用于治疗骨丢失的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于治疗骨丢失的方法和组合物的制作方法
用于治疗骨丢失的方法和组合物相关申请本申请要求于2008年3月M日提交的美国临时申请号61/039028，和于2009年 1月四日提交的美国临时申请号61/148313的优先权利益。所有上文提及的优先权申请的内容在此整体引入作为参考。
背景技术：
骨丢失的特征在于骨组织的结构退化，这可以导致骨脆性和对骨折的易感性增加。骨丢失与许多疾病相关，包括骨质疏松症、骨关节炎和类风湿性关节炎。在类风湿性关节炎(RA)中，例如在放射照片上的骨伤害不仅呈现为侵蚀，而且还呈现为关节周围的骨质疏松症。[1]存在关于抑制炎症以避免RA中骨伤害的重要性的数据。通过几个随机化对照临床试验的结果，有效抗炎治疗已显示减少关节侵蚀的进展。[4-6]破骨细胞的炎性活化与两个特征都有关，[2，3]并且使用唑来膦酸二膦酸盐 (bisphosphonatezoledronic acid)抑制破骨细胞活性已显示减少侵蚀的进展[3]。少数研究已提示抗TNF疗法可能具有预防一般骨丢失的能力。例如，抗肿瘤坏死因子(抗TNF)疗法的抗炎作用已显示显著减少RA患者中的放射照相的关节伤害进展。 [4-6]还存在抗炎治疗减少泛化的骨质疏松症的证据。[7-9]由于其在评估早期RA中的炎性骨累及中的灵敏性，已推荐定量手骨测量。[10] 然而，仅少数研究已检查抗炎治疗(包括抗TNF疗法)对RA中的手骨丢失的作用。[9，11， 12]在采用定量超声(QUS)的一项研究中，抗TNF疗法的使用对关节周围的骨具有正面作用。[11]然而，仅执行了一个随机化对照试验，其中与安慰剂相比较泼尼松龙(每日7. 5mg) 的抗炎作用显示不仅显著减小放射照相的关节伤害的速率，还显著减小手骨丢失的速率。 [12]然而，除其抗炎作用外，泼尼松龙还已知引起骨质疏松症。[12]同样，仍需要用于治疗骨丢失特别是手骨丢失的治疗剂。发明概述本发明提供了用于治疗受试者中的骨丢失例如减少和/或预防骨丢失的方法，其包括给受试者施用TNFa抑制剂，例如抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，治疗受试者手中的骨丢失。在一个实施方案中，治疗皮质手骨丢失。在一个实施方案中，受试者具有与骨丢失相关的病症。在一个实施方案中，受试者具有骨质疏松症。在一个实施方案中，受试者具有骨关节炎。在另外一个实施方案中，受试者具有类风湿性关节炎(RA)。在一个实施方案中，受试者具有骨质疏松症和RA。在本发明的一个实施方案中，TNFCI抑制剂与另外试剂组合施用。在一个实施方案中，TNFa抑制剂与氨甲蝶呤组合施用。在另一个实施方案中，TNF α抑制剂与抗再吸收试剂(antiresorptive agent)组合施用，所述抗再吸收试剂例如阿仑特罗、阿仑特罗加上维生素D3、伊本膦酸钠、利塞膦酸钠、含钙的利塞膦酸钠、唑来膦酸、降钙素、雌激素和雷洛昔芬。在另外一个实施方案中，TNF α抑制剂与骨形成试剂组合施用，所述骨形成试剂例如甲状旁腺激素例如特立帕肽。在一个实施方案中，施用TNFa抑制剂用于治疗骨丢失的受试者可以就具有骨丢失和/或处于具有骨丢失危险中进行选择。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者中的手骨丢失的方法，其包括选择具有手骨丢失或处于具有手骨丢失危险中的受试者，并且给受试者施用TNFa抑制剂，从而治疗手骨丢失。在另一个实施方案中，本发明的方法对先前选择为具有骨丢失或处于具有骨丢失危险中的受试者执行。本发明还提供了用于预测骨丢失包括但不限于手骨丢失的方法。本发明提供了可以用于预测受试者中的骨丢失例如手骨丢失的指标。例如，受试者的年龄和/或CRP水平可以用于预测受试者中的手骨丢失。在本发明的一个实施方案中，TNFa抑制剂是TNF α抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，TNFa抗体或其抗原结合部分是人TNF α抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，TNFa抗体或其抗原结合部分是英夫单抗(inliximab)或戈利木单抗 &01加11111￡113)。在一个实施方案中，人1顺(1抗体或其抗原结合部分以IX 10_1或更少的Kd 和IX KT3iT1或更少的Koff速率常数与人TNF α解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外测定中以1 X 10_7M或更少的IC5tl中和人TNF α细胞毒性。在另一个实施方案中，人TNFa抗体或其抗原结合部分具有下述特征如通过表面等离振子共振测定的，以1 X ΙΟ、—1或更少的K。ff速率常数与人TNF α解离；具有轻链⑶R3结构域， 其包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO :3修饰的氨基酸序列；并且具有重链⑶R3结构域，其包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、 5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1-5个保守氨基酸取代由SEQID NO 4修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，人TNF a 抗体或其抗原结合部分包括具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVR)，所述CDR3结构域包括 SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO: 3修饰的氨基酸序列，并且包括具有CDR3结构域的重链可变区(HCVI )，所述CDR3结构域包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO :4修饰的氨基酸序列。在一个实施方案中，人TNFa抗体或其抗原结合部分包括包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，和包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。在一个实施方案中，人TNFa抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗(adalimumab)。在另一个实施方案中，人TNF α抗体或其抗原结合部分是戈利木单抗。附图简述

图1是在本发明分析中检查的具有早期类风湿性关节炎的患者的流程图。与原始研究J相比较丢失X射线数目在括号中提供。MTX=氨甲蝶呤；MR=数字X射线放射照片测量术(radiogrammetry) ；MCI =掌骨皮质指数；BMD =骨量(bone mass)密度。图2显示在研究J的3个治疗组中随着时间过去在DXR-MCI (百分比)和改良的 Sharp得分(单位)中的改变(A =中值，B =平均值)。Mod. Sharp得分=改良的总Siarp 得分；MTX =氨甲蝶呤；D)(R =数字X射线放射照片测量术；MCI =掌骨皮质指数。图3是累积概率图-在研究J中在104周时DXR-MCI和放射照相得分中的改变。 Mod. Sharp得分=改良的总Siarp得分；MTX =氨甲蝶呤；D)(R =数字X射线放射照片测量术;MCI =掌骨皮质指数。
