专利名称：病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA设计模板的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒核酸序列高度保守区片段作为SiRNA设计模板的应用，尤其 是指肠病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA药物设计模板的应用，所述siRNA是治疗 新生血管异常增生相关疾病的药物中的活性成分。
背景技术：
siRNA (small interfering RNA 小片段干扰核糖核酸)是带有特定基因密码的 短小核酸碱基片断，一般功能长度为21-23bp。其作用原理是与特定靶基因mRNA结合，使 之降解而失去功能。这种双链RNA分子介导的高效转录的基因沉默现象称之为RNAi (RNA interference 核糖核酸干扰)，是自然存在于细胞中的防御能力双链RNA进入细胞内被 切割成21-25个核酸碱基片断的siRNA，先与细胞内的其他成分结合成一个核酸复合体，从 而形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)；激活的RISC通过 碱基配对定位到同源mRNA上并切割而导致mRNA降解，从而清除细胞内特定的基因表达。 siRNA不仅广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、血管神经系 统疾病等具有广阔的前景。年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是 50 岁以上的 人视力不可逆性损害的主要原因之一。AMD在临床上分为干性和湿性两型，湿性发展快，是 引起失明的主要原因。该病引起严重视觉损害的病理变化表现为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells, RPE)功能受损，黄斑部可见异常的脉络膜新生血管(choroid neovascularization, CNV)伴有大量渗出，造成RPE或神经上皮的脱离，血管破裂造成出血 性脱离，以后出血和渗出逐渐吸收形成机化疤痕，细胞外基质积聚导致Bruch膜增厚，形成 脂褐素和玻璃膜疣。此外，氧化应激、炎症反应和免疫反应进一步加重了 Bruch膜的病变。 已发现包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管 内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor rec印tor, VEGFR)、缺氧 诱导因子(hypoxiainduced factor, HIF)和血管生成素(angiopoietin，Ang)等多种细胞 因子，以及MAPK(mitogen-activated protein kinases，丝裂原活化蛋白激酶)和Ca2+等 信号转导通路在CNV的生成过程中发挥着重要的调控作用。在RNAi眼药的开发应用方面，Cashman等的研究表明(Cashman SM. et al. Invest Ophthalmol Vis Sci，2006 ；47 (8) 3496-3504)，将腺病毒载体表达的 VEGF 短发夹 RNA (short hairpin RNA, shRNA)对VEGF165诱导CNV的小鼠进行玻璃体腔注射，可以有效 地沉默高水平的VEGF，从而阻止CNV的形成。显然是通过腺病毒载体将shRNA跨膜(细胞 膜)传输到胞浆，激活RISC引起碱基配对的同源mRNA降解，从而抑制细胞内特定的VEGF基 因表达而发挥作用的。由于腺病毒载体在临床应用上的顾虑，人们发现裸露(无传输中介) 的VEGF siRNA同样可以有效地沉默高水平的VEGF，从而阻止CNV的形成(Reich，S. J. et al.Mol. Vis. 9，210-216，2003)，因而成为目前RNAi眼药的开发应用主流。问题是无法解 释这些裸露的siRNA是如何进入细胞内而通过RISC旁路使目的mRNA降解而抑制CNV的。最新的研究报道认为siRNA是通过细胞膜存在的Toll样受体3 (Toll-like receptor3, TLR3)来抑制 CNV (Mark Ε. Kleinman，Nature ；2008 April 3 ；452 (7187) :591_597)，认为 激活Toll样受体3的siRNA抑制CNV为“序列非依赖性”的。虽然裸露(无传输中介)的 VEGF siRNA作用机制得以阐明，由此提出两个关键问题1)RNA病毒进化中的保守序列是 否为激活TLR3的最佳外源性配体？ 2)由此设计的siRNA是否具有高度靶向性而非不依赖 序列？
Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类进化中序列高度保守的天然免 疫受体大家族，至少包括10个成员。TLRs能特异地识别病原相关的分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，不仅在激活天然免疫中发挥重要的作用，而且 还调节获得性免疫，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。TLR3是TLRs中的重要成员之 一，能够识别病毒双链RNA。但天然免疫细胞所识别的主要靶分子称之为病原相关的分子模 式(PAMPs)是众多微生物共有的一种保守的模式分子，广泛存在于病原体细胞表面。为了开发可以激活TLR3从而抗CNV的靶向性siRNA新型眼药，我们首次以肠病毒 (一群DNA病毒，大小仅20-30nm。以血清分类，目前可分出67种)的保守序列为靶序列设 计模型，依照其进化中高度保守区序列(5’端非编码区5’ UTR)设计靶siRNA，并以编码区 (开发阅读框Open Reading Frame, 0RF)高度变异序列为模板设计的siRNAs和以3’端非 编码区(3’UTR)非高度保守区为模板设计的siRNAs为对照，分别直接以眼内注射的方式注 入到AMD小鼠模型中进行研究。令发明人吃惊的是，发现以5’ UTR高度保守区为模板设计 得到的siRNA序列对CNV的抑制作用明显高于以ORF高度变异区序列和3’UTR非高度保守 区为模板设计的siRNAs。同时，前者组织中的TLR3和IL12的mRNA含量较后两者明显增 高，而VEGF mRNA的含量较后两者明显降低。本发明人的研究表明，利用病毒核酸序列高度保守区片段的序列为模板可设计出 特定结构的siRNA，可作为激活TLR3高效外源性配体的药靶，在治疗AMD和其它与新生血管 异常增生有关的疾病(如糖尿病眼损害，癌症等)方面具有潜在的广泛用途。
