专利名称：：用于治疗脂肪肝的中药主要成分组方的制作方法
技术领域：
：本发明属于中医药研究开发利用领域，特别涉及一种用于治疗脂肪肝的中药主要成分组方(主要成分为人参茎叶皂苷、三七总皂甙和天麻素)。
背景技术：
：脂肪肝是由一种或者多种原因引发的以肝脏脂类物质(一般是甘油三酯)蓄积为病理改变的肝脏疾病。随着我国人民生活饮食结构的变化以及医学影像检査技术的提高，脂肪肝在我国的诊断率逐年增加，根据是否饮酒将脂肪肝分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝可在较短期内发展为不可逆的肝损害，其肝纤维化的发生率约高达25%，且约1.5%-8.0%患者可进展为肝硬化。酒精性脂肪肝发生肝纤维化和肝硬化的进程比非酒精性脂肪肝更快，发生率更高。因此，早期积极治疗脂肪肝，对于阻止脂肪肝的进一步发展，甚至使其逆转有着十分重要的意义。由于引起脂肪肝的机制复杂而仍未完全阐释，临床上尚无满意治疗脂肪肝的药物，寻找有效的药物防治脂肪肝是当今医学面临的重要课题。脂肪肝的确切发病机理尚未明确，通常认为是肝细胞脂肪合成增加和氧化减少所致。近来有学者提出了"二次打击"的假说，初次打击诱发脂肪肝，脂肪肝发生后，须经脂质过氧化这一生化和结构破坏性反应的打击才能促进病变进展。有大量文献报道中药复方可以防治脂肪肝，但是组方药物较多，一般至少为510味中药，多的高达数10味中药，且多为自买和自煎为主，品质难以保证。发明人先前经研究得出的中药复方(自定义代号为GST)，由人参、三七、天麻3味中药组成，经研究证明具有明显防治脂肪肝的作用。
发明内容为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于治疗脂肪肝的中药主要成分组方。本发明的目的通过下述技术方案实现一种用于治疗脂肪肝的中药主要成分组方，是由以下重量配比的有效组分组成人参茎叶皂苷0.0150g、三七总皂甙0.0150g、天麻素0.0150g。3上述组方的优选配比为人参茎叶皂苷0.385g、三七总皂甙0.385g、天麻素0.385g。上述组方可采用常规加工方法，制成注射剂、口服液、胶囊剂或片剂。本发明采用培外培养肝细胞脂肪变性模型，观察中药主要成分组方对乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用和肝细胞甘油三酯(TG)含量的影响，采用正交实验，筛选出中药主要成分组方，并确定了体外培养的最佳用药剂量人参茎叶皂苷、三七总皂甙、天麻素3种成分浓度均为50mg/L，而小鼠灌胃的有效剂量人参茎叶皂苷、三七总皂甙、天麻素3种成分均为50mg/kg体重/d，换算成人(体重70kg)的最佳有效剂量人参茎叶皂苷、三七总皂甙、天麻素3种成分均为0.385g/d。同时观察中药主要成分组方对肝细胞活性氧(用流式细胞仪检测)、细胞线粒体膜电位(用流式细胞仪检测)、细胞ATP含量(反相高效液相色谱分析法测定)、肝细胞脂肪变性的影响。并以小鼠高脂血症性脂肪肝为模型，研究中药主要成分组方对脂肪肝的治疗作用。本发明相对现有技术具有如下的优点及有益效果(1)本发明是对中药GST复方的进一步研究，筛选出一种用于治疗脂肪肝的中药主要成分组方，经体内和体外研究证明，本发明中药主要成分组方具有明显治疗脂肪肝和改善培养肝细胞脂肪变性作用，寻找中西医两个不同医学理论体系相融的切入点，对脂肪肝的防治具有重要的临床应用价值，研究成果可以开发治疗脂肪肝的现代中药有效成分产品，为研制拥有自主知识产权的治疗脂肪肝的现代中成药奠定了良好的基础；(2)本发明组方成分较少、易于分离提取、疗效肯定，具有良好的市场前景，并且对于推动中药现代化有一定现实意义。图1是建立体外肝细胞株脂肪变性模型时对照组的小鼠肝细胞油细胞O染色图(X200)。图2是建立体外肝细胞株脂肪变性模型时肝细胞株脂肪变性模型组的小鼠肝细胞油细胞O染色图(X200)。图3是中药主要成分组方对肝细胞株脂肪变性的影响试验中对照组的小鼠肝细胞油细胞O染色图(X400)。图4是中药主要成分组方对肝细胞株脂肪变性的影响试验中肝细胞株脂肪变性模型组的小鼠肝细胞油细胞O染色图(X400)。