑BBB通透性的调节，有效的降低了脑缺血后24小时BBB的通透性， 对MCAO大鼠产生脑保护作用。(图4)6.环饼结构2 (Kringle2)降低内源tPA活性Casein-zymograph法测定内源tPA活性。根据Cheng 16等的方法并加以改进。大 鼠脑24h后取血脑勻浆，离心取上清，测定蛋白浓度。取25 μ g蛋白，8%非还原聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE，含2mg/mLCasein，5mg/mL蔗糖)电泳。电泳结束后，在室温下将凝胶置于复性缓 冲液(2. 5%Triton X-lOOv/v，50mmol/L Tris-Cl, 200mmol/L NaCl, 5mmol/L CaCl2,0. 02% NaN3,pH 8.0)中振荡洗脱4次，每次15分钟，洗去胶中的SDS，恢复酶的活性。将凝胶置于 孵育缓冲液(50mmol/L Tris-Cl, 200mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2,0. 02% NaN3,pH 8.0)中 37°C孵育16小时。孵育结束后经染色液(0. 5%考玛斯亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸) 染色1小时，脱色(甲醇浓度为40%、乙酸浓度为10% )至显示出位于蓝色背景上的透亮 带。阴性对照胶复性以后，置于含lOmmol/L EDTA孵育缓冲液中孵育16小时。凝胶经凝胶 成像仪扫描，使用分析软件测定酶分解条带的密度。如图5，K_L，外源ret印Iase注入大鼠脑室以后，能够调节内源tPA活性。相对于 假手术大鼠(sham)，脑缺血3小时内源tPA活性略有提高，12小时达高峰，24小时略有下 降。随着外源ret印Iase注入时间的改变，这种tPA活性改变的模式也随之改变。脑缺血 后90分钟和120分钟注射大鼠内源tPA活性，随时间的推移，逐渐提高。但是，缺血后15 分钟注射大鼠脑组织内源tPA活性，随时间的推移，逐渐下降。6.环饼结构2 (Kringle2)减少MCAO大鼠神经元细胞凋亡通过对H-E染色切片的分析，我们发现在脑缺血后24小时，PBS对照大鼠大脑皮 层缺血区，有大量凋亡的神经元细胞，细胞体皱缩，细胞核裂解，可见明显凋亡小体(图6， C，F，G)。而Kringle2注射组，仅有少量凋亡的神经元细胞(图6，B，E)。7环饼结构2 (Kringle2)降低对PC12氧和葡萄糖剥夺细胞的保护作用模型的制备参照Hillion17等提供的方法。六孔板每孔接种3X105PC12细胞悬液， 在完全培养基中(10%马血清，5% FBS的RPMI 1640)，5% C02，37°C培养24小时。0⑶诱 导前，培养箱用95% N2/5% CO2按照3L/分钟的速度，室温预处理30分钟。PC12细胞转入 OGD培养基(2 %马血清，1 % FBS，无糖型RPMI 1640)，放入培养箱，在95 % N25 % CO2, 37°C条 件下密闭培养箱，OGD诱导15小时。药品预先加在OGD培养基中。培养箱在OGD结束时的 氧浓度约为2% 3%。对照组PC12细胞，在OGD培养基中，37°C，5% CO2,有氧培养15小 时。PC12细胞缺氧的同时分别在培养基中加入7 μ g/mL alt印lase、4 μ g/mL ret印lase、l μ g/mLkringle2，检验这些蛋白对OGD处理PC12细胞的保护作用。
PC12 缺氧以后培养液中力口入 alt印lase、ret印lase、kringle2, Hoechst/PI 双染 法检测细胞凋亡，荧光显微镜观察，分析凋亡百分比。正常细胞由于对染料有抗拒性，荧光 染色很浅。Hoechst 33258相对分子质量小，呈现强蓝色荧光，主要用于检测早期细胞死亡； PI相对分子质量大，呈强的红色荧光，与细胞膜完全破坏的凋亡晚期和坏死细胞核DNA结 合。(图6，A-0)PBS对照组PC12细胞OGD以后，Hoechst和PI染色细胞占细胞总数的百 分比分别是9. 97士0.92%和8. 39士 1. 2%，受损细胞约占细胞总数的20%。在alt印lase、 ret印lase、kringle2作用下，PC12细胞OGD以后，PI染色细胞百分比显著(P < 0. 05)下 降至2%左右；Hoechst染色细胞百分比(P < 0. 05)下降至4 5%左右。实验结果表明， 不同tPA对OGD PC12具有很好的保护作用，细胞凋亡减少一半，坏死细胞下降4倍。(图 6，P)如图6Q，PC12 细胞，Kringle2、ret印lase 和 alt印Iase 处理以后，0GD16 小时，MTT 检测细胞存活的百分数。PC12的存活率分别为73. 3%、74.0%、74. 1%，显著(P < 0. 05) 高于PBS对照29. 0%的存活率。8.统计学处理各项指标均以平均值士标准差(means士SD)表示，应用SPSS 15. 0 for windows 统计软件包进行one-wayANOVA检验。显著性P < 0. 01。参考文献1. Kim YH,Park JH,Hong SH,Koh JY. Nonproteolytic neuroprotection by human recombinant tissueplasminogen activator. Science.1999 ；284 :647_650·2. Yi JS, Kim YH, Koh JY. Infarct reduction in rats following intraventricular administration of either tissueplasminogen activator(tpa)or its non-protease mutant s478a-tpa. Exp Neurol.2004 ； 189 354-360.3. Padmanabhan K, Wu TP, Ravichandran KG, Tulinsky A.Kringle-kringle interactions in multimer kringlestructures. Protein Sci. 1994 ；3 :898_910·4. Huang J,Kim LJ,Mealey R，Marsh HC,Jr.