发明内容
因此，本发明的一个目的在于提供一种病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA 序列设计模板的应用，所述siRNA用作药物的活性成分。在一个优选的实施方式中，上述药物是治疗新生血管异常增生相关疾病的siRNA 药物，其中siRNA序列是作为Toll样受体3的高效配体的双链siRNA序列。本发明的另一个目的在于提供上述的双链SiRNA分子，其具有如下序列结构正义链(sensestrand) :5，-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3，反义链(antisensestrand) :5，-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3，；其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤 A胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ;n是0 2的整数。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为正义链5，-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUA-3，(SEQID NO 2)反义链5，-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUA-3，(SEQID NO :3)。
在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本发明的再一个目的在于提供上述SiRNA分子在制备治疗新生血管异常增生相关疾病的药物中的应用。在一个优选的实施方式中，所述新生血管异常增生相关疾病包括年龄相关性黄斑 变性、糖尿病眼损害和癌症等。研究表明，以病毒核酸序列高度保守区片段作为模板可设计出具有药用价值的 siRNA序列，本发明设计得到的siRNA分子可充当细胞膜的Toll样受体3的高效外源性配 体，抑制新生血管异常增生。
图1是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大40 倍)=Phalloidin阳性的视网膜色素上皮细胞呈均勻一致的六边形排列紧密(图la)，不显 示IB4标记的内皮细胞(图lb)，DAPI标记物在三通道叠加图像中可以鉴别出视网膜色素 上皮细胞核(图Ic)。图2a为激光光凝作用建立C57BL/6J小鼠的脉络膜CNV模型的小鼠眼球剖面图， 图右方下箭头指示光凝斑在视乳头旁；图2b为氪激光光凝后5min后眼底照片，箭头指示光 凝斑白色，下方为视盘区，视网膜上光斑立即呈白垩样改变，视网膜急性水肿(如图中箭头 所示)；图2c是显微镜下下观察到的小鼠眼球脉络膜铺片显微照片(放大100倍)，箭头指 示光凝斑在视乳头旁。图3是用共焦激光视网膜断层扫描仪记录的显微照片FFA检查所见C57BL/6J小 鼠氪激光光凝后血管改变。光凝后7天，光凝斑处可见盘状荧光素渗漏(图3a)；光凝后 14d，光凝斑可见明显荧光渗漏(图3b)(图中箭头所指为光凝部位)。光凝后28d，光凝斑 无明显荧光渗漏，出现瘢痕化(图3c)。图4是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)C57BL/6J小鼠氪激光光凝后5min、4d和7d的脉络膜铺片，免疫荧光抗体染色，荧 光显微镜观察成像。光凝后5min，在光凝部位可检测到一个环形荧光缺损区，标志脉络 膜-Bruch膜-视网膜色素上皮复合体已经破坏(图4d-f)；光凝后4d，出现一些细胞碎片 以及核碎片，Bruch膜破损处可见自发荧光环(图4g-i)。到第7d时，在激光损伤区可以看 到界限清楚的CNV网，视网膜色素上皮细胞覆盖CNV复合体所在区域(图4j-l)，一直可以 持续到4w并伴有该区视网膜色素上皮细胞的修复。图5是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)单纯光凝7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI(蓝色)、Is0lectin-B4(红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图6是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)5%葡萄糖溶液7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0lectin-B4(红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图7是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大 100倍):Avastin(阿瓦斯汀)药物处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、 IS0leCtin-B4(红色)及Phalloidin (绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图8是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)SiEv70_l处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0lectin-B4 (红色)及 Phalloidin (绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图9是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)siEv70_2处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0lectin-B4 (红色)及 Phalloidin (绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图10是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)s iEv70_3处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0lectin-B4 (红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图11是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)siEv70_4处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0lectin-B4 (红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图12是在荧光显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光抗体染色显微照片(放大100 倍)siEv70_5处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0lectin-B4 (红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光显微镜观察成像。图13是用ImageJ图像分析软件处理计算免疫荧光染色中的血管平均数柱形图。 横坐标横坐标表示各处理实验组。纵坐标表示血管平均数。图14是不同处理组VEGF mRNA表达量柱形图实时定量PCR检测VEGF mRNA表 达，横坐标表示各处理实验组，纵坐标分别表示VEGF mRNA表达量。图15是不同处理组TLR3mRNA表达量柱形图实时定量PCR检测TLR3mRNA表达， 横坐标表示各处理实验组，纵坐标分别表示TLR3的mRNA表达量。图16是不同处理组IL12a mRNA表达量柱形图实时定量PCR检测IL12a mRNA表 达，横坐标表示各处理实验组，纵坐标分别表示IL12a的mRNA表达量。
具体实施例方式为方便起见，在下文中将本发明中提及的术语“病毒核酸序列高度保守区片段”简 称为“病毒高度保守区序列”、或“高度保守区序列”、或“高度保守区片段”。应当理解，它们 表示的意思和范围相同。本文中，术语“模板”、“模型”或“模板序列”可以互换，它们表示的意思和范围相同。本文中，术语“siRNA”、"siRNA序列，，或“siRNA分子”可以互换，它们表示的意思
和范围相同。本发明中提到的病毒泛指一切RNA或DNA病毒。其中DNA病毒在转录/复制的过 程中会有RNA中间体产生。比如，作为模板序列来源的病毒可以是肠病毒。对于本发明的高度保守区序列，无论其位于非编码区还是开放阅读框，都可以作 为药用siRNA序列的设计模板。其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。
比如，针对治疗与新生血管异常增生有关的疾病进行药物设计时，以高度保守区 序列或其片段为模板所设计出的siRNA只要能被模式识别受体_即细胞膜的Toll样受体 3识别，即能充当该受体的高效外源性配体，激活TLR3的信号通路(signaling pathway)， 抑制新生血管异常增生。因而这样设计出的siRNA序列在治疗与新生血管异常增生有关的 疾病如年龄相关性黄斑变性、糖尿病眼损害、癌症等疾病等方面有广泛的用途。本发明的靶向性TLR3高效配体siRNA的模板序列是我们首次于肠病毒(一群小 DNA病毒，目前可分出67种)中发现的，其位于5’端非编码区(高度保守区)，序列(SEQ IDNO 1)如下1 ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 61 accccggtac ccttgtacgc ctgttttata ctccctttcc caagtaactt tagaagaaat121 aaactaatgt tcaacaggag ggggtacaaa ccagtaccac cacgaacaca cacttctgtt181 tccccggtga agttgcatag actgtaccca cggttgaaag cgatgaatcc gttacccgct241 taRRtacttc RaRaaRccta Rtatcatctt ggaatcttcg atgcgttgcg atcagcactc301 taccccgagt gtagcttggg tcgatgagtc tggacacccc acaccggcga cggtggtcca361 ggctgcgttg gcggcctacc catggctagc accatgggac gctagttgtg aacaaggtgc421 gaagagccta ttgagctacc tgagagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcccaacca481 cggagcaaat gctcacaatc cagtgagtgg tttgtcgtaa tgcgcaagtc tgtggcggaa541 ccgactactt tgggcgtccg tgtttccttt tatttttatt atggctgctt atggtgacaa601 tctgagattg ttatcatata gctattggat tagccatccg gtgaSEQ ID NO 1其中基于任何一条小于30bp的DNA所设计出的双链siRNA可充当细胞膜的Toll 样受体3的外源性配体，靶向性的激活TLR3的信号通路，从而抑制新生血管异常增生。