专利名称：抗老化剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗老化剂、特别是抗老化皮肤外用剂，其特征在于，含有 显示TSP-1诱导活性、且通过诱导血管内皮细胞死亡而抑制血管新生的特 定药剂的血管新生抑制剂以及含有通过显示血管新生抑制活性而发挥抗老 化作用、特别是抗光老化作用的特定药剂作为有效成分。
背景技术：
近年来，对于皮肤老化的研究有了很大的i^艮。皮肤老化的原因虽然 从宏观上看年龄的增加是重要的因素，但是除此之外，作为与皮肤老化有 关的直接的因素也可以列举干燥、氧化、太阳光(紫外线)等的影响.作 为皮肤老化的具体现象，已知有以透明质酸为主的粘多糖类的减少、 的交^JL、紫外线导致的细胞损伤等。
另外，进行了以抑制、改善皮肤伤害为原因、或者由于暴露在紫外线 下导致的皮肤老化为原因的皮肤的皱紋、细紋、松弛等为目的的各种研究， 明确了例如促进透明质酸的产生(特开2001 — 163794号公报)、抑制基质 金属蛋白酶(MMP)的产生 活性(特表2000 - 503660号公报)、促进 胶原的产生、抑制酯酶的活性(特开平11-335235号公报)是有效的。而 且，作为这些研究的成果，发现透明质酸或氨基酸、各种多元醇、糖类、 进而各种各样的植物提取物对抑制、改善皮肤老化是有效的。
该研究主要关注表皮或表皮细胞、谋求抑制、改善皱紋等，但与此不同的是，最近有报告显示在皮肤的血管系统中的内皮细胞也与皮肤的老化 有关.
本发明的目的在于从皮肤血管系内皮细胞与皮趺老化的关系的观点出 发找出新的对皮肤老化的预防或抑制有效的药剂。
发明内容
本发明者深入研究的结果发现，特定的生药、即、枣提取物、朝鲜人 #^取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芹提取物、 薏苡仁提取物和蚕丝提取物能抑制血管新生、结果能有效地预防或抑制老 化。
因此，本发明提供一种血管新生抑制剂，其特征在于，含有选自^l: 取物、朝鲜人^取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芽菜提取物、 欧芽提取物、薏苡仁提取物、蚕丝提取物组成的组中的l种或多种的药剂。
更详细地说，本发明提供一种抗老化剂，其特征在于，含有选自M 取物、朝鲜人;0^取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芽菜提取物、 欧芽提取物、薏苡仁提取物、蚕丝提取物组成的组中的l种或多种的药剂。 这种抗老化剂能防止或抑制皱紋的形成、特别是通过光老化的皱紋的形成， 是非常有效的。
本发明进一步涉及抑制老化的方法，该方法包括在皮肤上涂布上^ 管新生抑制剂或抗老化剂。
皮肤的血管系为了维持正常皮肤的结构和机能是必须的。除此之外， 皮肤的血管系分别在控制毛发生长、镇静紫外线引起的皮肤损伤、年龄增 加导致的皮肤老化、对于刺激和炎症的皮M应以及修复组织中扮演着重 要的角色。血管在正常的成人皮肤内稳定的工作着，但是对于异常的刺激 迅速的活化、进而进行血管扩张并伴随有从已有的血管形成新的毛细血管 的血管新生反应。这些变化在前血管新生分子(血管新生促进因子)和抗 血管新生分子(血管新生抑制因子)两者间存在平衡。而且，明确了正常 皮肤中内在性的血管新生抑制因子比血管新生促进因子更优先地作用。血管内皮生长因子(VEGF)，虽然已知作为血管通透因子，但在最 近的研究中表明，也是人皮肤内主要的血管新生促进因子。在正常的皮肤 中，VEGF由角化细胞少量分泌、与真皮的微血管内皮细胞上的特异受体 结合，由此确保内皮细胞的生存能力、从而维持上部的网状结构的血管。 在炎症或创伤愈合时的肥厚表皮中VEGF非常高度地表达，正因为如此， 可以导出由于血管没有表皮，因此用真皮进行血管增加和营，应。
与VEGF相对照，作为正常皮肤中的血管新生抑制因子起主要作用的 是细胞外基质蛋白质的血小板凝血S^感蛋白(TSP)系的两种，TSP-1 和TSP-2。 TSP通过基底层的含有角化细胞的多种皮肤细胞表达，堆积在 真皮-表皮间的基底膜区域、作为防止表皮的血管新生的自然的抗血管新 生屏障作用。另外，还判明在血管新生和血管的退化之间，TSP的表达被 调节。
