通过miRNA增强药物疗法的制作方法

专利名称：通过miRNA增强药物疗法的制作方法
通过mi RNA增强药物疗法
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尽管在阐明引起恶性癌细胞的基因组异常方面已取得了巨大进展，但目前可用的 化学疗法仍不是令人满意的，并且对于大多数被诊断为具有癌症的患者的预后仍是令人沮 丧的。因此，需要继续开发新疗法，特别是与其他试剂和治疗共同一起良好工作(如果不是 协同地)的新疗法。热休克蛋白(HSPs)是响应于升高的温度和其他环境应激例如紫外线、营养剥夺 和缺氧而上调的一类伴侣蛋白。HSR充当其他细胞蛋白质(称为“客户”蛋白质)的分子伴 侶，并且有助于它们的正确折叠和客户蛋白质的修复。存在几个已知的HSI^s家族，其各自 具有其自身的客户蛋白质组。HSP90家族是最丰富的HSP家族之一，其总计占未处于应激下 的细胞中的蛋白质的大约1_2%，并且在处于应激下的细胞中增加至大约4-6%。HSP90的 抑制导致经由遍在蛋白蛋白酶体途径的其客户蛋白质的降解。与其他伴侣蛋白不同，HSP90 的客户蛋白质大多数是牵涉信号转导的蛋白激酶或转录因子，并且许多其客户蛋白质已显 示牵涉癌症的进展。因此，HSP90的抑制是用于治疗癌症和其他疾病的有希望的途径。17-AAG是与HSP90 (热休克蛋白90)结合并且改变其功能的安莎霉素抗生素。特 别地，17-AAG以高亲和力结合到HSP90中的ATP结合袋内，并且诱导需要该分子伴侣用于构 象成熟的蛋白质的降解。雷帕霉素是用于防止器官和骨髓移植物被机体排斥的药物。雷帕霉素是这样的抗 生素，其阻断牵涉细胞分裂的蛋白质，并且抑制在机体排斥外来组织和器官中所牵涉的免 疫系统的某些T细胞的生长和功能。它是一种类型的免疫抑制剂和一种类型的丝氨酸/苏 氨酸激酶抑制剂。雷帕霉素也称为西罗莫司。基于钼的化学治疗试剂(“钼试剂”)包括例如奥沙利钼、顺钼和卡钼。钼试剂类 别的药物以几种不同方式使DNA交联，从而干扰通过有丝分裂的细胞分裂。受损的DNA引 发DNA修复机制，这又在当修复经证明不可能时激活细胞凋亡。此外，已假定钼试剂还与细 胞蛋白质特别是HMG结构域蛋白质反应，从而进一步干扰有丝分裂。紫杉醇是在癌症化学治疗中所使用的有丝分裂抑制剂。紫杉醇还用于预防再狭 窄。与多西他赛一起，它形成称为紫杉烷类的药物类别。紫杉烷类通过干扰在细胞分裂过 程中的正常微管分解而起作用。值得注意的是，HSP抑制剂、钼试剂和紫杉烷类是不同药物类别的成员，并且具有 广泛不同的作用机制。发明概述本发明提供了用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再狭窄或增殖性细胞疾病的 生物中治疗剂的活性的方法，其包括在施用另一种治疗剂之前、期间或之后，施用治疗有 效量的miRNA。在一个优选的实施方案中，本发明的方法和组合物旨在增强HSP90抑制剂 17-AAG的活性。根据本发明的方法和组合物包括例如，其中所述miRNA包含一种或多种下述RNA 序列
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miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO 1),miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)，miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)，miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，和miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)。备选地，在其他实施方案中，所述miRNA包含SEQ ID NO 10-35中的一种或多种。特别地，本发明提供了这样的方法和组合物，其中所述miRNA选自miR4M_3p (UAG UGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U) (SEQ ID NO :4)，其互补物，以及其组合；并且所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼或其组合。此外，本发明提供了这样的方法和组合物，其中所述miRNA选自miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO 6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)，其互补物，以及其组合；并且所述治疗剂为紫杉醇。因此，本发明提供了用于预测对于使用HSP90抑制剂、微管抑制剂或有丝分裂抑 制剂的疗法的应答的方法，其包括(a)提供患病组织的生物学样品；(b)测量患病组织的生物学样品中RNA的水平，其中所测量的RNA由下列序列组 成(i)miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO :1)，miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)，miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)，miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)；(ii) (i)的互补 RNA ；禾口(iii)具有与(i)或(ii)的21个邻接核苷酸至少大约81%同一的序列的RNA ；(c)将患病组织中来自(b)的RNA的水平与对照中相同RNA的水平相比较，其中高 于对照水平的该核酸的水平表明对所述疗法作出应答，和低于对照水平的该核酸的水平表
11明对所述疗法不作出应答。备选地，在其他实施方案中，所述miRNA包含SEQ ID NO 10-35 中的一种或多种。本发明提供了分离的核酸，包括载体，其具有与报道基因有效地连接的一种或多 种体内表达控制元件，其中所述报道基因处于靶基因(其表达水平待调节，增加或降低其 水平)3’非翻译区的全部或部分的上游，其中在所述分离的核酸转染到真核细胞中后，经转 染的细胞表达编码处于所述3’非翻译区上游的该报道分子的mRNA。值得注意的是，根据本 发明提供的外源miRNA也可以与抑制性内源miRNA相互作用，以增加靶基因的表达。根据本发明的分离的核酸包括例如，其中载体选自质粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人 工染色体。根据本发明的分离的核酸包括例如，其中所述一种或多种体内表达控制元件选 自启动子、增强子、RNA剪接信号及其组合。在优选的实施方案中，所述报道基因编码萤光素酶蛋白，并且所述靶基因为CD44、 ⑶C27、MAPK活化激酶2、PAR4或PKC γ，并且所述3，非翻译区来自⑶44、⑶C27、MAPK活化 激酶 2、PAR4 或 PKC γ。本发明进一步提供了鉴定靶基因的表达调节剂的方法，其包括(a)用包含与报道基因有效地连接的一种或多种体内表达控制元件的分离的核酸 转染真核细胞，所述报道基因被克隆在靶基因3’非翻译区的全部或部分的上游，其中所述 体内表达控制元件导致产生出编码处于靶基因3’非翻译区上游的该报道分子的mRNA，(b)用包含与所述报道基因有效地连接的所述一种或多种体内表达控制元件的分 离的核酸转染其他真核细胞，其中所述表达控制元件导致转录出编码该报道分子的mRNA，(c)使来自(a)和(b)的经转染的细胞与候选表达调节剂相接触和假接触 (mock-contacting)，禾口(d)将在经转染的细胞与候选表达调节剂相接触和未接触的情况下在来自(a)和 (b)的经转染的细胞中的报道基因活性进行比较。所要求保护的方法的实施方案包括，其中所述方法进一步包括用第二报道构建体 共转染(a)和(b)中的细胞，所述第二报道构建体表达用于标准化(d)中所比较的数据的 第二报道分子。在本发明的优选实施方案中，所述靶基因为CD44、CDC27、MAPK活化激酶2、 PAR4或PKC γ。所述方法还规定使报道分子表达构建体中的⑶44、⑶C27、MAPK活化激酶 2、PAR4、PKCy的3’非翻译区突变，将所述经突变的报道分子表达构建体转染到真核细胞 中，和将在经转染的细胞与候选表达调节剂相接触和未接触的情况下由于经突变和未突变 的报道分子表达构建体的表达而产生的报道基因活性进行比较。因此，本发明提供了用于鉴定靶基因表达调节剂的试剂盒，其包括(a)第一分离的核酸，其具有与第一报道基因有效地连接的第一组一种或多种体 内表达控制元件，所述第一报道基因被克隆在靶基因3’非翻译区的全部或部分的上游，其 中在所述第一分离的核酸转染到真核细胞中后，所述第一组体内表达控制元件导致产生 出编码处于靶基因3’非翻译区上游的该第一报道分子的mRNA，所述靶基因例如为CD44、 0)〇27、嫩131(活化激酶2、？41 4或？1((^ ；(b)第二分离的核酸，其包含与所述第一报道基因有效地连接的来自(a)的该组 体内表达控制元件，其中在所述第二分离的核酸转染到真核细胞中后，所述体内表达控制 元件导致转录出编码所述第一报道分子的mRNA ；和
(c)第三分离的核酸，其包含与第二报道基因有效地连接的第二组一种或多种所 述体内表达控制元件，其中在所述分离的核酸转染到真核细胞中后，所述第二组体内表达 控制元件导致所述第二报道分子表达。在另外一个实施方案中，本发明提供了包含miRNA的分离的核酸，其中当将所 述miRNA施用至哺乳动物细胞并且随后将所述哺乳动物细胞暴露于治疗剂或与治疗剂 相接触时，所述哺乳动物细胞在Apo-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7测定法(Apo-ONE Homogeneous Caspase_3/7Assay) (Promega，Madison,WI)或其他用于定量细胞凋亡的合适 测定法中产生至少大约200，优选地至少大约225，更优选地至少大约250，最优选地至少大 约275的485/538nm比率。因此，本发明还提供了能够表达包含miRNAs的转录物的分离的 核酸，其中当在哺乳动物细胞中表达所述miRNAs并且随后将所述哺乳动物细胞暴露于治 疗剂或与治疗剂相接触时，所述哺乳动物细胞在Apo-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7测定法 (Promega, Madison, WI)或其他用于定量细胞凋亡的合适测定法中产生至少大约200，优选 地至少大约225，更优选地至少大约250，最优选地至少大约275的485/538nm比率。用于 根据本发明的这个方面进行使用的合适治疗剂包括例如17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇及其组
I=I ο进一步地，本发明提供了用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再狭窄或增殖性细 胞疾病的生物中治疗剂的活性的方法，其包括在施用另一种治疗剂之前、期间或之后，施用 治疗有效量的miRNA。在一个优选的实施方案中，本发明的方法和组合物旨在增强雷帕霉 素的活性。在一个这样的实施方案中，本发明提供了增强、加强或增加雷帕霉素的活性的方 法，其包括表达包含下列序列中的一种或多种序列的miRNAs CCAGUAUUAACU⑶GCUGCUGA (SEQ ID NO 36),AAGUGUGCAGGGCACUGGU (SEQ ID N0:37)，和AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG(SEQ ID NO 38),以及其组合。附图的几个视图的简述

图1描绘了关于HSP90抑制剂17-AAG的细胞凋亡活性的剂量-应答曲线。图2描绘了关于在HSP90被17-AAG抑制后Her2下调的剂量-应答曲线。图3描绘了在用HSP90抑制剂17-AAG进行处理后，Her2的内在化和降解。图4描绘了万珂(Velcade)抑制由17-AAG诱导的细胞凋亡活性。图5为与17-AAG的1 800稀释物协同地诱导细胞凋亡的miRNAs的表格式呈现。 暗色背景，最佳候选物，在1 800和1 3200下。浅色背景，候选物，仅在1 800下。图6为与17-AAG的1 3200稀释物协同地诱导细胞凋亡的miRNAs的表格式呈 现。暗色背景，最佳候选物，在1 800和1 3200下。浅色背景，候选物，仅在1 800 下。图7描绘了通过所鉴定的miRNAs而发生的细胞凋亡诱导的17-AAG浓度依赖性。 1E2, mir-145(SEQ ID NO 1) ；3F6，mir-454 (SEQ ID NO 2) ；4C6，mir-519 (SEQ ID NO 3)； 4D4-520c (SEQID NO 4) ；4D5, mir-520d(SEQ ID NO 5) ； 17AAG，无 miRNA 的基线活性。图8呈现了这5种miRNAs的关系和序列比对，其中显示出has-mir-145属于独特 的类别。
图9显示了 17-AAG/miRNA诱导细胞凋亡的miRNA浓度依赖性。A，具有治疗剂；B， 没有治疗剂。图10显示了抗体微阵列结果。图11显示了 miRNAs增强奥沙利钼活性。图12显示了 miRNAs增强紫杉醇活性。发明详述I.定义如本文中所使用的，术语“施用”是指将治疗剂例如miRNA递送至生物，从而所述 试剂将会接触患病细胞，并且如果对于功能而言必需，进入患病细胞。在载体的情况下， miRNA在患病细胞中的表达也将会是由于施用而引起。许多施用方法是本领域普通技术人 员已知的。如本文中所使用的，术语“增强治疗剂的活性”意指引起治疗剂的活性的显著改变 (例如，至少大约10%，至少大约20%，至少大约25%，至少大约33%，至少大约50%，至少 大约100 %，至少大约2倍，至少大约3倍，至少大约10倍，至少大约100倍或更多的改变)。 所述增强可以表现为减少剂量、减少副作用或缩短疗法过程的能力。如本文中所使用的，术语“核酸”是指多个核苷酸(即，包含与磷酸基团和可交换 的有机碱相连接的糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子，所述可交换的有机碱为经取代的嘧 啶(例如胞嘧啶(C)、胸苷(T)或尿嘧啶(U))或经取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤 (G)))。该术语还应当包括多核苷(即，减去了磷酸的多核苷酸)和任何其他包含有机碱的 聚合物。嘌呤类和嘧啶类包括但不限于，腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸苷，肌苷，5-甲基胞嘧 啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2，6_ 二氨基嘌呤，次黄嘌呤，以及其他天然和非天然存 在的核碱基，经取代和未取代的芳香族部分。其他此类修饰是本领域技术人员众所周知的。 因此，术语“核酸”还包括具有取代或修饰(例如在碱基和/或糖中)的核酸。如本文中所使用的，术语“微小RNA”(或miRNA)是指任何类型的干扰RNA，包括但 不限于，内源微小RNA和人工微小RNA。内源微小RNA是在基因组中天然存在的小RNAs，其 能够调节mRNA的生产利用。术语“人工的”或“合成的”微小RNA包括除内源微小RNA之 外的任何类型的RNA序列，其能够调节mRNA的生产利用。如本文中所使用的，“微小RNA侧翼序列”是指包括微小RNA加工元件的核苷酸序 列。微小RNA加工元件是促成从前体微小RNA产生成熟微小RNA的最小限度核酸序列。称 为pri-miRNAs的前体miRNA在细胞核中被加工成大约15-70个核苷酸的pre-miRNAs，其折 叠成不完全的茎-环结构。微小RNA侧翼序列可以是天然微小RNA侧翼序列或人工微小RNA侧翼序列。天然 微小RNA侧翼序列是在天然存在的系统中通常与微小RNA序列相联合的核苷酸序列，即这 些序列被发现存在于在体内围绕最小限度微小RNA发夹的基因组序列内。人工微小RNA侧 翼序列是在天然存在的系统中未发现处于微小RNA序列侧翼的核苷酸序列。人工微小RNA 侧翼序列可以是天然地在其他微小RNA序列的情形下发现的侧翼序列。备选地，它们可以 由最小限度微小RNA加工元件组成，所述最小限度微小RNA加工元件在天然存在的侧翼序 列内被发现，并且插入到并不天然地作为侧翼序列存在或仅部分地作为天然侧翼序列存在 的其他随机核酸序列中。