，Zhang Y,Tenner AJ,Connolly ES, Jr.，Pinsky DJ. Neuronalprotection in stroke by an slex-glycosylated complement inhibitory protein. Science. 1999 ；285 :595_599·5. Nassar Τ,Akkawi Se,Shina A,Haj-Yehia A,Bdeir K,Tarshis Μ,Heyman SN, Higazi AA-R. In vitro and invivo effects of tpa and pai-1 on blood vessel tone. Blood. 2004 ；103 :897_902.6.Ware JH,DiBenedetto AJ,Pittman RN. Localization of tissue plasminogen activator mrna in the developing ratcerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. J Neurobiol. 1995 ；28 9-22.7.Seeds NW, Basham ME, Haffke SP.Neuronal migration is retarded in mice lacking the tissue ρlasminogenactivator gene. PNAS. 1999 ；96 :14118_14123.8. Tsirka SE, Rogove AD, Strickland S. Neuronal cell death and tpa. Nature. 1996 ；384 :123-124.9.Indyk JA, Chen ZL, Tsirka SE, Strickland S.Laminin chain expression suggests that laminin-10 is a majorisoform in the mouse hippocampus and isdegraded by the tissue plasminogen activator/plasmin proteasecascade during excitotoxic injury. Neuroscience. 2003 ；116 :359_37L10. Chen ZL, Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalyzed degradation oflaminin. Cell. 1997 ；91 :917_925·11. Rogove AD, Siao CJ, Keyt B，Strickland S，Tsirka SE. Activation of microglia reveals a non-proteolyticcytokine function for tissue plasminogen activator in the central nervous system. Journal Of Cell Science. 1999 ；112 4007-4016.12. Longa EZ, Weinstein PR，Carlson S，Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion withoutcraniectomy in rats. Stroke. 1989 ；20 84-91.13.Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. Evaluation of2,3，5-triphenyltetrazoIium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke. 1986 ； 17 1304-1308.14.Belayev L，Busto R，Zhao W，Ginsberg MD. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeabilityfollowing middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 1996 ；739 :88_96·15. Aoki T，Sumii T，Mori Τ, Wang X，Lo EH. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9expression during reperfusion injury :Mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensiverats. Stroke. 2002 ； 33 :2711-2717.16. Cheng T，Petraglia AL, Li Z，Thiyagarajan M，Zhong Z，Wu Z，Liu D， Maggirwar SB， Deane R， Fernandez JA, LaRue B， Griffin JH, Chopp M， Zlokovic BV.Activated protein c inhibits tissue plasminogenactivator-induced brain hemorrhage. Nat Med. 2006 ；12 :1278.17. Hillion JA, Kenzo T, Dragan M, Christl R, Jeffery LB, John MH. Development of an ischemic tolerance modelin a pcl2 cell line. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 2005 ；25 :154_162.