使用TSP-1、 TSP-2等的血管新生抑制因子基因敲除模型、或者在皮 肤中过量表达血管新生促进因子VEGF或血管新生抑制因子的转基因模型 的体内研究显示，这些血管新生促进因子或血管新生抑制因子的水平调节
对紫外线引起的损伤和皮肤的皱紋的程度、刺激性的皮M应、以及皮肤 损伤的修复有显著的影响。
如果对小鼠长时间照射紫外线能形成显著的皱紋，但是令人震惊的是， 此时皮下血管的显著生长可看到伴随着血管的扩大和分支的增大。另外， 若对小鼠长时间照射紫外线，发现了血管内皮生长因子的表达也亢进。由 此明确了 ，紫外线照射等的皮肤伤害引起皱紋的形成与血管内皮细胞的新 生有关，换言之、明确了抑制血管内皮细胞的新生、并且诱导血管内皮细 胞的细胞死亡，可以抑制皱紋的形成。
因此，利用基于诱导血管新生抑制因子TSP-1的抑制血管新生和基于 诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的抑制血管新生这两者的机理，筛选 作为抑制皮肤老化候补药剂的多种生药的结果，发现了存在几种具有诱导 TSP-1、且诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡活性的生药。这些生药中， M取物、朝鲜人M取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹菜提取物、欧芽提取物、惹苡仁提取物和蚕丝提取物显示血管新生抑制作用或 抗老化作用、特别是抗光老化作用在现有的技术中是完全未知的，而且也 没有暗示。
附图的简单说明
图1显示TSP-1诱导剂的筛选结果。
图2显示编程性细胞死亡诱导剂的筛选结果。
具体实施方案
诱导血管新生抑制因子TSP-1的药剂的筛选在下述的实施例、实验1 中有详细的记载，使各种候补药剂与导入了 DNA构建体的HaCat细JJ&^ 作用，该DNA构建体为在TSP-1启动子的下游结合了荧光素酶作为才艮告 基因的DNA构建体，进行荧光素酶活性的测定，将该荧光酶活性作为 TSP-1启动子活性，来选定具有TSP-1启动子活性的药剂作为有效药剂。
TSP-1诱导剂未必诱导血管内皮细胞死亡。例如，TSP-1诱导物质的
血管内皮细胞内不诱导细胞死亡。因此，为了鉴定不仅可进行TSP-1诱导， 而且还发挥TSP-1机能(血管内皮细胞的细胞死亡)的药剂，实施对诱导 血管内皮细胞的编程性细胞死亡的药剂的筛选作为二次筛选.
诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的药剂的筛选用对细胞测定编程 性细胞死亡活性的常用的方法、具体的在下述的实施例、实验2中进行了 详细地记载，使候补药剂与适当的细胞培^养基中的血管内皮细胞作用、 测定该细胞的细胞死亡、选择能增强该细胞的细胞死亡的药剂作为有效药 剂。
结果发现，以下的药剂可以诱导TSP-1、而且可诱导血管内皮细胞的 编程性细胞死亡并抑制血管新生。
M取物枣的果实提取液。作为主成分，除了含有皂苷或^t等的 糖类、有机酸类以外，还含有作为核酸相关物质的称为环AMP的物质。该环AMP具有皮肤组织蛋白质的新生(再生)或皮脂分泌调节等的作用。
朝鲜人M取物别名高丽参的提取液。作为主成分，含有人参皂苷、 人参醇、P-榄香烯等。人参皂苷具有蛋白质、DNA合成促进作用。
白花春黄菊提取物原产于欧洲的l年草的提取液。作为主成分，含 有薛烯醇、母菊萬、壬酸等。干燥的头状花具有抗炎、促ii^^欲的作用。
小球藻提取物从在淡水中生存的单细胞植物得到的提取液。作为主 成分，大多含有氨基酸、维生素。具有细胞分裂作用、抗肿瘤作用等。
芽菜提取物原产于南欧的l年草的提取液。作为主成分，含有称为 芽菜戒的黄酮配糖体、甘露糖醇、香杼檬脑、肌醇等。芽菜提取物具有降 压作用。
欧芽提取物原产于欧洲的多年草的提取液。作为主成分，含有芹菜 脑、肉豆蔻醚等。该芽菜脑具有利尿作用。