以序列SEQ ID NO 1中的第241 263位核酸序列为模板，可以设计出一种双链 siRNA分子，其具有如下序列结构正义链(sensestrand) :5，-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3，反义链(antisensestrand) :5，-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3，； 其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤 A胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ;n是0 2的整数。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为正义链5，-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUA-3，(SEQID NO 2)反义链5，-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUA-3，(SEQID NO :3)。在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。当然，以序列SEQ ID NO 1中的第241 263位核酸序列为模板，还可以设计出其 它序列结构的双链siRNA分子。只要其能作为Toll样受体3的高效外源性配体，激活TLR3 的信号通路，抑制新生血管异常增生，就可以用于治疗与新生血管异常增生有关的疾病。本发明所述的与新生血管异常增生有关的疾病包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病 眼损害和癌症等。因此，包含上述SiRNA分子的制备治疗新生血管异常增生相关疾病的药物的剂型 可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应 的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，在临床使用中，对于眼科用药，可以将本发明的siRNA溶于不含有RNA酶的 无菌水中，轻轻混勻，HPL-siRNA浓度为1微克/微升，眼内玻璃体腔注射。两周注射一次， 30天一个疗程进行治疗。为了验证本发明的设计思想和 siRNA抑制新生血管异常增生的效果，设计了如下 实验方案(1)建立CNV小鼠模型，使其新脉络膜血管增生的病理状况接近于人AMD疾病。(2)针对呈高度同源性、且与人基因组非同源的肠病毒EV70 (Genebank Accssion number :DQ201177)的5，端非编码区(5，UTR)序列，设计多种siRNAs ；并且以在编码区 (ORF)及3’UTR的非保守区作为阴性对照设计siRNA。阳性对照为VEGF抗体药物Avastin。(3)用免疫荧光化学染色的方法观察上述siRNA对眼球中新生血管的作用。(4)运用实时定量PCR的技术，检测给药siRNA后小鼠CNV模型中相关基因TLR3、 VEGF、KDR、IL12a的表达水平。以下以小鼠为AMD动物模型，采用包含特定序列siRNA分子双链冻干粉为药物剂 型，对本发明进行详细描述。应理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行 限制。需要说明的是，如无特别注明，下述实施例中的百分比含量皆为重量百分含量
Wt %。实施例1AMD动物模型的建立1.主要仪器、试剂和材料1. 1 仪器5. 4mm手持式接触镜(Ocular Instruments，Bellevue，WA)，氪离子激光 机(Coherent, Nuvus2000)、荧光显微镜(Eclipse TS100 ；Nikon, Tokyo, Japan)，眼前节裂 隙灯显微照相系统，共焦激光视网膜断层扫描仪(Heidelberg retinatomo-graph II，HRT II ；Heidelberg, Germany)。1. 2 实验动物C57BL/6J 小鼠，体重 20_30g。1. 3材料和试剂0. 3%戊巴比妥钠(45mg/kg)，复方托吡卡胺(日本参天制药株 式会社)，1%甲基纤维素，10%荧光素钠(广西梧州制药股份有限公司)，4%多聚甲醛(用 PH 7. 3磷酸盐缓冲液稀释，国药集团化学试剂有限公司)，IOmg 4'，6- 二脒基-2-苯基吲 哚盐酸盐(DAPI),0. 2u/y 1 鬼笔环肽(Phalloidin-Alexa Fluor 488)和 1 μ g/μ 1 异凝集 素-Β4 (Isolectin B4_Alexa Fluor 568)(Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR)。2建立动物模型氪激光光凝眼底的方式建立CNV模型。0.3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射 麻醉，复方托吡卡胺扩瞳。将小鼠实验眼固定于裂隙灯前，在甲基纤维素的辅助下，将 5. 4mm手持式接触镜置于角膜前，用氪离子激光机，激光波长647. Inm,功率260mw，光斑直 径50 μ m,曝光时间0. 05s。围绕视盘并在距视盘2个乳头直径位置等距离光凝2个点，分 别位于6点和12点处，以光凝后有气泡产生提示Bruch膜被击破为标准。无气泡产生或有玻璃体出血的光凝点需被排除。分别于光凝后5分钟(min)、4天(d)、1周(w)、2周(w)和 4周(w)对模型小鼠行眼底照相和眼底荧光血管造影(Fundus Fluorescein Angiography, FFA)检查。摘除眼球行脉络膜铺片用荧光抗体(DAPI、Is0lectin-B4及Phalloidin)分别 标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白。3模型小鼠行眼底照相和眼底荧光血管造影通过将光凝过的小鼠模型行眼底照相和眼底荧光血管造影，以确认是否成功建立 CNV模型。眼底摄像检查0. 3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉，复方托吡卡胺扩瞳后 加置眼底接触镜，经眼前节裂隙灯显微照相系统行眼底摄像检查。
