金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用及产品的制作方法

专利名称：：金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用及产品的制作方法
技术领域：
：本发明涉及金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用及产品，属于中药
技术领域：
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背景技术：
：脑血管疾病是神经系统的常见病、多发病，严重危害着人类健康。脑卒中是脑血管疾病中的严重类型，其平均年发病率男性为124/10万一388/10万，女性为61/10万一312/10万，具有极高的致残率和致死率。近年来我国脑卒中的死亡率下降，但发病率有上升趋势，并日趋年轻化，有近25%发生于65岁以前，尤其是40岁以下的脑梗死患者，发病率较5年前提高6倍。其中缺血性卒中的发生率是出血性卒中的3-4倍，占全部卒中的70%—80%。因此，对脑卒中、尤其是缺血性卒中的治疗有待进一步研究和提高。脑卒中的病理生理机制比较复杂，有人提出损伤级联学说，包括兴奋性毒性，梗死周围去极化，炎症和程序性死亡，且各个环节交互影响，形成复杂的网络联系。近年研究表明caspase-3与缺血性卒中的发生发展密切相关，caspase-3参与了脑缺血后的神经元损伤过程，尤其是迟发性神经元死亡过程。脑缺血后，神经元caspase-3mRNA及蛋白表达明显增加。缺血性卒中目前的治疗药物有谷氨酸受体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂、抗氧化剂、抗炎剂、神经营养因子以及干细胞移植等，但都存在着各自的缺陷和不足。我国在用中草药防治缺血性脑血管疾病方面已有丰富的临床实践经验，中草药因含有多种活性成分，具有多靶点的作用特点，在临床防治脑血管疾病中具有独特的优势。石斛(Dendrobium)是我国传统医学中的名贵中药材，包括马鞭石斛、黄草石斛、铁皮石斛、金钗石斛和D.officinaleKimkuraetMingo等。石斛的主要化学成分为多糖、生物碱、氨基酸、酚类、挥发油等。现有研究表明，石斛属植物具有以下的药理作用减慢心率，拮抗肾上腺素、苯肾上腺素和5羟色胺对肠系膜血管的收縮；降低血黏度，拮抗花生四烯酸和胶原蛋白致兔血小板凝集；抗自由基损伤作用；拟似单胺氧化酶抑制剂，可调节单胺类递质。金钗石斛生物总碱是金钗石斛的主要活性成分之一，具有抗肿瘤活性及免疫调节活性。但前述金钗石斛属植物及金钗石斛生物总碱的药理作用及其机制尚不明确，有待进一步研究和探索。
发明内容本发明的目的在于提供金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用及产品。本发明针对脑卒中的发病机制，通过研究金钗石斛生物总碱对大鼠急性脑缺血模型的保护作用，并分析其机制，进一步明确了其治疗缺血性脑损伤的药理作用机制，为金钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。本发明是这样构成的金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用。所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。前述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至无醇味，用酸溶液调PH至34，滤过，滤液用碱溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃取58次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。优选的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至34，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取58次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。前述金钗石斛生物总碱中亲脂性总生物碱的含量》60%。一种治疗缺血性脑损伤的药物制剂，是以金钗石斛生物总碱为原料药，加入适量辅料制成的口服制剂或注射剂。所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。金钗石斛具有生津益胃、清热养阴的作用，本申请人通过对其化学成分、药理作用、作用机制等方面进行深入细致的研究，发现金钗石斛药材中所含的生物碱成分能明显减轻缺氧缺糖/复氧复糖所致原代培养神经元的损伤，有效减轻大鼠急性脑缺血所致神经功能损伤。试验研究的主要过程及结果如下一.实验材料1.实验动物SD大鼠，雄性体重为280-350g，SD大鼠乳鼠80只(l-3天)，清洁级动物，购自重庆市中药研究院动物室，合格证号SCXK(渝)20020004。饲养环境的室温控制在20-25摄氏度，室内安静，每日光照12小时，动物自由进食水。2.