图 l(A)Kringle2纯化流程图。(B)纯化Kringle2和P(Coomassie Brilliant Blue stain，15% reducing SDS-PAGE)。1，reteplase ；2，酶切 reteplase ；3，Kringle2 ；4P图2(A)Kringle2基因克隆。(B)原核表达纯化Kringle2。1，2原核表达； 3. 4Kringle2 纯化。图3环饼结构2(Kringle2)显著降低MCAO大鼠死亡率、脑梗死体积。(A，B)缺血 以后15分钟内注射ret印Iase显著降低大鼠的脑梗死体积和24小时死亡率(P < 0.01) (C，D，E)tPA、ret印lase、和Kringle2(n = 12)缺血以后15分钟内注射ret印Iase显著降 低大鼠的脑梗死体积和24小时死亡率(P < 0. 01)。EACA能够抑制Kringle2的脑保护作用。
图4Ret印Iase降低脑血脑屏障通透性。Ret印Iase提高脑缺血后3小时BBB通透 性，但有效的降低了脑缺血后24小时BBB的通透性，对MCAO大鼠产生脑保护作用。
图5环饼结构2(Kringle2)显著降低神经元凋亡。A，假手术大鼠大脑皮层(20X)； B，接受Kringle2治疗大鼠大脑皮层(20X) ；C, MCAO鼠大脑皮层(20X) ；D，假手术大鼠 大脑皮层(100X) ；E，接受Kringle2治疗大鼠大脑皮层(100X) ；F，假手术大鼠大脑皮层 (100X) ；G，凋亡神经元细胞Bar = IOOum图6环饼结构2(Kringle2)对氧和葡萄糖剥夺PC12细胞的保护作用(η = 3， 20Χ)。(A-Q)氧和葡萄糖剥夺PC12细胞荧光显微镜照片(Hoechst/PI双染)(A-C)PBS处 理对照，(D-F)kringle2处理细胞，(G-I)Ret印Iase处理细胞，(J-L)Alt印Iase处理细胞， (M-O)正常细胞，(P)PC12细胞凋亡百分比，(Q)MTT检测存活PC12细胞百分比。序列表<110>南京大学<120>组织型纤溶酶原激活物环饼结构_2多肽(kringle2)对脑卒中的治疗作用 及制备方法<160>7<210>1<211>246<212>DNA<213>artificial<220><223>组织型纤溶酶原激活物环饼结构2 (Kringle2)的氨基酸序列列<400>ctcaccgagt cgggtgcctc ctgcctcccg tggaattcca tgatcctgat aggcaaggtt 60tacacagcac agaaccccag tgcccaggca ctgggcctgg gcaaacataa ttactgccgg 120aatcctgatg gggatgccaa gccctggtgc cacgtgctga agaaccgcag gctgacgtgg 180gagtactgtg atgtgccctc ctgctccacc tgcggcctga gacagtacag ccagcctcag 240tttcgc<210>2<211>82<212>PRT<213>artificial<220><223>组织型纤溶酶原激活物环饼结构2 (Kringle2)的氨基酸序列<400>Cys Tyr Phe Gly Asp Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu151015Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met lie Leu16202530lie Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
31354045GlyLeu Gly Lys His Asn TyrCys Arg AsnPro Asp Gly Asp Ala46505560LysPro Trp Cys His Val LeuLys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu61657075 TyrCys Asp Val Pro Ser Cys7680
权利要求
环饼结构-2多肽(Kringle2)制备方法在于2mg/mL reteplase与2μg/mL人源plasminogen在digest buffer(100mmol/L PBS，0.7mol/LArg，pH8.0)中37℃酶切过夜。反应混合物在室温用β-巯基乙醇(5mmol/L)限制性还原2小时，然后用H2O2(0.1mmol/L)室温氧化1小时，破坏kringle2结构域与P结构域之间的二硫键。用lysine-Sepharose 4B column进一步纯化Kringle2多肽。所得Kringle2多肽对100mMPBS透析。SDS-PAGE电泳检验蛋白纯度。脑缺血后脑室注射kringle2用于脑缺血后脑保护。
2.根据1所述方法，其特征在于ret印lase作为原料，alt印laseplasminogen浓度比 为 1 200 1 5000。
3.根据1所述的方法，其特征在于反应混合物反应混合物在室温用巯基乙醇限制 性还原，浓度为1 20mmol/L，时间0. 5 24小时。然后用H202室温氧化，浓度为0. 01 lmmol/L,时间为0. 5 24小时。
4.根据1所述的方法，其特征为lysine-S印harose4B column纯化Kringle2。