FFA检查眼底摄像检查后将10%荧光素钠用注射用水稀释成2%荧光素钠， 经腹腔注射0. 3ml，注射后100-140秒开始用共焦激光视网膜断层扫描仪(Heidelberg retinatomo-graph II，HRT II ；Heidelberg, Germany)直接记录造影过程。记录时间为 30min，观察时间点分别为腹腔注射荧光素钠后2min、5min、15min及30min。4免疫荧光染色摘除眼球行脉络膜铺片用荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0leCtin-B4(红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白。4. 1 脉络膜铺片(Choroid Flatmounts)及染色于光凝后 5min、4d、lw、2w 和 4w 将 各组小鼠用过量戊巴比妥钠腹腔注射处死，立即摘出双侧眼球，放入4%多聚甲醛中快速固 定lh。在解剖显微镜下，沿赤道部环④行剪开眼球壁，去除眼前节，用画笔小心分离并去除 视网膜神经上皮层，获得RPE-脉络膜-巩膜复合体眼杯，用冷ICC缓冲液(0. 5%BSA,0. 2% Tween 20,0. 1% TritonX-100)反复冲洗眼杯。在暗室里，将IOmg 4'，6-二脒基-2-苯基 吲哚盐酸盐(DAPI)、0. 2U/y 1 鬼笔环肽(Phalloidin-Alexa Fluor 488)和 1 μ g/μ 1 异凝 集素-Β4 (Isolectin B4_Alexa Fluor 568) (Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR) 分别用ICC缓冲液以1 500,1 100和1 100的稀释，5000rpm离心lmin，充分混勻 后，分别移入装有眼杯的离心管中进行染色，避光置于4°C冰箱轻摇4h后，再用冷ICC缓冲 液充分冲洗眼杯。将RPE-脉络膜-巩膜复合体沿视乳头为中心做4个放射状切口，使其平 铺于载玻片上，RPE面朝上，巩膜面朝下，封片待查。4. 2荧光显微镜(Fluorescence Microscopy)观察用荧光显微镜(120W卤素灯 和适当的发射和激发滤光片)观察脉络膜铺片上CNV的形态，每例所选取的光凝斑图象采 集在DAPI、Isolectin B4,Phalloidin分别对应的蓝色、红色和绿色通道下的CNV复合体的 图像。所采集图象的分辨率均为1392X1040dpi，每个通道的深度为8bit。5.小鼠CNV模型的鉴定成功建立接近人体AMD发病机理的小鼠CNV模型。氪激光光凝眼底的方式(激光波长647. Inm,功率260mw，光斑直径50 μ m,曝光 时间0. 05s)建立CNV模型1周后，经眼底摄像、FFA和脉络膜铺片检查结果显示开始出 现CNV。正常C57BL/6J小鼠腹腔注入荧光素钠后约2min眼底血管开始显影，视网膜血管 以视乳头为中心呈放射状排列，脉络膜血管呈网状分布。脉络膜铺片后荧光显微镜检测显 示Phalloidin阳性的视网膜色素上皮细胞呈均勻一致的六边形排列紧密(图la)，不显 示Isolectin B4标记的内皮细胞(图lb)，DAPI标记物在三通道叠加图像中可以鉴别出视网膜色素上皮细胞核(图lb)；制摸组眼底摄像所见激光光凝后视网膜上光斑立即呈白 垩样改变，视网膜急性水肿(图2) ；4d时灰白色水肿明显；7d时仍可见视网膜水肿，少许 色素形成，出血开始吸收；14d后视网膜水肿消失，出血大部分明显吸收；28d后色素明显， 瘢痕形成。FFA检查所见光凝后5min，光凝处可见荧光着色；4d后荧光着色消失；光凝后 7d,出现圆盘状荧光素渗漏(图3a)，14d时光斑处荧光素渗漏逐渐增强(图3b)；光凝后 28d，光凝斑无明显荧光渗漏，出现瘢痕化(图3c)。脉络膜铺片后荧光显微镜检测显示光 凝后5min，在光凝部位可检测到一个环形荧光缺损区，标志脉络膜-Bruch膜-视网膜色素 上皮复合体已经破坏(图4d-f)；光凝后4d，出现一些细胞碎片以及核碎片，Bruch膜破损 处可见自发荧光环(图4g-i)。到第7d时，在激光损伤区可以看到界限清楚的CNV网，视 网膜色素上皮细胞覆盖CNV复合体所在区域(图4j-l)，一直可以持续到4w并伴有该区视 网膜色素上皮细胞的修复。在7d、14d和28d时根据脉络膜铺片所测得的CNV面积分别为 8. 03 士 0. 53Χ103μπι2、16· 69 士 4. 78Χ103μπι2 禾口 15. 23 士 4. 47Χ IO3Um20 14d 与 28d 脉络膜 铺片上CNV面积相差不大，但与7d时相比面积均明显增加。 说明荧光抗体标记法可用来定性和定量检测氪激光诱导的小鼠实验性CNV而且 能很好地显示CNV的形态和面积，可为抗新生血管药物应用的有效性提供依据。实施例2siRNA 的制备1主要仪器、试剂和材料1. 1主要仪器核酸合成仪(GE)，微量注射器(HAMLT0N)等。1. 2材料和试剂化学合成的siRNA，抗体药物Avastin (Genentech)，5%葡萄糖溶液等。1.3siRNA 序列siRNA 代号 siRNA 序列(5，— 3，)siEv70_l 正义 CAAUGCAUUGAGAGGCCUGGAUdTdT SEQ ID NO 4反义 AUCCAGGCCUCUCAAUGCAUUGdTdT SEQ ID NO 5siEv70_2* 正义 UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUAdTdT SEQ ID NO 6反义 UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUAdTdT SEQ ID NO 7siEv70_3 正义 CCUGAGA⑶CCUCCGGCCCCUdTdT SEQ ID NO 8反义 AGGGGCCGGAGGACUCUCAGGdTdT SEQ ID NO 9siEv70_4 正义 AGAGAGAAAGUAGAGAAGGGCdTdT SEQ ID NO: 10反义 GCCCUUCUCUACUUUCUCUCUdTdT SEQ ID NO: 11siEv70_5 正义 UAGGAACCCAAGAACCCCUCCdTdT SEQ ID NO: 12反义 GGAGGGGUUCUUGGGUUCCUAdTdT SEQ ID NO: 13(其中，dT为脱氧胸腺嘧啶，U为尿嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤，A为腺嘌呤)*siEv70_2 为肠病毒 70(EV70)高度保守区序列。其余 siEv70_l、siEv70_3、 siEv70_4> siEv70_5 力 __ 冑 it 呆 $ g ·歹[J。