主要试剂及药品金钗石斛生物总碱由遵义医学院药化教研室提取，临用时以无水乙醇溶解，过滤除菌，用生理盐水稀释至所需浓度；尼莫地平为上海华联制药有限公司生产，批号20060124;水合氯醛为中国医药集团上海化学试剂公司生产，批号F20050915;TTC为北京生化制药厂生产，批号20050302;DMEM/F12培养基:Sigma公司产品;胎牛血清(FBS):杭州四季青生物公司；胰蛋白酶Gibco公司产品；HEPES:sigma公司产品；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)、MDA、S0D、NO检测试剂盒均为南京建成生物有限公司产品；TritonX-100:上海生工生物工程公司；牛血清白蛋白(BSA):华美生物工程公司；Fura-2/AM、Rhodaminel23:Sigma公司产品。3.主要仪器C02孵箱美国SLSHELNB公司；TMS-1015倒置显微镜日本0LYMPUS公司；TDGC2J-0.5超净工作台上海先锋电器厂；RF-5000荧光分光度仪日本岛津公司；荧光实时定量-PCR:美国百乐公司。二.方法与结果1.金钗石斛生物总碱对原代皮层神经元缺氧缺糖损伤模型的保护作用1.1原代神经元培养出生3天内乳鼠，75%的酒精浸泡消毒，无菌条件下断头取脑。在预冷的D-Hank's液中解剖分离大脑皮层。剔除脑膜和血管，D-Hank's液洗2-3次，剪成lmm3左右的小块。加入O.125。/。胰蛋白酶37。C消化20min。取出吹打，并用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止反应。200目筛网过滤，1000rmin—工离心8min。弃上清液，用含血清培养基吹打成单细胞悬液，调节细胞悬液浓度为lX109cellsL—、0.4%台盼蓝镜检存活率>95%，接种于经0.01%多聚赖氨酸浸泡过夜的孔板或培养瓶中，37。C恒温C02孵箱内(5%C02，湿度85-98%)培养。接种第3天全量换液，第5—6天加入含阿糖胞苷终浓度为5yg/ml培养基作用24h，抑制胶质细胞的增殖。观察瓶内培养基颜色变化，2-3天换液一次。细胞培养至第10天，经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学法鉴定，神经元占全部细胞的95%以上，仅少数细胞是星型细胞和其他胶质细胞。1.2实验分组实验随机分为七组空白组，模型组，溶媒组，金钗石斛生物总碱低、中、高组(终浓度分别为0.025mgL—、0.25mg'L—工和2.5mg'L—4和阳性对照组(尼莫地平0.42mgL—工)。1.3细胞缺氧缺糖损伤模型的建立以缺氧室(自制密闭保鲜盒，注入流速为lL-h95%&和5%(]02的混合气体)来诱导细胞损伤。取培养9d的神经细胞，去除原培养液后，空白组加入含糖Earle's液置于37'C5%(]02孵箱中继续培养。模型组加入无糖Earle's液置于缺氧室中孵育。分别处理不同时间后换为正常培养基，C02孵箱中(复氧复糖)继续培养。金钗石斛生物总碱组在缺氧前24h、缺氧缺糖和复氧复糖的换液时加入不同浓度的药物，其余处理同模型组。51.4观察指标1.4.1MTT法(四甲基偶氮唑蓝微量酶反应法)检测细胞存活率用四唑盐(噻唑蓝，MTT)，即溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑[3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-dipenylterazoliumbromide]检测培养的细胞生存率。MTT可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色结晶，测定吸光度大小可间接反映细胞的数量及活性。96孔细胞培养板去除培养基后每孔加入180mlD-Hank's液和20ylMTT(终浓度为O.5mg.m1—1)，C02孵箱中继续培养4h。小心吸除上清液体。加入二甲基亚砜150yl，37。C振荡10min，待结晶充分溶解后，酶标仪测定各孔的吸光度值(Absorbance，A)。MTT可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色结晶，测定吸光度大小可间接反映细胞的数量及活性。1.4.2细胞外液乳酸脱氢酶(LDH)检测乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)在氧化型辅酶I存在时能催化乳酸生成丙酮酸，后者与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，在波长440nm下通过比色测定丙酮酸二硝基苯腙的含量，从而推算LDH的活性。分别吸取96孔细胞培养板上清液，采用丙酮酸二硝基苯腙显色法，裂解前后的培养基上清液，LDH活性参照LDH试剂盒说明书测定。在采用全动生化仪测定其含量，从而推算LDH的活性，通过测定释放到培养基中LDH的量来判断细胞损伤状况。1.4.3细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)检测制备细胞悬液，利用5ymo1L—^勺钙荧光指示齐!jFura-2/AM负载细胞，37。C恒温避光振摇50min，用含2gL—工牛血清白蛋白的Hank's液冲洗2次以防止胞内Fura-2/AM外排。