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在前体微小RNA分子内的微小RNA侧翼序列可以处于包含微小RNA序列的茎-环 结构的一侧或两侧的侧翼。优选的结构在茎-环结构的两个末端处具有侧翼序列。侧翼序 列可以与茎-环结构的一个或两个末端直接相邻，或者可以通过接头、额外的核苷酸或其 他分子与茎-环结构相连接。如本文中所使用的，“茎-环结构”是指具有二级结构的核酸，所述二级结构包括 已知或预知形成双链的核苷酸的区域(茎部分)，所述双链在一侧通过主要地单链的核苷 酸的区域(环部分)相连接。术语“发夹”和“折回”结构在本文中也用于指茎-环结构。 此类结构和术语是本领域众所周知的。在茎-环结构内的核苷酸的实际一级序列不是关键 的，只要存在二级结构。如本领域中已知的，二级结构不需要精确的碱基配对。因此，茎可 以包含一个或多个碱基错配。备选地，碱基配对可以不包括任何错配。DNA分离物被理解为意指化学合成的DNA、cDNA或基因组DNA，其具有或不具有3 ‘ 和/或5 ‘侧翼区域。编码miRNA的DNA可以从任何来源获得，通过a)从包含mRNA的细胞 获得cDNA文库，b)用经标记的编码miRNA或其片段(通常，大于IOObp)的DNA进行杂交 分析，以便检测出在所述cDNA文库中的包含同源序列的克隆，和c)通过限制酶分析和核酸 测序来分析所述克隆，以鉴定出全长克隆。如本文中所使用的，当它们天然地或人工地源自共同的祖先核酸或核酸序列时， 核酸和/或核酸序列是同源的。一般由两个或更多个核酸或蛋白质(或其序列)之间 的序列同一性来推断同源性。如本文中所使用的，如果两个核酸和/或核酸序列(包括 miRNAs)在这两个序列中的每个相应位置处具有相同的核苷酸，那么它们是“同一的”，其 中为了该分析的目的，尿嘧啶和胸苷视为等同。当两个序列通过合适的算法进行比对时， 这两个序列具有基于它们所共享的相同核苷酸的数目的同一性百分比，所述合适的算法例 如为 bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), " Blast 2 sequences-a newtool for comparing protein and nucleotide sequences " , FEMSMicrobiol Lett. 174 :247-250),其是公众通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可得的。如果两个序列可以在所有核苷酸处碱基配对，那么 它们是“互补的”。互补性百分比基于当就碱基配对将所述序列进行比对时每条链中可以与 另一序列碱基配对的核苷酸的百分比。如本文中所使用的，“治疗剂”是指用于治疗哺乳动物疾病或病状的任何合适的现 有技术药物或其他处理。例如，azileCt、L-多巴/卡比多巴、mirapex或苯海索，其用于帕 金森病。“分离的核酸”表示从其天然状态中取出并且对于进行克隆来说是合适地纯的。II. 一般原理A.热休克蛋白 90(HSP90)已通过突变分析显示，HSP90为正常真核细胞的存活所必需的。此外，HSP90在许 多肿瘤类型中过表达，这表明它可能在癌细胞的存活中起重大作用，并且癌细胞可能对于 HSP90的抑制比正常细胞更敏感。例如，癌细胞通常具有大量的经突变且过表达的癌蛋白 质，其依赖于HSP90来进行折叠。已牵涉癌症进展的HSP90客户蛋白质的实例包括Her_2、 c-Kit, c-Met, Akt激酶、Cdk4/细胞周期蛋白D复合体、Raf-I、v_src、BCR-ABL融合蛋白、 类固醇激素受体、P53和Hif-Ι。此外，因为肿瘤的环境由于低氧、营养剥夺、酸中毒等而通
15常是不适宜的，所以肿瘤细胞可能尤其依赖于HSP90而存活。因此，HSP90的抑制有希望用于开发新的癌症疗法。HSP90的抑制引起许多癌蛋白 质以及激素受体和转录因子的同时抑制，这使其成为抗癌剂的有吸引力的靶标。HSP90抑制剂可能在治疗其他疾病中具有效用。例如，HSP抑制剂，17-AAG， 引起多谷氨酰胺(PolyQ)-扩展的雄激素受体(Al )的降解，所述多谷氨酰胺-扩展的 雄激素受体是神经变性疾病脊髓延髓性肌萎缩中的致病性基因产物(Waza M等人， 2006, Alleviatingneurodegeneration by an anticancer agent. Annals of the New YorkAcademy of Sciences 1086 :21-34)。B.微小 RNAs微小RNAs (称为“miRNAs”)是小的非编码RNAs，其属于在植物和动物中发现的 一类调节分子，该类调节分子通过与靶信使RNA(mRNA)转录物上的互补位点结合来控制 基因表达。mi RNAs由大的RNA前体(称为pri_miRNAs)产生，所述大的RNA前体在细胞 核中被加工成大约70个核苷酸的pre-miRNAs，其折叠成不完全的茎-环结构(Lee，Y.等 人，Nature (2003) 425 (6956) :415-9)。pre_miRNAs在细胞质内经历额外的加工步骤，其中 通过RNA酶III酶(切酶(Dicer))而从pre-miRNA发夹的一侧切割下长度为18-25个 核苷酸的成熟 miRNAs (Hutvagner，G.等人，Science (2001) 12 :12 ；和 Grishok，Α.等人， Cell (2001) 106(1) :23-34)。已显示，miRNAs以两种方式调节基因表达。首先，与和该miRNA 精确互补的编码蛋白质的mRNA序列结合的miRNAs诱导RNA介导性干扰(RNAi)途径。通 过RISC复合体中的核糖核酸酶来切割信使RNA靶。主要在植物中已观察到这种miRNA-介 导的基因沉默机制(Hamilton，A. J.和 D. C. Baulcombe，Science (1999) 286 (5441) :950-2; 禾口 Reinhart，B. J.等人，MicroRNAs in plants. Genes and Dev. (2002) 16:1616—1626)， 但从动物中获知了实例(Yekta, S.，I. H. Shih 和 D. P. Bartel，Science (2004) 304(5670) 594-6)。在第二种机制中，与信使RNA转录物上的不完全互补位点结合的mi RNAs指导在 转录后水平上的基因调节，但不切割其mRNA靶。在植物和动物中所鉴定的miRNAs使用这 种机制来施行其基因靶的翻译控制(Bartel，D. P.，Cell (2004) 116(2) :281-97)。因此，总体而言，本发明的目标为在联合疗法中提供天然存在的miRNAs，以增强任 何治疗剂的治疗活性。在此，呈现了用于使用HSP90抑制剂来增强治疗剂的活性的方法，以 证实所述方法。适合于活性增强的其他治疗剂包括例如奥沙利钼和紫杉醇。本发明的进一步目标为提供天然存在的核酸用于治疗或预防癌症或增殖性疾病 (其依赖于HSP90失调或者由HSP90失调引起)的一种或多种症状。本发明的进一步目标为将miRNA的检测用作关于对于疗法的应答的诊断，所述疗 法作为具有miRNA的联合疗法或者作为使用治疗剂例如HSP90抑制剂的单一疗法。为了达到这些和其他目标，本发明提供了用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再 狭窄或增殖性细胞疾病的生物中治疗剂(例如HSP抑制剂17-AAG)的活性的方法和组合 物，其包括在施用所述治疗剂之前、期间或之后，施用有效量的miRNA。因此，本发明提供了可以是合成的或由分离的核酸编码的miRNA。根据本发明的 miRNA包括例如pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、ds miRNA及其片段或变体。所述miRNA 可以是经化学修饰的RNA，例如它可以用选自下列的化学部分进行修饰硫代磷酸酯、硼烷 磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、末端反转-dT碱基、PEG及其组合。根据本发明，所述miRNA
16可以作为裸露的RNA即在盐水或D5中进行施用，或者在阳离子脂质体、中性脂质体、基于 聚合物的纳米颗粒、胆固醇缀合物、环状葡聚糖复合物、聚乙烯亚胺聚合物或蛋白质复合物 中进行施用。根据本发明，可以以静脉内、皮下、肌内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、经口、 眼内或鞘内方式将所述miRNA直接施用至患病组织。参见例如，Fougerolles, Human Gene Therapy(2008) 19 :125-132 ；Behlke, Molecular Therapy(2006) 13(4) :644-670 本发明还提供了用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再狭窄或增殖性细胞疾病 的生物中治疗剂的活性的方法和治疗性组合物(包括miRNAs)，其包括在施用所述治疗剂 之前(包括例如，之前大约8小时、大约12小时、大约1天、大约2天、大约3天、大约1周、 大约2周、大约1个月或更多)、期间(包括例如，同时地，在大约10分钟内、在大约30分钟 内、在大约1小时内、在大约2小时内、在大约8小时内、在大约12小时内、在大约1天内) 或之后(包括例如，之后大约8小时、大约12小时、大约1天、大约2天、大约3天、大约1 周、大约2周、大约1个月或更久)，施用有效量的miRNA或者表达有效量的miRNA的载体。在优选的实施方案中，本发明提供了分离的核酸，包括包含任何下列miRNAs的序 列的那些miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO 1),miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)，miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)，miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572 (GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)，miR-661 (UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU) (SEQ ID NO :9)，其互补物，或者与其 18 个 邻接核苷酸至少81 %同一，优选地至少95 %同一的序列。备选地，在其他实施方案中，所述 miRNA包括SEQ ID NO :10-35中的一种或多种。还提供了包含与miRNAs互补的核酸或肽核酸的探针。还提供了包含所述探针的 组合物。还提供了包含所述探针的生物芯片。本发明进一步提供了生物学样品，其可以就可测量的核酸水平进行检验。所述核 酸可以包含任何下列 miRNAs 的序列miR145 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO 1)，miR454-3p(UA(iUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU) (SEQ ID NO 2)，miR519a (AAAGUGCAUCCUU UUAGA⑶⑶UAC) (SEQ ID NO 3)，miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U) (SEQ ID NO :4)， miR520d(AAA⑶GCUUCUCUUUGGUGGGUU) (SEQ ID NO :5)。所述核酸还可以包含与任何所列出 的miRNAs的大约18个邻接核苷酸至少大约81%同一，优选地至少95%同一的序列。高于 对照水平的该核酸的水平表明对所述疗法作出应答，和低于对照水平的该核酸的水平表明 对所述疗法不作出应答，在这个实例中所述疗法为HSP90抑制剂，例如17-AAG、奥沙利钼或 其组合。本发明进一步提供了生物学样品，从中可以测量核酸水平。所述核酸可以包 含任何下列 miRNAs 的序列:miR-425_3p(AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCC)(SEQ ID NO :6)， miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)，miR-572^UCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID N0:8)，miR-661(UGCCUGG(iUCUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)。所述核酸还可以 包含与任何所列出的miRNAs的大约18个邻接核苷酸至少大约81 %同一，优选地至少95% 同一的序列。高于对照水平的该核酸的水平表明对所述疗法作出应答，和低于对照水平 的该核酸的水平表明对所述疗法不作出应答，例如关于用于紫杉醇的miR-425-3p(SEQ ID NO :6)、miR-495(SEQ ID NO :7)、miR_572 (SEQ ID NO :8)和 miR-661 (SEQID NO :9)的序列。本发明还提供了用于鉴定调节癌症相关miRNA的表达的化合物的方法(a)提供 能够表达根据权利要求1的核酸的细胞；(b)使所述细胞与候选调节剂相接触；和(c)测 量所述核酸的表达水平，其中相比于对照而言所述核酸水平的差异将该化合物鉴定为所述 miRNA的表达的调节剂。III.组合物已显示了，HSP90抑制剂17-AAG的活性通过一系列miRNA而得到增强。因此，上 调这些特定的微小RNAs或者外源地提供类似的药物化合物，一般而言应当对于在特定和 任何治疗学中增强HSP90抑制剂来说是有效的。在优选的实施方案中，将miRNA制剂施用给具有已使HSP90表达失调的癌症的个 体。A.核酸序列和变体本发明的特别有利的实施方案包括下列的miRNAs组作为HSP90抑制 齐U 的增强剂miR145 (⑶CCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO 1), miR454-3p ( UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU) (SEQ ID NO :2)，miR519a (AAAGUGCAUCCUUUUAGAG UGUUAC) (SEQ ID NO :3)，miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU) (SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)。miRNA的序列变体落入下列三个类别中的一个或多个之中置换、插入或缺失变 体。插入包括5'和/或3'末端融合物，以及单个或多个残基(包括至少3个、至少5个、 至少10个、至少15个、至少30个和至少50个核苷酸)的序列内插入。还可以在成熟序列 内引入插入。然而，这些通常将会是比在5'或3'末端处的那些更小的插入，1-4个残基左