歹[J * iH GenebankAccssionnumber DQ201177。2siRNA 的设计肠病毒EV70(GenebankAccssion number :DQ201177)的 5，端非编码区(5，UTR)序列在肠病毒家族中经BLAST检索(美国NCBI人基因组数据库中核苷酸序列比较)呈高度 同源性，为高度保守区且与人基因组非同源。其中设计siRNA作为靶向性TLR3配体siRNA ； 在编码区(ORF)以及3’ UTR的非保守区设计的siRNAs作为阴性对照组。参照siRNA设计 原则和实验参数，综合考虑双链siRNA的稳定性、二级结构、正义链和反义链两端的Tm、GC
含量等因素。
3siRNA化学合成利用百奥迈科生物技术有限公司拥有的核酸合成仪(美国GE公司)分别合成 siRNA正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的RNA链。并进行纯化，将正 义链和对应的反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装IOD/管，最后冷冻干燥。4眼内玻璃体腔注射siRNA将siRNA duplex冻干粉分别用5%葡萄糖溶液(无RNase)进行稀释至适当浓 度(1-2 μ g)。取1 μ 1 (1-2 μ g)稀释好的siRNA duplex注射到CNV模型小鼠眼玻璃体腔 内。同时做对照组=Avastin阳性药物组，在CNV模型小鼠眼内注射Ιμ VEGF抗体类药物 Avastin (25mg/ml)处理作为实验的阳性对照；5%葡萄糖阴性对照组，在CNV模型小鼠眼内 注射 μ 5%葡萄糖溶液作为实验的阴性对照。具体注射方法如下先行前房穿刺，放出 少许房水，再距角膜缘后约1mm，用严格消毒的微量注射器行玻璃体腔内缓慢注药，以避免 急性高眼压和视网膜中央动脉栓塞，注射完毕后用棉签轻压穿刺口，防止液体反流。经不同时段行眼底摄像检查、FFA检查、脉络膜铺片及染色、荧光显微镜检查，通过 计算机图象分析系统进行血管密度图像处理。实施例3免疫荧光标记法筛选有效siRNA1主要仪器、试剂和材料1. 1 仪器5. 4mm手持式接触镜(Ocular Instruments，Bellevue，WA)，氪离子激光 机(Coherent，Nuvus2000)、荧光显微镜(Eclipse TS 100 ;Nikon，Tokyo，Japan)，共焦激光 视网膜断层扫描仪(Heidelberg retinatomo-graph II,HRT II ;Heidelberg，Germany)等。1. 2材料和试剂0. 3%戊巴比妥钠(45mg/kg)，复方托吡卡胺(日本参天制药株式 会社)，甲基纤维素，10%荧光素钠(广西梧州制药股份有限公司)，4%多聚甲醛(用PH 7. 3磷酸盐缓冲液稀释，国药集团化学试剂有限公司)等；荧光抗体IOmg 4'，6_ 二脒基_2_苯基吲哚盐酸盐(DAPI)，0. 2U/μ 1鬼笔环肽 (phalloidin-Alexa Fluor 488)和 1 μ g/μ 1 异凝集素-B4 (isolectin B4_Alexa Fluor 568) (Invitrogen-Molecular Probes, Eugene, OR)。2脉络膜铺片及荧光抗体染色摘除眼球行脉络膜铺片用荧光抗体DAPI (蓝色)、Is0leCtin-B4(红色)及 Phalloidin(绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白。2. 1 脉络膜铺片(Choroid Flatmounts)及染色于光凝后 5min、4d、lw、2w 和 4w 将各组小鼠用过量戊巴比妥钠腹腔注射处死，立即摘出双侧眼球，放入4%多聚甲醛中快速 固定1小时。在解剖显微镜下，沿赤道部环④行剪开眼球壁，去除眼前节，用画笔小心分离 并去除视网膜神经上皮层，获得RPE-脉络膜-巩膜复合体眼杯，用冷ICC缓冲液(0. 5% BSA, 0. 2% Tween 20，0. 1 % TritonX-100)反复冲洗眼杯。在暗室里，将 IOmg 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI)、O. 2U/μ 1 鬼笔环肽(Phalloidin-Alexa Fluor 488)和 1 μ g/μ 1 异凝集素-B4(Isolectin B4_Alexa Fluor 568)分别用 ICC 缓冲液以 1 500、 1 100和1 100的稀释，5000rpm离心lmin，充分混勻后，分别移入装有眼杯的离心管 中进行染色，避光置于4°C冰箱轻摇4h后，再用冷ICC缓冲液充分冲洗眼杯。将RPE-脉络 膜_巩膜复合体沿视乳头为中心做4个放射状切口，使其平铺于载玻片上，RPE面朝上，巩 膜面朝下，封片。2. 2荧光显微镜(Fluorescence Microscopy)观察用荧光显微镜(120W卤素灯 和适当的发射和激发滤光片)观察脉络膜铺片上CNV的形态，每例所选取的光凝斑图象采 集在DAPI、Isolectin B4,Phalloidin分别对应的蓝色、红色和绿色通道下的CNV复合体的 图像。所采集图象的分辨率均为1392X1040dpi，每个通道的深度为8bit。