调节细胞数为lXlC)9cellsL—、RF-5000荧光分光光度计检测，ExA:340nm，ExB:380nm，Em:500nm，激发和发射光栅分别为5nm、10nm。测定静息状态下的荧光强度(F34o，F38());加入10%TritonX-100水溶液20y1，测定最大荧光强度(Fmax340，F隨,);加入O.2moll^EGTATris溶液40yl，测定最小荧光强度(Frain340，Frain380)计算公式为[Ca2+]i=KdX(R一Rmin)Fmin38o/(Rmax—R)Fmax380。其中Kd二224nmo1L—、R=F34o/F380，Rmin=Fmin34o/Fmin380，Rm;ix=Fm;ix34o/Fm;ix3801.4.4线粒体跨膜电位(MMP)检测采用间接法，制备细胞悬液，加入溶于PBS液的荧光染料Rhodaminel23至终浓度2ymo1L—、C02培养箱负载细胞45min，调节细胞数2X108cellsL—、Ex:488nm，EmA:515nm，EmB:575nm。记录荧光强度，作为评定跨膜电位改变的指标。1.5统计学处理计量资料以^±5表示，应用SPSS12.0统计软件包分析，组间比较用单因素方差分析判断其显著性。P〈0.05有差异，P〈0.01有显著性差异。1.6结果1.6.l形态学观察缺氧缺糖损伤后模型组细胞失去折光性，胞体轮廓模糊，细胞间隙增宽；部分神经元胞体肿胀、增大，突起减少或回縮、断裂；少数神经元胞体内可见颗粒和空泡，HE染色发现模型组细胞还有核固縮、浓染等现象。表明缺氧缺糖/复氧复糖对神经细胞造成了较严重的损伤。预先加入金钗石斛生物总碱组对细胞损伤程度有所降低，细胞形态基本正常。1.6.2金钗石斛生物总碱对正常培养皮层神经元的影响结果显示，采用MTT法检测，与对照组比较，金钗石斛生物总碱对正常神经元生长无影响，结果见表l。表l金钗石斛生物总碱对正常培养皮层神经元的影响(f±s'n=6)组别剂量(mg*L—"不同培养(h)6122448空白对照组o.50i±0』150-511±0.0110.506±0.。040.505±0』14低剂量组0.025謹±0.014。473±0.015。479±0.016謹±0.019中剂量组0.250.489±0.0060.498±0.0300.502±(L01i0.499±0.006高剂量组2.50.512±。.0.512±。.017謹±0.0200.512±。.。141.6.3金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖/复氧复糖损伤神经元的保护作用结果显示，与对照组比较，模型组细胞活性降低，LDH漏出增加(P〈0.01)。预先加入金钗石斛生物总碱2.5mgL—^且能显著保护细胞活性，降低损伤细胞LDH漏出率，与模型组比较有统计学意义(P〈0.01)。结果见表25。表2金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖损伤大鼠皮层神经元MTT吸光度值的影响(^±s，n=6)阔(h)组另Udose(呢I/1)24Control-0.406±0.0090.403±0.015Model-0.292±0.012"0.2犯±0.027"Nimodipine0.420.333±0.041*0.316±0.037*及alkLD0.0250.332±0.033*0.313±0.068*及alkMD0.250.334±0.037*0.334±0.033*及alkffi)2.50.353±0.028林0.347±0.057**0.38肚0.0170.145±0.009"0.157±0.0100.15肚0.0120.159±0.0140.179±0.035*代O.01与空白对照组比较；*:代O.05,尺O.01与模型组比较。7表3金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖/复氧复糖损伤大鼠皮层神经元MTT吸光度值的影响(A490)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>:代O.01与空白组比较；*:代O.05，代O.Ol与模型组比较。1.6.4金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖2h/复氧复糖12h神经细胞内[Caz+]i和丽P的影响结果显示，与正常对照组比较，模型组内[C^+]i显著升高，丽P水平下降，较对照组有统计学意义(P〈0.01)。金钗石斛生物总碱O.025mgL—、0.25mgL—、2.5mgL—4匀能降低细胞内[Ca」+]i，提高腿P水平。见表6。表6金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤神经元细胞内游离Ca2+浓度和神经元线粒体膜电位的影响^±5'n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>:代O.01vs与空白组比较；*:代O.05，代O.01与模型组比较。2.