右οmiRNA的插入序列变体是其中一个或多个残基引入到靶miRNA中的预定位点处的 那些。最常见的插入变体是在miRNA的5'或3'末端处的核酸融合物。缺失变体的特征在于从miRNA序列中去除一个或多个残基。这些变体通常通过下 列方式来制备对编码miRNA的DNA中的核苷酸进行位点专一诱变，从而产生编码变体的 DNA，并在其后在重组细胞培养中表达DNA。但是，变体miRNA片段可以方便地通过体外合成 来制备。变体通常展示在质上与天然存在的类似物相同的生物活性，尽管也选择变体以便 修饰miRNA的特征。置换变体是其中已去除了序列的例如至少1个到至少3个核苷酸并且在其位置处 插入了不同核苷酸的那些。尽管用于引入序列变异的位点是预先确定的，但突变本身无需 是预先确定的。例如，为了优化在给定位点处的突变的性能，可以在靶区域处进行随机诱 变，并且就所需活性的最佳组合来筛选所表达的miRNA变体。用于在具有已知序列的DNA 中的预定位点处进行置换突变的技术是众所周知的。核苷酸置换通常是单个残基；插入常常将会是大约1-10个残基左右；和缺失将会
18是大约1-30个残基。优选地，在相邻对中进行缺失或插入；即缺失2个残基或插入2个残 基。置换、缺失、插入或其任何组合可以相组合以获得最终构建体。可以进行改变以增加 miRNA的活性，增加其生物学稳定性或半衰期，等等。包括了对于编码此类miRNA的核苷酸 序列的所有此类修饰。在建立同源性中有用的序列之间的精确的同一性百分比随着所讨论的核酸和蛋 白质而变化，但低至25%的序列同一性常规地用于建立同源性。更高水平的序列同一性， 例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或者更高，也可以用于建立同源 性。用于测定序列相似性百分比的方法(例如，使用缺省参数的BLASTN)是普遍可获得的。 用于执行BLAST分析的软件是公众通过美国国家生物技术信息中心可得的。B.增强HSP90抑制剂的治疗潜能的miRNAs已鉴定了调节人癌基因的天然存在的微小RNAs，pri-miRNA、pre-miRNA、成 熟miRNA或者其片段或变体(保留了成熟miRNA的生物活性)，以及编码pri-miRNA、 pre-miRNA、成熟miRNA、其片段或变体或者编码该miRNA的调控元件的DNA。miRNA的大小 通常为18个核苷酸至170个核苷酸，尽管可以采用高至2000个核苷酸的核苷酸。在一个 优选的实施方案中，pre-miRNA的大小范围为长70-170个核苷酸，和成熟miRNA的长度为 21-25个核苷酸。还可以使用允许将成熟的单链miRNA并入到RISC复合体中的合成miRNAs例如 ds-miRNA和经修饰的ds_miRNA。ds_miRNA的大小为长10-70个核苷酸。从显示出增强HSP90抑制剂17-AAG的细胞凋亡活性的miRNA组中选择miRNA。 这些包括下述 miRNAs 组miR145 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO :1)、miR 454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)、miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUA GAGUGUUAC) (SEQ ID NO :3)、miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU) (SEQ ID NO :4)、 miR520d (AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U) (SEQ ID NO :5)，作为HSP90抑制剂或有丝分裂抑制剂 的增强剂。C.核酸技术描述了分子生物学技术的普通教科书包括Sambrook，MolecularCloning a Laboratory Manual (2. sup. nd ed.), Vols. 1-3, ColdSpring Harbor Laboratory, (1989) ；Current Protocols inMolecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc. , NewYork (1997) ；Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology !Hybridization With Nucleic Acid Probes, Parti. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993) ；Berger 禾口 Kimmel, Guide to Molecular CloningTechniques Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc. ,San Diego,Calif0这些教科书描述了诱变、载体的使用、启动子和许多其他与例如基 因的产生和表达有关的相关主题，所述基因编码let-7或任何其他miRNA活性。用于核酸 (基因)的分离、纯化和操作的技术，例如产生文库、亚克隆到表达载体中、标记探针和DNA 杂交也描述在上述教科书中，并且是本领域普通技术人员众所周知的。核酸(无论是miRNA、DNA、cDNA或基因组DNA，还是其变体)可以从各种来源中分 离，或者可以在体外合成。本文中所描述的核酸可以施用至人、转基因动物、经转化的细胞 或者在人、转基因动物、经转化的细胞中表达，在经转化的细胞裂解物中，或者以经部分纯
19化的或实质上纯的形式。依照本领域技术人员众所周知的许多一般手段中的任何手段来检测和定量核酸。 这些包括例如分析型生物化学方法，例如分光光度法，射线照相术，电泳，毛细管电泳，高效 液相色谱法(HPLC)，薄层色谱法(TLC)，和超扩散色谱法，各种免疫学方法，例如流体或凝 胶沉淀素反应，免疫扩散(单向或双向)，免疫电泳，放射免疫测定法(RIA)，酶联免疫吸附 测定法(ELISA)，免疫荧光测定法等，Southern分析，Northern分析，斑点印迹分析，凝胶电 泳，RT-PCR,定量PCR，其他核酸或靶或信号扩增方法，放射性标记，闪烁计数，和亲和层析。可以使用各种类型的诱变，例如来修饰编码具有miRNA活性的基因的核酸。它们 包括但不限于位点定向诱变、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含尿嘧啶的模板的诱 变、寡核苷酸指导的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、和使用有缺口的双链体DNA的诱变 等。另外的合适方法包括，点错配修复、使用修复缺陷型宿主株系的诱变、限制-选择和限 制-纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复等。例如牵涉嵌合构建体的诱 变也包括在本发明中。在一个实施方案中，可以通过天然存在的分子或者经改变或突变的 天然存在的分子的已知信息(例如序列、序列比较、物理性质、晶体结构等)来指导诱变。可 以进行改变以增加miRNA的活性、增加其生物学稳定性或半衰期，等等。比较杂交可以用于鉴定编码具有let-7或其他miRNA活性的基因的核酸，包括核 酸的保守变异。当核酸结合在一起(通常在溶液中)时，它们“杂交”。核酸由于各种经 充分表征的物理化学力(例如氢键合、溶剂排斥、碱基堆积等)而杂交。关于核酸 杂交的广泛指导可在 Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part 1 chapter2, " Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays, “ (Elsevier, N. Y.)中以及在 Ausubel (同上)中找至[U Hames 禾口 Higgins(1995)Gene Probes 1 IRL Pressat Oxford University Press, Oxford, England, (HamesfPHigginsl)以及 Hames 禾口 Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at OxfordUniversity Press, Oxford, England(Hames 禾口 Higgins 2)提供了关于 DNA 禾口 RNA(包括寡核苷酸)的合成、标记、检测和定量的细节。如果它们所编码的多肽是实质上同一的，那么在严紧条件下不相互杂交的核酸仍 是实质上同一的。这例如在当使用由遗传密码所允许的最大限度密码子简并性来产生核酸 拷贝时发生。术语“严紧杂交条件”意指这样的条件，在所述条件下核酸将会与其靶子序列杂交 (通常在复杂的核酸混合物中)，但不与其他序列杂交。严紧条件是序列依赖性的，并且在 不同境况下将是不同的。更长的序列在更高的温度下特异性地杂交。一般地，将严紧条件 选择为比在指定的离子强度和PH下特定序列的热解链温度(Tm)低大约5-10°C。Tm是这 样的温度(在指定的离子强度、PH和核酸浓度下)，在该温度下50%的与靶互补的探针与 靶序列平衡地杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm下，50%的探针平衡地被占据)。严 紧条件将会是这样的条件，其中在PH 7. 0-8. 3下，盐浓度小于大约1. OM钠离子，通常大约 0.01-1. OM钠离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短探针(例如，10-50个核苷酸)为至少 大约30°C，和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少大约60°C。严紧条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少2 倍，优选地为背景杂交的10倍。示例性的严紧杂交条件可以为如下50%甲酰胺，5XSSC， 和SDS，在42°C下温育，或5XSSC，1% SDS，在65°C下温育，采用在65°C下在0. 2XSSC 和0. SDS中进行洗涤。用于在本文所描述的方法中使用的合适核酸包括但不限于pri-miRNA、 pre-miRNA.ds miRNA、成熟miRNA或者保留了该miRNA的生物活性的其片段或变体，以及编 码pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、其片段或变体的DNA，或者编码该miRNA的调控元件 的DNA。此外，DNA和PNA可以替代RNA，条件是维持碱基配对能力。D.载体在一个实施方案中，编码miRNA分子的核酸在载体上。这些载体包括编码成熟微 小RNA的序列和体内表达元件。在一个优选的实施方案中，这些载体包括编码pre-miRNA 的序列和体内表达元件，从而使得所述pre-miRNA在体内表达并加工成成熟miRNA。在另一 个实施方案中，这些载体包括编码pri-miRNA基因的序列和体内表达元件。在这个实施方 案中，首先，初级转录物进行加工，从而产生茎-环前体miRNA分子。然后，该茎-环前体进 行加工，从而产生成熟微小RNA。载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其他媒介物， 其已经通过插入或掺入用于产生微小RNA的核酸序列和可以附着至这些核酸序列的游离 核酸片段而进行了操作。病毒和逆转录病毒载体是优选的载体类型，并且包括但不限于 来自下列病毒的核酸序列逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒；鼠干细胞病毒，哈维 (Harvey)鼠肉瘤病毒；鼠乳腺肿瘤病毒；劳斯肉瘤病毒；腺病毒；腺伴随病毒；SV40-型病 毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒 例如任何逆转录病毒。本领域技术人员可以容易地采用本领域已知的其他载体。病毒载体通常基于非致细胞病变性真核病毒，其中非必需基因已被目的核酸序 列替代。非致细胞病变性病毒包括逆转录病毒，其生活周期涉及基因组病毒RNA逆转录 成DNA，随后原病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已被批准用于人基因疗法试验。 在遗传上经改变的逆转录病毒表达载体通用于核酸的体内高效转导。用于产生复制缺 陷型逆转录病毒的标准方案(包括将外源遗传材料掺入到质粒中，用质粒转染包装细胞 系，通过该包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒，和用病毒颗 粒转染靶细胞这些步骤)提供在 Kriegler，M.，“ Gene Transfer and Expression, A LaboratoryManual, ‘’ W. H. Freeman Co. , New York (1990),禾口 Murry, Ε. J. Ed. '’ Methods in Molecular Biology, " vol. 7, Humana Press, Inc. , Cliffton, N. J. (1991)中。Ε.启动子和其他转录/表达控制序列“体内表达元件”是任何调控核苷酸序列，例如启动子序列或启动子-增强子组合， 其促进核酸的有效表达以产生微小RNA。体内表达元件可以例如为哺乳动物或病毒启动子， 例如组成型或诱导型启动子或者组织特异性启动子。其实例是本领域普通技术人员众所周 知的。组成型哺乳动物启动子包括但不限于，聚合酶启动子以及下列基因的启动子次黄嘌 呤磷酸核糖转移酶(HPTR)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶和β -肌动蛋白。在真核细胞中组成性 地起作用的示例性病毒启动子包括但不限于，来自猿猴病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、人免 疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒的启动子，莫洛尼白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)，和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其他组成型启动子是本 领域普通技术人员已知的。诱导型启动子在诱导物存在下表达，并且包括但不限于金属诱 导型启动子和类固醇调节型启动子。例如，金属硫蛋白启动子在某些金属离子存在下被诱 导以推进转录。其他诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。组织特异性启动子的实例包括但不限于，肌酸激酶的启动子(其已用于指导在肌 肉和心脏组织中的表达)和用于在B细胞中进行表达的免疫球蛋白重链或轻链启动子。其 他组织特异性启动子包括人平滑肌α-肌动蛋白启动子。