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发明详述I.定义如本文使用的，术语“人TNFa ”(本文缩写为hTNFa，或简单地hTNF)意指作为17kD分泌形式和^kD膜结合形式存在的人细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的17kD分子的三聚体组成。hTNF α的结构在例如Pennica，D.，等人(1984) Nature 312 :724-729 ；Davis, J. Μ.，等人(1987) Biochemistry 26 :1322-1326 ；和 Jones, Ε. Y.，等人(1989)Nature 338 :225-2 中进一步描述。术语人TNFβ意欲包括重组人 TNFa (rhTNF a )，其可以通过标准重组表达法进行制备或进行商业购买(R&D Systems,目录号 210-TA, Minneapolis, Minn.)。TNF α 在本文中也称为 TNF。术语“TNFa抑制剂”包括干扰TNFa活性的试剂。该术语还包括本文描述的抗 TNFa人抗体和抗体部分中的每一种以及美国专利号6，090，382 ；6, 258, 562 ；6，509，015以及美国专利申请系列号09/801，185和10/302，356中描述的那些，所述专利文献各自引入本文作为参考。在一个实施方案中，在本发明中使用的TNFa抑制剂是抗TNFa抗体或其片段，包括英夫单抗(Remicade , Johnson和Johnson ；在引入本文作为参考的美国专利号 5，656，272 中描述)、CDP571 (人源化单克隆抗 TNF α IgG4 抗体)、CDP 870 ( CIMZIA , 人源化单克隆抗TNF α抗体片段)、抗TNF dAb (Peptech)XNTO 148 (戈利木单抗；Medarex 和 Centocor，参见 WO 02/12502)、和阿达木单抗(HUMIRA Abbott Laboratories,人抗TNF mAb，在美国专利号6，090，382中描述为D2E7)。可以在本发明中使用的另外TNF抗体在美国专利号6，593，458 ；6, 498, 237 ；6, 451, 983 ；和6，448，380中描述，所述专利各自引入本文作为参考。在另一个实施方案中，TNFa抑制剂是TNF融合蛋白，例如依那西普 (Enbrel ,Amgen ；在引入本文作为参考的WO 91/0；3553和WO 09/406，476中描述)。在另一个实施方案中，TNFa抑制剂是重组TNF结合蛋白(r_TBP_I) (Serono)。如本文使用的，术语“抗体”意指由4条多肽链——通过二硫键互联的2条重(H) 链和2条轻(L)链——组成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域——CHU CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域 CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，由称为构架区 (FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本发明的抗体在美国专利号 6，090，382 ；6, 258，562 ；和6，509,015中进一步详细描述，所述专利各自整体引入本文作为参考。如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简单地“抗体部分”)指保留与抗原(例如，hTNFa )特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab' )2、 Fabc, Fv、单链和单链抗体。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的例子包括 (i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab ‘ )2片段，包括在铰链区由二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段； (iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(ν)由VH或VL结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外， 尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science242 :423-426 ； 和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879-5883))。此种单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包括其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并且生成2个抗原结合部位(参见例如，Holliger等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 ;Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。本发明的抗体部分在美国专利号6，090，382,6, 258，562,6, 509，015中进一步详细描述，所述专利各自整体引入本文作为参考。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的，较大的免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.， 等人(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6 :93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标记，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人 (1994)Mol. Immunol. 31 :1047-1058)。抗体部分例如Fab和F(ab‘ )2片段可以使用常规技术由完整抗体进行制备，例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，如本文描述的，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。如本文使用的，“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基由具有相似侧链的另一个氨基酸残基替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中进行定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、非荷电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β 分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“嵌合抗体”指这样的抗体，其中重和轻链的氨基酸序列各自的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的剩余区段与来自另一个物种的相应序列同源。在一个实施方案中，本发明的特征在于嵌合抗体或抗原结合片段，其中轻和重链的可变区模拟衍生自哺乳动物的一个物种的抗体可变区，而恒定部分与衍生自另一个物种的抗体中的序列同源。在本发明的优选实施方案中，嵌合抗体通过将来自小鼠抗体的 CDRs嫁接到人抗体的构架区上进行制备。“人源化抗体”指包括至少一条这样的链的抗体，所述链包括基本上来自人抗体链 (被称为受体免疫球蛋白或抗体)的可变区构架残基和基本上来自非人抗体(例如，小鼠) 的至少一个互补性决定区(OTR)。除⑶Rs嫁接外，人源化抗体一般经历进一步改变，以改善亲和力和/或免疫原性。术语“多价抗体”指包括超过一个抗原识别位点的抗体。例如，“二价”抗体具有 2个抗原识别位点，而“四价”抗体具有4个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性数目(与抗原识别位点数目不同)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点全部结合相同表位。