金钗石斛生物总碱对大鼠脑中动脉缺血损伤的保护作用2.1分组和给药取SD大鼠，随机分为5组，分别为正常对照组、假手术组、模型组(大脑中动脉梗塞组)、金钗石斛生物总碱低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照药组(尼莫地平组)。2.2模型制作取SD大鼠，随机分为5组，分别为假手术组、模型对照组(大脑中动脉梗塞组)、天麻脑复康低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照药组(尼莫地平组)。采用线栓法制备大脑中动脉梗塞模型，SD大鼠，用10%水合氯醛(350400mg/kg)腹腔麻醉后，沿颈正中切开皮肤，分离右颈总动脉，颈外及颈内动脉。颈总动脉及颈内动脉用动脉夹夹闭，结扎颈外动脉远心端，剪开颈外动脉。使颈外动脉游离与颈内动脉拉成一条直线，将尼龙线(0.28mm)由颈外动脉插入，插入后用0号丝线结扎，以防出血。打开颈内动脉，将尼龙线继续插入颅内，当有轻微阻力时停止，插入深度为1720mm，大鼠大脑中动脉梗塞24h。假手术组大鼠麻醉后仅分离颈总、颈内及颈外动脉而不结扎，模型对照组大鼠仅接受大脑中动脉梗塞24小时，受试药低、中、高剂量组(分别为O.375g/kg、0.75g/kg、1.5g/kg)，每天灌胃给药一次，连续给药5天，未次给药后lh，进行大鼠大脑中动脉梗塞24小时，术后6小时和24小时再灌胃给药一次。2.3观察指标2.3.l神经功能症状观察采用Bederson评分法在制模后24h对大鼠神经功能症状进行评分，级别在0-4级之内(不包括0级和4级)为制模成功。评分标准如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.3.2脑梗塞面积测定大鼠断头取脑，将脑置-2(TC冰箱内20min，去除嗅球，小脑和低位脑干，沿寇状面平均切五片。然后迅速将脑片置于5ml，浓度为2%的红四氮唑(含有0.lmol/LK2HP04)溶液中，避光37。C温育30min，其间每隔7-8min翻动一次，经染色后，正常脑组织呈红色，而梗塞区组织为白色，数码相机照相观察记录后缺血区面积后将白色梗塞区仔细挖下称重，以梗塞组织重量占脑梗塞百分比计算其为梗塞范围。2.4脑组织病理形态学观察造模成功后麻醉大鼠，断头取脑置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定24小时，大鼠冠状位切片，取海马齿状回层面(视交叉后l.7-4毫米处)，每块厚度为2mm，石蜡包埋，5微米连续切片，常规HE染色。2.5对生化指标的测定2.5.1脑组织蛋白含量测定原理考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白氨根离子结合，使溶液变为兰色，通过测定吸光度可以计算出蛋白含量。操作步骤(1)准确称取待测组织的重量，按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，10003000转/分，离心10分钟，然后取组织匀浆上清再用生理盐水按l:9稀释成1%组织匀浆，或用生理盐水按l:4稀释成2%的组织匀浆，待测。(2)按试剂操作方法，加入不同试剂，混匀，静置10分钟，于595nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管OD值。计算公式蛋白含量(g/L)=(测定管OD值一空白管OD值)/(标准管OD值一空白管OD值)X标准管溶度(g/L)2.5.2—氧化氮合酶(NOS)活性测定原理一氧化氮合酶催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小可计算出NOS的活力(u/mgprot)。按下表操作空白管总NOS测定管a*样本(必a*试剂一底物缓冲液(必200200试剂二促进剂(必1010试剂三显色剂(必100100混匀，37。C水浴准确反应15分钟。空白管总NOS测定管试剂四透明剂(W10010试剂五终止液(W20002000混匀，蒸馏水调零，530nm波长处测各管吸光度值(OD值)。计算公式总NOS活力二(总NOS测定管OD值一空白管OD值)/38.3X10—6X(2.41+a)/aXl/15X蛋白含量(mg/L)2.5.3—氧化氮含量测定原理NO化学性质活泼，在体内很快转化为N03—，本法利用硝酸还原酶特异性将N03一还原为N02—，通过显色深浅测定其溶度的高低。按下表操作空白管标准管测定管双蒸水(ld)0.50.4100[im。l/L标准应用液(ml)0.1样本(IDl)0.5试剂一(rd)0.20.20.2试剂二(rd)0.20.20.2试剂三(rd)0.20.20.2试剂四(rd)0.10.10.1上情(ml)0.80.80.8显色剂(rd)0.60.60.6混匀，37。C准确水浴60分钟，充分旋涡混匀30秒，室温静置40分钟，35004000转/分11，离心10分钟，取上清显色。混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，550nm波长处测各管吸光度值(OD值)。