用于肝的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，HMG-COA还原酶启动子、固 醇调节元件1、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子、人C-反应蛋白(CRP)启动子、人葡 糖激酶启动子、胆固醇7-α羟化酶(CYP-7)启动子、β-半乳糖苷酶α-2，6唾液酸转移酶 启动子、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-I)启动子、醛缩酶B启动子、人转铁蛋白启动 子和I型胶原启动子。用于前列腺的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，前列腺酸性磷酸酶 (PAP)启动子、前列腺分泌性蛋白94(PSP 94)启动子、前列腺特异性抗原复合物启动子、和 人腺体激肽释放酶基因启动子(hgt-1)。用于胃组织的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，人H+/K+-ATP酶α亚 基启动子。用于胰腺的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，胰腺炎相关蛋白启动子 (PAP)、弹性蛋白酶1转录增强子、胰腺特异性淀粉酶和弹性蛋白酶增强子启动子、以及胰 腺胆固醇酯酶基因启动子。用于子宫内膜的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，子宫珠蛋白启动 子。用于肾上腺细胞的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，胆固醇侧链切割 酶(SCC)启动子。用于一般神经系统的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，Y-Y烯醇化 酶(神经元特异性烯醇化酶，NSE)启动子。用于脑的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，神经丝重链(NF-H)启动 子。用于淋巴细胞的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，人CGL-I/粒酶B启 动子、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)启动子、λ 5启动子、VpreB启动子、和Ick(淋巴细胞 特异性酪氨酸蛋白激酶p561ck)启动子、人CD2启动子及其3'转录增强子、以及人NK和T 细胞特异性激活基因(NKGO启动子。用于结肠的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，pp60c-src酪氨酸激酶 启动子、器官特异性新抗原(OSNs)启动子和结肠特异性抗原-P启动子。用于乳腺细胞的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，人α-乳清蛋白启 动子。用于肺的示例性的组织特异性表达元件包括但不限于，囊性纤维化跨膜传导调节 蛋白(CFTR)基因启动子。帮助在目的组织中的表达特异性的其他元件可以包括分泌前导序列、增强子、核
22定位信号、内体分解肽等。优选地，这些元件源自目的组织以帮助特异性。一般而言，需要时，体内表达元件应当包括涉及转录起始的5'非转录和5'非翻 译序列。它们任选地包括增强子序列或上游激活子序列。F.用于产生miRNA的方法和材料miRNA可以从细胞或组织中分离，重组产生，或者通过本领域普通技术人员众所周 知的各种技术在体外合成。在一个实施方案中，从细胞或组织中分离miRNA。用于从细胞或组织中分离miRNA 的技术是本领域普通技术人员众所周知的。例如，可以使用来自Ambion，Inc的mirVana miRNA分离试剂盒从总RNA中分离miRNA。另一种技术利用flashPAGE Fractionator System (Ambion, Inc.)用于小核酸的PAGE纯化。miRNA可以通过制备其重组形式来获得(即，通过使用基因工程技术来产生重组 核酸，其随后可以通过本领域普通技术人员众所周知的技术来分离或纯化)。这个实施方 案涉及在合适的培养基中生长宿主细胞培养物，并且从所述细胞或其中生长有所述细胞的 培养物中纯化出miRNA。例如，所述方法包括用于产生miRNA的过程，其中将包含包括编 码miRNA的核酸的合适表达载体的宿主细胞在允许所编码的miRNA表达的条件下进行培 养。在一个优选的实施方案中，所述核酸编码let-7。miRNA可以从培养物中、从培养基 中或者从由宿主细胞制备的裂解物中回收，并且进一步进行纯化。宿主细胞可以是高等 真核宿主细胞例如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞例如酵母细胞，或者宿主细胞可以是 原核细胞例如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖介导的转染或电穿孔来实现 将包含编码miRNA的核酸的载体引入到宿主细胞中(Davis，L.等人，Basic Methods in MolecularBiology(1986)) ο任何宿主/载体系统都可以用于表达所述miRNAs中的一种或多种。这些包括 但不限于，真核宿主例如HeLa细胞和酵母，以及原核宿主例如大肠杆菌(E. coli)和枯草 芽孢杆菌(B. subtilis)。可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中表达miRNA，其中 miRNA基因处于合适启动子的控制下。用于与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表 达载体由 Sambrook 等人描述在 Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)中。在优选的实施方案中，在哺乳动物细胞中表达miRNA。哺 乳动物表达系统的实例包括C127、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、 人表皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-I细胞、其他经转化的灵长类细胞系、正 常二倍体细胞、衍生自原初组织的体外培养的细胞株、原初外植块、HeLa细胞、小鼠L细胞、 BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。哺乳动物表达载体将包括复制起点、合适的启动子、 多腺苷酸化位点、转录终止序列和5'侧翼非转录序列。源自SV40病毒基因组的DNA序 列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点可以用于提供所需的非转 录的遗传元件。可能合适的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂 殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母属 (Candida)或能够表达miRNA的任何酵母菌株。可能合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽 孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能够表达miRNA的任何细菌菌株。在一个优选的实施方案中，分离编码选自下列的miRNA的基因组DNA miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU) (SEQ ID NO 1) , miR454_3p (UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU) (SEQ ID NO 2)，miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGAGUGUU AC) (SEQ ID NO 3) , miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU) (SEQ ID NO :4)， miR520d (AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUU) (SEQ ID NO :5)，miR_425_3p(AUCGGGAAUGUCG UGUCCGCC) (SEQ ID NO :6)，miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU) (SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA)(SEQ ID NO :8)和 / 或miR-661(UGCCUGGGUCUCUGGCCUGCG CGU) (SEQ ID NO :9)，在哺乳动物表达系统中表达所述基因组DNA，纯化RNA，并且进行修饰， 当对于施用给患者而言必需时。在一个优选的实施方案中，miRNA以pre-miRNA的形式，其 可以根据需要进行修饰(即，为了增加的稳定性或细胞摄取)。对于miRNA的DNA序列的了解使得能够对细胞进行修饰，以允许或增加内源miRNA 的表达。细胞可以进行修饰(例如，通过同源重组)以提供增加的miRNA表达，通过整体 或部分地用异源启动子的全部或部分替代天然存在的启动子，从而使得细胞以较高水平 表达miRNA。异源启动子以这样的方式插入，即使得它与所希望的miRNA编码序列有效地 连接。参见例如，Transkaryotic Therapies, Inc.的 PCT 国际公开号 WO 94/12650，Cell Genesys，Inc.的PCT 国际公开号W092/20808，和 Applied Research Systems 的PCT 国际公 开号W091/09955。细胞还可以进行改造，以在诱导型调控元件控制下表达包含mi RNA的内 源基因，在这种情况下该内源基因的调控序列可以通过同源重组而被替代。基因激活技术 描述在Chappel的美国专利号5，272，071 ；Sherwin等人的美国专利号5，578，461 ；Selden 等人的 PCT/US92/09627 (W093/09222)；和 Skoultchi 等人的 PCT/US90/06436 (W091/06667) 中。miRNA可以通过在适合于表达miRNA的培养条件下培养经转化的宿主细胞来 制备。然后，可以从此类培养物中(即，从培养基或细胞提取物中)纯化所得到的表达 出的miRNA，其中使用已知纯化方法，例如凝胶过滤和离子交换色谱法。miRNA的纯化还 可以包括包含将会与蛋白质结合的试剂的亲和柱；在诸如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝 素-toyopearl 或Cikicrom blue 3GA kpharose 的亲和树脂上的一个或多个柱步骤；涉 及疏水作用色谱法的一个或多个步骤，其中使用诸如苯基醚、丁基醚或丙基醚的树脂；免疫 亲和层析，或互补cDNA亲和层析。miRNA也可以被表达为转基因动物的产物，所述转基因动物的特征为包含编码 miRNA的核苷酸序列的体细胞或生殖细胞。可以使用同源重组将包含编码miRNA的DNA和 合适的调控元件的载体插入到动物种系中(Capecchi, Science 244 :1288-1292(1989)), 从而使得表达miRNA。转基因动物(优选地，非人哺乳动物)通过使用下列文献中所描述 的方法来产生:Robinson等人的美国专利号5，489，743，和Ontario Cancer Institute的 PCT公开号WO 94/28122.可以从分离自转基因动物的细胞或组织中分离miRNA，如上所讨 论的。在一个优选的实施方案中，miRNA可以合成获得，例如通过经由技术人员已知的任 何合成方法来化学合成核酸。然后，所合成的miRNA可以通过本领域已知的任何方法进行 纯化。用于化学合成核酸的方法包括但不限于，体外化学合成，其使用磷酸三酯、磷酸酯或 亚磷酰胺化学和固相技术，或者经由脱氧核苷氢膦酸酯中间体(参见Miongle的美国专利 号 5，705，629)。在某些情况下，例如，当希望获得增加的核酸酶稳定性时，具有核酸类似物和/或经修饰的核苷间键合的核酸可能是优选的。包含经修饰的核苷间键合的核酸也可以 使用本领域众所周知的试剂和方法来合成。例如，合成包含下列核苷间键合的核酸的方 法是本领域众所周知的膦酸酯、硫代硫酸酯、二硫代硫酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨 基磷酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛(thioformacetal)、二异丙基甲硅烷基、乙酰 胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、二亚甲基-硫醚(--CH2—S—CH2)、二亚甲基-亚砜 (-CH2-SO-CH2)、二亚甲基-砜(--CH2--SO2-CH2)、2 ‘ -0-烷基和 2 ‘-脱氧-2 ‘-氟 硫代硫酸酯核苷间键合(参见Uhlmann等人，1990，Chem. Rev. 90 :543-584 ；Schneider等 人，1990，"Tetrahedron Let t. 31 :335，以及其中所引用的参考文献)。Cook等人的美国 专利号5，614，617和5，223，618，Acevedo等人的美国专利号5，714，606，Cook等人的美 国专利号5，378，825，Buhr等人的美国专利号5，672，697和5，466，786，Cook等人的美国 专利号5，777，092，De Mesmaeker等人的美国专利号5，602，240，Cook等人的美国专利号 5，610，289,以及Wang的美国专利号5，858，988，也描述了用于增强的核酸酶稳定性和细胞 摄取的核酸类似物。IV.制剂将所述组合物施用给需要治疗或预防癌症/增殖性疾病的至少一种症状或表现 (因为疾病可以在不存在症状的情况下发生/进展)的患者。癌基因的异常表达是癌症的 标志。在优选的实施方案中，所述组合物以有效量进行施用，以增强hsp90抑制剂17-AAG 的治疗活性。还描述了用于治疗或预防癌症的至少一种症状或表现的方法，其包括施用有效量 的包含核酸分子的组合物，以减轻至少一种症状或降低至少一种表现。在一个优选的实施 方案中，所述癌症为肺癌症。本文所描述的组合物可以单独地或者与辅助癌症疗法(例如 手术、化学疗法、放射疗法、温热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法)相组合地以有效剂 量进行施用，以提供有益的效果，例如减少肿瘤大小、减少肿瘤的细胞增殖、抑制血管生成、 抑制转移，或者改善疾病的至少一种症状或表现。上文所描述的核酸优选地与合适的药物载体组合地用于治疗用途。此类组合物包 含有效量的化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。制备制剂以适宜于施用方式。药学 上可接受的载体部分地由待施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来决定。 因此，存在有广泛多样的包含核酸的药物组合物的合适制剂，其中某些在本文中描述。本领域普通技术人员理解，体内施用的核酸被摄取并分配至细胞和组织(Huang 等人，FEBS Lett. 558(1-3) :69-73 (2004))。例如，Nyce等人已显示，当吸入时，反义寡脱 氧核苷酸(ODNs)结合至内源表面活性剂(由肺细胞产生的脂质)，并且被肺细胞摄取而 无需额外的载体脂质(Nyce和Metzger，Nature, 385 :721-725 (1997))。小的核酸容易地 被摄取到TM膀胱癌组织培养细胞中(Ma等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8 415-426(1998))。已将siRNAs用于通过全身施用来进行内源基因的治疗沉默(Soutschek 等人，Nature 432,173-178 (2004)) 上文所描述的核酸可以处于用于在合适的药物载体中表面地、局部地或全身地 施用的制剂中 ° E. W. Martin 的 Remington ‘ sPharmaceutical Sciences,第 15 版(Mark Publishing Company, 1975)公开了典型的载体和制备方法。所述核酸也可以包囊在合适的 生物相容性微胶囊、微颗粒或微球体(其由生物可降解或生物不可降解的聚合物或蛋白质