2. 3结果分析图5-12小鼠CNV模型处理7天后脉络膜铺片，荧光抗体DAPI (蓝色)、 IS0leCtin-B4(红色)及Phalloidin (绿色)分别标记细胞核、内皮细胞和肌动蛋白，荧光 显微镜观察成像。IS0leCtin-B4(红色)标记内皮细胞，可以观察到各处理组血管增生的程度，从而 可以推测到siRNA试剂及阳性药物Avastin抑制新生血管形成的有效性。siEv70_2处理 组(图9)、Avastin阳性对照组(图7)与阴性对照组(图5、图6)相比较，新生血管明显 减少，显示其抑制新生血管形成的有效性。其它各处理组(图8、图10、图11、图12)，血管 增生严重，无抑制现象。图13为用ImageJ图像分析软件处理计算免疫荧光染色中的血管平均数，各处理 组的血管数均较阴性对照少，尤其是siEv70_2处理组血管数明显少于其它处理组。实施例4实时定量PCR比较激活TLR3的药理作用1主要仪器、试剂和材料1. 1仪器iQ5多色实时定量PCR检测系统(Bio-rad)，离心机(Eppendorf)，玻璃 勻浆器等。1. 2材料和试剂96孔qPCR板(Bio-rad)，RISOTM RNA提取试剂(百奥迈科)， SYBRGreen I (Invitrogen), Icycler iQ calibration solutions (Bio-rad) ,AMV 反转录试 剂盒(Promega)，Taq DNA 聚合酶(百奥迈科)、Avastin (Genentech)等。1. 3实时定量PCR引物及检测基因 2实时定量PCR2. 1小鼠CNV模型眼球RNA提取(试剂和离心管、移液器吸头均要去除RNase)将-80°C冻存的小鼠眼球取出置装有Iml RISO试剂的1. 5ml离心管中，4°C完全解 冻。具体操作方法如下用眼科剪将眼球在RISO试剂中充分剪碎，然后转移至玻璃勻浆器 中勻浆化，再转移至1. 5ml离心管中；在得到的勻浆液中加入0. 2ml氯仿，盖紧管盖，用手上 下振荡15sec，得浑浊液，无分层现象，室温静置2-3min ；12, 000g，4°C离心15min。离心后， 样品分为三层无色上清水相、中间蛋白层及下层有机相，水相的体积约为所用RISO试剂 的60% ；小心吸取无色上清液至另一 1. 5ml离心管；加入0. 5ml异丙醇(每使用Iml RISO 加0. 5ml异丙醇)，轻轻混勻，室温静置IOmin ；12, 000g，4°C离心IOmin ；弃去上清，加Iml 70%乙醇(每使用Iml RISO试剂至少加Iml 70%乙醇)，涡旋振荡混勻；7，500g，4°C离心 5min ；弃尽上清，超净工作台干燥沉淀或真空离心干燥，加入适量DEPC-H2O溶解RNA沉淀； RNA的分析和定量1)用分光光度计测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。 0D260/280在1. 8-2. 1视为抽提的RNA的纯度很高。2)进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA 的完整性和污染情况。2. 2反转录合成cDNA第一链将样本RNA用AMV逆转录酶反转录成cDNA第一链。在200 μ IPCR反应管中加入 1 μ g模板RNA置于70°C /lOmin，取出置冰上5min。依次加入如下试剂5XAMV逆转录酶 反应缓冲液5μ 1，1μ g 01igo(dT)15，2. 5μ ldNTP，40单位的RNA酶抑制剂，AMV逆转录酶30 单位，用无RNA酶的水补至25μ 1，充分混勻。置于42°C反应1小时。反应结束后在每个反 应体系中加ddH20至200 μ 1。2. 3实时定量PCR反应用基因特异性引物检测样本中IL12a、TLR3、VEGF mRNA表达水平，同时扩增看 家基因GAPDH作为内参对照。每个样本同时扩增IL12a、TLR3、VEGF、内参基因GAPDH，每 个反应做3个平行。建立如下25μ 1反应体系5μ 1模板cDNA，2. 5μ 110XPCR buffer,0. 5 μ IdNTP (IOmM each), 0. 5 μ 1 5，引物(10 μ Μ)，0. 5 μ 1 3，引物(10 μ Μ)，1. 5 μ 1 SYBR Green I (2000 倍稀释)，O. 25 μ 1 Icycler iQ calibration solutions (100 X)，0· 25 μ 1 Taq DNA聚合酶，用ddH20补足体系至25 μ 1。反应条件95°C预变性5min，95°C变性20sec， 60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。2. 4结果分析图14显示各实验处理组VEGF mRNA表达水平光凝未处理组与其它处理组相比较 VEGF mRNA表达显著升高，其它各处理组与光凝未处理组相较VEGF mRNA表达均有下降，特 别是siEv70_2处理组其VEGF表达水平显著下降，表明其抑制血管增生的效果比较明显。图15显示各实验处理组TLR3 mRNA表达水平siEv70_2处理组与正常组相较 TLR3呈现高表达水平，其它各实验处理组与正常组相较TLR3表达水平无明显变化。 图16显示各实验处理组IL12a mRNA表达水平siEv70_2处理组与正常组相较 IL12a呈现高表达水平，其它各组与正常组相较IL12a无明显差异。虽然以上仅以肠病毒核酸序列高度保守区第241-263位片段作为模板设计双 链siRNA序列、并且用2个脱氧胸腺嘧啶dTdT对该双链siRNA分子的3’端进行修饰、以 C57BL/6J小鼠CNV模型为例，对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，采 用其他病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA设计模板同样也可以实施本发明，这对于 本领域的技术人员来说是显而易见的。在不违背本发明的思想下，本领域的技术人员在此 基础上，所做的各种变形、修饰与应用，均应包括在本发明的范围内。