“双特异性” 或“双重特异性”抗体具有结合第一种表位的至少一个抗原识别位点和结合与第一种表位不同的第二种表位的至少一个抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有全部结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中一些数目结合第一种表位，并且其中一些数目结合与第一种表位不同的第二种表位。如本文使用的，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基 (例如，通过体外随机或位点专一诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDRs 且特别是CDR3中。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不意欲包括这样的抗体，其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上。如本文使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、生成或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 :6287)，或通过任何其他方法制备、表达、生成或分离的抗体，所述其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或， 当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此，重组抗体的VH和VL 区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内人抗体种系谱(repertoire)内不天然存在。此种嵌合、人源化、人和双重特异性抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用下述专利文献中描述的方法PCT国际申请号PCT/US86/02269 ；欧洲专利申请号184，187 ；欧洲专利申请号171，496 ；欧洲专利申请号173，494 ；PCT国际公开号WO 86/01533 ；美国专利号4,816, 567 ；欧洲专利申请号125,023 ；Better等人(1988) Science240 :1041-1043 ；Liu 等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :3439-3443 ；Liu 等人(1987) J. Immunol. 139 :3521-3526 ；Sun 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 214-218 ；Nishimura ^ 人(1987)Cancer Res. 47 :999-1005 ；Wood ^ 人(1985)Nature 314:446-449 ;Shaw 等人(1988)J. Natl. Cancer Inst. 80 :1553-1559) ；Morrison(1985) Science229 :1202-1207 ；Oi 等人(1986)BioTechniques 4 :214 ；美国专利号 5，225，539 ； Jones 等人(1986)Nature 321 :552-525 ;Verhoeyan 等人(1988)kience 239:1534; 和 Beidler 等人(1988) J. Immunol. 141 :4053-4060, Queen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033(1989)，美国专利号 5，530，101，美国专利号 5，585，089，美国专利号 5，693，761，美国专利号 5，693，762，Selick 等人，WO 90/07861，和 Winter，美国专利号 5^ 225，539 ο如本文使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hTNFa的分离的抗体基本上不含特异性结合除hTNF α外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hTNFa的分离的抗体与其他抗原例如来自其他物种的TNFa 分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。
如本文使用的，“中和抗体”(或“中和hTNFa活性的抗体”)意指其与hTNFa的结合导致hTNFa的生物活性抑制的抗体。hTNFa的生物活性的这种抑制可以通过测量 hTNFa生物活性的一种或多种指示物进行评估，例如hTNF α诱导的细胞毒性(在体外或在体内)、hTNFa诱导的细胞活化和hTNFa与hTNF α受体的结合。hTNFa生物活性的这些指示物可以通过本领域已知的几种标准体外或体内测定中的一种或多种进行评估(参见，美国专利号6，090，382)。优选地，抗体中和hTNF α活性的能力通过抑制hTNF α诱导的
细胞的细胞毒性进行评估。作为hTNFa活性的另外或可替代参数，可以评估抗体抑制 hTNF α诱导的在HUVEC上的ELAM-1表达的能力，作为hTNF α诱导的细胞活化的量度。如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度中的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统 (Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典禾口 Piscataway,N. J.)。关于进一步描述，参见美国专利号 6，258，562 的实施例 1 和Jijnsson等人(1993)Ann. Biol. Clin. 51 :19 ；JonSSOn 等人(1991)Biotechniques 11 :620-627 Johnsson 等人(1995) J. Mol. Recognit. 8 :125 ； 和 Johnnson 等人(1991)Anal. Biochem. 198 :268。如本文使用的，术语“KofT”意指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。如本文使用的，术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。如本文使用的，术语“IC50”意指抑制目的生物终点例如中和细胞毒性活性所需的抑制剂浓度。如本文使用的，术语“剂量”指施用于受试者的TNFa抑制剂的量。如本文使用的，术语“给药”指施用物质(例如，抗TNFa抗体)以达到治疗目的 (例如，治疗骨丢失)。“给药方案”描述用于TNF α抑制剂的治疗时间表，例如在延长的时间段期间和/ 或治疗过程自始至终的治疗时间表，例如在第O周时施用TNF α抑制剂的第一剂，随后为在每两周一次给药方案上的TNFa抑制剂的第二剂。在一个实施方案中，给药方案包括每月一次或每4周一次施用TNF α抑制剂，例如人TNF α抗体或其抗原结合部分。如本文使用的，术语“每两周一次给药方案”、“每两周一次给药”和“每两周一次施用”指给受试者施用物质(例如，抗TNFa抗体)以达到治疗目的的时间过程(time course)，例如治疗过程自始至终。每两周一次给药方案不意欲包括每周一次给药方案。可以例如每9-19天、更优选每11-17天、更加优选每13-15天、并且最优选每14天施用物质。 在一个实施方案中，每两周一次给药方案在治疗第O周时在受试者中起始。在另一个实施方案中，维持剂量在每两周一次给药方案上施用。在一个实施方案中，起始和维持剂量根据每两周一次给药方案施用。在一个实施方案中，每两周一次给药包括这样的给药方案，其中在第O周时开始将TNFa抑制剂的剂量每隔一周施用于受试者。在一个实施方案中，每两周一次给药包括这样的给药方案，其中对于给定时间段连续每隔一周将TNFa抑制剂的剂量施用于受试者，例如4周、8周、16周、24周、26周、32周、36周、42周、48周、52周、56周等。每两周一次给药方法也在引入本文作为参考的US 20030235585中描述。