图5是中药主要成分组方对肝细胞株脂肪变性的影响试验中本发明中药主要成分组方组的小鼠肝细胞油细胞O染色图(X400)。图6是本发明中药主要成分组方治疗脂肪肝试验中对照组的小鼠肝组织病理切片图(苏木素伊红染色，X400)。图7是本发明中药主要成分组方治疗脂肪肝试验中高脂组的小鼠肝组织病理切片图(苏木素伊红染色，X400)。图8是本发明中药主要成分组方治疗脂肪肝试验中正常饮食组的小鼠肝组织病理切片图(苏木素伊红染色，X400)。图9是本发明中药主要成分组方治疗脂肪肝试验中给药组的小鼠肝组织病理切片图(苏木素伊红染色，X400)。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1建立体外肝细胞株(L02)脂肪变性模型，观察本中药主要成分(参茎叶皂苷、三七总皂甙、天麻素是纯化的中药主要成分标准品，购自中国药品生物制品检定所)组方对乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用和肝细胞甘油三酯(TG)含量，采用正交实验，筛选出中药主要成分组方，确定最佳用药剂量；并探讨其对肝细胞株脂肪变性的作用机制研究。1、建立体外肝细胞株(L02)脂肪变性模型乙醇作用浓度的确定取对数生长期的L02细胞，调整细胞浓度为5X104cells/mL，取200uL细胞悬液加入96孔培养板中，细胞培养48h待细胞贴壁后，分别加入含不同体积浓度的乙醇(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%)，同时设对照组(用体积浓度为10%的小牛血清培养)，继续培养36h，用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性。结合细胞形态观察，选择对细胞有一定损伤、又不会导致细胞裂解死亡的浓度作为乙醇作用于肝细胞的浓度。表1不同浓度乙醇对L02细胞活性的影响("=6)乙醇浓度(％)吸光度值(A)细胞存活率(％)(HControl)1.27±0.111000.41.24±0.1297.630.61.23±0.1396.850.81.23±0.1296.85%1.01.21±0.1495.232.01.16±0.1591.343.00.58±0.13**45.67尸<0.01vscontrolgroup.表1显示，对照组细胞活性为100%，体积浓度为3.0%的乙醇对细胞损伤较大，细胞活性降低至45.67%，显微镜下观察发现细胞大量浮起，故不适宜作为诱导肝细胞脂肪变性的浓度；体积浓度为0.4%1.0%的乙醇对细胞活性影响较小，细胞活性在97.63%-95.23%之间，没有发现明显的细胞损伤；体积浓度为2.0。/。的乙醇对肝细胞有一定的损伤，但细胞活性减少不明显，细胞活性为91.34%;因此，接下来的实验选用2.0%乙醇作为诱导浓度。L02细胞TG含量变化将培养48h后的L02细胞加体积浓度为2.0。/。的乙醇及体积浓度为50。/。的小牛血清培养36h(模型组)；并设对照组体积浓度为10%小牛血清培养细胞。收集6孔板中的细胞，力叫.5mL的异丙醇，在冰水中制成10%的匀浆，4°C抽提24h，3000r/min离心10min，提取上清液，全自动生化分析仪测定甘油三酯(TG)含量。用Lowry氏法测定蛋白含量，以mg/gprotein表示。结果如表2所示，可以看出，模型组细胞TG含量明显高于对照组(尸<0.01)。表2L02细胞TG含it变化组别n甘油三酉旨(mg/gprotein)对照组60.50±0.07模型组61.07±0.06"**P<0.01vscontrolgroup油红O染色光学显微镜观察对照组细胞边缘清晰，核大，细胞内几乎都未着色，细胞内少见染色脂滴(如图l所示)；模型组细胞内有大小不等的橘红色脂滴聚集,且大部分细胞内含多个脂滴,分布不均匀(如图2所示)，表明成功建立了体外肝细胞株脂肪变性模型。