序列表<110>百奥迈科生物技术有限公司<120>病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA设计模板的应用<130>PCNBA0900605S<141>2009-04-13<160>13<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>644<212>DNA<213> 肠病毒<400>1ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60accccggtac ccttgtacgc ctgttttata ctccctttcc caagtaactt tagaagaaat 120aaactaatgt tcaacaggag ggggtacaaa ccagtaccac cacgaacaca cacttctgtt 180tccccggtga agttgcatag actgtaccca cggttgaaag cgatgaatcc gttacccgct 240taggtacttc gagaagccta gtatcatctt ggaatcttcg atgcgttgcg atcagcactc 300taccccgagt gtagcttggg tcgatgagtc tggacacccc acaccggcga cggtggtcca 360ggctgcgttg gcggcctacc catggctagc accatgggac gctagttgtg aacaaggtgc 420gaagagccta ttgagctacc tgagagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcccaacca 480cggagcaaat gctcacaatc cagtgagtgg tttgtcgtaa tgcgcaagtc tgtggcggaa 540
ccgactactt tgggcgtccg tgtttccttt tatttttatt atggctgctt atggtgacaa 600tctgagattg ttatcatata gctattggat tagccatccg gtga644<210>2<211>23
<212>RNA<213>人工序列<400>2uagguacuuc gagaagccua guadTdT25<210>3<211>23<212>RNA<213>人工序列<400>3uacuaggcuu cucgaaguac cuadTdT25<210>4<211>22<212>RNA<213>人工序列<400>4caaugcauug agaggccugg audTdT24<210>5<211>22<212>RNA<213>人工序列<400>5auccaggccu cucaaugcau UgdTdT24<210>6<211>23<212>RNA<213>人工序列<400>6uagguacuuc gagaagccua guadTdT25<210>7<211>23<212>RNA<213>人工序列<400>7uacuaggcuu cucgaaguac cuadTdT25<210>8
<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>8ccugagaguc cuccggcccc udTdT23<210>9<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>9aggggccgga ggacucucag gdTdT23<210>10<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>10agagagaaag uagagaaggg cdTdT23<210>11<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>11gcccuucucu acuuucucuc udTdT23<210>12<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>12uaggaaccca agaaccccuc cdTdT23<210>13<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>13ggagggguuc uuggguuccu adTdT2权利要求
一种病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA设计模板的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒是肠病毒。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高度保守区片段位于5’端非编码区、3’ 端非编码区或编码区。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高度保守区片段是SEQID N0:1中的 第241 263位。
5.一种以权利要求4中所述的高度保守区片段为模板所设计的双链siRNA分子，其具 有如下序列结构正义链5’ -UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3’ 反义链5’ -UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’ ；其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A胸 腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ;n是0 2的整数。
6.如权利要求5所述的双链siRNA分子，其特征在于，所述N为dT，且n为2。
7.如权利要求5所述的双链siRNA分子，其特征在于，所述n为0。
8.如权利要求5 7中任一项所述的双链siRNA分子在制备治疗新生血管异常增生相 关疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述新生血管异常增生相关疾病是下述疾 病中的至少一种年龄相关性黄斑变性、糖尿病眼损害和癌症。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物是眼科用药。
全文摘要
本发明涉及病毒核酸序列高度保守区片段作为siRNA设计模板的应用，设计得到的siRNA序列能被细胞膜的Toll样受体3识别，充当该受体的高效外源性配体，激活TLR3的信号通路，从而抑制新生血管异常增生。本发明还涉及该siRNA序列在制备治疗新生血管异常增生相关疾病的药物中的应用。
文档编号A61P35/00GK101857860SQ20091004920
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者孙云成, 朱远源, 李铁军, 王晋康, 陆毅祥, 陈莉 申请人:百奥迈科生物技术有限公司