薏苡仁提取物薏苡的种子提取液。作为主成分，除了谷氨酸、亮氨 酸、酪氨酸等氨基酸以外，还含有薏苡仁酯。该薏苡仁酯作为抗肿瘤成分 起作用。
蚕丝提取物从家蚕得到的丝纤维的提取液。作为主成分，含有大约 20种的氨基酸。作为功能，具有细胞的再生、新陈代谢的促进等作用。
上述提取物可以通过常规方法得到，例如将成为^1取物起源的植物 和提取溶剂一起浸渍或加热回流后、过滤、浓缩得到。作为提取溶剂，只
要是通常提取中使用的溶剂则可以任意的使用，例如可以单独或组合使用 水，曱醇、乙醇、丙二醇、1, 3-丁二醇、甘油等的醇类，含水醇类，氯 仿，二氯乙烷，四氯化碳，丙酮，乙酸乙酯，己烷等的有机溶剂等。可以 直接使用用上述溶剂提取得到的提取物、或者将浓缩的提取物用吸附法，
例如使用离子交换树脂除去杂质的提取物，或者用多孔聚合物(例如:ry
^一，Y卜XAD-2)的柱子吸附后、用曱醇或乙醇洗脱，浓缩后得到的提 取物。另外，也可以使用通过分配法、例如用水/乙酸乙酯提取的提取物。 本发明涉及的药剂对于预防、抑制以血管内皮细胞的新生、成长、增 殖为原因的老化非常有效。以血管内皮细胞的新生、成长、增殖为原因的老化意味着皮肤伤害或者暴露在紫外线下引起的光老化等。本发明涉及的 药剂对于防止、抑制光老化特别有效。
光老化一般意味着，作为反复被日光照射的结果可看到皮肤外观以及
机能的变化。作为日光构成要素的紫外线(uv)、特别是中波uv (称为
UVB、波长290 320nm)主要引起光老化。引起光老化的必要的UVB的 照射量现在还不知道。但是，对于引起红斑或晒黑水平的UVB反复的照 射，通常与光老化相关。临床上，光老化可特定为皮肤粗糙、形成皱紋、 色斑、土色化、形成松弛、毛细管扩张病的发病、痣的产生、紫癥的产生、 容易受伤、萎缩、纤维变性的去除色素区域的产生、前恶性肿瘤以及恶性 肿瘤的发病等。光老化一歉良生在脸、耳、头、颈和手等习惯上暴露在日 光下的皮肤。
本发明的血管新生抑制剂或抑制抗老化剂中的抑制血管新生的药剂的 配合量，在血管新生抑制剂总量中、作为干燥物为0.0001 ~20.0质量％、 优选为0.0001 ~ 10.0质量％ 。
另外，在本发明的血管新生抑制剂或抗老化剂中，除了上述必须成分 以外，根据需要也可以适当配合通常在化妆品或药品等的皮肤外用剂中使 用的成分、例如、美白剂、保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、 表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色素、水性成分、水、各种皮肤 营养剂等。
此外，也可以适当地配*地酸二钠、依地酸三钠、柠檬酸钠、多磷 酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等的金属阻断剂，咖啡因、鞣酸、异搏定、凝血 酸及其衍生物，甘草提取物、光甘草定、木瓜果实的热7JC提取物、各种生 药、醋酸生育酚、甘草皂苦及其衍生物或其盐等的药剂，维生素C、抗坏 血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等的美白剂，葡萄糖、果糖、 甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖类，视黄酸、视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄 醇棕榈酸酯等的维生素A类等。
本发明的血管新生抑制剂或抗老化剂只要是例如软骨、霜剂、乳液、 洗剂、面膜、洗浴用剂等现有的皮肤外用剂的话即可，对剂型没有特别限制。
实施例
以下，通过实施例进一步详细地i兌明本发明。另外，本发明并不仅限 于以下的实施例。配合量为质量％。 实验l.(一次筛选)
TSP-1诱导剂的筛选