计算公式NO含量(ymol/gprot)=(测定管0D值-空白管0D值)/(标准管0D值-空白管0D值)X标准品溶度(ymol/L)/样品蛋白含量(g/L)2.5.4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定原理超氧化物歧化酶对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，而亚硝酸盐在显色剂作用下呈现紫红色，可测定吸光度求出其活力。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95'C水浴(或用锅开盖煮沸)40分钟，取出后流水冷却，然后35004000转/分，离心10分钟，取上清液，532nm波长处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。计算公式MDA含量(nmol/mgprot)=(测定管OD值-测定空白管OD值)/(标准管OD值-标准空白管OD值)X标准管溶度(皿ol/ml)/样品蛋白含量(mg/ml)2.6检测凋亡基因caspase-3、caspase-8mRNA表达7K平的方法2.6.1RNA的提取及纯化①提取RNA:取出备用脑组织，再加入TrizolOOOyl后匀浆，室温静置5min;加入氯仿700微升，剧烈振荡混匀，静置10min，4"C下12000rpm离心10min取出上清液；加入异丙醇500微升，再次振荡混匀，室温静置10min，4"C下12000rpm离心10min，丢弃上清液，加入75%乙醇500微升，振荡清洗；4"C下12000rpm离心5min，弃上清，超净工作台上倒置晾干，加入100微升DEPC水中，室温溶解10min。②纯化RNA:在粗提RNA的EP管内加入500微升RP液，混匀后吸入RNA纯化柱，10000rmp离心lmin;加入500微升75X酒精10000rmp离心lmin并重复一次后以7500rmp干离心lmin;把纯化柱移入新的EP管内，加入DEPC水50微升37r静置l分钟后以7500rmp离心2min;再加入DEPC水30微升重复操作一次，EP管内所得溶液即纯化的RNA样品。2.6.2样品中RNA的纯度及浓度的测定使用紫外分光光度计，检测波长为260nm和280nm;取纯化的RNA样品10微升加入990微升超纯水后检测。A260/A280的比值在l.62.O范围内较为理想，其中A260的值在0.020.2之间较好。2.6.3逆转录合成互补DNA(cDNA)反转录体系为10ul体系(反应液配制在冰上操作，防止RNA降解)。2.6.3.1逆转录体系试剂使用量5XPrimeScriptTMBuffer(forRealTime)2ylPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5y1OligodTPrime(50uM)0.5u1Total丽RNaseFreedH202.6.3.2逆转录反应条件37°C15分钟85。C5秒2.6.4PCR反应2.6.4.1引物的设计和合成根据Medline上相关文献设计引物序列0.5y1xupto10y1GeneGeiiebankPrimerscaspass--3NO-012922.2上游引物5'--TGCGCCATGCTGAAACTG-3'caspass--3NO-012922.2下游引物5'-TGGCCACCTTCCGGTTAAC-3'caspass--8NO-022277r上游引物5'-GAGCTGCCAGTTTCTGTTTTGG-3'caspass--8NO-022277r下游引物5'-CCCCGAGGTTTGCTCTTCA-3'2.6.4.2PCR反应(反应液配制在冰上操作)(1)PCR反应体系(15y1)试剂使用量荧光7.5yl引物0.5ylcDNA(母液稀释6.5倍)3y1灭RNA酶dH204y1(2)PCR的反应条件为Stage1:95。C灭活8min，预变性30秒并重复一次；Stage2:95。C5秒，60°C(Caspase-3的退火温度)30秒，40个循环。3.统计学处理实验数据用SPSS12.0ForWindows统计软件包处理，各项指标采用均数士标准差(？眘)表示，多组间数据比较使用ONE-WAYANOVA检验(方差齐使用LSD法，方差不齐使用Gunnett'T3法)，两组间数据比较使用TTEST检验。P〈0.05有统计学意义。4.结果64°C(Caspase-8的退火温度)4.1大鼠神经功能缺损评分造模后，假手术组大鼠未出现神经功能症状，其余大鼠均表现为左侧不同程度的神经功能症状，总评分为3.51士1.59，各组神经功能评分结果见表8。表8金钗石斛生物总碱对大鼠神经功能评分的影响^is，^6)_分组ii评分模型组104.55±1.40低剂量组10124±1.48中剂量组103.90±1.55高剂量组102.79±1.23'.尼莫地平组102.10±0.77'与假手术组比较，"P〈0.05;与模型组比较，*P〈0.05。4.2大鼠脑梗死面积结果显示，假手术组脑组织未见梗死，模型组脑组织梗死较明显，金钗石斛生物总碱中、高剂量组有所改善，结果见表9。表9金钗石斛生物总碱对大鼠脑梗死体积的影响^is，^6)全脑重量S^重量/全脑重量1.3±0.0400模型组1.5±0.120.28±0.060.19±0.04高剂量组1.4±0.130.09±0.050.07±0.03'中剂量组1.3±0.080.15±0.040.11±0.03'低剂量组1.4±0.080.33±0.080.23±0.06尼莫地平组1.4±0.040.07±0.070.05±0.05'与假手术组比较，"P〈0.05;与模型组比较，*P〈0.05。