2、中药主要成分对乙醇诱导L02细胞损伤的影响由前面的表1可知实验中体积浓度为3%的乙醇对细胞损伤影响较大，细胞活性明显降低；因此在培养的L02细胞中加入体积浓度为3%的乙醇，同时加入不同浓度的中药主要成分，观察其对乙醇诱导L02细胞损伤的影响。加人参茎叶皂苷，细胞活性明显增强的2个剂量组是50mg/L和25mg/L;加入三七总皂苷细胞活性最强的2个剂量组是50mg/L和25mg/L;加入天麻素，细胞活性最强的2个剂量组是25mg/L和50mg/L。因此，确定中药主要成分2个浓度作为正交分析的2个水平，人参茎叶皂苷为50mg/L、25mg/L;三七总皂苷为50mg/L、25mg/L;天麻素为25mg/L和50mg/L，如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>②L02细胞TG含量正交实验的方差分析表5L02细胞TG含量正交实验的方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果显示，L02细胞实验数据组间差异有显著意义(尸〈O.OD，而次间差异无显著意义(尸〉0.05)，说明说明实验结果的变异来源于组间，而不是来源于次间。表明实验安排稳定，正交实验有效，组间差异值得作细致的析因分析，见表5。3、L02细胞TG含量正交实验的析因分析表6L02细胞TG含量正交系数分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表6和表7可以看出，在正交实验析因分析中，a药是主药，因均方最大，D值为正，是最重要的因素，且剂量较大时疗效更好；b药和c药单独分析时对疗效影响不大，但与a、b及c药联用则有明显的交互作用(尸<0.01)，均方最大，整个合剂疗效更好，且以大剂量疗效最佳。虽然a和b，c和a也存在交互作用，但疗效都不如a、b及c药联用。所以，通过肝组织TG含量正交设计实验得到有效组方为a、b、c3种中药主要成分，a、b、c最佳浓度均为50mg/L。4、中药主要成分组方对肝细胞株脂肪变性的影响油红0染色光学显微镜观察可见对照组细胞边缘清晰，核大，细胞核呈蓝色，细胞内少见染色脂滴(如图3所示)；模型组细胞内有大小不等的橘红色脂滴聚集,且大部分细胞内含多个脂滴，分布不均匀(如图4所示)；中药主要成分组方治疗组细胞内的橘红色脂滴明显减少，大多细胞内只存在少数几个脂滴(如图5)，结果说明中药主要成分组方能明显改善肝细胞脂肪变性。5、中药主要成分组方对肝细胞株脂肪变性的作用机制研究①细胞活性氧(ROS)水平变化DCFH-DA染色流式细胞术表8中药主要成分组方对L02细胞活性氧产生的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表8可见，模型组平均荧光强度(MFI)显著高于对照组(尸〈0.01);阴性对照组MFI与对照组比较无显著差异(P>0.05);中药主要成分组方治疗组MFI明显低于模型组(尸<0.01)，提示中药主要成分组方可明显抑制细胞内R0S的产生。②细胞线粒体膜电位的变化DiOC6(3)染色流式细胞术采用DIOC6(3)染色流式细胞术测细胞线粒体内染料的吸收量及其荧光强度，可反映线粒体膜电位变化，平均荧光强度(MFI)越高，线粒体膜电位越高。模型组MFI明显低于对照组平(尸<0.01),表明脂肪变性肝细胞线粒体膜电位显著降低；阴性对照组MFI与对照组比较无显著差异(尸〉0.05);中药主要成分组方组MF明显高于模型组(尸<0.01)，提示中药主要成分组方可抑制脂肪变性肝细胞线粒体膜电位的降低，改善线粒体功能(如表9所示)。表9中药主要成分组方对L02细胞线粒体膜电位的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>③细胞ATP含量变化(采用反相高效液相色谱分析法测定)模型组细胞ATP含量明显低于对照组，两组比较差异有显著意义(尸〈0.01);阴性对照组细胞ATP含量与对照组比较无显著差异(尸〉0.05);中药GST主要成分组方组细胞ATP含量明显高于模型组(尸〈0.01)，提示中药主要成分组方可抑制脂肪变性肝细胞ATP的降低，增加细胞能量合成(表10)。