如在短语“与第二种试剂组合的第一种试剂”中的术语“组合”包括第一种试剂和第二种试剂的共施用，其例如可以在相同药学上可接受的载体中溶解或混合，或施用第一种试剂，随后为第二种试剂，或施用第二种试剂，随后为第一种试剂。因此，本发明包括组合治疗性治疗的方法和组合药物组合物。如在短语“伴随治疗方案”中的术语“伴随”包括在第二种试剂的存在下施用试剂。伴随治疗性治疗方法包括其中共施用第一种、第二种、第三种或另外试剂的方法。伴随治疗性治疗方法还包括其中第一种或另外试剂在第二种或另外试剂的存在下施用的方法， 其中第二种或另外试剂例如可以先前已施用。伴随治疗性治疗方法可以通过不同行动者 (actor)逐步执行。例如，一个行动者可以给受试者施用第一种试剂，并且第二个行动者可以给受试者施用第二种试剂，并且施用步骤可以同时、或几乎同时或在远隔的时间执行，只要第一种试剂(和另外试剂)在第二种试剂(和另外试剂)的存在下后施用。行动者和受试者可以是相同实体(例如，人)。如本文使用的，术语“联合治疗”指施用2种或更多种治疗物质，例如抗TNFa抗体和另一种药物。一种或多种其他药物可以在抗TNF α抗体的施用同时、之前或之后施用。如在本发明的背景中使用的，术语“治疗”意欲包括用于治疗骨丢失例如手骨丢失例如皮质手骨丢失的治疗性治疗，以及预防或抑制措施。例如，术语治疗可以包括在骨丢失例如手骨丢失发作前或后施用TNFa抑制剂，从而预防或去除疾病或病症的症征。作为另一个例子，在骨丢失的临床表现后施用TNFa抑制剂以对抗与骨丢失相关的症状和/或并发症和病症构成疾病的“治疗”。此外，在发作后和在临床症状和/或并发症已发展后施用试剂构成骨丢失的“治疗”，其中施用影响疾病或病症的临床参数和可能疾病的改善。在一个实施方案中，治疗受试者中的骨丢失包括减少病征和症状。“需要治疗的”那些包括已具有骨丢失的哺乳动物例如人，包括其中待预防疾病或病症的那些。总的来说，本发明提供了关于用TNFa抑制剂如人TNFa抗体或其抗原结合部分治疗骨丢失例如手骨丢失例如皮质手骨丢失的改进的用途和组合物。涉及用于治疗骨丢失的方法和用途的组合物和制造物品包括试剂盒也预期作为本发明的部分。本发明的各个方面在本文中进一步详细描述。II.用于治疗骨丢失的用途和组合物本发明提供了通过给有此需要的受试者施用TNF α抑制剂例如TNF α抗体或其抗原结合部分，治疗骨丢失包括手骨丢失的方法。在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗具有与另一种病症相关的骨丢失的受试者，所述另一种病症包括例如类风湿性关节炎、骨关节炎和/或骨质疏松症。可以受益于本发明的方法的受试者包括已诊断有骨丢失 (或与骨丢失相关的病症)的那些受试者，以及鉴定为处于关于骨丢失危险中的受试者(包括诊断有与骨丢失相关的病症的受试者)。在一个实施方案中，本发明的方对于治疗手的骨丢失有用。在一个实施方案中，将TNF α抑制剂例如TNFa抗体或其抗原结合部分施用于具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)的受试者，从而阻止骨丢失的进展，或相当于无治疗的骨丢失减慢骨丢失的进展。因此，本发明的方法可以用于减少受试者中的骨丢失，以及预防进一步的骨丢失。本发明的一个方面涉及出乎意料的发现TNFci抑制剂例如人TNFa抗体或其抗原结合部分可以用于治疗手骨丢失。在这个发现之前，使用嵌合TNF α抗体英夫单抗的研究显示，即使治疗的受试者的髋和脊柱中的骨丢失被阻止，但手骨丢失不停止。[9]因此，在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗手骨丢失，包括与RA、骨关节炎和骨质疏松症相关的手骨丢失。本发明的方法和组合物可以用于治疗具有手骨丢失或可能发展手骨丢失的受试者中的手骨丢失。在一个实施方案中，本发明的方法对于治疗皮质骨丢失有用。与骨小梁或松质骨形成对比，骨皮质或骨密质是致密的且形成骨的表面，促成人骨骼的80%重量。它是极硬的，由具有很少空隙的多个堆积层形成。它的主要功能是支持身体，保护器官，提供用于运动的杠杆，和(与松质骨共同分担)贮存矿物质。如本文描述的，下文提供的实施例的一个发现是TNFa抑制剂可以用于治疗皮质骨丢失。在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗手的皮质骨丢失。骨丢失例如皮质骨丢失或手骨丢失例如皮质手骨丢失的治疗可以使用本领域已知的方法进行评估，包括但不限于，数字X射线放射照片测量术(DXR) (Sectra, Linkiiping,瑞典)。MR测量在相同数字化的手上的骨矿物质密度(bmd)和掌骨皮质指数 (MCI)，用于评估放射照相的关节伤害。D)(R是传统放射照片测量技术的计算机形式。在手放射照片上，计算机自动识别在第二、第三和第四掌骨的最狭窄部分周围的目标区(ROI)， 并且测量皮质厚度、骨宽度和孔隙率118次/cm。DXR-BMD定义为c X VPAcomb X(l-p), 其中c是常数(通过平均起来DXR-BMD等于Hologic QDR-2000设备的中-远侧前臂区的结果决定)；VPA是体积/面积；并且ρ是孔隙率。DXR-MCI定义为组合皮质厚度除以外部皮质直径，并且是不依赖于骨大小、骨长度和图像捕获设置的相对骨量度。通过其可以测定骨丢失的其他方法的例子在 Haugeberg(2008)Best Pract Res Clin Rheumatol 22(6) 1127-39中描述。在一个实施方案中，本发明提供了改善具有骨丢失的受试者的DXR-MCI和/或 DXR-BMD得分的方法，其包括给有此需要的受试者施用TNF α抑制剂，例如TNFa抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善是在用TNFa抑制剂治疗前受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分的维持。DXR-MCI和/或 DXR-BMD得分的此种维持指示骨丢失不是进行性的。可替代地，在一个实施方案中，就骨丢失进行治疗的受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善可以通过DXR-MCI和/或 DXR-BMD得分丧失降低的速率进行测量。受试者的DXR-MCI和/或DXR-BMD得分中的改善可以相对于在治疗前测定的起始基线得分进行测量。例如，在TNFa抑制剂治疗约沈周或约13次TNFa抑制剂治疗后，受试者可以具有DXR-MCI得分中1.4或更少的减少(例如，相对于基线得分—I. 4,-1. 3,-1. 2,-1. 1.、-1. 0,-0. 9,-0. 8,-0. 7,-0. 6,-0. 5,-0. 4,-0. 3,-0. 2 、-0. 1或0.0)。在另一个例子中，相对于基线得分，受试者的DXR-MCI得分中小于0.44(例如，-0· 43、_0· 42、_0· 41、-0· 40、_0· 39、_0· 38、_0· 37、_0· 36、_0· 35、_0· 34、_0· 33、_0· 32、_0 .31、-0. 30、-0. 29、-0. 28、-0. 27,-0. 26,-0. 25,-0. 24,-0. 23,-0. 22、_0. 21、_0. 20,-0. 19、_0 18,-0. 17,-0. 16,-0. 15,-0. 14,-0. 13,-0. 12,-0. 11,-0. 10,-0. 09,-0. 08,-0. 07,-0. 06,-0. 05、 -0. 04、-0. 03、-0. 02、-0. 01)的减少指示受试者中骨丢失的治疗。在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者中的骨丢失的方法，其包括在每两周一次给药方案上在第0周时给受试者施用人TNF α抗体或其抗原结合部分，例如人TNF a 抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，根据每两周一次给药方案，给具有骨丢失(或处于具有骨丢失危险中)的受试者皮下施用人TNFa抗体或其抗原结合部分。