25形成)或者脂质体中以用于靶向细胞。此类系统是本领域技术人员众所周知的，并且可以 就与合适的核酸一起使用来进行优化。用于核酸递送的各种方法描述在例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory,New York ；禾口Ausubel 等人，1994, Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 中。此类核酸 递送系统包含所希望的核酸，例如但不限于，以作为“裸露”核酸的“裸露”形式(例如，在 盐水或D5中)，或者配制在适合于递送的媒介物中，例如在具有阳离子分子或脂质体形成 性脂质的复合物中，或者作为载体的组分，或者作为药物组合物的组分。可以将核酸递送系 统直接地(例如通过使其与细胞相接触)或间接地(例如通过任何生物学过程的作用)提 供给细胞。例如但不限于，可以通过下列方式将核酸递送系统提供给细胞胞吞作用，受体 靶向，与天然或合成细胞膜片段相偶联，物理手段例如电穿孔，使核酸递送系统与聚合物载 体例如控释薄膜或纳米颗粒或微颗粒相组合，使用载体，将核酸递送系统注射到围绕细胞 的组织或流体中，核酸递送系统简单扩散穿过细胞膜，或者通过任何主动或被动转运机制 而穿过细胞膜。另外，可以通过使用诸如病毒载体的与抗体相关的靶向和由抗体介导的固 定化的技术来将核酸递送系统提供给细胞。用于表面施用的制剂可以包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、 液体制剂和粉剂。根据需要可以使用常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等。适合于肠胃外施用(例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和 皮下途径)的制剂包括水性和非水性的、等渗的无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲 剂、抑菌剂和使得该制剂与预期受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液、 溶液或乳状液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、分散剂、稳定剂和防腐剂。用于注射的 制剂可以与所添加的防腐剂一起以单位剂量形式呈现，例如在安瓿中或在多剂量容器中。 组合物可以采取此类形式。制备物包括无菌的水性或非水性的溶液、悬浮液和乳状液，其可以与受试者的血 液等渗，在某些实施方案中。非水性溶剂的实例为聚丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油、 芝麻油、椰子油、落花生油、花生油，矿物油，可注射的有机酯例如油酸乙酯，或固定油(包 括合成的甘油单酯或甘油二酯)。水性载体包括水，醇性/水性溶液、乳状液或悬浮液，其 包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、1，3_ 丁二醇、林格氏葡萄糖、葡萄糖 和氯化钠、乳酸盐林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充物、电解质补充物 (例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、 抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，无菌的固定油常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目 的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸 可以用于制备注射剂。载体制剂可以在Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton, 1 中找到。本领域技术人员可以容易地确定用于制备和配制组 合物的各种参数，而不依靠过度的实验。单独的或与其他合适组分相组合的核酸也可以制备成气雾剂制剂(即，它们可以 “雾化”)，以经由吸入进行施用。气雾剂制剂可以置于加压的可接受的推进剂(例如二氯二 氟甲烷、丙烷、氮气等)中。对于通过吸入进行施用，常规地以从加压的包装或喷雾器中的 气雾剂喷雾呈现形式来递送核酸，其中使用合适的推进剂。
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在一些实施方案中，上文所描述的核酸可以包括药学上可接受的载体，其有着配 制成分，例如盐、载体、缓冲试齐 、乳化齐 、稀释齐 、赋形齐 、螯合齐 、填充齐 、干燥齐 、抗氧化 剂、抗微生物剂、防腐剂、粘合剂、增量剂、二氧化硅、增溶剂或稳定剂。在一个实施方案中， 将核酸缀合至亲脂性基团例如胆固醇以及具有C32官能度的月桂酸和石胆酸衍生物，以改 善细胞摄取。例如，胆固醇已被证实在体外(Lorenz等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 14(19) 4975-4977(2004))和体内(Soutschek 等人，Nature 432(7014) :173-178(2004))增强 siRNA的摄取和血清稳定性。此外，已显示，缀合有类固醇的寡核苷酸与血流中不同脂蛋白 例如LDL的结合，保护完整性并且促进生物分布(Rump等人，Biochem. Pharmacol. 59 (11) 1407-1416(2000))。可以附着至或缀合至上文所描述的核酸以增加细胞摄取的其他基团包 括但不限于，吖啶衍生物；交联剂例如补骨脂素衍生物、叠氮基苯甲酰甲基、原黄素和叠氮 基原黄素；人工核酸内切酶；金属络合物例如EDTA-Fe(II)和卟啉-Fe(II)；烷基化部分； 核酸酶例如碱性磷酸酶；末端转移酶；抗体酶；胆固醇基部分；亲脂载体；肽缀合物；长链 醇；磷酸酯；放射性标记物；非放射性标记物；碳水化合物；和聚赖氨酸或其他多胺。Levy 等人的美国专利号6，919，208还描述了用于增强的核酸分子递送的方法。
这些药物制剂可以以本身已知的方式进行制备，例如借助于常规的混合、溶解、粒 化、水飞、乳化、包囊、包载或冻干过程。本文所描述的核酸制剂包括核酸的融合物或核酸的修饰物，其中核酸与另外一个 或多个部分(例如靶向部分)或另一治疗剂相融合。此类类似物可以展示出经改善的性 质，例如活性和/或稳定性。可以与核酸相连接或不相连接的部分的实例包括例如提供将 核酸递送至特定细胞的靶向部分，例如针对胰腺细胞、免疫细胞、肺细胞或任何其他首选的 细胞类型的抗体，以及在首选的细胞类型上表达的受体和配体。优选地，所述部分靶向癌症 或肿瘤细胞。例如，由于癌细胞增加了葡萄糖的消耗，所以核酸可以与葡萄糖分子相连接。 靶向癌症或肿瘤细胞的单克隆人源化抗体是优选的部分，并且可以与核酸相连接或不相连 接。在癌症治疗学的情况下，靶抗原通常是对于肿瘤细胞而言独特的和/或必需的蛋白质 (例如，受体蛋白HER-2)。V.治疗方法A.施用方法一般而言，施用核酸的方法是本领域众所周知的。特别地，已用于核酸治疗学的施 用途径连同目前使用的制剂一起提供了用于上文所描述的核酸的优选的施用途径和制剂。核酸组合物可以通过许多途径进行施用，包括但不限于经口、静脉内、腹膜内、肌 内、透皮、皮下、表面、舌下或经直肠方式。核酸还可以经由脂质体进行施用。此类施用途径 和合适的制剂是本领域技术人员普遍已知的。本文所描述的制剂的施用可以通过任何可接受的方法来完成，所述方法允许 miRNA或编码miRNA的核酸到达其靶。所选择的特定方式当然将会依赖于诸如下列的因素 特定的制剂，待治疗的受试者的状态的严重度，和对于治疗效果而言所需的剂量。如本文中 通常使用的，核酸的“有效量”是这样的量，所述量在施用了该制剂的受试者中能够治疗癌 症或相关疾病的一种或多种症状，逆转癌症或相关疾病的一种或多种症状的进展，停止癌 症或相关疾病的一种或多种症状的进展，或者预防癌症或相关疾病的一种或多种症状的出 现，与未接受该化合物或治疗剂的相匹配的受试者相比较。根据待利用的特定药物或其组
27合，配制的特定组合物，施用方式，和患者的年龄、重量、状况，以及待治疗的症状或病状的 严重度，药物的实际有效量可以变化。本领域普通技术人员已知的任何可接受的方法可以用于将制剂施用给受试者。依 赖于待治疗的病状，施用可以是局域性的(即，施用至特定的区域、生理学系统、组织、器官 或细胞类型)或全身性的。注射可以是例如静脉内的、皮内的、皮下的、肌内的或腹膜内的。可以皮内注射组 合物以用于治疗或预防例如癌症。在一些实施方案中，可以在多个位置处给予注射。植入包 括插入植入型药物递送系统，例如微球体，水凝胶，聚合物储库，胆固醇基质，聚合物系统， 例如基质侵蚀和/或扩散系统，和非聚合物系统，例如压缩的、融合的或部分融合的小丸。 吸入包括以在吸入器中的气雾剂来施用组合物，单独地或附着至可以被吸收的载体。对于 全身施用，优选的是将组合物包囊在脂质体中。优选地，以这样的方式提供试剂和/或核酸递送系统，所述方式使得达到所述试 剂和/或核酸递送系统的组织特异性摄取。技术包括使用组织或器官定位装置例如伤口敷 料或透皮递送系统，使用侵入性装置例如血管或尿道导管，和使用介入性装置例如具有药 物递送能力并被设置为扩张装置或支架移植物的支架。可以使用生物可蚀解植入物经由扩散或者通过聚合物基质的降解来递送制剂。在 某些实施方案中，可以这样设计制剂的施用，以便导致在一定的时间段(例如数小时、数 天、数周、数月或数年)期间连续暴露于miRNA。这可以例如通过制剂的反复施用或者通过 持续释放或控制释放递送系统(其中在延长的时间段期间递送miRNA，而无需反复施用) 来完成。使用此类递送系统来施用制剂可以例如通过口服剂型、推注、透皮贴剂或皮下植入 物。维持基本上恒定的组合物浓度在一些情况下可以是优选的。其他合适的递送系统包括但不限于，择时释放、延迟释放、持续释放或控制释放递 送系统。此类系统在许多情况下可以避免反复施用，从而增加对于受试者和医生而言的方 便。许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可获得的且已知的。它们包括例如， 基于聚合物的系统，例如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酐、聚己酸内酯、共聚草酸酯、聚酰胺 酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和/或这些的组合。包含核酸的前述聚合物的微胶囊描述在例 如美国专利号5，075，109中。其他实例包括基于脂质的非聚合物系统，包括固醇例如胆固 醇，胆固醇酯，和脂肪酸或中性脂肪例如甘油单酯、二酯和三酯；水凝胶释放系统；基于脂 质体的系统；基于磷脂的系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋 形剂的压制片剂；或部分融合的植入物。具体的实例包括但不限于，侵蚀系统，其中miRNA 包含于在基质内的制剂之中(例如，如在美国专利号4，452，775、4，675，189,5, 736, 152、 4，667，013,4, 748，034和5，239，660中所描述的)；或者扩散系统，其中活性组分控制释 放速率(例如，如在美国专利号3，832，253,3, 854，480,5, 133，974和5，407，686中所描述 的)。所述制剂可以作为例如微球体、水凝胶、聚合物储库、胆固醇基质或聚合物系统。在 一些实施方案中，所述系统可以允许发生组合物的持续释放或控制释放，例如通过控制包 含miRNA的制剂的扩散或侵蚀/降解速率。此外，基于泵的硬器具递送系统(pump-based hardware delivery system)也可以用于递送一个或多个实施方案。其中释放以爆发方式发生的系统的实例包括，例如其中组合物包载在脂质体中而 所述脂质体包囊在聚合物基质中的系统，所述脂质体对于特定的刺激例如温度、PH、光或降解酶敏感；和其中组合物通过具有微胶囊核心降解酶的离子包覆的微胶囊进行包囊的系 统。其中抑制剂的释放是逐步且连续的系统的实例包括，例如其中以在基质内的形式包含 组合物的侵蚀系统，和其中组合物以受控的速率渗透(例如通过聚合物)的渗出系统。此 类持续释放系统可以例如以小丸或胶囊的形式。在一些实施方案中，长期释放植入物的使用可能是特别合适的。如本文中所使用 的，“长期释放”意指，构建包含组合物的植入物，并将其布置为以至少30或45天，并且优选 地至少60或90天，或者在一些情况下甚至更久，递送治疗有效水平的组合物。长期释放植 入物是本领域普通技术人员众所周知的，并且包括上文所描述的释放系统中的一些。用于特定患者的剂量可以由本领域普通技术人员来确定，通过采用常规考虑(例 如借助于合适的常规药理学方案)。医生可以例如首先开出相对较低的剂量，随后增加剂量 直至获得合适的应答。施用给患者的剂量足以随着时间过去而在患者中实现有益的治疗应 答，或例如减少症状，或其他合适的活性，这取决于应用。通过特定制剂的功效，和所采用的 miRNA的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况，以及待治疗的患者的体重或表面积来确 定剂量。也通过任何不良副作用的存在、性质和程度来确定剂量的大小，所述不良副作用伴 随着在特定患者中特定载体、制剂等的施用而出现。任选地在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中测试包含一种或多 种核酸的治疗组合物，以证实功效、组织代谢以及评估用量，这根据本领域众所周知的方法 来进行。特别地，最初可以通过在相关测定法中治疗相比于未治疗而言(例如，经处理的与 未处理的细胞或动物模型的比较)的活性、稳定性或其他合适的量度来确定剂量。以通过 下列方式确定的速率来施用制剂相关制剂的LD50，和/或观察在各种浓度下的核酸的任 何副作用，其例如应用于患者的质量和总体健康状况。可以经由单个剂量或分份剂量来完 成施用。体外模型可以用于确定作为潜在癌症治疗的核酸的有效剂量。合适的体外模型 包括但不限于，培养的肿瘤细胞的增殖测定法，培养的肿瘤细胞在软琼脂中的生长(参见 Freshney, (1987)Culture ofAnimal Cells :A Manual of Basic Technique, Wily-Liss, New York, N. Y. Ch 18 和 Ch 21)，裸鼠中的肿瘤系统，如在 Giovanella 等人，J. Natl. Can. Inst. ,52 :921-30(1974)中所描述的，Boyden Chamber测定法中肿瘤细胞的移动性和侵 袭潜力，如在Pilkington等人，Anticancer Res. ,17 :4107-9(1997)中所描述的，和血管 生成测定法，例如鸡尿囊绒膜血管形成的诱导或血管内皮细胞迁移的诱导，其分别描述在 Ribatta 等人，Intl. J. Dev. Biol. ,40 :1189-97(1999)和 Li 等人，Clin. Exp. Metastasis, 17:423-9(1999)中。合适的肿瘤细胞系是可获得的，例如可从美国典型组织培养物保藏中 心(American Type Tissue Culture Collection)目录中获得。体内模型是用于确定作为潜在癌症治疗的上文所描述的核酸的有效剂量的优选 模型。合适的体内模型包括但不限于，在KRAS癌基因中携带突变的小鼠(Lox-Mop-Lox K-Ras. sup. G12D 突变体，Kras2. sup. tm4TYj)，其可从 National Cancer Institute (NCI) Frederick Mouse R印ository获得。本领域已知并且可获得的其他小鼠模型包括但不限 于，用于胃肠癌症、造血系统癌症、肺癌症、乳腺癌症、神经系统癌症、卵巢癌症、前列腺癌 症、皮肤癌症、宫颈癌症、口腔癌症和肉瘤癌症的模型(参见http://emice. nci. nih. gov/ mouse_models/)。