5.PET-29a-K的构建，目的基因来自本所构建载体，上游引物5’端引物序列 5,_ggaatt cca tat gtg eta tga ggg gaa tg_3'下游引物序列 5'-ccg ctc gag gca gtc atg cac cat gc_3' . 0
6.根据5 所述的方法，其特征为 5，-gga att cca tat gtg eta tga ggg gaa tg_3， 下游弓I物序列 5，-ccg ctc gag gca gtc atg cac cat gc_3。
7.环饼结构_2活性检测用大鼠模型为大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCA0)模型参照Zea Longa等12，13于1989年报道的方法加以改进。SD (Sprague Dawley)大鼠，雄性，280 320g。颈外动脉分离完毕后，将直径0. 16mm钓鱼线从切口插入，将钓鱼线和血管轻轻用手 术线结扎，将颈外动脉于切口处剪断。打开颈总动脉及颈内动脉的动脉夹，将钓鱼线轻轻 送入颈总动脉，再回抽至颈内动脉分叉处，使颈外动脉与颈内动脉成一直线，顺势将钓鱼 线送入颈内动脉颅内段，至Willian’ s环再回抽1 2mm，钓鱼线插入深度由分叉部开始 18. 5士0. 5mm，并开始计时。扎紧颈外动脉处手术线，缝合皮肤，钓鱼线的末端留在皮肤外。 大鼠的直肠温度要保持在36. 5 37. 5°C之间。正常对照组不做任何处理，假手术组大鼠只 切开皮肤，分离暴露血管后消毒缝皮。缺血2小时后将留在皮肤外的钓鱼线从颈内动脉抽 出。脑梗死体积血使用TTC染色。脑屏障完整性采用依文氏蓝染色荧光检测法测定。内源 tPA 使用 casein-zymography 检测。
8.根据5所述的方法，其特征为SD(Sprague Dawley)大鼠，雄性，280 320g。环饼结 构_2引起脑梗死体积下降，BBB通透性下降，内源tPA活性下降。
9.环饼结构_2活性检测用大鼠模型为PC12氧和葡萄糖剥夺细胞模型的制备参照Hillion16等提供的方法。六孔板每孔接种 3X105PC12细胞悬液，在完全培养基中(10%马血清，5% FBS的RPMI 1640), 5% C02,37°C 培养24小时。0GD诱导前，培养箱用95% N2/5% C02按照3L/分钟的速度，室温预处理30 分钟。PC12细胞转入0⑶培养基(2%马血清，l%raS，无糖型HRPMI 1640H)，放入培养箱， 在95%N2 5% C02，37°C条件下密闭培养箱，0GD诱导15小时。药品预先加在0GD培养基 中。培养箱在0GD结束时的氧浓度约为2% 3%。对照组PC12细胞，在0GD培养基中，37°C,5% C02，有氧培养15小时。PC12细胞缺氧的同时分别在培养基中加入7ii g/mL alt印lase、4ii g/mL ret印lase、 1 U g/mLkringle2，检验这些蛋白对OGD处理PC12细胞的保护作用。Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡，荧光显微镜观察，分析凋亡百分比。
10.根据7所述的方法，其特征为使用PC12细胞，0GD诱导15小时。应用环饼结构-2 降低OGD PC12细胞凋亡。Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡，荧光显微镜观察，分析凋亡百 分比。
11.组织型纤溶酶原激活物环饼结构_2多肽(Kringle2)的医药用途，主要用脑卒中的 治疗，也可用于脑损伤以及神经退行性病的神经保护。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程技术领域，包括组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2多肽的制备及应用。本发明使用两种方法制备组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2。方法一，人源组织型纤溶酶原激活物变体瑞替普酶(reteplase)作为原料，使用纤溶酶原(plasminogen)切割瑞替普酶(reteplase)得到由二硫键连接的环饼结构-2(kringle-2)和碳端丝氨酸蛋白酶组成的多肽。使用β-巯基乙醇限制性还原断裂二硫键，H2O2限制性氧化。用lysine-Sepharose 4B亲和层析进一步纯化环饼结构-2多肽。SDS-PAGE电泳检验蛋白纯度。方法二，利用PCR技术获得环饼结构-2基因，将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中。重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，其产物以包涵体形式存在，通过体外复性，得到可溶性的环饼结构-2。在脑缺血后给予环饼结构-2，可降低脑卒中大鼠死亡率；减少脑梗死体积；降低内源tPA的表达；调节BBB开放模式，使得BBB在脑缺血后24小时BBB通透性降低，有效的防止了脑水肿发生；减少脑神经元凋亡。组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2多肽主要用于脑卒中的治疗，也可用于脑损伤以及神经退行性病的神经保护。
文档编号A61P9/10GK101886066SQ200910027920
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者刘建宁, 张海涛, 张菁 申请人:南京大学