可替代地，根据每月一次给药方案，或由此抗体或其抗原结合部分每4周施用一次的给药方案，给具有骨丢失(或处于具有骨丢失危险中)的受试者施用人TNFa抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，通过在每两周一次给药方案上施用人TNFa抗体或其抗原结合部分治疗骨丢失，进行至少约2周、至少约6周、至少约12周、至少约16周、至少约18周、 至少约20周、至少约22周、至少约M周、至少约30周、至少约36周、至少约52周至少约 72周、至少约96周、至少约104周等。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如23周、60周、64周等。在一个实施方案中，TNFa抑制剂例如抗体或其抗原结合部分也可以施用于受试者用于治疗骨丢失，进行以月限定的时间段，例如3个月、6个月、12个月、18个月、M个月、 30个月、36个月、42个月、48个月、M个月、60个月等。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如38个月、50个月、52个月。在一个实施方案中，TNFa抑制剂例如抗体或其抗原结合部分也可以施用于受试者用于治疗骨丢失，进行以年限定的时间段，例如1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年等。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如1. 5年、2. 2年、3. 5年。在本发明的方法中使用的TNFa抑制剂也可以根据本领域已知的给药决定进行施用。例如，在一个实施方案中，根据基于重量的给药方案，即mg/kg，将TNFa抑制剂施用于受试者用于治疗骨丢失，由此TNF α抑制剂的量由受试者的重量决定。可替代地，TNFa 抑制剂可以根据固定剂量或总全身剂量进行施用，由此对于每次施用递送恒定固定量的 TNFa抑制剂。在一个实施方案中，人TNFa抗体或其抗原结合部分以IO-IOOmg的固定剂量施用于受试者。在一个实施方案中，人TNF α抗体或其抗原结合部分以40mg、50mg、60mg、 70mg、80mg、90mg、100mg等的固定剂量施用于受试者。任何上述值之间的值范围也预期包括在本发明的范围内，例如85mg、95mg，基于上述剂量的范围也一样，例如20_80mg。在一个实施方案中，TNFa抑制剂的施用是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，TNFa抑制剂通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个实施方案中，TNFa抑制剂通过肌内注射或通过皮下注射(例如，每两周一次，皮下注射)进行施用。在一个实施方案中，人TNFa抗体或其抗原结合部分根据肺技术施用于受试者。考虑到本文的教导，本文描述的给药方案可以进行调整，以提供最佳所需应答，例如治疗骨丢失。应当指出剂量值可以随着骨丢失的类型和严重程度而改变。应进一步理解对于任何具体受试者，根据规格的教导和个体需要以及施用组合物或监督组合物施用的个人的职业判断，随着时间过去可以调整特定给药方案，并且本文所述的剂量的量和范围仅是示例性的，并且不意欲限制请求保护的本发明的范围或实践。在一个实施方案中，本发明的方法包括选择具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)或处于具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)危险中的受试者。在另一个实施方案中， 本发明的方法包括给受试者施用TNFa抑制剂，所述受试者先前选择为具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)或选择为处于具有骨丢失(或与骨丢失相关的病症)危险中。在一个实施方案中，手骨丢失的预测值(predictor)在本文描述的实施例中描述，并且包括年龄和/或CRP水平。本发明的方法和组合物可以用于治疗与另一种病症相关的骨丢失。在一个实施方案中，TNFa抑制剂用于减少具有与骨丢失相关的病症的受试者中的骨丢失，例如手骨丢
13失。本文描述的方法可以用于预防具有与骨丢失相关的病症或处于具有与骨丢失相关的病症危险中的受试者中的骨丢失也在本发明的范围内。关于与骨丢失相关的病症的另外细节在下文描述。类风湿性关节炎肿瘤坏死因子(TNF)是类风湿性关节炎(RA)的发病机理中的关键细胞因子。 TNFa已牵涉于激活组织炎症且引起类风湿性关节炎中的关节破坏(参见例如，Moeller， Α.，等人(1990) Cytokine 2 :162-169 ；授予 Moeller 等人的美国专利号 5，231，024 ； Moeller, A.的欧洲专利公开号 260610 Bl ；Tracey 和 Cerami,同上；Arend, W. P.和 Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38 :151-160 ；Fava, R. Α.,等人(1993) Clin. Exp. Immunol. 94 261-266)。除关节破坏外，具有RA的受试者还具有局部和全身骨丢失。近年来，抑制TNF活性的生物应答调节物已变成用于RA的确定的疗法。阿达木单抗、依那西普和英夫单抗已证实在RA患者中的疾病控制以及放射照相的伤害的延迟和预防中的显著改善(Breedveld 等人，Arthritis Rheum 2006 ；54 26-37 ；Genovese 等人 J Rheumatol 2005 ；32 :1232-42 ；Keystone φ A, Arthritis Rheum 2004 ；50 :1400-11 ； Navarro-Sarabia 等人’ Cochrane Database Syst Rev 2005 Jul. 20 ； (3) :CD005113 ； Smolen 等人，Arthritis Rheum 2006 ;54 :702-10 ;St. Clair 等人 Arthritis Rheum 2004 ； 50 :3432-43 ；van der Heijde 等人，ArthritisRheum 2006 ；54 :1063-74)。就抗TNF疗法对具有类风湿性关节炎(RA)的受试者中的手骨丢失的作用而言，仅进行了少数研究。一个开放群组(open-cohort)研究考察在接受英夫单抗的RA患者中的手BMD改变。在这个群组中，关键发现是即使髋和脊柱中的骨丢失被阻止，但手骨丢失不停止。[9]。因此，尽管用TNFa抑制剂英夫单抗的治疗阻止具有RA的受试者中的全身骨丢失，但英夫单抗未能阻止手中的骨丢失。本发明提供了令人惊讶的发现TNF α抑制剂例如人TNFa抗体可以用于治疗具有RA的受试者中的骨丢失，包括手骨丢失。TNFa抑制剂可以用于治疗处于具有骨丢失危险中的受试者中的骨丢失也在本发明的范围内，所述受试者包括例如诊断有RA的受试者。在一个实施方案中，处于发展骨丢失危险中的受试者是具有早期RA或诊断有RA小于3年的受试者。在一个实施方案中，骨丢失的治疗通过给具有类风湿性关节炎的受试者施用人 TNFa抗体或其抗原结合部分来达到，其中人TNFa抗体或其抗原结合部分在每两周一次给药方案上施用。在一个实施方案中，人TNF α抗体或其抗原结合部分以约IO-IOOmg的剂量施用，包括但不限于，约40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或IOOmg的剂量。在一个实施方案中，人TNFa抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗或戈利木单抗。令人惊讶的是，如本文所示，已发现人TNF α抗体或其抗原结合部分减少具有类风湿性关节炎(RA)的受试者中的骨丢失，例如皮质骨丢失，例如手的皮质骨丢失，这不依赖于其对临床评估的疾病活动性的作用。同样，TNFa抑制剂疗法的利益可以在具有RA的受试者中获得，所述受试者不显示临床改善，因为骨丢失可以不依赖于临床参数进行治疗。骨质疏松症本发明的方法可以用于治疗具有骨质疏松症或处于具有骨质疏松症危险中的受试者中的骨丢失，例如手骨丢失。骨质疏松症是特征在于低骨量和骨组织的结构退化的疾病。