4.3金钗石斛生物总碱对脑组织MDA、NO含量和NOS活性提高、SOD活性的影响结果显示，与正常组比较，假手术组脑组织中MDA、NO含量和NOS活性提高，SOD活性无明显差异；与假手术组比较，模型组脑组织中MDA、NO含量和NOS活性明显升高，SOD活性则明显降低；与模型组比较，金钗石斛生物总碱中、高剂量组MDA、NO含量和NOS活性则明显降低，SOD活性明显升高(P〈0.05)，金钗石斛生物总碱无明显改善，结果见表IO、11。15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>caspase-3mRHAcaspase-8mRNA模型组1.78±0.631.47±0.5高剂量0.45±0.22.0.4±0.16.中剂量0.95±0.340.92±0.19.低剂量1.25±0.521.14±0.36尼莫地平0.犯±0.210.38±0.1.tarn0.21±0.040.24±0.08与假手术组比较，"P〈0.05;与模型组比较，*P〈0.05。4.5大鼠脑皮层凋亡基因表达水平检测结果结果显示，与假手术组比较，模型组皮层组织caspase-3、caspase-8mRNA表达均有降低作用；与模型组比较，金钗石斛生物碱中、高剂量组对皮质caspase-3、caspase-8mRNA表达均有降低作用，结果见表13。表13金钗石斛生物总碱对大鼠皮质凋亡基因表达水平的影响(f±s，^0casp3se-3mRWAcaspase-8mRNA模型组1.77±0.571.59±0.49中剂量0.99±0.36'0.86±0.4'高剂量0.62±0.0.48±0.26fl尼莫地平0.58±0.19.0.40±o.rnam0.26±0.140.24±0.08与假手术组比较，#P〈0.05;与模型组比较，*P〈0.05。三.结论1.金钗石斛生物总碱能够明显减轻缺氧缺糖/复氧复糖所致原代培养神经元的损伤；2.金钗石斛生物总碱保护缺氧缺糖/复氧复糖损伤原代培养神经元的机制可能涉及改善能量代谢、抑制细胞内Ca2+超载、抑制凋亡特异性蛋白酶等多种因素；3.金钗石斛生物总碱能有效减轻大鼠急性脑缺血所致神经功能损伤，其机制可能涉及减少氧自由基的生成，抗氧化应激，降低大鼠脑内凋亡基因转录水平，抑制神经细胞凋亡等。与现有技术相比，本发明针对脑卒中的发病机制，通过研究金钗石斛生物总碱对原代皮层神经元缺氧缺糖损伤模型的保护作用及对大鼠急性脑缺血模型的保护作用，并分析其机制，进一步明确了其治疗脑缺血的药理作用和机制，为金钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。具体实施例方式本发明的实施例l:金钗石斛生物总碱的提取取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至34，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得金钗石斛生物总碱；其中亲脂性总生物碱的含量为68%。本发明的实施例2:金钗石斛生物总碱的提取取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至34，滤过，滤液用氢氧化钠溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃取56次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得金钗石斛生物总碱；其中亲脂性总生物碱的含量为62%。本发明的实施例3:金钗石斛生物总碱的应用取实施例1制得的金钗石斛生物总碱提取物502000毫克、硬脂酸镁O.10.40毫克、羧甲基淀粉钠412毫克、微晶纤维素50100毫克，将提取物与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压装置将颗粒压制成片，即得治疗缺血性脑损伤的片剂。该片剂口服，一日3次，每次13片本发明的实施例4:金钗石斛生物总碱的应用取实施例2制得的金钗石斛生物总碱提取物502000毫克、硬脂酸镁O.10.30毫克、羧甲基淀粉钠412毫克、淀粉50100毫克，将提取物与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得治疗缺血性脑损伤的胶囊剂。该胶囊剂口服，一日3次，每次13粒。本发明的实施例5:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物1005000毫克、糊精或蔗糖110克、矫味剂和甜味剂适量，将提取物与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制粒，干燥，整粒，分装，即得治疗缺血性脑损伤的颗粒剂。该颗粒剂口服，一日3次，每次510克。