在确定在治疗或预防疾病中待施用的miRNA的有效量中，医生评估循环血浆水 平、制剂毒性和疾病的进展。施用给70千克患者的剂量通常在与目前使用的治疗性反义寡核苷酸例如 Yitravene (福米韦生钠注射剂)(其由fda批准用于治疗巨细胞病毒rna)的剂量等 价的范围中，并且其就相关组合物的改变的活性或血清半衰期进行调整。本文所描述的制剂可以补充通过任何已知常规疗法(包括但不限于，抗体施用、 疫苗施用、细胞毒剂的施用、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节物)的 治疗病状。两种或更多种相组合的化合物可以一起或顺次使用。例如，所述核酸也可以作 为抗癌混合物的一部分以治疗有效量进行施用。抗癌混合物是寡核苷酸或调节剂与一种 或多种抗癌药物的混合物，还包括用于递送的药学上可接受的载体。抗癌混合物用作癌症 治疗是常规的。抗癌治疗包括权利要求四-40中任一项的组合物，其中所选择的治疗剂 为放射性核素、癌症化学治疗剂、靶向抗癌剂、DNA嵌入/损伤试剂、细胞周期关卡抑制剂、 抗代谢物、HSP抑制剂、抗生素、激酶抑制剂、放射性核素、生物学活性多肽、抗体、凝集素、毒 素、激素、基质金属蛋白酶抑制剂、血管抑制性类固醇或其组合。此外，本领域众所周知且 可以与本文所描述的核酸相组合地用作治疗的治疗剂包括但不限于mI、9°Y、mh、211At、 32P、染料木素、阿霉素、安莎霉素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、卡 培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐 生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃坡霉素类、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟 基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲蝶呤、雷帕 霉素、西罗莫司、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、丙 卡巴胼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷类、长春碱、长春新碱、 长春瑞滨、红豆杉醇、康普瑞汀类、淅皮海绵内酯类、反钼、博来霉素、激素、他莫昔芬、己烯 雌酚、阿西替尼、阿瓦斯丁、马立马司他、贝伐珠单抗、羧胺三唑(carboxyamidotriazole)、 TNP-470、CM101、IFN-a、IL_12、血小板因子_4、苏拉明、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮 抗剂、软骨衍生的血管生成抑制因子、血管抑制素、内皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、替可加兰 (tecogalan)、血小板反应蛋白、促乳素、α νβ3抑制剂、替可加兰、BAY 12-9566、AG3340、 CGS27023A、C0L-3、vitaxin、ZD0101、TNP-40、沙立度胺、角鲨胺、IM862、PTK787、夫马洁林、 夫马洁林的类似物、BB-94、BB-2516、利诺胺、17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇及其组合。VI.所治疗的疾病神经变性疾病例如为阿尔茨海默病、帕金森病、ALS和脊髓延髓性肌萎缩。增殖性疾病选自肥大性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病性视网膜病变、类风湿性关 节炎、动静脉畸形、动脉粥样硬化斑块、伤口愈合延迟、血友病性关节、骨不连合性骨折、 奥-韦综合征、银屑病、脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼、月经过多、血管粘连和再狭窄。癌症治疗通过下述方式来促进肿瘤消退抑制肿瘤细胞增殖、抑制血管生成(支 持肿瘤生长所需的新血管的生长)和/或经由降低肿瘤细胞运动性或侵袭力而阻止转移。 本文所描述的治疗制剂在成人和儿科肿瘤学中可以是有效的，包括在固相肿瘤/恶性肿 瘤，局部进展的肿瘤，人软组织肉瘤，转移性癌症(包括淋巴转移)，血细胞恶性肿瘤(包括 多发性骨髓瘤、急性和慢性白血病、和淋巴瘤)，头与颈癌症(包括口腔癌症、喉癌症和甲状 腺癌症)，肺癌症(包括小细胞癌和非小细胞癌)，乳腺癌症(包括小细胞癌和导管癌)，胃肠癌症(包括食管癌症、胃癌症、结肠癌症、结肠直肠癌症和与结肠直肠瘤形成相关的息 肉)，胰腺癌症，肝癌症，泌尿道癌症(包括膀胱癌症和前列腺癌症)，女性生殖道的恶性肿 瘤(包括卵巢癌、子宫(包括子宫内膜)癌症、和卵泡中的实体瘤)，肾癌症(包括肾细胞 癌)，脑癌症(包括内因性脑肿瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑肿瘤，神经胶质瘤，在中枢神 经系统中的转移性肿瘤细胞侵袭)，骨癌症(包括骨瘤)，皮肤癌症(包括恶性黑素瘤、人 皮肤角质形成细胞的肿瘤进展、鳞状细胞癌、基底细胞癌、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤) 中。治疗制剂可以单独地或与辅助癌症疗法(例如手术、化学疗法、放射疗法、温热疗法、免 疫疗法、激素疗法和激光疗法)相组合地以治疗有效剂量进行施用，以提供有益的效果，例 如减少肿瘤大小、减慢肿瘤生长速率、减少肿瘤的细胞增殖、促进癌细胞死亡、抑制血管生 成、抑制转移、或者改善总体临床状况，而并非必需根除癌症。癌症包括但不限于胆道癌症；膀胱癌症；乳腺癌症；脑癌症，包括成胶质细胞瘤 和成神经管细胞瘤；宫颈癌症；绒毛膜癌；结肠癌症，包括结肠直肠癌；子宫内膜癌症；食管 癌症；胃癌症；头与颈癌症；血液学肿瘤，包括急性淋巴细胞和髓性白血病、多发性骨髓瘤、 AIDS相关的白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括鲍恩病和佩吉特病；肝 癌症；肺癌症，包括小细胞肺癌症和非小细胞肺癌症；淋巴瘤，包括霍奇金病和淋巴细胞性 淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌症，包括鳞状细胞癌；骨肉瘤；卵巢癌症，包括由上皮细胞、 基质细胞、生殖细胞和间充质细胞而产生的那些；胰腺癌症；前列腺癌症；直肠癌症；肉瘤， 包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、滑囊肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌症，包括黑 素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌症和鳞状细胞癌症；睾丸癌症，包括生殖性细胞肿瘤例如精 原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、基质瘤和胚细胞瘤；甲状腺癌症，包括甲状 腺腺癌和髓样癌；移行细胞癌症和肾癌症，包括腺癌和维尔姆斯瘤。在一个优选的实施方案 中，施用制剂以用于治疗或预防肺癌症。因此，本文公开的本发明方法和组合物可以由正经历选自手术、化学疗法、放射疗 法、温热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的一种或多种癌症疗法的人患者来使用。进 一步地，本发明的方法和组合物允许在正经历选自手术、化学疗法、放射疗法、温热疗法、免 疫疗法、激素疗法、激光疗法或放置支架的一种或多种抗增殖疗法的人患者中使用。此外，治疗性核酸可以用于癌症的预防性治疗。存在有使个体易于形成癌症的本 领域已知的遗传状况和/或环境情况(例如，暴露于致癌物)。在这些情况下，可能有益的 是，用治疗有效剂量的核酸治疗这些个体以减少形成癌症的风险。在一个实施方案中，可以 将在合适制剂中的核酸施用给具有癌症家族史的受试者，或者具有对于癌症的遗传易感性 的受试者。在其他实施方案中，将在合适制剂中的核酸施用给已达到特定年龄的受试者，或 者更可能获得癌症的受试者。在另外其他实施方案中，将在合适制剂中的核酸施用给已显 示出癌症(例如，早期或晚期)的症状的受试者。在另外其他实施方案中，可以将在合适 制剂中的核酸施用给受试者以作为预防措施。在一些实施方案中，可以将在合适制剂中的 核酸施用给基于人口统计状况或流行病学调查的受试者，或者在特定领域或职业中的受试 者ο下述实施例进一步举例说明了本发明，但当然不应当被解释为以任何方式限制了 其范围。实施例1
这个实施例证明了 HSP90抑制剂17-AAG的细胞凋亡活性。ApO-ONE 均相胱天蛋白酶-3/7测定法(ftOmega，Madison, WI)使用拥有专 利权的裂解/活性缓冲液连同(Z-DEVD) 2-罗丹明110底物一起，允许用于在贴壁、悬浮和 原代培养细胞中或者在纯化的胱天蛋白酶制备物中检测胱天蛋白酶-3和-7的简单的“添 加-混合-读取”形式。该测定法使用基于罗丹明110的底物，其允许先前用常规的比色测 定法或荧光测定法无法获得的极度灵敏度。特别地，将100 μ 1 ApO - ONE 胱天蛋白酶-3/7试剂添加到包含100 μ 1空白、对 照或培养细胞的白色或黑色96-孔平板的每个孔中。用平板密封物覆盖该平板以用于温育 延长的时间段(>4小时)。为了在384-孔平板中施行该测定法，采用Αρο-ΟΝΕ 胱天蛋 白酶-3/7试剂样品的1 1体积比。使用平板摇动器以300-500rpm使孔的内容物混合 30秒，并且在室温下温育6小时。在485/538nm下测定每个孔的荧光(细胞凋亡的量度，其 中更高的比率表明更多的细胞凋亡)。使用关于胱天蛋白酶-3/7活性的测定法(Αρο-ΟΝΕ试剂盒，Promega)，在结肠癌症 系HD9中测定17-AAG(17-(烯丙基氨基)-17-脱甲氧格尔德霉素)的细胞凋亡活性。将 经17-AAG处理的细胞与经DMSO处理的对照进行比较(图1)。用各种浓度的17-AAG 在37°C下处理Η ^9细胞72小时。17-AAG以0. 07 μ g/ml或0. 12 μ M的EC50诱导细胞凋 亡。在更高浓度的17-AAG下，细胞死亡经由非细胞凋亡途径发生，并且存在有细胞凋亡活 性的人为减少。实施例2这个实施例证实了 HSP90抑制剂17-AAG抑制Her2的表达。将10，000个BT474细胞/孔种植到微量滴定板中，并且生长48小时。在该预温 育后，用各种浓度的17-AAG及其类似物处理BT474细胞M小时。在该温育结束时，从每个 孔中除去培养基，用冰冷的Tris缓冲盐水(包含0. 1% Tween 20)将每个孔洗涤2次，并且 用甲醇(冰冷的)在40°C下固定细胞10分钟。经固定的BT474细胞用抗-Her2抗体进行 免疫染色。通过在平板阅读器中测量405nm下的吸光度来测定Her2蛋白的存在。如图2中所显示的，关于Her2抑制测定法而言17-AAG的IC50接近32nM。这个结 果暗示，17-AAG强烈抑制Her2蛋白表达。实施例3这个实施例证明了，在17-AAG抑制HSP90后存在有Her2的内在化和降解。通过共焦成像系统来检查经17-AAG处理的BT474细胞。将BT474细胞种植在载 玻片上，并且以IC50的浓度处理M小时。用甲醇固定经17-AAG处理的和对照BT474细 胞，用Her2抗体染色，并且通过共焦成像进行分析。如图3中所显示的，在17-AAG处理后， Her2蛋白表达从其细胞表面亚定位消除，而亚定位至细胞质。实施例4这个实施例证实了，使用17-AAG和化学疗法的联合疗法上调Hsp70。因此，HSP90 疗法受到HSP70的补偿性增加限制。就使用17-AAG的细胞凋亡活性的增强来测试抗癌化学治疗剂的实验对象组(使 用与实施例1中相同的细胞凋亡测定法系统)，图4。在抗癌剂(包括已知的HSP70促进剂 诱导物)存在或不存在下，用各种浓度的17-AAG处理HD9细胞。在药物处理后3天，通