骨质疏松症可以导致骨脆性和对骨折的易感性增加，特别是髋、脊柱和腕，尽管任何骨都可以受影响。骨质疏松症的例子包括但不限于，特发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症和髋关节一过性骨质疏松症(transient osteoporosis of the hip)。骨量减少是其中骨矿物质密度低于正常的状况，并且也可以根据本发明的方法进行治疗。骨量减少通常被视为骨质疏松症的前身。同样，TNFa抑制剂可以用于减少或预防具有骨量减少的受试者中的骨丢失，包括手骨丢失。骨质疏松症和骨量减少不仅可以起因于衰老和生殖状态，还可以继发于众多疾病和病症，以及由于众多药物的延长使用，例如抗惊厥剂(例如，用于癫痫)、皮质类固醇(例如，用于类风湿性关节炎和哮喘)和/或免疫抑制剂(例如，用于癌症)。例如，糖皮质激素诱导的骨质疏松症是通过服用糖皮质激素药物引起的骨质疏松症形式，所述糖皮质激素药物例如泼尼松(强的松、Orasone等)、泼尼松龙O^relone)、地塞米松(氟美松、甲氟烯索) 和可的松(Cortone Acetate)。这些药物经常用于帮助控制许多风湿性疾病，包括类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎性肠病和风湿性多肌痛。其中骨质疏松症可以是继发性的其他疾病包括但不限于，青少年类风湿性关节炎、糖尿病、成骨作用不全、甲状腺功能亢进、甲状旁腺机能亢进、Cushing氏综合征、吸收不良综合征、神经性厌食和/或肾脏疾病。此外，众多行为已与骨质疏松症相关，例如长时间不活动或不动、营养不足(特别是钙，维生素D)、 导致闭经(不存在月经期)的锻炼过度、吸烟和/或酗酒。值得注意的是，具有风湿性病学病症如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、全身性红斑狼疮和多关节青少年特发性关节炎的患者处于骨质疏松症增加的危险中，作为其疾病的部分或由于其他危险因素(特别是皮质类固醇疗法)。同样，在一个实施方案中，本发明的方法可以用于治疗具有类风湿性关节炎的受试者中的骨质疏松症。骨关节炎本发明的方法可以用于治疗具有骨关节炎或处于具有骨关节炎危险中的受试者中的骨丢失，例如手骨丢失。肿瘤坏死因子已牵涉于骨关节炎的病理生理学(Verm等人 (1993) Arthritis Rheum. 36 :819 ；Westacott 等人(1994) J Rheumatol. 21 :1710)。骨关节炎(OA)也被称为肥大性骨关节炎、骨关节病和退行性关节病。OA是骨骼关节的慢性退行性疾病，其影响所有年龄成年人中的特定关节，通常是膝、髋、手关节和脊柱。OA的特征在于许多下述表现包括关节软骨的退化和变薄伴随“溃疡”或缺损(craters)的相关发展、骨赘形成、在边缘处的骨肥大、以及滑膜中的改变和受累关节的膨大。此外，骨关节炎伴随疼痛和僵硬，特别是在长时间活动后。本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗骨关节炎。 骨关节炎的特征性放射照相的特征包括关节间隙变窄、软骨下硬化、骨赘病、软骨下囊肿形成、骨游离体(loose osseous body)(或“关节鼠”)。用于治疗骨关节炎的药物包括多种非类固醇消炎药(NSAIDs)。此外，COX 2抑制剂包括西乐葆、洛芬昔布和伐地考昔(Bextra)以及依托考昔(Etoricoxib)也用于治疗0A。 可以直接注射到关节内的类固醇也可以用于减少炎症和疼痛。在本发明的一个实施方案中，本发明的TNF α抗体与NSAID、C0X2抑制剂和/或类固醇组合施用。与骨丢失相关的其他病症在另一个实施方案中，可以治疗在具有与骨丢失相关的病症或处于具有与骨丢失相关的病症危险中的受试者中的骨丢失，即其中存在骨密度进行性丢失和骨组织变薄的病症。此种状况包括但不限于侵蚀性关节炎、骨恶性肿瘤、骨软化、甲状旁腺机能亢进的骨骼变化、慢性肾衰竭(肾性骨营养不良症)、畸形性骨炎(骨的I^get氏病)和溶骨性转移。在一个实施方案中，本发明的方法用于治疗具有TNFa相关病症的受试者(参见例如， US20040126372和US6，090, 382中描述的病症，所述专利文献各自的内容特别引入本文作为参考)。在一个实施方案中，施用TNFa抑制剂用于治疗骨丢失的受试者可以就具有骨丢失和/或处于具有骨丢失危险中进行选择。例如，绝经后的受试者可能处于发展骨丢失危险中。在另一个例子中，诊断有骨关节炎的受试者可能具有骨丢失，包括手骨丢失，并且因此，可以受益于本发明的方法。因此，在一个实施方案中，本发明包括鉴定可能受益于本发明的方法的受试者，即骨丢失例如手骨丢失的治疗，并且随后给受试者施用TNFa抑制剂用于治疗。在一个实施方案中，本发明还提供了用于治疗受试者中的手骨丢失的方法，其包括选择具有手骨丢失或处于具有手骨丢失危险中的受试者，并且给受试者施用TNFa抑制剂，从而使得手骨丢失得到治疗。可替代地，本发明的方法可以对先前选择为具有骨丢失或处于具有骨丢失危险中的受试者执行，所述骨丢失包括手骨丢失。III. TNF 抑制剂在本发明的方法和组合物中使用的TNF α抑制剂包括干扰TNF α活性的任何试剂。在优选实施方案中，TNFa抑制剂可以中和TNFa活性，特别是有害的TNF α活性。在一个实施方案中，在本发明中使用的TNFa抑制剂是TNF α抗体(在本文中也称为TNFa抗体)或其抗原结合片段，包括嵌合、人源化和人抗体。可以在本发明中使用的 TNFa抗体的例子包括但不限于，英夫单抗(Remicade ，Johnson和Johnson ；在引入本文作为参考的美国专利号5，656，272中描述)、CDP571 (人源化单克隆抗TNF α IgG4抗体)、 CDP 870(人源化单克隆抗TNF α抗体片段)、抗TNF dAb (Peptech)XNTO 148(戈利木单抗； Medarex和Centocor，参见引入本文作为参考的WO 02/12502和US 7,250，165)、和阿达木单抗(HUMIRA AbbottLaboratories,人抗 TNF mAb，在美国专利号 6，090，382 中描述为D2E7)。可以在本发明中使用的另外TNF抗体(及其序列)在美国专利号6，593，458 ； 6，498，237 ；6，451，983 ；7, 250，165 ；和6，448，380中描述，所述专利各自特别引入本文作为参考。可以在本发明的方法和组合物中使用的TNFa抑制剂的其他例子包括依那西普 (Enbrel，在WO 91/0；3553和WO 09/406，476中描述)、可溶性TNF受体I型、加入聚乙二醇的可溶性TNF受体I型(PEGsTNF-Rl)、p55TNFRlgG (来那西普(Lenerc^pt))和重组TNF结合蛋白(r-TBP-I) (Serono)。在一个实施方案中，术语“ TNF α抑制剂”排除英夫单抗。在一个实施方案中，术语 "TNFa抑制剂”排除阿达木单抗。在另一个实施方案中，术语“TNF α抑制剂”排除阿达木单抗和英夫单抗。在一个实施方案中，术语“TNF α抑制剂”排除依那西普，和任选地阿达木单抗、英夫单抗、以及阿达木单抗和英夫单抗。在一个实施方案中，术语“TNFa抗体”排除英夫单抗。在一个实施方案中，术语 "TNF^抗体”排除阿达木单抗。在另一个实施方案中，术语“TNF α抗体”排除阿达木单抗和英夫单抗。在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或测定TNFa抑制剂用于治疗骨丢失的功效的用途和组合物，其中TNFa抗体是分离的人抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力和低解离速率与人TNF α结合，并且还具有高中和能力。优选地，在本发明中使用的人抗体是重组、中和人抗hTNF α抗体。本发明最优选的重组、中和抗体在本文中被称为D2E7，也称为HUMIRA 或阿达木单抗(D2E7 VL区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO=I 中；D2E7 VH区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO :2中)。