本发明的实施例6:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物1002000毫克、聚乙醇或豆油1002000毫克、助悬剂3IO毫克、乳化剂310毫克和明胶50100毫克、甘油1030毫克、纯化水50100毫克及防腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，7crc下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将提取物与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合均匀，再和制备好的明胶置于旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得治疗缺血性脑损伤的软胶囊。该软胶囊口服，一日3次，每次13粒。本发明的实施例7:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物10200毫克、聚乙二醇40002040毫克、甲基硅油适量，将提取物加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质(聚乙二醇4000)液，加热熔融成澄清液体，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝液，收集滴丸，置干燥器内，即得治疗缺血性脑损伤的滴丸剂。该滴丸剂口服，一日3次，每次1050毫克。本发明的实施例8:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物2005000毫克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠O.l克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有提取物、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得治疗缺血性脑损伤的糖浆剂。该糖浆剂口服，一日3次，每次510毫升。本发明的实施例9:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物502000毫克、可压蔗糖4080毫克、硬脂酸镁O.10.3毫克，将提取物过筛后与可压蔗糖、硬脂酸镁混合均匀，并用冲压装置压片，即得治疗缺血性脑损伤的舌下含片。该制剂含服，一日3次，每次1片。本发明的实施例10:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物102000毫克，加水至1000ml，加入O.5%活性炭，保持PH值7.0，加热微沸15分钟，冷却，滤过，加注射用水至全量，罐装，于115i:灭菌30分钟，冷藏48小时，滤过，滤液浓縮，喷雾干燥，分装，即得治疗缺血性脑损伤的注射剂。该制剂注射用，一日3次，每次510毫升。19权利要求1.金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用。2.按照权利要求l所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。3.按照权利要求1或2所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至无醇味，用酸溶液调PH至34，滤过，滤液用碱溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃取58次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。4.按照权利要求3所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至34，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取58次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。5.按照权利要求4所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述金钗石斛生物总碱中亲脂性总生物碱的含量》60%。6.一种治疗缺血性脑损伤的药物制剂，其特征在于它是以金钗石斛生物总碱为原料药，加入适量辅料制成的口服制剂或注射剂。7.按照权利要求6所述治疗缺血性脑损伤的药物制剂，其特征在于所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。全文摘要本发明公开了金钗石斛生物总碱在制备治疗缺血性脑损伤的药物中的应用及产品，所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。与现有技术相比，本发明针对脑卒中的发病机制，通过研究金钗石斛生物总碱对原代皮层神经元缺氧缺糖损伤模型的保护作用及对大鼠急性脑缺血模型的保护作用，并分析其机制，进一步明确了其治疗脑缺血的药理作用和机制，为金钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。文档编号A61K135/00GK101537129SQ20091030176公开日2009年9月23日申请日期2009年4月23日优先权日2009年4月23日发明者石京山申请人:遵义医学院