表10中药主要成分组方对L02细胞ATP含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>综上所述，结果表明本发明中药主要成分组方具有减少肝细胞TG产生、拮抗乙醇诱导的肝细胞损伤及有效改善肝细胞脂肪变性的作用。其作用机制与抑制肝细胞活性氧生成，抗脂质过氧化反应，改善线粒体功能，增加能量合成有关。实施例2以小鼠高脂血症性脂肪肝为模型，验证中药主要成分组方对脂肪肝的治疗作用实验动物健康昆明种小鼠，清洁级(SPF级)，雄性，分笼饲养，每天自由饮食、饮水，在实验环境(清洁无尘，空气新鲜，温度在1822'C，相对湿度5060%，噪音85分贝以下)中适应6d。随后给小鼠饲高脂饲料，每次称词料重量，保证每只小鼠平均摄食量一致，对照组饲基础饲料(基础词料由广东省实验动物中心加工制作，包括6.4%的粗灰分、4.9%的粗脂肪、4.6%的粗纤维、19.1%的粗蛋白、8.3%的水分、1.17%的钙、0.63%的磷，以上组分均以重量百分比计)，12周后小鼠随机分为4组l组对照组2组高脂组3组正常饮食组4组中药主要成分组方给药组高脂组继续饲高脂饲料，其余各组词以基础词料(基础饲料由广东省实验动物中心加工制作，包括6.4%的粗灰分、4.9%的粗脂肪、4.6%的粗纤维、19.1%的粗蛋白、8.3%的水分、1.17。/。的ef5、0.63%的磷，以上组分均以重量百分比计)。中药主要成分组方组小鼠每天灌胃人参茎叶皂苷、三七总皂苷、天麻素(3种成分均为50mg/kg体重/d)的中药溶液，0.1mL/10g，对照组、正常饮食治疗组和高脂组灌胃相同体积的双蒸水，连续给药14d。实验结束后，测定血清总胆固醇(TC)、TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及肝组织TC、TG、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，并观察肝指数(liverindex)和肝组织病理变化。结果分析1、中药主要成分组方对高脂饮食小鼠血脂含量的影响ii表ll中药主要成分组方对高脂饮食小鼠血脂的影响组别只数血清总胆固醇甘油三酯高密劇旨蛋白低密劍旨蛋白胆固醇胆固醇高密劍旨(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)蛋白胆固醇对照组122.37±0.271.37±0.281,88±0.220.48±0.171.26±0.10高脂组124.73±0.67"1.39±0.492.82±0.53*1.44±0.261.72±0.39**正常饮食组133.42±0.55*'AA1.36±0.332.03土0.39'"0.50±0.75AA1.73±0.18'*中药主要成分组方组133.30±0.57"AA0.84±0.29*'"1.86±0.27'\A0.46±0.08AA1.80±0.41"'尸O.05,"PO.01vs对照组；a尸0.05,AAP<0.01ra高脂组；#尸<0.05^正常饮食组.表11显示高脂组血清TG含量与对照组比较无显著差异；其余各项指标均高于对照组；正常饮食组血清TC含量及TC/HDL-C显著高于对照组组，HDL-C、LDL-C恢复至对照组水平；中药主要成分组方可降低血清TG含量(户<0.05)，而其余各项指标与正常饮食组无显著性差异。2、中药主要成分组方对脂肪肝小鼠肝指数和肝脂的影响表12中药主要成分组方对高脂饮食小鼠肝指数、肝组织TC和TG水平的影响组别n肝指数(％)血清总胆固醇(mmol/L)甘油三酉歐mmol/L)对照组123.78±0.271.40±0.371.65±0.57高脂组125.47±0.43**5.85±0.43"6.63±0.86"正常饮食组134.58±0.45"AA3.87±0.80"AA5.14±0.96*'AA中药主要成分组方组134.08±0.30AA#3.94±0.69"AA3.48±0.66"AA##'户O.01ra对照组；aa尸O.01vs高脂组；**尸<0.01ra正常饮食组从表12可见，高脂组肝指数、肝组织TC和TG含量明显高于对照组；正常饮食组肝指数、肝组织TC和TG含量也高于对照组，但低于高脂组；中药主要成分组方组与正常饮食组比较，其肝指数、肝组织TG含量显著降低(均PO.Ol)，但TC含量无显著差异。