D2E7 (阿达木单抗/ HUMIRA )的性质已在Salfeld等人，美国专利号6，090，382,6, 258，562和6，509，015中描述，所述专利各自引入本文作为参考。本发明的方法还可以使用嵌合和人源化鼠类抗hTNFa抗体执行，所述抗体已经历用于治疗类风湿性关节炎的临床测试(参见例如，Elliott, Μ. J.， 等人(1994)Lancet 344 :1125-1127 ；Elliot, Μ. J.，等人(1994)Lancet 344 :1105-1110 ； Rankin, Ε. C.，等人(1995)Br. J. Rheumatol. 34 :334-342)。在一个实施方案中，本发明的方法包括测定D2E7抗体和抗体部分、D2E7相关抗体和抗体部分、或具有与D2E7等价性质的其他人抗体和抗体部分用于治疗骨丢失的功效，所述性质例如与hTNFa的高亲和力结合伴随低解离动力学和高中和能力。在一个实施方案中，本发明提供了用分离的人抗体或其抗原结合部分的治疗，其以IX 10-8M或更少的Kd和 1乂10-38-1或更少的1(#€速率常数与人1顺(1解离，两者都通过表面等离振子共振进行测定，并且在标准体外测定中以1 X 10-7M或更少的IC50中和人TNF α细胞毒性。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分以5 X 10-4S-1或更少的KofT与人TNF α解离，或甚至更加优选地，以1 X 10-4s-l或更少的Koff。更优选地，分离的人抗体或其抗原结合部分在标准体外测定中以1 X 10-8M或更少的IC50中和人TNF α细胞毒性，甚至更加优选以1Χ10-9Μ或更少的IC50，和更加优选以1 Χ10-10Μ或更少的IC50。在优选实施方案中， 抗体是分离的人重组抗体或其抗原结合部分。本领域众所周知的是抗体重和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/ 亲和力中起重要作用。因此，在另一个方面，本发明涉及通过施用人抗体治疗骨丢失，所述人抗体对于与hTNFa结合具有缓慢的解离动力学，并且具有在结构上与D2E7的那些等同或相关的轻和重链⑶R3结构域。D2E7 VL⑶R3的位置9可以由Ala或Thr占据，而基本上不影响Koff。因此，关于D2E7 VL⑶R3的共有基序包括氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/ A) (SEQ ID NO :3)。此外，D2E7 VH CDR3的位置12可以由Tyr或Asn占据，而基本上不影响 Koff0因此，关于D2E7 VH CDR3的共有基序包括氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L_D-(Y/ N) (SEQ ID NO 4)。此外，如美国专利号6，090，382的实施例2中证实的，D2E7重和轻链的 ⑶R3结构域适合于由单个丙氨酸残基的取代(在VL⑶R3内的位置1、4、5、7或8上，或在 VH CDR3内的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上)，而基本上不影响Koff。再进一步地，技术人员将认识到，给定D2E7 VL和VH CDR3对由丙氨酸取代的适应性，在CDR3结构域内的其他氨基酸取代可以是可能的，同时仍保留抗体的低解离速率常数，特别是用保守氨基酸取代。 优选地，在D2E7 VL和/或VH⑶R3结构域内进行不超过1_5个保守氨基酸取代。更优选地，在D2E7 VL和/或VH⑶R3结构域内进行不超过1_3个保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代不应在对于与hTNF α结合关键的氨基酸位置上进行。D2E7 VL⑶R3的位置2和 5以及D2E7 VHCDR3的位置1和7看起来对于与hTNF α相互作用是关键的，并且因此，保守氨基酸取代优选不在这些位置上进行(尽管如上所述在D2E7 VIXDR3的位置5上的丙氨酸取代是可接受的)(参见美国专利号6，090, 382)。
因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选包含下述特征a)如通过表面等离振子共振测定的，以IX 10-3s-l或更少的Koff速率常数与人 TNF α解离；b)具有轻链⑶R3结构域，其包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、
5、7或8上的单个丙氨酸取代，或通过在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO 3修饰的氨基酸序列；c)具有重链⑶R3结构域，其包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、 4、5、6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代，或通过在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12 上的1-5个保守氨基酸取代由SEQ ID NO 4修饰的氨基酸序列。更优选地，抗体或其抗原结合部分以5X 10-4S-1或更少的Koff与人TNF α解离。 甚至更加优选地，抗体或其抗原结合部分以1\10-48-1或更少的1(0 与人1顺(1解离。在另外一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选包含具有CDR3结构域的轻链可变区(LCVI )，所述⑶R3结构域包括SEQ IDNO 3的氨基酸序列，或通过在位置1、4、5、7 或8上的单个丙氨酸取代由SEQ ID NO 3修饰的氨基酸序列，以及具有⑶R3结构域的重链可变区(HCVI )，所述⑶R3结构域包括SEQ ID NO :4的氨基酸序列，或通过在位置2、3、4、5、
6、8、9、10或11上的单个丙氨酸取代由SEQID NO :4修饰的氨基酸序列。优选地，LCVR进一步具有包括SEQ ID NO 5的氨基酸序列的⑶R2结构域(S卩，D2E7 VL⑶R2)，并且HCVR 进一步具有包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的⑶R2结构域(即，D2E7 VH⑶R2)。甚至更加优选地，LCVR进一步具有包括SEQ ID NO 7的氨基酸序列的⑶Rl结构域(即，D2E7 VL CDR1)，并且HCVR具有包括SEQ ID NO :8的氨基酸序列的⑶Rl结构域(即，D2E7 VH CDR1)。 关于VL的构架区优选来自V κ I人种系家族，更优选来自Α20人种系Vk基因，并且最优选来自美国专利号6，090，382的图IA和IB中所示的D2E7 VL构架序列。关于VH的构架区优选来自VH3人种系家族，更优选来自DP-31人种系VH基因，并且最优选来自美国专利号 6，090, 382的图2Α和2Β中所示的D2E7 VH构架序列。因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选包含轻链可变区(LCVR) 和重链可变区(HCVI )，所述LCVR包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列(S卩，D2E7 VUJy^iHCVR 包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列(S卩，D2E7 VH)。在特定实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgGl 重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。在另外其他的实施方案中，本发明包括包含D2E7相关VL和VHCDR3结构域的分离的人抗体或其抗原结合部分的用途。