32过Apo-ONE试剂盒来测量细胞凋亡活性(参见上文)。当与抗癌剂(包括HSP70诱导物) (例如顺钼、依托泊苷、多柔比星、万珂、Dimethylenastron)相联合时。17-AAG的细胞凋 亡活性在万珂存在下被强烈抑制，已知万珂诱导HSP70表达(参见Lauricella M.等人， Apoptosis. 2006Apr ；11 (4) :607-25)。对于HSP70的其他诱导物也观察到一些抑制。实施例5这个实施例证明了通过miRNAs增强17-AAG活性。为了观察17-AAG活性的增强，已将具有470种pre-miRNA的miRNA文库转染 (Ambion, siPORT NeoFx转染试剂)到Η ^9结肠癌症系中，随后进行17-AAG处理。将来自 该miRNA文库的合成ds-miRNAs转染到Η ^9细胞中，并且在37°C下温育48小时。将各种 浓度的17-AAG添加至经miRNA转染的细胞，并且再温育48小时。从每个孔中吸出 IOOuL培养基。通过以1 100浓度在缓冲液中稀释底物来制备Apo-One胱天蛋白酶试剂。 将IOOuL试剂添加到每个孔中。使平板在室温下温育6小时。通过Fluoroskan平板阅读 器来测量细胞凋亡活性。通过显示出超过单独的17-AAG的细胞凋亡读数而与17-AAG发生 协同作用的分子。在17-AAG的1 800和1 3200稀释度下均发生协同作用的分子为 miR-145、miR-454-3p、miR519a、miR-520c 和 miR_520d (SEQ ID NO :1_5)(图 5，分别为暗色 背景)O实施例6这个实施例证实了一些来自实施例5的结果。将在实施例5中所使用的相同操作程序用于转染在实施例5中鉴定发现的5种 miRNAs。但是，以1 800、1 3200和1 8000添加17-AAG，以进一步确定用于细胞凋亡 活性的其最佳浓度。使细胞温育48小时，并且使用与实施例5中所描述的相同操作程序来 进行显色。如图6 (暗色)和图7中所显示的，所有5种miRNAs增强17-AAG的活性，而没有 一种单独地具有活性。“DMS0”代表了用miRNAs转染但未用17-AAG处理的细胞。使用用于转染的各种不同miRNA浓度(6、3、1. 5和0. 75pmol)重复该实验，以最优 化miRNA的工作剂量。使用在生长培养基中的1 3200的17-AAG浓度。实施例7这个实施例证明了被发现增强由17-AAG诱导的杀伤的miRNAs之间的相似性。将所鉴定的miRNAs的序列进行比较，其中显示出共享保守的残基链段。一种 miRNA, hsa-mir-145,共享较少的序列同源性；而其他的 hsa-mir_519a、hsa-mir_520c、 hsa-mir-520d和hsa-4M_3p (分别为SEQ ID NO :3_6)显示出广泛的彼此同源性(图8)。 因此，存在有2类受这些miRNA控制的靶。实施例8这个实施例证明了，17-AAG协同作用随着所使用的miRNA的量增加而增加。为了证实实施例6中所显示的活性，以恒定量的17_AAG(3. 125ug/ml)和增加量 的用于转染的miRNAs (60、30、15、7.5nM)重复该实验。与17-AAG的协同作用显示出随 着所使用的miRNA的量增加而增加的活性(参见图9A)。对于单独的miRNA未观察到细 胞凋亡活性(参见图9B)。根据活性，存在有2种不同类别的miRNAs (—类具有高活性 miR454(SEQ ID NO :2)、miR_520c (SEQ ID NO :4)和 miR_520d (SEQ ID NO :5)；—类具有低活性miR-145(SEQ ID NO 1)和 miR_519a(SEQ ID NO :3))。实施例9这个实施例给出了用miRNAs处理的肿瘤细胞的蛋白质表达谱。为了测定用这些miRNAs处理的细胞的总蛋白质表达谱，使用包含针对关键细胞 蛋白质(特别是细胞信号传导蛋白质)的2M种人抗体的抗体阵列。(图10)将所述抗 体一式两份地点在经硝化纤维素包被的载玻片上，并且可以检测低至几ng/ml的蛋白质水 平。用Cy5标记来自未处理的Η ^9细胞的细胞裂解物。用4种miRNAs (SEQ ID NO :1_4)之 一或者说(SEQ ID N0:l、2、3或4)处理来自Η ^9细胞的细胞裂解物。使抗体阵列与Cy3/ Cy5 (经处理的/未处理的)裂解物的相等混合物进行反应，洗涤，并扫描。使经log标准化 的“经处理的/未处理的”(分开地用17-AAG、mir-145、mir-454、mir519a或mir_520c (分 别为SEQ ID NO 2-4)进行处理)之比进行聚类分析，以确定类似地受所述4种miRNAs调 节的蛋白质。如图10中所显示的，所有5种经处理的样品的蛋白质谱是相似的，这表明这些 miRNAs作用于相同的途径，并且该途径也与由17-AAG所作用于的途径相同，从而产生协同 作用。此外，聚类分析表明，519a和145属于一个类别，而520c和519a属于另一个类别，这 与使用活性测定法所达到的结论相一致。与17-AAG—样由这些miRNAs下调的基因为信号 传导分子，并且包括FAK-pTyr577、cdc27、MAPK 活化激酶 2、PAR4、PKC γ 和 RAF_pkr621。 与17-AAG —样由这些miRNAs上调的基因为细胞骨架元件，并且包括细胞角蛋白4、S100b 和粘着斑蛋白。此外，已显示hsa-mir-520c (SEQ ID NO :4)调节 CD44 翻译(HuangQ 等人，2008)。 微小 RNAs mir-373 (GAAGUGCUUCGAUUUUGGG⑶⑶)(SEQ ID NO :39)和 mir_520c (SEQ ID NO 4)促进肿瘤侵袭和转移。Nature Cell Biology 10:202-10。这将使得 CD44、CDC27、MAPK 活化激酶2、PAR4、PKC γ成为关于miRNAs的潜在靶。实施例10这个实施例显示了这些miRNAs的严格序列要求，这是从目前对于miRNA的了解未 预期到的。由于miRNA数据库不断更新和变化，所以存在有显示出增强17-AAG细胞凋亡活性 的5种miRNAs的几种经报到的形式。当从3'末端删除少至单个残基时，这些miRNAs的活
性形式失活，如下表中所显示的
权利要求
1.用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再狭窄或增殖性细胞疾病的生物中治疗剂的 活性的方法，其包括在施用所述治疗剂之前、期间或之后，施用有效量的包含miRNA的组合 物。
2.权利要求1的方法,其中所述miRNA选自pri_miRNA、pre_miRNA、成熟miRNA、ds miRNA及其片段或变体。
3.权利要求2的方法，其中所述miRNA由分离的核酸编码。
4.权利要求3的方法，其中将所述分离的核酸整合到载体中。
5.权利要求4的方法，其中所述载体选自质粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色体。
6.权利要求4的方法，其中所述载体进一步包含一种或多种体内表达控制元件。
7.权利要求6的方法，其中所述一种或多种体内表达控制元件选自启动子、增强子、 RNA剪接位点及其组合。
8.权利要求3-7中任一项的方法，其中将所述分离的核酸转染到所述生物的细胞中。
9.权利要求1的方法，其中所述miRNA为裸露的合成RNA。
10.权利要求1的方法，其中所述miRNA为经化学修饰的合成RNA。
11.权利要求10的方法，其中所述合成RNA用选自下列的化学部分进行修饰硫代磷 酸酯、硼烷磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、PEG、末端反转-dT碱基及其组合。
12.权利要求1的方法，其中在脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆固醇缀合物、环状葡 聚糖复合物、聚乙烯亚胺聚合物或蛋白质复合物中施用所述miRNA。
13.权利要求1的方法，其中以静脉内、皮下、肌内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、经 口、眼内或鞘内方式将所述miRNA直接施用至所述生物中的患病组织。
14.权利要求1的方法，其中所述miRNA的长度为18个核苷酸至170个核苷酸。
15.权利要求14的方法，其中所述miRNA的长度为18至25个核苷酸。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述治疗剂选自放射性核素、化学治疗剂、靶 向抗癌剂、DNA嵌入/损伤试剂、细胞周期关卡抑制剂、抗代谢物、热休克蛋白抑制剂、激酶 抑制剂及其组合。
17.权利要求1的方法，其中所述治疗剂选自染料木素、mI、9°Y、mIn、211At、32P、阿霉 素、安莎霉素抗生素类、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、卡培他滨、苯 丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生、多西他 赛、多柔比星、依托泊苷、埃坡霉素类、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达 比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲蝶呤、雷帕霉素、西罗 莫司、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴胼、利 妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷类、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、红 豆杉醇、康普瑞汀类、淅皮海绵内酯类、反钼、博来霉素、激素、他莫昔芬、己烯雌酚、生物学 活性多肽、抗体、凝集素、毒素、阿西替尼、阿瓦斯丁、马立马司他、贝伐珠单抗、羧胺三唑、 TNP-470, CMlOU IFN-α、IL-12、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮 抗剂、血管抑制性类固醇、软骨衍生的血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、血管抑 制素、内皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、替可加兰、血小板反应蛋白、促乳素、ανβ3抑制剂、 替可加兰、BAY 12-9566、AG3340、CGS27023A、C0L-3、vitaxin、ZDOlOU TNP-40、沙立度胺、 角鲨胺、IM862、PTK787、夫马洁林、夫马洁林的类似物、BB-94、BB-2516、利诺胺、17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇及其组合。
18.权利要求17的方法，其中所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇或其组合。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中(a)所述癌症选自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌症、胰腺癌症、皮肤癌症、 血液学肿瘤、乳腺癌症、脑癌症、结肠癌症、膀胱癌症、宫颈癌症、子宫内膜癌症、食管癌症、 胃癌症、头与颈癌症、多发性骨髓瘤、肝癌症、白血病、淋巴瘤、口腔癌症、骨肉瘤、卵巢癌症、 前列腺癌症、睾丸癌症和甲状腺癌症，(b)所述再狭窄选自冠状动脉再狭窄、大脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、 股动脉再狭窄、外周动脉再狭窄或其组合，(c)所述增殖性疾病选自增生、子宫内膜异位症、肥大性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病 性视网膜病变、增殖性肾小球肾炎、肺动脉高压、类风湿性关节炎、动静脉畸形、动脉粥样硬 化斑块、伤口愈合延迟、血友病性关节、骨不连合性骨折、奥-韦综合征、银屑病、脓性肉芽 肿、硬皮病、沙眼、月经过多、血管粘连和乳头状瘤，以及(d)所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、ALS和脊髓延髓性肌萎缩。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述miRNA选自 miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO 1), miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGACT(}UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)， miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)， miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)， 其互补物，以及其组合。
21.权利要求1-17或19中任一项的方法，其中所述miRNA选自miR4M_3p(UAGUGCAAU AUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， 其互补物，以及其组合。
22.权利要求21的方法，其中所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼或其组合。
23.权利要求1-17或19中任一项的方法，其中所述miRNA选自 miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO 6), miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)，其互补物， 以及其组合。
24.权利要求23的方法，其中所述治疗剂为紫杉醇。
25.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述miRNA为SEQID NO 10-35中的一种或多种。
26.权利要求19的方法，其中所述生物为正经历一种或多种癌症疗法的人患者，所述 癌症疗法选自手术、化学疗法、放射疗法、温热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法。
27.权利要求19的方法，其中所述生物为正经历一种或多种抗增殖疗法的人患者，所 述抗增殖疗法选自手术、化学疗法、放射疗法、温热疗法、免疫疗法、激素疗法、激光疗法或 放置支架。
28.权利要求I-M中任一项的方法，其中所述生物为人。
29.用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再狭窄或增殖性细胞疾病的生物中治疗剂的 活性的治疗组合物，其包含有效量的miRNA，或者在施用所述治疗剂之前、期间或之后表达 有效量的miRNA的载体。
30.权利要求四的组合物,其中所述miRNA选自pri_miRNA、pre_miRNA、成熟miRNA、 ds miRNA及其片段或变体。
31.权利要求四的组合物，其中所述miRNA由包含一种或多种体内表达控制元件的分 离的核酸载体编码。
32.权利要求31的组合物，其中所述分离的核酸已转染到所述生物的细胞中。
33.权利要求四的组合物，其中所述miRNA为裸露的合成RNA。
34.权利要求四的组合物，其中所述miRNA为经化学修饰的合成RNA。
35.权利要求34的组合物，其中所述合成miRNA用选自下列的化学部分进行修饰硫 代磷酸酯、硼烷磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、PEG、末端反转-dT碱基及其组合。
36.权利要求四的组合物，其中在脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆固醇缀合物、环 状葡聚糖复合物、聚乙烯亚胺聚合物或蛋白质复合物中负载所述miRNA。
37.权利要求四的组合物，其中所述miRNA用于以静脉内、皮下、肌内、经鼻、腹膜内、经 阴道、经肛门、经口、眼内或鞘内方式直接施用至患病组织。
38.权利要求四的组合物，其中所述miRNA的长度为18个核苷酸至170个核苷酸。
39.权利要求38的组合物，其中所述miRNA的长度为18至25个核苷酸。
40.权利要求四的组合物，其中(a)所述癌症选自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌症、胰腺癌症、皮肤癌症、 血液学肿瘤、乳腺癌症、脑癌症、结肠癌症、膀胱癌症、宫颈癌症、子宫内膜癌症、食管癌症、 胃癌症、头与颈癌症、多发性骨髓瘤、肝癌症、白血病、淋巴瘤、口腔癌症、骨肉瘤、卵巢癌症、 前列腺癌症、睾丸癌症和甲状腺癌症，(b)所述再狭窄选自冠状动脉再狭窄、大脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、 股动脉再狭窄、外周动脉再狭窄或其组合，(c)所述增殖性疾病选自增生、子宫内膜异位症、肥大性瘢痕和瘢痕瘤、增殖性糖尿病 性视网膜病变、增殖性肾小球肾炎、肺动脉高压、类风湿性关节炎、动静脉畸形、动脉粥样硬 化斑块、伤口愈合延迟、血友病性关节、骨不连合性骨折、奥-韦综合征、银屑病、脓性肉芽 肿、硬皮病、沙眼、月经过多、血管粘连和乳头状瘤，以及(d)所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、ALS和脊髓延髓性肌萎缩。