使用在HaCat细胞林中稳定地导入了再TSP-1启动子的下游结合了荧 光素酶编码基因作为报告基因的DNA构建体的细M。将上述细Jf&^悬 浮在DMEM/F12 (Invitrogen 7>司)(含有10 %的FBS以及lmg/mL的 潮霉素B (Invitrogen公司))培养基中，在24孑Ul上每孑L播种4 x 104 个细胞。大约30小时后，将培养基换为无血清DMEM/F12培养基，在5 %C02、 37"C下培养25小时。然后，将作为候补药剂的各种植物提取物干 燥物溶解于DMSO (和光纯药工业)中达到2质量％的物质以培养液的 1/1000、 1/10000或者1/100000的容量加入，培养24小时。除去培养上清 ^，用PBS洗涤细胞，使用荧光素酶检测系统(Promega公司)进行荧 光素酶的活性测定。以其荧光素酶活性作为TSP-1启动子活性。结a 明，实验的各种植物提取物中，包括^R取物(1)、朝鲜人^C取物(2 )、 白花春黄菊提取物(3)、小球藻提取物(4)、芹菜提取物(5)、欧芹提 取物(6)、薏苡仁提取物(7)以及蚕丝提取物(8)(全部来自一丸:77 少:n7公司)等任几个具有有效的TSP-1启动子活性。使用这些生药的实 验结果如图l所示。对照是代替候补药剂使DMSO作用的实验。
如上所述，TSP-1诱导剂不一定诱导血管内皮细胞死亡。因此，为了 筛选不^L挥TSP-1诱导功能、还发挥TSP-1机能(血管内皮细胞的细胞 死亡)的药剂，我们进一步实施了 2次筛选。 实验2 (二次筛选) 编程性细胞死亡诱导剂的筛选
在细胞培养玻片(chamber slide)上培养至大约70 %融合的血管内皮细胞HMVEC (三光纯药)中添加在一次筛选中添加药剂(1/1000)培养 24小时后的培养上清液后，培养24小时，研究血管内皮细胞的细胞死亡 谦导。细胞死亡的检领，H吏用ApopTag Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit,细胞死亡诱导计算是分别计算引起各种药剂添加组和对照 组的细胞死亡的细胞比率来进行的。计算方法是从各种药剂添加組和对照 组的玻片用数码相机得到3处图像，在各个画像中计算对于核数的细胞死 亡信号数、作为比率(％ )。
结果表明，实验的各种植物提取物中，M取物(1)、朝鲜人M取 物(2)、白花春黄菊提取物(3)、小球藻提取物(4)、芽菜提取物(5)、 欧芽提取物(6)、薏苡仁提取物(7)以及蚕丝提取物(8)能有效地诱导 血管内皮细胞的编程性细胞死亡。4吏用这些生药的实验结果如图2所示。 作为比较例，也显示了只用培养基(图中，右棒1/10000;左棒1/1000)、 DMSO (图中，右棒1/10000;左棒图1/1000)或者TSP國1 (1/1000) (Haematologic Technologies, Inc.)代脊娱补药剂作用的实验结果。
以上两种筛选的结果表明，M取物、朝鲜人M取物、白花春黄菊 提取物、小球藻提取物、芽菜提取物、欧芽提取物、薏苡仁提取物、蚕丝 提取物在诱导TSP-1、且诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡中是有效的。
产业上的可利用性
^取物、朝鲜人M取物、白花春黄菊提取物、小球藻提取物、芹 菜提取物、欧芽拔:取物、薏苡仁提取物、蚕丝换^取物等的诱导TSP-1、而 且诱导血管内皮细胞的编程性细胞死亡的药剂，在抑制老化上是有效的。
权利要求
1.一种血管新生抑制剂，其特征在于，含有欧芹提取物(Petroselinumsativum Hoffman)。
2. —种抗老化剂，其特征在于，含有欧芽提取物。
3. 如权利要求2所迷的抗老化剂，防止或抑制皱紋的形成。
4. 一种非治疗目的的用于抑制由于暴露在紫外线下导致的皮肤老化 的方法，包括在皮肤上涂布权利要求2所述的抗老化剂。
全文摘要
本发明提供一种血管新生抑制剂以及抗老化剂，其特征在于，含有欧芹提取物。
文档编号A61P35/00GK101601702SQ20091013434
公开日2009年12月16日 申请日期2003年6月18日 优先权日2002年6月25日
发明者加治屋健太朗, 矢野喜一郎 申请人:株式会社资生堂