例如，抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR) 或重链可变区(HCVR)，所述LCVR具有包括选自下述的氨基酸序列的⑶R3结构域SEQ ID NO :3,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO :14,SEQ ID NO :15,SEQ ID NO :16,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO :18,SEQ ID NO :19,SEQ ID NO :20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25 禾口 SEQ ID NO :26，所述 HCVR 具有包括选自下述的氨基酸序列的CDR3结构域SEQID NO :4、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、 SEQ ID NO29,SEQ IDNO30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32,SEQ ID NO33,SEQ IDNO 34和 SEQ ID NO :35ο在本发明的方法和组合物中使用的TNFa抗体可以进行修饰用于骨丢失的改善治疗。在一些实施方案中，TNFa抗体或其抗原结合片段进行化学修饰以提供所需作用。 例如，本发明的抗体和抗体片段的加入聚乙二醇可以通过本领域已知的任何加入聚乙二醇反应进行，如例如在下述参考文献中描述的Focus on Growth Factors 3:4-10(1992)； EP 01M316;和EP 0401384(所述文献各自整体引入本文作为参考)。优选地，加入聚乙二醇经由与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应执行。用于本发明抗体和抗体片段的加入聚乙二醇的优选水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG)。如本文使用的，“聚乙二醇”意欲包括已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(Cl-ClO)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。用于制备本发明加入聚乙二醇的抗体和抗体片段的方法一般将包括步骤(a)在由此抗体或抗体片段变得与一个或多个PEG基团附着的条件下，使抗体或抗体片段与聚乙二醇例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应，和(b)获得反应产物。基于已知参数和所需结果选择最佳反应条件或酰化反应，对于本领域普通技术人员将是显而易见的。通过施用本文描述的TNFa抗体和抗体片段，加入聚乙二醇的抗体和抗体片段一般可以用于离析(educe)或预防骨丢失。一般地，与非加入聚乙二醇的抗体和抗体片段相比较，加入聚乙二醇的抗体和抗体片段具有增加的半衰期。加入聚乙二醇的抗体和抗体片段可以单独、一起或与其他药物组合物组合采用。在本发明的另外一个实施方案中，可以改变TNFa抗体或其片段，其中修饰抗体的恒定区，以相对于未经修饰的抗体，减少至少一种恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰本发明的抗体从而使得它显示出与Fc受体减少的结合，抗体的免疫球蛋白恒定区区段可以在对于Fc受体(FcR)相互作用所需的特定区域上进行突变(参见例如，Canfield, S. M.禾口 S. L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173 1483-1491 ；禾口 Lund, J.等人(1991) J. of Immunol. 147 :2657-2662) 抗体的FcR结合能力中的减少也可以减少依赖于FcR相互作用的其他效应子功能，例如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。在本发明的方法中使用的抗体或抗体部分可以与另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白质)衍生或连接。因此，本发明的抗体和抗体部分预期包括衍生和以其他方式修饰形式的本文描述的人抗hTNF α抗体，包括免疫粘附分子。例如，本发明的抗体或抗体部分可以与一种或多种其他分子实体在功能上连接(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)，所述分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒剂、药学试剂和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如，链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标记)的结合的蛋白质或肽。一种类型的衍生抗体通过使2种或更多种抗体(相同类型或不同类型，例如以生成双特异性抗体)交联而产生。合适交联剂包括其为异双功能(例如，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能(例如，二琥珀酰亚胺辛二酸酯)的那些，所述异双功能的交联剂具有通过合适间隔臂分开的2种不同的反应基团。此种接头可从 PierceChemical Company, Rockford，111 获得。本发明的抗体或抗体部分可以由其衍生的有用可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可以用可检测酶进行衍生，所述可检测酶例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、 葡糖氧化酶等。当抗体由可检测酶进行衍生时，它通过加入酶用于产生可检测反应产物的另外试剂进行检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加导致可检测的有色反应产物。抗体也可以由生物素进行衍生，并且通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。在本发明的方法和组合物中使用的抗体或抗体部分可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻和重链基因进行制备。为了重组表达抗体，用携带DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述DNA片段编码抗体的免疫球蛋白轻和重链，从而使得轻和重链在宿主细胞中表达，并且优选地分泌到其中培养宿主细胞的培养基中，从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重和轻链基因，将这些基因整合入重组表达载体内，并且将载体引入宿主细胞内，例如下述中描述的那些=Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis (编辑)，MolecularCloning ；A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Ausubel, F. Μ.等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和在 Boss 等人的美国专利号 4，816，397 中。为了表达阿达木单抗(D2E7)或阿达木单抗(D2E7)相关抗体，首先获得编码轻和重链可变区的DNA片段。这些DNAs可以通过使用聚合酶链反应(PCR)扩增和修饰种系轻和重链可变序列获得。关于人重和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的 (参见例如，“Vbase”人种系序列数据库；还参见Kabat，Ε. Α.，等人(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Healthand Human Services，NIH
发明者A·埃尔登, G·海于格伯格 申请人:艾博特生物技术有限公司