提示正常饮食组小鼠恢复基础饲料喂养后，可降低肝指数、肝组织TC和TG含量，但效果不理想。中药主要成分组方可明显降低肝指数、肝组织TG含量。3、中药主要成分组方对脂肪肝小鼠肝组织SOD和MDA水平的影响表13中药主要成分组方对高脂饮食小鼠肝组织SOD和MDA水平的影响Groupn超氧化物歧化酶(U/mgprot)丙二醛(nmol/mgprot)对照组12高脂组12正常饮食组13中药主要成分组方组13'><0.01w对照组；AP<0.05，AA尸O.Ol高脂组；##尸<0.01正常饮食组.如表13所示，高脂组肝组织MDA含量明显高于对照组，而SOD活性显著低于对照组；正常饮食组肝组织MDA含量高于对照组，但低于高脂组，SOD活性低于对照组，却较高脂组明显升高；中药主要成分组方组与正常饮食组比较，其MDA含量显著下降，SOD活性明显上升(均尸O.Ol)。提示中药主要成分组方可明显抑制脂质过氧化反应。4、小鼠肝组织病理变化对照组肝脏无异常变化，肝小叶清晰可见。高脂组出现大泡性的肝细胞脂肪变性，变性的肝细胞累及几乎所有肝小叶,并有炎症细胞渗出；正常饮食组肝细胞出现弥漫性脂变，与高脂组比较肝细胞脂肪变性程度减轻；中药主要成分组方组肝细胞排列较整齐，脂滴减少，脂肪变性明显改善(图6-9)。病理分级显示对照组轻度脂肪肝小鼠占O.17，其余均正常；髙脂组重度脂肪肝小鼠占0.83，中度占0.17;正常饮食组重度脂肪肝小鼠占0.08，中度占0.69，轻度占0.23;中药主要成分组方组中度脂肪肝小鼠占0.23，轻度占0.54，正常占0.23(如表14所示)。表14脂肪肝分级分组正常轻度中度重度对照组10200高脂组00210正常饮食组0391中药主要成分组方组3"730本实验结果证实正常饮食组小鼠恢复基础饲料喂养后，对小鼠脂肪肝有一定的改善作用，但效果不理想。中药主要成分组方可显著降低肝指数、血清TG和肝组织TG含量，同时抑制脂质过氧化反应，明显改善肝细胞脂肪变性，具有有效的治疗脂肪肝的作用。286.70±26.021.25±0.09157.34±20.78**5.15±0.64"187.45±15.1(TA4.49±0.33"z229.14±21.87WAA"2.65±0.24'上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种用于治疗脂肪肝的中药单体组方，其特征在于它是由以下重量配比的有效组分组成人参茎叶皂苷0.01～50g、三七总皂甙0.01～50g、天麻素0.01～50g。2、根据权利要求l所述的一种用于治疗脂肪肝的中药单体组方，其特征在于它是由以下重量配比的组分组成人参茎叶皂苷0.385g、三七总皂甙0.385g、天麻素0.385g。3、根据权利要求l所述的一种用于治疗脂肪肝的中药单体组方，其特征在于所述中药单体组方制成注射剂、口服液、胶囊剂或片剂。全文摘要本发明公开了一种用于治疗脂肪肝的中药主要成分组方。它是由以下重量配比的有效组分组成人参茎叶皂苷0.01～50g、三七总皂甙0.01～50g、天麻素0.01～50g。可采用常规加工方法，制成注射剂、口服液、胶囊或片剂。本发明中药主要成分组方具有明显治疗高脂血症性脂肪肝和改善培养肝细胞脂肪变性作用，寻找中西医两个不同医学理论体系相融的切入点，对脂肪肝的防治具有重要的临床应用价值，研究成果可以开发治疗脂肪肝的现代中药有效成分产品，为研制拥有自主知识产权的治疗脂肪肝的现代中成药奠定了良好的基础；本发明组方成分较少、易于分离提取、疗效肯定，具有良好的市场前景，并且对于推动中药现代化有一定现实意义。文档编号A61K36/258GK101524386SQ20091003873公开日2009年9月9日申请日期2009年4月17日优先权日2009年4月17日发明者戚仁斌,胡巢凤,陆大祥申请人:暨南大学