41.权利要求四-40中任一项的组合物，其中所述治疗剂选自放射性核素、癌症化学治 疗剂、靶向抗癌剂、DNA嵌入/损伤试剂、细胞周期关卡抑制剂、抗代谢物、HSP抑制剂、抗生素、激酶抑制剂、放射性核素、生物学活性多肽、抗体、凝集素、毒素、激素、基质金属蛋白酶 抑制剂、血管抑制性类固醇或其组合。
42.权利要求四-40中任一项的组合物，其中所述治疗剂选自mI、9°Y、mIn、211At、32P、 染料木素、阿霉素、安莎霉素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、卡培他 滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生、多 西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃坡霉素类、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、 伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲蝶呤、雷帕霉素、 西罗莫司、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴 胼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷类、长春碱、长春新碱、长春瑞 滨、红豆杉醇、康普瑞汀类、淅皮海绵内酯类、反钼、博来霉素、激素、他莫昔芬、己烯雌酚、阿 西替尼、阿瓦斯丁、马立马司他、贝伐珠单抗、羧胺三唑、TNP-470、CMlOU IFN-α、IL-12、血 小板因子-4、苏拉明、STO416、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、软骨衍生的血管生成抑制因 子、血管抑制素、内皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、替可加兰、血小板反应蛋白、促乳素、α νβ 3 抑制剂、替可加兰、BAY 12-9566、AG3340, CGS27023A、C0L-3、vitaxin、ZDOlOU TNP-40、沙 立度胺、角鲨胺、IM862、PTK787、夫马洁林、夫马洁林的类似物、BB-94、BB-2516、利诺胺、 17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇及其组合。
43.权利要求42的组合物，其中所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇或其组合。
44.权利要求四-42中任一项的组合物，其中所述miRNA包含选自下述的序列(a)miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQID NO :1)， miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)， miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO :6)， miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)；(b)(a)中所述序列之中的任何序列的互补RNA ；和(c)具有与(a)或(b)的21个邻接核苷酸至少大约81%同一的序列的RNA。
45.权利要求四-42中任一项的组合物，其中所述miRNA选自miR4M_3p(UAGUGCAAU AUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)，miR520c (AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， 其互补物，以及其组合。
46.权利要求45的组合物，其中所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼或其组合。
47.权利要求四-42中任一项的组合物，其中所述miRNA选自 miR-425-3p (AUCGGGAAUGUC⑶⑶CCGCC) (SEQ ID NO 6), miR-495(AAACAAACAUGGUGCACUUCUUU)(SEQ ID NO :7)， miR-572(GUCCGCUCGGCG⑶GGCCCA)(SEQ ID NO :8)， miR-661(UGCCUGG⑶CUCUGGCCUGCGCGU)(SEQ ID NO :9)，其互补物，以及其组合。
48.权利要求47的组合物，其中所述治疗剂为紫杉醇。
49.探针，其包含与权利要求44的RNA序列中的任何RNA序列互补的核酸或肽核酸。
50.生物芯片，其包含肽核酸探针的核酸，所述肽核酸探针包含权利要求49的miRNA序 列中的任何miRNA序列。
51.用于预测对于使用HSP90抑制剂、微管抑制剂或DNA复制抑制剂的疗法的应答的方法(a)提供患病组织的生物学样品；(b)测量患病组织的生物学样品中RNA的水平，其中所测量的RNA选自(i)miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQID NO 1), miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGG⑶U)(SEQ ID NO :4)， miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)；(ii)(i)的互补RNA ；和(iii)具有与(i)或(ii)的21个邻接核苷酸至少大约81%同一的序列的RNA ；(c)将患病组织中来自(b)的RNA的水平与对照中相同RNA的水平相比较，其中高于对 照水平的该核酸的水平表明对所述疗法作出应答，和低于对照水平的该核酸的水平表明对 所述疗法不作出应答。
52.权利要求51的方法，其中所述HSP90抑制剂为17-AAG，所述微管抑制剂为紫杉醇， 和所述DNA复制抑制剂为奥沙利钼。
53.权利要求51的方法，其中所述RNA通过RT-PCR、微阵列、invader、质谱法、杂交或 TMA来测量。
54.用于抑制一种或多种蛋白质的表达的方法，其包括给生物施用有效量的一种或多 种选自下列的miRNA miR145 (GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ ID NO :1)， miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU)(SEQ ID NO :4)，和 miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)。
55.权利要求讨的方法，其中所述蛋白质选自FAK、⑶C27、MAH(活化蛋白激酶2、PAR4、 PKCy 禾口 RAF0
56.用于增强在生物中一种或多种蛋白质的表达的方法，其包括给所述生物施用有效 量的一种或多种选自下列的mi RNA miR145(GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU)(SEQ IDNO :1)， miR454-3p(UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGUUU)(SEQ ID NO :2)， miR519a(AAAGUGCAUCCUUUUAGA(iU(;UUAC) (SEQ ID NO :3)， miR520c(AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU)(SEQ ID NO :4)，和 miR520d(AAAGUGCUUCUCUUUG⑶GG⑶U)(SEQ ID NO :5)。
57.权利要求56的方法，其中所述蛋白质选自细胞角蛋白4、SlOOb和粘着斑蛋白。
58.分离的核酸，其包含与报道基因有效地连接的一种或多种体内表达控制元件，其中 所述报道基因处于靶基因3’非翻译区的全部或部分的上游，其中在所述分离的核酸转染到 真核细胞中后，所述体内表达控制元件导致产生出编码处于靶基因mRNA的3’非翻译区上 游的该报道分子的mRNA。
59.权利要求58的分离的核酸，其中所述分离的核酸为选自质粒、粘粒、噬菌粒、病毒 和人工染色体的载体。
60.权利要求59的分离的核酸，其中所述一种或多种体内表达控制元件选自启动子、 增强子、RNA剪接信号及其组合。
61.权利要求59的分离的核酸，其中所述报道基因编码萤光素酶蛋白。
62.权利要求59的分离的核酸，其中所述靶基因为⑶44、⑶C27、MAPK活化激酶2、PAR4 或 PKC γ 0
63.鉴定基因表达调节剂的方法，其包括(a)用包含与报道基因有效地连接的一种或多种体内表达控制元件的分离的核酸转染 真核细胞，所述报道基因被克隆在靶基因3’非翻译区的全部或部分的上游，其中所述体内 表达控制元件导致产生出编码处于所述3’非翻译区上游的该报道分子的mRNA，(b)用包含与所述报道基因有效地连接的所述一种或多种体内表达控制元件的分离的 核酸转染其他真核细胞，其中所述表达控制元件导致转录出编码该报道分子的mRNA，(c)使来自(a)和(b)的经转染的细胞与候选表达调节剂相接触和假接触，和(d)将在经转染的细胞与候选表达调节剂相接触和未接触的情况下在来自(a)和(b) 的经转染的细胞中的报道基因活性进行比较。
64.权利要求63的方法，其进一步包括用第二报道构建体共转染(a)和(b)中的细胞， 所述第二报道构建体表达用于标准化(d)中所比较的数据的第二报道分子。
65.权利要求63或64的方法，其进一步包括使该报道分子表达构建体中的靶基因3’ 非翻译序列突变，将所述经突变的报道分子表达构建体转染到真核细胞中，和将在经转染 的细胞与候选表达调节剂相接触和未接触的情况下由于经突变和未突变的报道分子表达 构建体的表达而产生的报道基因活性进行比较。
66.权利要求63-65中任一项的方法，其中所述靶基因为⑶44、⑶C27、MAPK活化激酶 2、PAR4 禾口 PKC γ ο
67.用于鉴定表达调节剂的试剂盒，其包括(a)第一分离的核酸，其具有与第一报道基因有效地连接的第一组一种或多种体内表 达控制元件，所述第一报道基因被克隆在靶基因3’非翻译区的全部或部分的上游，其中在 所述第一分离的核酸转染到真核细胞中后，所述第一组体内表达控制元件导致产生出编码 处于靶基因3’非翻译区上游的该第一报道分子的mRNA ；(b)第二分离的核酸，其包含与所述第一报道基因有效地连接的来自(a)的该组体内 表达控制元件，其中在所述第二分离的核酸转染到真核细胞中后，所述体内表达控制元件 导致转录出编码所述第一报道分子的mRNA ；和(c)第三分离的核酸，其包含与第二报道基因有效地连接的第二组一种或多种所述体 内表达控制元件，其中在所述分离的核酸转染到真核细胞中后，所述第二组体内表达控制元件导致所述第二报道分子表达。
68.权利要求67的试剂盒，其中所述靶基因为⑶44、⑶C27、MAPK活化激酶2、PAR4或 PKCy 0
69.包含miRNA的分离的核酸，其中当将所述miRNA施用至哺乳动物细胞并且随后将所 述哺乳动物细胞暴露于治疗剂时，所述哺乳动物细胞在Apo - ONE 均相胱天蛋白酶-3/7 测定法中产生至少大约200的485/538nm比率。
70.权利要求69的分离的核酸，其中所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇及其组合。
71.能够表达包含miRNA的转录物的分离的核酸，其中当在哺乳动物细胞中表达所述 miRNA并且随后将所述哺乳动物细胞暴露于治疗剂时，所述哺乳动物细胞在ApO-ONE 均 相胱天蛋白酶-3/7测定法中产生至少大约200的485/538nm比率。
72.权利要求71的分离的核酸，其中所述治疗剂为17-AAG、奥沙利钼、紫杉醇及其组合。
73.用于增强在患有癌症、神经变性疾病、再狭窄或增殖性细胞疾病的生物中雷帕霉素 的活性的方法，其包括在施用所述治疗剂之前、期间或之后，施用有效量的包含miRNA的组 合物。
74.权利要求73的方法，其中所述miRNA选自pri_miRNA、pre_miRNA、成熟miRNA、ds miRNA及其片段或变体。
75.权利要求74的方法，其中所述miRNA由分离的核酸编码。
76.权利要求75的方法，其中将所述分离的核酸整合到载体中。
77.权利要求76的方法，其中所述载体选自质粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色体。
78.权利要求77的方法，其中所述载体进一步包含一种或多种体内表达控制元件。
79.权利要求78的方法，其中所述一种或多种体内表达控制元件选自启动子、增强子、 RNA剪接位点及其组合。
80.权利要求75-79中任一项的方法，其中将所述分离的核酸转染到所述生物的细胞中。
81.权利要求73的方法，其中所述miRNA为裸露的合成RNA。
82.权利要求73的方法，其中所述miRNA为经化学修饰的合成RNA。
83.权利要求81的方法，其中所述合成RNA用选自下列的化学部分进行修饰硫代磷 酸酯、硼烷磷酸酯、2’ -0-甲基、2’ -氟、PEG、末端反转-dT碱基及其组合。
84.权利要求73的方法，其中在脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆固醇缀合物、环状 葡聚糖复合物、聚乙烯亚胺聚合物或蛋白质复合物中施用所述miRNA。
85.权利要求73的方法，其中以静脉内、皮下、肌内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、经 口、眼内或鞘内方式将所述miRNA直接施用至所述生物中的患病组织。
86.权利要求73的方法，其中所述miRNA的长度为18个核苷酸至170个核苷酸。
87.权利要求86的方法，其中所述miRNA的长度为18至25个核苷酸。
88.权利要求73-87中任一项的方法，其中所述miRNA选自 CCAGUAUUAACU⑶GCUGCUGA(SEQ ID NO 36), AAGUGUGCAGGGCACUGGU(SEQ ID NO 37),AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG(SEQ ID NO :38)，及其组合。
89.权利要求1-19或四-42中任一项的方法，其中所述miRNA选自SEQID NO :10-35。
90.权利要求51的方法，其中所述miRNA选自SEQID N0:10_35。
91.权利要求四-43中任一项的组合物，其中所述miRNA选自SEQIDN0:10_35。
全文摘要
本发明提供了用于筛选微小RNA的方法和组合物，所述微小RNA能够在HSP90抑制剂存在下调节细胞凋亡途径中的基因表达。还公开了miRNA用于增强治疗剂(并不限于HSP90抑制剂)的活性的用途。还公开了miRNA用于预测对于疗法(并不限于治疗剂)的应答的诊断用途。本申请中还包括用于小分子的鉴定和治疗应用的方法，所述小分子是这些核酸的调节剂。
文档编号A61K31/00GK102076853SQ200980124435
公开日2011年5月25日 申请日期2009年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者L·黄, N·德塞, V·特里鲁 申请人:阿布拉西斯生物科学有限责任公司